CN106867969B - 一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法，包括步骤：A、利用DNA重组技术将细胞永生化基因插入第一克隆载体的克隆位点中并制成病毒颗粒；B、利用磁珠特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，再利用步骤A中所制得的病毒颗粒感染，得永生化免疫细胞；C、利用DNA重组技术将自杀基因插入第二克隆载体中，然后转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；D、利用DNA重组技术将单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点中并制成病毒颗粒，再转染条件自杀性免疫细胞，得条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。解决了现有技术中肿瘤细胞靶向治疗副作用大、无法广泛临床应用、体内存活时间短、成本较高、可控性差的问题。
Description
技术领域
本发明涉及免疫细胞领域，尤其涉及一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法。
背景技术
免疫细胞对肿瘤细胞具有免疫监视和杀伤作用，尤其是携带有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体（ScFV）的免疫细胞能高效特异性的识别、结合以及杀死相关的肿瘤细胞。比如，携带有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体T淋巴细胞技术（CAR-T）在治疗急性淋巴细胞白血病以及淋巴瘤中，肿瘤患者的缓解率高达80%以上。然而，传统的CAR-T细胞技术具有潜在的细胞因子风暴等副作用，该副作用若不能有效控制，造成肿瘤患者死亡的概率在5-10%；另一方面，常规的CAR-T细胞技术需个性化制备每个患者的CAR-T细胞，更是限制了CAR-T技术不能真正广泛临床应用。而最近兴起的带有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体NK细胞技术（CAR-NK），虽然细胞因子风暴的概率大大降低，但其在体内存活时间短，需要多次注射，这样不仅大大提高治疗成本，可控性也较差。
因此，现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞及其制备方法，旨在解决现有技术中肿瘤细胞靶向治疗副作用大、无法广泛临床应用、体内存活时间短、成本较高、可控性差的问题。
本发明的技术方案如下：
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，包括步骤：
A、利用DNA重组技术将细胞永生化基因插入第一克隆载体的克隆位点，并通过病毒包装系统将第一克隆载体包装成病毒颗粒；
B、利用磁珠富集法特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，然后利用含胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，得到扩大培养后的免疫细胞，再利用步骤A中所制得的病毒颗粒感染并进行传代培养，即得永生化免疫细胞；
C、利用DNA重组技术将自杀基因插入第二克隆载体中，构建自杀基因的克隆载体，然后将所述自杀基因的克隆载体转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；
D、利用DNA重组技术将肿瘤抗原基因对应的单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点，然后利用病毒包装系统构建含有单链抗体基因的病毒颗粒，并利用所述含有单链抗体基因的病毒颗粒转染条件自杀性免疫细胞，即得到条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述细胞永生化基因为SV40大T抗原永生化基因、端粒逆转录酶基因中的一种或多种。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述自杀基因为单纯孢疹病毒胸腺嘧啶激酶基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因、人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶基因中的一种或多种。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述单链抗体基因为CD19单链抗体基因、CD20单链抗体基因、CD30单链抗体基因、CD33单链抗体基因、CD38单链抗体基因、EGFRvIII单链抗体基因、ERBB单链抗体基因、FAP单链抗体基因 、GD-2单链抗体基因、HER2单链抗体基因、MESOTHELIN单链抗体基因、PSMA单链抗体基因、WT1单链抗体基因、NY-ESO-1单链抗体基因、MART-1单链抗体基因、PD1单链抗体基因中的一种或多种。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述第一克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第二克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第三克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第一克隆载体和第三克隆载体带有不同的荧光标记基因。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述第一克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，所述第二克隆载体为附加体载体pCEP4，所述第三克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-TdTomato。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述一种免疫细胞为T细胞或NK细胞；
当从人外周血中选择T细胞时，所述步骤B具体为：
采集人外周血，以Ficol法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理，取磁珠吸附的细胞即为富集后的T细胞，富集后的T细胞用添加有15~25 U/mL白介素2、50-100 U/mL抗CD3抗体、50-100 U/mL抗CD28抗体、5%~15% 胎牛血清的DMEM培养基进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤A所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到永生化T细胞；
当从人外周血中选择NK细胞时，所述步骤B具体为：
采集人外周血，以Ficol法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行磁珠负选处理，得CD3-细胞，再通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3-细胞中CD56+的细胞，获得的CD56+CD3-细胞即为NK细胞，富集后的NK细胞用添加有15~25U/mL白介素2、5%~15%胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤A所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到永生化NK细胞。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述步骤C具体为：
选择附加体载体pCEP4，采用DNA重组技术将TK基因插入到pCEP4多克隆位点之间，构建TK的附加体表达载体pCEP4-TK，以电穿孔的方式将pCEP4-TK转入步骤B中所制备的永生化免疫细胞，得到携带有附加体pCEP4-TK的永生化免疫细胞，然后利用添加有潮霉素的培养基选择潮霉素抗性的细胞，即为条件自杀性免疫细胞。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其中，所述通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理的具体过程为：利用带有抗CD3抗体且直径为45~55nm的磁珠，在磁珠与单核细胞的比例为12:1~20:1、温度3~5℃下处理所述单核细胞3~5h，然后以900~1100 RPM离心4~6mins，取沉淀；
所述用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行负选处理的具体过程为：利用带有抗CD3抗体且直径为45~55 nm的磁珠，在磁珠与人外周血中细胞的比例为12:1~20:1、温度3~5℃下处理1.5~2.5h，然后以900~1100 RPM离心4~6mins，取离心液；
通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3-细胞中CD56+的细胞的具体过程为：利用带有抗CD56抗体且直径为45~55 nm的磁珠，在磁珠与CD3-细胞的比例为12:1~20:1、温度4℃下处理3~5h，然后900~1100 RPM离心4~6mins，取沉淀。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞，其中，采用上述任一方法制备而成。
有益效果：本发明通过病毒载体将携带有SV40大T抗原永生化基因或端粒逆转录酶基因，将T细胞或NK细胞做成可以永久传代的永生化免疫细胞，然后利用克隆载体的方法将携带有药物诱导性自杀基因、以及有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体同时整合到以上制备的永生化免疫细胞上，如此制备的免疫细胞在体内的存活时间可以通过药物严格控制及清除，避免了导入的用于治疗的外源性免疫细胞长期存在所带来的潜在副作用，解决了现有技术中肿瘤细胞靶向治疗副作用大、无法广泛临床应用、体内存活时间短、成本较高、可控性差的问题。
附图说明
图1为本发明条件自杀性免疫细胞制备方法较佳实施例的流程图。
具体实施方式
本发明提供一种条件自杀性免疫细胞及其制备方法和应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，如图1所示，包括以下步骤：
S1、利用DNA重组技术将细胞永生化基因插入第一克隆载体的克隆位点，并通过病毒包装系统将第一克隆载体包装成病毒颗粒；
S2、利用磁珠富集法特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，然后利用含胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，得到扩大培养后的免疫细胞，再利用步骤S1中所制得的病毒颗粒感染并进行传代培养，即得永生化免疫细胞；
S3、利用DNA重组技术将自杀基因插入第二克隆载体中，构建自杀基因的克隆载体，然后将所述自杀基因的克隆载体转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；
S4、利用DNA重组技术将肿瘤抗原基因对应的单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点，然后利用病毒包装系统构建含有所述单链抗体基因的病毒颗粒，并利用所述含有单链抗体基因的病毒颗粒转染条件自杀性免疫细胞，即得到条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。
本发明中，通过DNA重组手段将细胞永生化基因（如SV40大T抗原永生化基因、端粒逆转录酶基因中的一种或多种）插入到第一克隆载体，制备带有细胞永生化基因的克隆载体，然后将该带有细胞永生化基因的克隆载体包装成滴度不低于107/mL病毒颗粒，再转染免疫细胞，即可以将细胞永生化基因转入免疫细胞中，使免疫细胞成为可无限传代的永生化免疫细胞。
所述第一克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第二克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第三克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第一克隆载体和第三克隆载体带有不同的荧光标记基因，以便于通过荧光标记检测带有永生化基因的病毒颗粒是否成功侵染进入了免疫细胞中，以及通过另一种荧光标记检测带有单链抗体基因的病毒颗粒是否成功侵染进入了条件自杀性免疫细胞，并且避免二者之间的干扰。
较佳地，本发明采用所述第一克隆载体为Clontech公司的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，该载体携带不仅含有多克隆位点，而且还带绿色荧光标记基因ZsGreen，方便通过流式分选的方式筛选出永生化的免疫细胞；所述第二克隆载体为Clontech公司的附加体载体pCEP4，其表达产物可通过催化丙氧鸟苷（GCV）磷酸化，产生araAMP,araAMP进一步磷酸化形成具有细胞毒性的araATP，从而杀死外源治疗性的永生化免疫细胞；所述第三克隆载体为Clontech公司的慢病毒载体pLVX-IRES-TdTomato，带有红色荧光标记基因，方便通过流式分选的方式筛选出成功转染上单链抗体的自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞，以及计算其自杀效率。
本发明中，所述一种免疫细胞为T细胞或NK细胞；
当从人外周血中选择T细胞时，所述步骤S2具体为：
采集人外周血，以Ficoll法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理，取磁珠吸附的细胞即为富集后的T细胞，富集后的T细胞用添加有15~25 U/mL白介素2、50-100 U/mL抗CD3抗体、50-100 U/mL抗CD28抗体、5%~15% 胎牛血清的DMEM培养基进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤S1所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到一种永生化的免疫细胞，即为永生化T细胞；
当从人外周血中选择NK细胞时，所述步骤S2具体为：
采集人外周血，以Ficoll法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行负选处理，去除其中的带有CD3抗原的细胞，得到CD3-细胞，再通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3-细胞中带有CD56表面抗原的细胞，记为CD56+的细胞，获得的表面带有CD56抗原且不带有CD3表面抗原的CD56+CD3-细胞，即为NK细胞，富集后的NK细胞用添加有15~25U/mL白介素2、5%~15%胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤S1所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到另一种永生化的免疫细胞，即为永生化NK细胞。
更具体的，所述通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理的具体过程为：利用带有抗CD3抗体且直径为45~55nm的磁珠，在磁珠与单核细胞的比例为12:1~20:1、温度3~5℃下处理所述单核细胞3~5h，然后以900~1100 RPM离心4~6mins，取沉淀；
所述用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行负选处理的具体过程为：利用带有抗CD3抗体且直径为45~55 nm的磁珠，在磁珠与人外周血中细胞的比例为12:1~20:1、温度3~5℃下处理1.5~2.5h，然后以900~1100 RPM离心4~6mins，取离心液；
通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3-细胞中CD56+的细胞的具体过程为：利用带有抗CD56抗体且直径为45~55 nm的磁珠，在磁珠与CD3-细胞的比例为12:1~20:1、温度4℃下处理3~5h，然后900~1100 RPM离心4~6mins，取沉淀。
所述步骤S3中，因为获得永生化的免疫细胞理论上可无限传代，要实现对其可控，则必须为永生化的免疫细胞加入自杀基因，具体是利用DNA重组技术将自杀基因插入第二克隆载体中，构建自杀基因的克隆载体，然后将所述自杀基因的克隆载体转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞。较佳地，所述自杀基因为单纯孢疹病毒胸腺嘧啶激酶基因、大肠杆菌胞嘧啶脱氨基酶基因、人胸腺嘧啶核苷磷酸化酶基因中的一种或多种，相应的，在条件自杀性免疫细胞把肿瘤细胞杀死之后，通过往受体中对应注射丙氧鸟苷（GCV）、5-氟胞嘧啶（5-FC）、5-脱氧-5-尿嘧啶核苷（5-FuDR），即可激发自杀机制，完成对条件自杀性免疫细胞的清除，达到可控效果。
进一步，所述步骤S3具体为：
选择附加体载体pCEP4，采用DNA重组技术将TK基因插入到pCEP4多克隆位点之间，构建TK的附加体表达载体pCEP4-TK，以电穿孔的方式将pCEP4-TK转入步骤S2中所制备的永生化免疫细胞，得到携带有附加体pCEP4-TK的永生化免疫细胞，然后利用添加有潮霉素的培养基选择潮霉素抗性的细胞，得到携带有附加体pCEP4-TK的阳性细胞，即为条件自杀性免疫细胞。
要使得步骤S3中所制备的条件自杀性免疫细胞能够针对性地杀死肿瘤细胞，即使得条件自杀性免疫细胞具有特异性识别肿瘤细胞的能力，则还需为条件自杀性免疫细胞加入肿瘤抗原基因对应的单链抗体基因，例如，利用DNA重组技术将CD19单链抗体基因、CD20单链抗体基因、CD30单链抗体基因、CD33单链抗体基因、CD38单链抗体基因、EGFRvIII单链抗体基因、ERBB单链抗体基因、FAP单链抗体基因 、GD-2单链抗体基因、HER2单链抗体基因、MESOTHELIN单链抗体基因、PSMA单链抗体基因、WT1单链抗体基因、NY-ESO-1单链抗体基因、MART-1单链抗体基因、PD1单链抗体基因中的一种或多种基因插入第三克隆载体的克隆位点，然后利用病毒包装系统构建含有所述单链抗体基因的病毒颗粒，其滴度不低于107/mL，并利用所述含有单链抗体基因的慢病毒颗粒转染条件自杀性免疫细胞，即得到条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。
基于上述方法，本发明还提供了一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞，采用上述方法制备而成。
本发明所制备的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞可用于白血病、肺癌、乳腺癌、肝癌、直肠癌、卵巢癌、宫颈癌以及前例腺癌等的治疗。
下面通过实施例对本发明作进一步说明：
实施例 1
慢病毒颗粒的制备
首先选用Clontech的慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，该载体携带不仅含有多克隆位点，而且还带绿色荧光标记基因ZsGreen, 用DNA重组手段将SV40LT基因克隆到载体基因中BamHI与EcoRI位点之间，获得能包装成慢病毒颗粒的质粒pLVX-SV40LT-ZsGreen，用慢病毒包装系统将所述质粒pLVX-SV40LT-ZsGreen质粒包装成滴度不低于107/ml 的慢病毒颗粒。
实施例 2
永生化T细胞的制备
采集10mL人外周血，以Ficoll法获得的人外周血中的单核细胞（PMBC），具体操作如下：
将10mL全血转入50mL离心管中，加入10mL PBS溶液稀释，轻轻混匀；取两支15mL离心管，先加入5mL 9% Ficoll溶液，然后分别将10mL稀释的血液轻轻加到两支离心管的Ficoll上层，避免两种溶液混合在一起， 2000rpm离心20min，出现白色分层的细胞，然后用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15mL离心管中，并加入PBS至15mL，1500rpm离心10min后去掉上清，再加入含10% FBS、1% P/S的RPMI1640培养基至15mL，1500rpm离心10min后去掉上清，再加入10mL含10% FBS、1% P/S的RPMI1640培养基重悬细胞，即获得单核细胞（PMBC）。
然后，利用带有抗CD3抗体且直径为50nm的磁珠，在磁珠与单核细胞的比例为16:1、温度4℃下处理所述单核细胞4h，然后以1000 RPM离心5mins，丢弃未被磁珠吸附的细胞，得到富集后的T细胞，富集后的T细胞用添加有20 U/ml白介素2（IL2）、50 U/ml抗CD3抗体、50 U抗CD28抗体、10% 胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，再利用实施例1中包装好的慢病毒感染富集的T细胞，持续传20代以上之后再以流式分选其中的ZsGreen 阳性细胞，即得到永生化T细胞。经检验，细胞的CD3阳性率以及ZsGreen 阳性率接近100%。
实施例 3
永生化NK细胞的制备
首先，采集10mL人外周血，以Ficoll法获得的人外周血中的单核细胞（PMBC），具体操作如下：
将10mL全血转入50mL离心管中，加入10mL PBS溶液稀释，轻轻混匀；取两支15mL离心管，先加入5mL 9% Ficoll溶液，然后分别将10mL稀释的血液轻轻加到两支离心管的Ficoll上层，避免两种溶液混合在一起， 2000rpm离心20min，出现白色分层的细胞，然后用吸管将该层细胞吸取在另一干净的15mL离心管中，并加入PBS至15mL，1500rpm离心10min后去掉上清，再加入含10% FBS、1% P/S的RPMI1640培养基至15mL，1500rpm离心10min后去掉上清，再加入10mL含10% FBS、1% P/S的RPMI1640培养基重悬细胞，即获得单核细胞（PMBC）。
然后，用带抗CD3且直径为50nm抗体的磁珠，在磁珠与单核细胞的比例为16:1、温度4℃下处理所述单核细胞2h，然后以1000RPM离心5mins，丢弃被磁珠吸附的细胞，从而去除其中的带有CD3抗原的细胞，得到CD3-细胞，再通过携带有抗CD56抗体且直径为50 nm的磁珠，在磁珠与CD3-细胞的比例为16:1、温度4℃下处理4h，然后1000 RPM离心5mins，以富集CD3-细胞中带有CD56表面抗原的细胞，记为CD56+的细胞，获得的表面带有CD56抗原且不带有CD3表面抗原的CD56+CD3-细胞，即为NK细胞，富集后的NK细胞用添加有20U/mL白介素2、10%胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤S1所制备的慢病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，以流式分选其中的ZsGreen 阳性细胞，即得到永生化NK细胞。经检验，细胞的CD56阳性率以及ZsGreen 阳性率接近100%。
实施例 4
自杀性免疫T细胞的制备
采用DNA重组技术将TK基因克隆到pCEP4的HindIII和BamHI位点之间，构建TK的附加体表达载体（pCEP4-TK），构建的附加体载体pCEP4-TK，以电穿孔或其他转染方法转化实施例2所建立的永生化T细胞，具体电转的方法如下：1）将细胞培养至对数生长期，4℃下650g 离心5mins，收集细胞；2）将细胞沉淀用冰预冷，然后用电穿孔缓冲液悬浮洗涤，继续4℃下650g 离心5mins，收集细胞；3）将细胞以107/mL密度重新悬浮于0℃的电穿孔缓冲液中，得细胞悬液，并转移到0℃预冷的电穿孔所用的电击池中，每池移入0.5 mL 细胞悬液；4）按每电击池10g DNA的量将附加体pCEP4-TK DNA将加入到细胞悬液中，晃动混合后于冰上放置5mins；5）将电击池放入电穿孔装置的架上，电容1050 F、电压200 V，电击1次后，将电击池冰上放置10mins；6）将细胞悬浮液转移到相应的T细胞培养基中培养48小时后，再将细胞转移到添加有100g/mL潮霉素的相应培养基进行选择潮霉素抗性的细胞，即为携带有附加体pCEP4-TK的自杀性免疫T细胞。
实施例 5
自杀性免疫NK细胞的制备
采用DNA重组技术将TK基因克隆到pCEP4的HindIII和BamHI位点之间，构建TK的附加体表达载体（pCEP4-TK），构建的附加体载体pCEP4-TK，以电穿孔或其他转染方法转化实施例3所建立的永生化NK细胞，具体电转的方法如下：1）将细胞培养至对数生长期，4℃下650g 离心5mins，收集细胞；2）将细胞沉淀用冰预冷，然后用电穿孔缓冲液悬浮洗涤，继续4℃下650g 离心5mins，收集细胞；3）将细胞以107/mL密度重新悬浮于0℃的电穿孔缓冲液中，得细胞悬液，并转移到0℃预冷的电穿孔所用的电击池中，每池移入0.5 mL 细胞悬液；4）按每电击池10g DNA的量将附加体pCEP4-TK DNA将加入到细胞悬液中，晃动混合后于冰上放置5mins；5）将电击池放入电穿孔装置的架上，电容为1050 F、电压350 V，电击2次后，将电击池冰上放置10mins；6） 将细胞悬浮液转移到相应的T细胞培养基中培养48小时后，再将细胞转移到添加有100g/mL潮霉素的相应培养基进行选择潮霉素抗性的细胞，即为携带有附加体pCEP4-TK的自杀性免疫NK细胞。
实施例 6
条件自杀性抗肿瘤靶向T细胞的制备
利用基因重组技术将CD19单链抗体基因插入Clontech公司的慢病毒载体pLVX-IRES-TdTomato的BamHI与EcoRI位点之间，以获得pLVX-ScFv-TdTomato慢病毒载体，构建的慢病毒载体用慢病毒包装系统包装成滴度不低于107/ml 的慢病毒颗粒，然后利用该慢病毒颗粒感染实施例4中所制备的自杀性免疫T细胞，得到条件自杀性抗肿瘤靶向T细胞。通过给小鼠静脉注射105条件自杀性抗肿瘤靶向T细胞，72小时观察小鼠体内肿瘤细胞数量，随后以丙氧鸟苷（GCV）诱导48小时以启动外源治疗性免疫细胞的自杀机制，并通过检测携带红色荧光的细胞个数确定条件自杀性抗肿瘤靶向T细胞的自杀效率。检测结果表明，条件自杀性抗肿瘤靶向T细胞的对肿瘤细胞的清除率为98%，以丙氧鸟苷（GCV）处理之后，条件自杀性抗肿瘤靶向T细胞的自杀效率为95%。
实施例 7
条件自杀性抗肿瘤靶向NK细胞的制备
利用基因重组技术将CD19单链抗体基因插入Clontech公司的慢病毒载体pLVX-IRES-TdTomato的BamHI与EcoRI位点之间，获得pLVX-ScFv-TdTomato慢病毒载体，构建的慢病毒载体用慢病毒包装系统包装成滴度不低于107/ml 的慢病毒颗粒，然后利用该慢病毒颗粒感染实施例5中所制备的自杀性免疫NK细胞，得到条件自杀性抗肿瘤靶向NK细胞。通过给小鼠静脉注射105自杀性抗肿瘤靶向NK细胞，72小时观察小鼠体内肿瘤细胞数量，随后以丙氧鸟苷（GCV）诱导48小时以启动条件自杀性抗肿瘤靶向NK细胞的自杀机制，并通过检测携带红色荧光的细胞个数确定条件自杀性抗肿瘤靶向NK细胞的自杀效率。检测结果表明，条件自杀性抗肿瘤靶向NK细胞对肿瘤细胞清除率为99%，以丙氧鸟苷（GCV）处理之后，T永生化治疗性T细胞的自杀效率为96%。
综上所述，本发明通过病毒载体将携带有SV40大T抗原永生化基因或端粒逆转录酶基因，将T细胞或NK细胞做成可以永久传代的永生化免疫细胞，然后用克隆载体将携带有药物诱导性自杀基因、以及有肿瘤特异性抗原递呈的单链抗体同时整合到以上制备的永生化免疫细胞上，如此制备的免疫细胞在体内的存活时间可以通过药物严格控制及清除，避免了导入的用于治疗的外源性免疫细胞长期存在所带来的潜在副作用，解决了现有技术中肿瘤细胞靶向治疗副作用大、无法广泛临床应用、体内存活时间短、成本较高、可控性差的问题。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，包括步骤：
A、利用DNA重组技术将细胞永生化基因SV40LT插入第一克隆载体的克隆位点，并通过病毒包装系统将第一克隆载体包装成病毒颗粒；
B、利用磁珠富集法特异性选择人外周血中的一种免疫细胞，然后利用含胎牛血清的DMEM培养基进一步培养，得到扩大培养后的免疫细胞，再利用步骤A中所制得的病毒颗粒感染并进行传代培养，即得永生化免疫细胞；
C、利用DNA重组技术将自杀基因TK基因插入第二克隆载体中，构建自杀基因TK基因的克隆载体，然后将所述自杀基因TK基因的克隆载体转入所制得的永生化免疫细胞，即制得条件自杀性免疫细胞；
D、利用DNA重组技术将肿瘤抗原基因对应的CD19单链抗体基因插入第三克隆载体的克隆位点，然后利用病毒包装系统构建含有CD19单链抗体基因的病毒颗粒，并利用所述含有CD19单链抗体基因的病毒颗粒转染条件自杀性免疫细胞，即得到条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞。
2.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第一克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第二克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第三克隆载体为慢病毒载体、附加体、腺病毒载体中的一种，所述第一克隆载体和第三克隆载体带有不同的荧光标记基因。
3.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述第一克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreen1，所述第二克隆载体为附加体载体pCEP4，所述第三克隆载体为慢病毒载体pLVX-IRES-TdTomato。
4.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述一种免疫细胞为T细胞或NK细胞；
当从人外周血中选择T细胞时，所述步骤B具体为：
采集人外周血，以Ficol法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理，取磁珠吸附的细胞即为富集后的T细胞，富集后的T细胞用添加有15～25U/mL白介素2、50-100U/mL抗CD3抗体、50-100U/mL抗CD28抗体、5％～15％胎牛血清的DMEM培养基进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤A所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到永生化T细胞；
当从人外周血中选择NK细胞时，所述步骤B具体为：
采集人外周血，以Ficol法处理所采集的人外周血，获得单核细胞，然后用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行负选处理，得CD3-细胞，再通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3-细胞中CD56+的细胞，获得的CD56+CD3-细胞即为NK细胞，富集后的NK细胞用添加有15～25U/mL白介素2、5％～15％胎牛血清的DMEM培养基中进一步培养，等细胞数量扩增到106以上，以步骤A所制备的病毒颗粒进行感染，再传代培养20代以上，即得到永生化NK细胞。
5.根据权利要求1所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述步骤C具体为：
选择附加体载体pCEP4，采用DNA重组技术将TK基因插入到pCEP4多克隆位点之间，构建TK的附加体表达载体pCEP4-TK，以电穿孔的方式将pCEP4-TK转入步骤B中所制备的永生化免疫细胞，得到携带有附加体pCEP4-TK的永生化免疫细胞，然后利用添加有潮霉素的培养基选择潮霉素抗性的细胞，即为条件自杀性免疫细胞。
6.根据权利要求4所述的条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞的制备方法，其特征在于，所述通过携带有抗CD3抗体的磁珠对所述单核细胞进行富集处理的具体过程为：利用带有抗CD3抗体且直径为45～55nm的磁珠，在磁珠与单核细胞的比例为12:1～20:1、温度3～5℃下处理所述单核细胞3～5h，然后以900～1100RPM离心4～6mins，取沉淀；
所述用带抗CD3抗体的磁珠对人外周血进行负选处理的具体过程为：利用带有抗CD3抗体且直径为45～55nm的磁珠，在磁珠与人外周血中细胞的比例为12:1～20:1、温度3～5℃下处理1.5～2.5h，然后以900～1100RPM离心4～6mins，取离心液；
通过携带有抗CD56抗体的磁珠富集CD3-细胞中CD56+的细胞的具体过程为：利用带有抗CD56抗体且直径为45～55nm的磁珠，在磁珠与CD3-细胞的比例为12:1～20:1、温度4℃下处理3～5h，然后900～1100RPM离心4～6mins，取沉淀。
7.一种条件自杀性抗肿瘤靶向免疫细胞，其特征在于，采用权利要求1～6任一方法制备而成。
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