CN106868190A - 一种检测sh2‑i基因型甜玉米的引物及试剂盒与应用 - Google Patents

一种检测sh2‑i基因型甜玉米的引物及试剂盒与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种检测sh2‑i基因型甜玉米的引物及试剂盒与应用，属于植物分子技术领域。该引物的序列如SEQ ID No：1～3所示。本发明利用分子技术进行甜玉米sh2‑i基因型鉴定，能够有效鉴定sh2‑i基因型或sh2‑i基因种质渗入超甜玉米基因型中。可克服了仅从籽粒外观和形态表现型判别sh2‑i基因型或sh2‑i基因种质渗入sh2超甜玉米种质的不确定性、盲目性的不足与缺点，准确识别sh2‑i基因型。本发明的方法是一种可早期获得sh2‑i甜玉米基因型的高效、准确的育种材料鉴定技术。

Description

一种检测sh2-i基因型甜玉米的引物及试剂盒与应用
技术领域
本发明属于植物分子技术领域，具体涉及一种检测sh2-i基因型甜玉米的引物及试剂盒与应用。
背景技术
甜玉米(Zea mays L.saccharata Sturt.)为玉米属(Zea mays L.)子粒胚乳基因发生突变而产生的1个亚种，主要包括su1、su2、sh1、sh2、sh4、du、ae、bt1、bt2、se等隐性突变基因，其中sh1、sh2、sh4、bt1和bt2基因突变体的蔗糖向淀粉的转变过程明显受阻，致使其胚乳的含糖量较高，乳熟期胚乳的可溶性糖含量高达15％以上。甜玉米起源于美洲，至今已有100多年的栽培历史。我国甜玉米育种始于20世纪50年代，兴盛于本世纪初，最初的育种材料引自美国。目前，我国育种资源仍主要来自美国、泰国和我国台湾等地，育种技术上主要以选育二环系为主，基础较薄弱，整体水平与国外先进水平相比还有一定差距。搜集与研究遗传基础多样、适应性强的甜玉米育种资源并加以有效利用和开发，才能从根本上提升甜玉米育种水平。
玉米胚乳含糖突变基因su1、sh2的发现与应用引发甜玉米产业的发展，产生了巨大社会经济效益。su1类型普甜玉米含糖量低主要用于加工，籽粒胚乳中的含糖量达8％～10％，相当于普通玉米的3～4倍。普甜玉米籽粒种皮较薄，胚乳中有1/3的淀粉为分子量较小的支链淀粉。这种淀粉溶解于水，具有粘性，被称为水溶性多糖(water-solublepolysaccharide，简称WSP)，易于被人体吸收。而淀粉含量只占35％左右，比普通玉米减少了一半。籽粒成熟后皱缩透明，其较高的糖分含量与WSP构成了其特有的粘、香的风味。sh2类型超甜玉米，是目前第2个最广泛利用的胚乳类型，含糖量比普通甜玉米高1倍或以上，可达20％以上，籽粒中主要是蔗糖、果糖、葡萄糖，淀粉少，一般以鲜穗供应市场为主，但植物糖原即水溶性多糖WSP含量少仅5％左右，因而不具粘性香味不浓，保鲜期较短，种子发芽率较低。sh2-i基因最早由美国科学家Gyula Ficsor利用EMS方法从成熟玉米籽粒诱变而来，2001年佛罗里达大学Curt Hannah引入甜玉米群体，2001年威斯康辛大学Bill Tracy培育su1sh2-i自交系，2008年成功培育sh2sh2-isu1su1基因型杂交种。sh2-i突变导致ADP葡萄糖-焦磷酸化酶部分失活，突变体内含子剪切位点大约10％转录本被正确剪切产生淀粉。与sh2比较，籽粒中蔗糖含量低、WSP和淀粉含量较高，sh2-i为sh2的等位基因。利用基因sh2-i，结合su1、sh2能够培育多基因复合甜玉米品种，克服sh2单基因遗传上的缺陷，该基因材料有潜在的遗传研究与商业价值，其研究与利用将扩展甜玉米的遗传基础，为开发新型甜玉米品种奠定基础。
因此，基于甜玉米新基因sh2-i种质特征，需要寻找一种高效、准确的鉴定方法。
发明内容
为了克服仅从籽粒外观和形态鉴定判别sh2-i基因种质及其渗入超甜玉米的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种检测sh2-i基因型甜玉米的引物。
本发明的另一目的在于提供一种检测sh2-i基因型甜玉米的试剂盒。
本发明的再一目的在于提供上述引物或试剂盒的应用。
实践证明，本发明可有效鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质渗入超甜玉米基因型中，是一种获得早代甜玉米基因型的高效、准确的育种材料鉴定技术。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种检测sh2-i基因型甜玉米的引物，其序列如下：
SL3：5′-CACTGTATGGCGGCATTGTT-3′；(SEQ ID No：1)
sh2R：5′-AAGTTCCAGCCTCCTTCCTG-3′；(SEQ ID No：2)
shiR：5′-TCCAGCCTCCTTCCGCTCC-3′。(SEQ ID No：3)
一种检测sh2-i基因型甜玉米的试剂盒，包括上述引物。
所述的检测sh2-i基因型甜玉米的引物在鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质渗入超甜玉米基因型中的应用。
所述的检测sh2-i基因型甜玉米的试剂盒在鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质渗入超甜玉米基因型中的应用。
一种sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法，包括如下步骤：
(1)引进携带sh2-i基因籽粒甜玉米种质资源；
(2)资源种植、自交、筛选鉴定：将引进的携带sh2-i基因籽粒甜玉米种质在田间种植，连续经历5季5轮以上选株自交，穗选、粒选、田间株选，获得性状一致的自交系(纯系)；
(3)分别种植sh2-i、sh2甜玉米自交系，通过杂交、回交、自交培育sh2sh2-i种质材料；
(4)将sh2-i、sh2甜玉米自交系sh2基因区域进行高通量测序，比较不同基因材料在sh2区域基因组差异，根据基因编码特异差异设计PCR扩增特征引物；其序列如SEQ ID No：1～3所示；
(5)提取不同甜玉米种质叶片DNA，以其为模板，进行PCR扩增；
(6)将步骤(5)中PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带差异进行判断，或PCR产物经测序，通过对不同种质材料DNA序列的差异鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质是否渗入sh2超甜玉米中。
采用引物SL3/shiR的PCR扩增产物电泳中出现明亮目的条带，则为基因型sh2- ish2-i或杂合基因型sh2-ish2；该目的条带的长度是579bp，碱基序列如SEQ ID No：4所示：
CGGCATTGTTTGATTATTTCAGTTCGCACCCGTTGGACCTTGCTCATTAAAAAAGTTTATACCATGGAGTCTTTGCATGTAGTTGTGTAGTAGGGGAAGAGTGGCATAGGAGGAATCACAACTTCAGCTAGCTTCTCTAGCCTTAGGGTATTTTTGTCTTTTTGCAGTTCGGTCTTTTCGCAGCCCTGCGCTGCCCCCCCTGTCCGCCTGTCCCTAGACCTGTTTTGCGTCGGCGGGGAAGACAGTTGACAGGAAGTACACGATCTTCGTGTCCGATGCCGATCTTCATGCGAGCAGCGAGCCACTACGTCGTTGCGCTGCCAGTGTCGGCTATGGCATCCAGGCACTCGTTGTGCACGTTGACGATGAGCTCGAAGCCGGTCCGGGTGAACGCGAGCAGCACGGTGAGGTCAACGTCGTACATCCGCACGTCGATGCTGAGGCCAGCCAGCAGCGGCATGACAGATTGCGGCGTCAGGAGATTGTGCCAGTAGGTGGCGGGGCTGGGGGCAGACCGGCAGGCGAGGCCTATGGGCGGGCAGTGCTGTGAGTTAGAGCAGTGTGGCAGTGTTGGTGGTA
采用引物SL3/sh2R的PCR扩增产物电泳中出现明亮目的条带，则为基因型sh2sh2或杂合基因型sh2-ish2；该目的条带的长度是619bp，碱基序列如SEQ ID No：5所示：
GGCATTGTTTGATTATTTCAGTTCGCACCCGTTGGACCTTGCTCATTAAAAAAGTTTATACCATGGAGTCTTTGCATGTAGTTGTGTAGTAGGGGAAGAGTGGCATAGGAGGAATCACAACTTCAGCTAGCTTCTCTAGCGGTCTAGCCTTAGGGTATTTTTGTCTTTTTGCAGTTCGGTCTTTTCGCAGCCCTGCGCTGCCCCCACCTGTCCGCCTGTCCCTAGACCTGTTTTGCGTCGGCGGGGAAGACAGTTGACAGGAAGGACACGATCTTCGTGTCCGATGCCGATCTTCATGCGAGCAGCGAGCCACTACGTTGCGTTGCCAGTGTCGGCTATGGCATCCAGGCACTCGTTGTGCACGTTGACGATGAGCTCGAAGCCGGTCCGGGTGAACGCGAGCAGCACGGTGAGGTCAACGTCGTACATCCGCACGTCGATGCTGAGGCCAGCCAGCAGCGGCATGACAGATTGCGGCGTCAGGAGATTGTGCCAGTAGGTGGCGGGGCTGGGGGCAGACCGGCAGGCGAGGCCTATGGGCGGGCAGTGCTGTGAGTTAGAGCAGTGTGGCAGTGTTGGTGGTAGTGGTGACACCCTTCGGGAGCGGAAAAGAGAAGAG
采用引物SL3/shiR或SL3/sh2R的PCR扩增产物电泳中均出现明亮目的条带，则为杂合基因型sh2-ish2；
步骤(1)中所述的sh2-i基因籽粒甜玉米种质资源引自美国威斯康辛大学BillTracy，sh2-i基因种质与sh2不同，但都是隐性胚乳突变基因。
步骤(2)中所述的资源种植按大田常规育种进行，在广东1年春秋两季种植。
步骤(3)中所述的杂交、回交、自交培育中间种质材料按常规育种方法进行。
步骤(4)中所述的高通量测序由北京百迈客生物科技有限公司(BiomarkerTech.)按基因测序方法进行。所述的引物由上海英潍捷基生物技术公司(InvitrogenBiotech.)合成；
步骤(5)中所述的提取不同甜玉米种质叶片DNA，以其为模板，进行PCR扩增按常规分子生物学方法进行。
步骤(6)中所述的PCR产物测序由上海英潍捷基生物技术公司(InvitrogenBiotech.)按基因测序方法进行。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：
(1)本发明利用分子技术进行甜玉米sh2-i基因型鉴定，能够有效鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质渗入超甜玉米基因型中。可克服了仅从籽粒外观和形态表现型判别sh2-i基因型或sh2-i基因种质渗入sh2超甜玉米种质的不确定性、盲目性的不足与缺点，准确识别sh2-i基因型。
(2)本发明的方法是一种可早期获得sh2-i甜玉米基因型的高效、准确的育种材料鉴定技术。
附图说明
图1是sh2-i、sh2基因型甜玉米与普通玉米B73在sh2基因区域测序碱基差异图。
图2是实施例1中sh2-i、sh2基因型甜玉米PCR检测电泳图；其中，1，2：Y4(基因型sh2-ish2-i)；3，4：B7(基因型sh2sh2)；5，6：杂合基因型(sh2-ish2)。引物类型：1，3，5：SL3/shiR；2，4，6：SL3/sh2R；M：DL2000Marker。
图3是实施例3中sh2-i、sh2基因型甜玉米PCR检测电泳图；其中，1，2：Y3(基因型sh2-ish2-i)；3，4：Y6(基因型sh2-ish2-i)；5，6：B6(基因型sh2sh2)；7，8：B84(基因型sh2sh2)；9，10，11，12杂合基因型(sh2-ish2)。引物类型：1，3，5，7，9，11：SL3/shiR；2，4，6，8，10，12：SL3/sh2R；M：DL2000Marker。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
sh2-i、sh2基因型甜玉米与普通玉米B73在sh2基因区域测序碱基差异图，如图1所示。
实施例1
本发明提供一种sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法。能够有效鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质渗入超甜玉米sh2基因型中。本发明包括sh2-i种质资源引进、sh2-i、sh2甜玉米自交系种植、选育，杂交、回交、自交等常规育种，sh2-i、sh2甜玉米自交系sh2基因区域高通量测序、根据基因编码特异差异设计PCR扩增特征引物、不同甜玉米种质叶片DNA提取及PCR扩增等。
详细过程如下：
(1)甜玉米种质或自交系准备：B7(基因型sh2sh2)、Y4(基因型sh2-ish2-i)、Z5、Z6(杂合基因型，sh2-ish2)(购自广东省农业科学院作物研究所)；
(2)种植：将步骤(1)中甜玉米材料种植；
(3)DNA提取、PCR扩增：提取不同甜玉米材料叶片DNA，以其为模板，根据不同基因材料在sh2区域基因编码差异区段设计PCR扩增特征引物，其序列如SEQ ID No：1～3所示，进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)中PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带初步进行判断，PCR产物经测序，通过对不同种质材料DNA序列的差异鉴定sh2-i籽粒基因型或sh2-i基因种质是否渗入其他甜玉米基因组中；
步骤(2)中所述的甜玉米种植按常规发芽或大田常规种植。
步骤(3)中所述的提取不同甜玉米种质或自交系叶片DNA，以其为模板，进行PCR扩增按常规分子生物学方法进行。
步骤(4)中所述的PCR产物测序由上海英潍捷基生物技术公司(InvitrogenBiotech.)按基因测序方法进行。
电泳结果如图2所示，结果表明：应用引物SL3/shiR进行PCR扩增，泳道1和5中出现明亮目的条带，说明存在sh2-i基因，泳道3没有扩增出目的条带，说明没有sh2-i基因；而采用引物SL3/sh2R进行PCR扩增，泳道4和6中出现明亮目的条带，说明存在sh2基因，泳道2没有扩增出目的条带，说明没有sh2基因。结果与实际基因型相符。
实施例2
一种甜玉米sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法。详细过程如下：
(1)甜玉米种质或自交系准备：S06(基因型sh2sh2)、Y1(基因型sh2-ish2-i)、Z1、Z2(杂合基因型，sh2-ish2)(购自广东省农业科学院作物研究所)；
(2)种植：将步骤(1)中甜玉米材料种植；
(3)DNA提取、PCR扩增：提取不同甜玉米材料叶片DNA，以其为模板，根据不同基因材料在sh2区域基因编码差异设计PCR扩增特征引物，其序列如SEQ ID No：1～3所示，进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)中PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带初步进行判断，PCR产物经测序，通过对不同种质材料DNA序列的差异鉴定sh2-i籽粒基因型或sh2-i基因种质是否渗入其他甜玉米基因组中；
步骤(2)中所述的甜玉米种植按常规发芽或大田常规种植。
步骤(3)中所述的提取不同甜玉米种质或自交系叶片DNA，以其为模板，进行PCR扩增按常规分子生物学方法进行。
步骤(4)中所述的PCR产物测序由上海英潍捷基生物技术公司(InvitrogenBiotech.)按基因测序方法进行。
实施例3
本发明提供一种sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法。
详细过程如下：
(1)甜玉米种质或自交系准备：B6、B84(基因型sh2sh2)、Y3、Y6(基因型sh2-ish2-i)、Z9，Z10，Z11，Z12杂合基因型(sh2-ish2)(购自广东省农业科学院作物研究所)；
(2)种植：将步骤(1)中甜玉米材料种植；
(3)DNA提取、PCR扩增：提取不同甜玉米材料叶片DNA，以其为模板，根据不同基因材料在sh2区域基因编码差异设计PCR扩增特征引物，其序列如SEQ ID No：1～3所示，进行PCR扩增；
(4)将步骤(3)中PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带初步进行判断，PCR产物经测序，通过对不同种质材料DNA序列的差异鉴定sh2-i籽粒基因型或sh2-i基因种质是否渗入其他甜玉米基因组中；
步骤(2)中所述的甜玉米种植按常规发芽或大田常规种植。
步骤(3)中所述的提取不同甜玉米种质或自交系叶片DNA，以其为模板，进行PCR扩增按常规分子生物学方法进行。
步骤(4)中所述的PCR产物测序由上海英潍捷基生物技术公司(InvitrogenBiotech.)按基因测序方法进行。
电泳结果如图3所示，结果表明：应用引物SL3/shiR进行PCR扩增，泳道1、3、9和11中出现明亮目的条带，说明存在sh2-i基因，泳道5、7中没有扩增出目的条带，说明没有sh2-i基因；而采用引物SL3/sh2R进行PCR扩增，泳道6、8、10、12中出现明亮目的条带，说明存在sh2基因，泳道2、4中没有扩增出目的条带，说明没有sh2基因。结果与实际基因型相符。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院作物研究所
<120> 一种检测sh2-i基因型甜玉米的引物及试剂盒与应用
<130> 1
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SL3
<400> 1
cactgtatgg cggcattgtt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> sh2R
<400> 2
aagttccagc ctccttcctg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> shiR
<400> 3
tccagcctcc ttccgctcc 19
<210> 4
<211> 579
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物SL3/shiR的PCR扩增产物电泳中出现明亮目的条带的序列
<400> 4
cggcattgtt tgattatttc agttcgcacc cgttggacct tgctcattaa aaaagtttat 60
accatggagt ctttgcatgt agttgtgtag taggggaaga gtggcatagg aggaatcaca 120
acttcagcta gcttctctag ccttagggta tttttgtctt tttgcagttc ggtcttttcg 180
cagccctgcg ctgccccccc tgtccgcctg tccctagacc tgttttgcgt cggcggggaa 240
gacagttgac aggaagtaca cgatcttcgt gtccgatgcc gatcttcatg cgagcagcga 300
gccactacgt cgttgcgctg ccagtgtcgg ctatggcatc caggcactcg ttgtgcacgt 360
tgacgatgag ctcgaagccg gtccgggtga acgcgagcag cacggtgagg tcaacgtcgt 420
acatccgcac gtcgatgctg aggccagcca gcagcggcat gacagattgc ggcgtcagga 480
gattgtgcca gtaggtggcg gggctggggg cagaccggca ggcgaggcct atgggcgggc 540
agtgctgtga gttagagcag tgtggcagtg ttggtggta 579
<210> 5
<211> 619
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物SL3/sh2R的PCR扩增产物电泳中出现明亮目的条带的序列
<400> 5
ggcattgttt gattatttca gttcgcaccc gttggacctt gctcattaaa aaagtttata 60
ccatggagtc tttgcatgta gttgtgtagt aggggaagag tggcatagga ggaatcacaa 120
cttcagctag cttctctagc ggtctagcct tagggtattt ttgtcttttt gcagttcggt 180
cttttcgcag ccctgcgctg cccccacctg tccgcctgtc cctagacctg ttttgcgtcg 240
gcggggaaga cagttgacag gaaggacacg atcttcgtgt ccgatgccga tcttcatgcg 300
agcagcgagc cactacgttg cgttgccagt gtcggctatg gcatccaggc actcgttgtg 360
cacgttgacg atgagctcga agccggtccg ggtgaacgcg agcagcacgg tgaggtcaac 420
gtcgtacatc cgcacgtcga tgctgaggcc agccagcagc ggcatgacag attgcggcgt 480
caggagattg tgccagtagg tggcggggct gggggcagac cggcaggcga ggcctatggg 540
cgggcagtgc tgtgagttag agcagtgtgg cagtgttggt ggtagtggtg acacccttcg 600
ggagcggaaa agagaagag 619

Claims (9)

1.一种检测sh2-i基因型甜玉米的引物，其特征在于该引物的序列如下：
SL3：5′-CACTGTATGGCGGCATTGTT-3′；
sh2R：5′-AAGTTCCAGCCTCCTTCCTG-3′；
shiR：5′-TCCAGCCTCCTTCCGCTCC-3′。
2.一种检测sh2-i基因型甜玉米的试剂盒，其特征在于包括权利要求1所示的引物。
3.权利要求1所述的检测sh2-i基因型甜玉米的引物在鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质渗入超甜玉米基因型中的应用。
4.权利要求2所述的检测sh2-i基因型甜玉米的试剂盒在鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质渗入超甜玉米基因型中的应用。
5.一种sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)引进携带sh2-i基因籽粒甜玉米种质资源；
(2)资源种植、自交、筛选鉴定：将引进的携带sh2-i基因籽粒甜玉米种质在田间种植，连续经历5季5轮以上选株自交，穗选、粒选、田间株选，获得性状一致的自交系；
(3)分别种植sh2-i、sh2甜玉米自交系，通过杂交、回交、自交培育sh2sh2-i种质材料；
(4)将sh2-i、sh2甜玉米自交系sh2基因区域进行高通量测序，比较不同基因材料在sh2区域基因组差异，根据基因编码特异差异设计PCR扩增特征引物；其序列如权利要求1所示；
(5)提取不同甜玉米种质叶片DNA，以其为模板，进行PCR扩增；
(6)将步骤(5)中PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳条带差异进行判断，或PCR产物经测序，通过对不同种质材料DNA序列的差异鉴定sh2-i基因型或sh2-i基因种质是否渗入sh2超甜玉米中。
6.根据权利要求5所述的sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法，其特征在于：采用引物SL3/shiR的PCR扩增产物电泳中出现明亮目的条带，则为基因型sh2-ish2-i或杂合基因型sh2-ish2；该目的条带的长度是579bp，碱基序列如SEQ ID No：4所示；
采用引物SL3/sh2R的PCR扩增产物电泳中出现明亮目的条带，则为基因型sh2sh2或杂合基因型sh2-ish2；该目的条带的长度是619bp，碱基序列如SEQ ID No：5所示；
采用引物SL3/shiR或SL3/sh2R的PCR扩增产物电泳中均出现明亮目的条带，则为杂合基因型sh2-ish2。
7.根据权利要求5所述的sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的资源种植按大田常规育种进行，在广东1年春秋两季种植。
8.根据权利要求5所述的sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法，其特征在于：步骤(3)中所述的杂交、回交、自交培育中间种质材料按常规育种方法进行。
9.根据权利要求5所述的sh2-i基因型甜玉米分子技术鉴定的方法，其特征在于：
步骤(5)中所述的提取不同甜玉米种质叶片DNA，以其为模板，进行PCR扩增按常规分子生物学方法进行。
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