CN106858061A - 一种用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物及其在饲料添加剂中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物及其在饲料添加剂中的应用。本发明天然产物组合物主要由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成，所述忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制过程中二者之间加入量的质量比例为1～8：1；或者本发明天然产物组合物是由忍冬叶和连翘叶按照3～12:1的质量比混合后，对所得混合物进行提取所得。本发明的植物活性成分组组合物具有作用效果明显，无毒、副作用，无残留，耐药性等特点，应用于畜禽养殖中可促进动物生长，在饲料添加剂或兽用药物上的应用前景广阔。
Description
一、技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组组成的天然产物组合物及其在饲料添加剂中的应用。
二、背景技术：
目前，抗生素滥用导致的环境污染问题尤为突出。由于抗生素等饲料添加剂在畜禽中的滥用，导致各种动物性食品如肉类、奶制品抗生素超标和环境污染，对人体器官产生危害，还可能有耐药细菌群产生。国家农业部已明令禁止使用西药抗病毒成分用于畜牧业。相对于抗生素类药物而言，植物药具有耐药性低、副作用小和不良反应少等优点。因此，从传统的植物药中寻找有效而不产生副作用的药物已经成为研究的热点。
忍冬为忍冬科忍冬属(Lonicera)植物，金银花(忍冬的花)和忍冬藤(忍冬的干燥茎枝)是临床常用中药。宋代及宋代以前多用忍冬的藤、叶入药。到了明代，对花的应用越来越重视，并逐渐发展至茎叶花并用阶段。李时珍《本草纲目》云：“忍冬茎叶及花功用皆同。昔人称其为治风、除胀、解痢为要药，后世称其消肿、散毒、治疮为要药。”。其中所引的附方也是茎叶花均入药。明代以后，对金银花的效用认识更加全面，并尤其强调用花，如[清]汪昂《本草各要》中记载：“散热、补虚、疗风、养血止渴，花叶同效，花香为佳。”。普遍研究认为忍冬中绿原酸含量：花≥叶＞茎，黄酮含量：叶≥花＞茎。并且忍冬叶中的化学成分种类较多，且和金银花的化学成分类似，大部分为以绿原酸为代表的酚酸类和黄酮类，国内外关于忍冬叶药用报道多是用于抗新城疫病毒活性、抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性、治疗艾滋病毒、治疗腹泻、肠炎等方面，说明忍冬叶和金银花功效近似。
忍冬叶为金银花和忍冬藤的副产物，忍冬叶产量是金银花的10倍左右，却一直被视为非药用部位而长期未得到充分利用，造成了资源的浪费。
连翘属连翘木犀科植物，是我国传统中药。连翘叶是连翘采摘后的废弃物，自从报道过叶子中的有效成分连翘苷和连翘酯苷A的含量高于连翘果后，连翘叶的各种药理活性也逐渐被发现，即具有抑菌、抗病毒、抗氧化、保肝等活性。
三、发明内容：
本发明要解决的技术问题是：根据现有技术中寻找能代替抗生素天然产物资源的需求，并考虑充分利用忍冬叶和连翘叶这两种废弃物资源，由此本发明提供一种忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组组成的天然产物组合物及其在饲料添加剂中的用途。本发明将忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组按照一定比例进行复配形成的组合物具有协同抑菌、抗氧化活性等特点。
为了解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是：
本发明提供一种用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，所述天然产物组合物主要由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成；
所述忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制过程中二者之间加入量的质量比例为1～8：1。
根据上述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，所述忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制过程中二者之间加入量的质量比例为4～8：1。
根据上述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的10～20倍，然后加热至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；提取后所得提取液进行过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取上清液，浓缩到无醇味，然后采用浓盐酸、硫酸或磷酸调节所得溶液的pH值为1～5，调节pH值过程中控制溶液温度为20～40℃；将调节后所得溶液上大孔树脂柱(采用D101大孔树脂或HP-20大孔树脂)，采用水进行洗脱，洗至洗脱液为中性，接着采用质量百分浓度为30～80％的乙醇进行洗脱，所得30～80％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩(低温减压浓缩时温度为50～60℃，压力为-0.09～-0.1MPa)，浓缩至相对密度为1.0～1.1(50℃条件下)，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，即得忍冬叶活性成分组。
根据上述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的10～20倍，然后加热至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.1～1.2，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用有机溶剂进行萃取3～4次(所述有机溶剂为乙酸乙酯或正丁醇)，萃取后所得萃取液进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为50～60℃，压力为-0.09～-0.1MPa)和真空干燥(真空度为-0.09～-0.1MPa，温度为50～55℃)，干燥后物料的含水率为3～5％，得到忍冬叶活性成分组。
根据上述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的10～20倍，然后加热至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.1～1.2，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用有机溶剂进行萃取3～4次(所述有机溶剂为乙酸乙酯或正丁醇)，萃取后所得萃取液进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为50～60℃，压力为-0.09～-0.1MPa)和真空干燥(真空度为-0.09～-0.1MPa，温度为50～55℃)，干燥后物料的含水率为3～5％，得到连翘叶活性成分组。
根据上述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的10～20倍，然后加热至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至原料连翘叶的4～8倍，所得浓缩液上聚酰胺柱，首先采用水进行洗脱，洗至洗脱液无颜色，再用质量百分浓度为30～80％的乙醇洗脱，所得30～80％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩(减压浓缩过程控制温度为50～60℃，压力为-0.09～-0.1MPa)，浓缩至相对密度为1.0～1.1(50℃条件下)，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，得到连翘叶活性成分组。
另外，提供一种用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，所述天然产物组合物是由忍冬叶和连翘叶按照3～12:1的质量比混合后，对所得混合物进行提取所得。
根据上述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，对所得混合物进行提取的方法为：
首先将忍冬叶与连翘叶按照上述的质量比进行混合，混合后加入水，水的加入体积量为总原料质量的10～20倍，然后加热升温，升温至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；提取后所得提取液进行过滤，所得溶液浓缩至相对密度为1.1～1.2；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取上清液减压浓缩至相对密度为1.0～1.1(50℃条件下)，所得产品进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，得到忍冬叶和连翘叶混合提取的组合物。
根据上述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，对所得混合物进行提取的方法为：
首先将忍冬叶与连翘叶按照上述的质量比进行混合，混合后加入水，水的加入体积量为总原料质量的10～20倍，然后加热升温，升温至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；提取后所得提取液进行过滤，所得溶液浓缩至相对密度为1.1～1.2；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用有机溶剂萃取3～4次(所述有机溶剂为乙酸乙酯或正丁醇)，萃取后所得萃取液依次进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为50～60℃，压力为-0.09～-0.1MPa)和真空干燥(真空度为-0.09～-0.1MPa，温度为50～55℃)，干燥后物料的含水率为3～5％，得到忍冬叶和连翘叶混合提取的组合物。
一种上述用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物在饲料添加剂中的应用。该组合物作为饲料添加剂在提高畜禽生产性能、抗氧化功能等方面有明显的效果。
本发明的积极有益效果：
1、本发明利用忍冬叶和连翘叶两种废弃物资源，将其采用水提取方法进行提取，得到两种活性成分组，进而将两种活性成分组按照一定比例进行复配得到组合物；或者将忍冬叶和连翘叶按照一定比例混合、提取和纯化得到组合物。本发明组合物具有协同抑菌、协同抗氧化活性等特点。
2、本发明所用原料为金银花和连翘加工废弃物，资源丰富，价格便宜，所采用提取溶剂均为水，仅在醇沉和上树脂柱时用少量的乙醇，成本低，易控制，比较节能环保，适宜大规模生产。
3、本发明的植物活性成分组组合物具有作用效果明显，无毒、副作用，无残留，耐药性等特点，应用于畜禽养殖中可促进动物生长，在饲料添加剂或兽用药物上的应用前景广阔。
4、本发明的各活性成分组在通过水提醇沉后上树脂柱或用有机溶剂萃取等方法纯化后，有效成分含量高，易于进行质量控制，保证产品效果的稳定性。
5、本发明技术方案中采用的忍冬叶和连翘叶中含有大量的微量元素、多糖类、蛋白质等，口感好，水溶性强，其相应的活性成分组均保留了这些特点，畜禽类喜欢采用，适宜于做成畜禽饲料添加剂。
6、本发明组合物作为饲料添加剂在畜禽养殖中的应用具有较好的抗应激、提高生产性能效果，可以作为抗生素替代品应用于畜禽养殖中。
四、具体实施方式：
以下结合实施例进一步阐述本发明，但并不限制本发明的内容。
实施例1：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成；以重量份表示，天然产物组合物由忍冬叶活性成分组8份和连翘叶活性成分组1份混合配制而成。
所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的10倍，然后加热至提取温度100℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为1h；提取后所得提取液进行过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为80％，醇沉时间为12h；醇沉后取上清液，浓缩到无醇味，然后采用浓盐酸调节所得溶液的pH值为5，调节pH值过程中控制溶液温度为25℃；将调节后所得溶液上D101大孔树脂柱，采用水进行洗脱，洗至洗脱液为中性，接着采用质量百分浓度为30％的乙醇进行洗脱，所得30％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩(低温减压浓缩时温度为60℃，压力为-0.09MPa)，浓缩至相对密度为1.1(50℃条件下)，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为5％，即得忍冬叶活性成分组。
所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的10倍，然后加热至提取温度100℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为1h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至原料连翘叶的8倍，所得浓缩液上聚酰胺柱，首先采用水进行洗脱，洗至洗脱液无颜色，再用质量百分浓度为50％的乙醇洗脱，所得50％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩(减压浓缩过程控制温度为60℃，压力为-0.09MPa)，浓缩至相对密度为1.08(50℃条件下)，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为5％，得到连翘叶活性成分组。
实施例2：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成；以重量份表示，天然产物组合物由忍冬叶活性成分组4份和连翘叶活性成分组1份混合配制而成。
所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的12倍，然后加热至提取温度60℃进行提取，提取次数为2次，每次提取时间为2h；提取后所得提取液进行过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为75％，醇沉时间为12h；醇沉后取上清液，浓缩到无醇味，然后采用浓盐酸调节所得溶液的pH值为2，调节pH值过程中控制溶液温度为30℃；将调节后所得溶液上D101大孔树脂柱，采用水进行洗脱，洗至洗脱液为中性，接着采用质量百分浓度为30％的乙醇进行洗脱，所得30％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩(低温减压浓缩时温度为50℃，压力为-0.1MPa)，浓缩至相对密度为1.1(50℃条件下)，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为4％，即得忍冬叶活性成分组。
所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的12倍，然后加热至提取温度80℃进行提取，提取次数为2次，每次提取时间为2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至原料连翘叶的6倍，所得浓缩液上聚酰胺柱，首先采用水进行洗脱，洗至洗脱液无颜色，再用质量百分浓度为40％的乙醇洗脱，所得40％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩至干(减压浓缩过程控制温度为50℃，压力为-0.1MPa)，浓缩后所得膏体进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为4％，得到连翘叶活性成分组。
实施例3：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成；以重量份表示，天然产物组合物由忍冬叶活性成分组1份和连翘叶活性成分组1份混合配制而成。
所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的15倍，然后加热至提取温度80℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为1h；提取后所得提取液进行过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为90％，醇沉时间为12h；醇沉后取上清液，浓缩到无醇味，然后采用浓盐酸调节所得溶液的pH值为3，调节pH值过程中控制溶液温度为20℃；将调节后所得溶液上D101大孔树脂柱，采用水进行洗脱，洗至洗脱液为中性，接着采用质量百分浓度为50％的乙醇进行洗脱，所得50％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩(低温减压浓缩时温度为50℃，压力为-0.1MPa)，浓缩至相对密度为1.0(50℃条件下)，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为3％，即得忍冬叶活性成分组。
所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的15倍，然后加热至提取温度90℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为1h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至原料连翘叶的8倍，所得浓缩液上聚酰胺柱，首先采用水进行洗脱，洗至洗脱液无颜色，再用质量百分浓度为30％的乙醇洗脱，所得30％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩(减压浓缩过程控制温度为50℃，压力为-0.1MPa)，浓缩至相对密度为1.0(50℃条件下)，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为3％，得到连翘叶活性成分组。
实施例4：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成；以重量份表示，天然产物组合物由忍冬叶活性成分组5份和连翘叶活性成分组1份混合配制而成。
所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的12倍，然后加热至提取温度100℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为1.5h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.2，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为90％，醇沉时间为12h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用乙酸乙酯进行萃取4次，萃取后所得萃取液进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为60℃，压力为-0.09MPa)和真空干燥(真空度为-0.09MPa，温度为55℃)，干燥后物料的含水率为5％，得到忍冬叶活性成分组。
所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的12倍，然后加热至提取温度100℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为1h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.2，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为70％，醇沉时间为12h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用乙酸乙酯进行萃取4次，萃取后所得萃取液进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为60℃，压力为-0.09MPa)和真空干燥(真空度为-0.09MPa，温度为55℃)，干燥后物料的含水率为5％，得到连翘叶活性成分组。
实施例5：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成；以重量份表示，天然产物组合物由忍冬叶活性成分组8份和连翘叶活性成分组1份混合配制而成。
所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的15倍，然后加热至提取温度60℃进行提取，提取次数为2次，每次提取时间为1.5h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.2，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为80％，醇沉时间为12h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用正丁醇进行萃取4次，萃取后所得萃取液进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为50℃，压力为-0.1MPa)和真空干燥(真空度为-0.1MPa，温度为50℃)，干燥后物料的含水率为4％，得到忍冬叶活性成分组。
所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的15倍，然后加热至提取温度70℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为1h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.2，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为75％，醇沉时间为12h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用正丁醇进行萃取4次，萃取后所得萃取液进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为50℃，压力为-0.1MPa)和真空干燥(真空度为-0.1MPa，温度为50℃)，干燥后物料的含水率为4％，得到连翘叶活性成分组。
实施例6：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成；以重量份表示，天然产物组合物由忍冬叶活性成分组4份和连翘叶活性成分组1份混合配制而成。
所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的10倍，然后加热至提取温度80℃进行提取，提取次数为2次，每次提取时间为2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.1，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为85％，醇沉时间为14h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用正丁醇进行萃取4次，萃取后所得萃取液进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为50℃，压力为-0.1MPa)和真空干燥(真空度为-0.1MPa，温度为50℃)，干燥后物料的含水率为4％，得到忍冬叶活性成分组。
所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的10倍，然后加热至提取温度80℃进行提取，提取次数为2次，每次提取时间为2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.1，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为80％，醇沉时间为14h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用正丁醇进行萃取4次，萃取后所得萃取液进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为50℃，压力为-0.1MPa)和真空干燥(真空度为-0.1MPa，温度为50℃)，干燥后物料的含水率为4％，得到连翘叶活性成分组。
实施例7：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，该天然产物组合物是由忍冬叶和连翘叶按照3：1的质量比混合后，对所得混合物进行提取所得。
对所得混合物进行提取的方法为：
首先将忍冬叶与连翘叶按照上述的质量比进行混合，混合后加入水，水的加入体积量为总原料质量的12倍，然后加热升温，升温至提取温度80℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为1h；提取后所得提取液进行过滤，所得溶液浓缩至相对密度为1.1；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为80％，醇沉时间为12h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用正丁醇萃取4次，萃取后所得萃取液依次进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为60℃，压力为-0.09MPa)和真空干燥(真空度为-0.09MPa，温度为55℃)，干燥后物料的含水率为5％，得到忍冬叶和连翘叶混合提取的组合物。
实施例8：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，该天然产物组合物是由忍冬叶和连翘叶按照12：1的质量比混合后，对所得混合物进行提取所得。
对所得混合物进行提取的方法为：
首先将忍冬叶与连翘叶按照上述的质量比进行混合，混合后加入水，水的加入体积量为总原料质量的10倍，然后加热升温，升温至提取温度100℃进行提取，提取次数为3次，每次提取时间为2h；提取后所得提取液进行过滤，所得溶液浓缩至相对密度为1.1；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为80％，醇沉时间为14h；醇沉后取上清液减压浓缩至相对密度为1.1(50℃条件下)，所得产品进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为5％，得到忍冬叶和连翘叶混合提取的组合物。
实施例9：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，该天然产物组合物是由忍冬叶和连翘叶按照6：1的质量比混合后，对所得混合物进行提取所得。
对所得混合物进行提取的方法为：
首先将忍冬叶与连翘叶按照上述的质量比进行混合，混合后加入水，水的加入体积量为总原料质量的15倍，然后加热升温，升温至提取温度100℃进行提取，提取次数为2次，每次提取时间为2h；提取后所得提取液进行过滤，所得溶液浓缩至相对密度为1.1；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为70％，醇沉时间为12h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用乙酸乙酯萃取4次，萃取后所得萃取液依次进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为55℃，压力为-0.09MPa)和真空干燥(真空度为-0.09MPa，温度为55℃)，干燥后物料的含水率为5％，得到忍冬叶和连翘叶混合提取的组合物。
实施例10：
本发明用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，该天然产物组合物是由忍冬叶和连翘叶按照8：1的质量比混合后，对所得混合物进行提取所得。
对所得混合物进行提取的方法为：
首先将忍冬叶与连翘叶按照上述的质量比进行混合，混合后加入水，水的加入体积量为总原料质量的20倍，然后加热升温，升温至提取温度60℃进行提取，提取次数为2次，每次提取时间为2h；提取后所得提取液进行过滤，所得溶液浓缩至相对密度为1.2；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为70％，醇沉时间为12h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用正丁醇萃取4次，萃取后所得萃取液依次进行减压浓缩(减压浓缩过程中控制温度为60℃，压力为-0.09MPa)和真空干燥(真空度为-0.09MPa，温度为55℃)，干燥后物料的含水率为5％，得到忍冬叶和连翘叶混合提取的组合物。
本发明组合物活性试验：
(一)抑菌活性：
1、实验材料：
培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。
供试菌：鼠伤寒沙门氏菌ATCC 13311、肺炎链球菌ATCC49619、大肠埃希菌ATCC25922、化脓性链球菌ATCC19615和金黄色葡萄球菌ATCC 29213，均购自南京便诊生物科技有限公司。
2、试验方法：将按照本发明方法提取的忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组分别按重量比1:1、1:4、1:8、1:16、4:1、8:1和16:1进行组配混合，每个比例的组合物用无菌水配制成浓度为250mg/mL的溶液，用0.22um的滤膜过滤，为样品原液；采用制备好的牛肉膏蛋白胨液体培养基依次倍比稀释，浓度依次为125mg/mL、62.5mg/mL、31.25mg/mL、15.625mg/mL、7.8mg/mL、3.9mg/mL和1.95mg/mL。将稀释成不同浓度的组合物溶液依次加入微量MIC测定板中，每孔0.1mL；再分别加入已稀释好的各种菌液(鼠伤寒沙门氏菌、肺炎链球菌A、大肠埃希菌、化脓性链球菌和金黄色葡萄球菌)，每孔0.1mL。分别设置阳性对照(加入0.1mL菌液和0.1mL液体培养基)和阴性对照(只加液体培养基)。
每种样品的浓度做三个平行样；制备好的微量MIC测定板于37℃恒温箱中培养24h观察，以无菌生长的那一孔中药液的浓度为最小抑菌浓度(MIC)。再依次从未见细菌生长的培养物分别吸取0.1mL，倾倒于铺好牛肉膏蛋白胨固体培养基的平皿上，于37℃恒温箱中培养24h观察，平皿上无菌生长的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度。
根据公式：
计算出两两组合的试验药物的分级抑菌浓度指数(Fractional InhibitoryConcentration,FIC)。FIC指数的判断标准为：当FIC≦0.5时，两种药物之间起协同作用；当0.5<FIC≦1.0，两种药物之间起相加作用；当1.0＜FIC≦2.0，两种药物之间无相关作用；FIC>2.0时，两种药物起拮抗作用。
3、试验结果：
本发明中的忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组及其组合物对鼠伤寒沙门氏菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度详见表1所示，两种活性成分组体外联合抑菌作用详见表2所示。
表1本发明组合物体外最小抑菌浓度
表2本发明组合物体外联合抑菌作用
由表1、表2实验结果表明：忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组按照4:1、8:1比例组配时效果最好；其中，二者比例为8:1时组合物对鼠伤寒沙门氏菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度分别为7.8mg/mL、7.8mg/mL、3.9mg/mL、7.8mg/mL、3.9mg/mL，二者比例8:1的组合物对鼠伤寒沙门氏菌、肺炎链球菌、大肠杆菌、化脓性链球菌、金黄色葡萄球菌最小杀菌浓度：15.6mg/mL、15.6mg/mL、7.8mg/mL、15.6mg/mL、7.8mg/mL。
当两者比例为4:1、8:1时，对5种菌均表现为协同作用。当二者比例为1:1时，对肺炎链球菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌表现为协同作用，对鼠伤寒沙门氏菌、化脓性链球菌表现为相加作用；当二者比例为16:1时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌表现为协同作用，对肺炎链球菌、鼠伤寒沙门氏菌、化脓性链球菌表现为相加作用；其它比例下表现为相加、拮抗作用。
由表2可以看出，忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组合并用药，比例为1:1～16:1时在抑菌活性方面有协同增效作用或者相加作用，当二者比例为4:1～8:1时效果最好，对5种畜禽上常见的病原菌完全表现为协同增效作用。
(二)体外抗氧化活性：
1、试验方法：将利用本发明方法提取的忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组分别按照重量比1:1、1:4、1:8、1:16、4:1、8:1、16:1进行复配，对照采用Vc、芦丁，将不同比例组合物、Vc和芦丁用无水乙醇分别配成浓度为0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL的待测溶液，DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)用无水乙醇配成0.08mg/mL的溶液。在96孔板中，每孔分别加入100μL待测溶液和等体积的DPPH溶液，室温避光静置30min，于517nm波长处测定吸光度Ai；同时测100μL无水乙醇与100μL DPPH混合后吸光度Ao；100μL待测溶液加100μL无水乙醇混合后吸光度Aj；每个样品平行测定三次，取其平均值。计算DPPH自由基清除率ESC：
ESC(％)＝[1-(Ai-Aj)/Ao]×100％
协同作用的计算：理论清除率(TSC)的计算公式为TSC(％)＝100-(100-ESC1)×(100-ESC2)/100；其中ESC1、ESC2为两样品试验清除率，协同作用(SE)＝ESC/TSC，SE>1表示具有协同作用。
各样品和对照的抗氧化活性结果详见表3。
表3本发明样品组合物的配制及体外抗氧化结果
2、实验结果：忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组按照按表3中的比例组成的组合物，其对DPPH自由基的清除能力比两者活性成分组单独使用时都有增加，当二者比例为1:1、4:1、8:1、16:1时其抗氧化活性明显增加；在浓度为0.125mg/mL时，二者比例为1:1、4:1、8:1时对DPPH自由基的清除能力协同作用大于1；在浓度为0.25mg/mL时，二者比例为1:1、4:1、8:1、16:1时对DPPH自由基的清除能力协同作用均大于1；在浓度为0.5mg/mL时其对DPPH自由基的清除能力达到93.2％、94.2％，和Vc相当，高于芦丁的抗氧化能力，其二者的协同作用为1.02，1.03，当二者比例为16:1时，二者协同作用为1.00。说明忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组按照1:1～8:1比例组成的组合物具有协同抗氧化作用。
(二)本发明组合物的应用实验：本发明组合物作为饲料添加剂，抗菌、抗氧化药物在畜禽养殖中的应用
1、利用本发明组合物对肉仔鸡生产性能的影响：
1)试验方法：选用1日龄健康公雏(Advian品种)150只，初始体重为41.0g左右，根据体重相近原则完全随机设计分为3个处理组，每个处理5个重复，每个重复10羽鸡；空白对照组为添加基础日粮；抗生素组为金霉素，添加量为30mg/Kg；试验处理组为本发明实施例4组合物，添加量为200mg/kg。
试验日粮及饲养管理：基础日粮组成及营养水平见表4。实验采用三层阶梯笼养(60cm×90cm×40cm)方式饲养。舍内温、通风以及氨气浓度通过环境控制系统自动控制，湿度通过手动调节加湿器释放水雾来调整。育雏期前2周舍温控制在33℃，以后每周下降2℃，直至降至24℃，相对湿度55-60％。1-3天光照24h，4-7天光照22h，8-42天光照20h，干粉料饲喂，自由采食和饮水；按照常规免疫程序免疫，试验期共42天。
表4肉鸡饲养基础日粮及营养水平
注：预混料为每公斤全价料提供铜9mg、碘0.48mg，铁100mg、锰71mg、硒0.4mg、锌90mg、VA 11000IU、VD 3200IU、VE 17IU、VK 1.5mg、泛酸11mg、烟酸17mg、生物素0.05mg、叶酸0.4mg、VB 18.0μg、胆碱0.55g和核黄素4.0mg。
2)、测定指标：
a、生产性能指标：分别于0天、42天称量鸡的体重，分笼结算饲料用量，计算平均日增重ADG、平均日采食量ADF1和饲料转化率FCR。
b、抗氧化指标：于试验结束(即42日龄)从3个处理组中随机选择3只试鸡，心脏采血5mL置于10mL非抗凝真空采血管中，3000r/min离心10min制备血清样品，分装后冷冻存放于-20℃待测。采用试剂盒测定血清中总抗氧化能力T-AOC、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px、超氧化物歧化酶SOD和丙二醛MDA的含量。
3)、试验结果：
1)添加本发明产品对肉仔鸡生产性能的影响(试验结果见表5)：
表5实施例4组合物对肉鸡生长性能的影响
由表5可知：与空白对照组比较，肉鸡中添加本发明实施例4组合物后，平均日增重、日采食量均有显著增加，料重比下降，鸡死亡数下降，与抗生素对照组效果几乎相当。由此表面，添加本发明产品能有效降低仔鸡死亡率，并能显著改善仔鸡的生长性能。
2、添加本发明产品对肉仔鸡血清抗氧化指标的影响：
试验结果详见表6。在仔鸡日粮中添加本发明的实施例7组合物可提高肉仔鸡血清中的GSH-PX、SOD含量，MDA含量降低，说明在肉仔鸡饲料中使用本发明产品能够消除体内多余的自由基，缓解肉仔鸡生长中生产的氧化应激，提高肉仔鸡的生长性能。
表6本发明实施例7组合物对肉仔鸡血清抗氧化指标的影响
| 项目 | |||
| 空白对照组 | 168.21±17.21 | 112.36±12.78 | 9.65±1.84 |
| 抗生素组 | 190.25±20.36 | 138.54±14.25 | 7.29±1.09 |
| 试验处理组 | 7.03±2.36 |
注：a表示与对照组相比，p<0.05。
试验结论：通过上述实验初步判断，肉仔鸡日粮中添加本发明组合物能够促进肉仔鸡生长，提高日增重，降低料重比，降低鸡死亡数，提高肉仔鸡抗氧化功能，减轻过氧化对机体的损伤，从而提高肉仔鸡的生长性能。
3、利用本发明组合物对断奶仔猪生产性能的影响：
1)试验方法：选取29日龄断奶杂交猪45头，体重约8Kg左右，根据体重相近、公母各半的原则将其分为3组。空白对照组为基础日粮组，试验处理组为0.5％实施例2组合物+基础日粮，抗生素组为0.1％金霉素+基础日粮，每组设3个重复，每个重复5头。免疫和管理按猪场常规进行，试验期35天。日粮配方见表。
表7基础日粮组成和营养水平(风干基础，％)
| 饲料组成 | 含量 | 营养指标含量 | |
| 玉米 | 61.00 | 消化能(KJ/Kg) | 14.30 |
| 豆粕 | 25.00 | 粗蛋白质 | 21.32 |
| 鱼粉 | 4.00 | 赖氨酸 | 1.13 |
| 乳清粉 | 3.00 | 蛋氨酸 | 0.32 |
| 葡萄糖 | 2.00 | 色氨酸 | 0.20 |
| 石粉 | 0.25 | 钙 | 0.80 |
| 磷酸氢钙 | 0.60 | 总磷 | 0.61 |
| 食盐 | 0.15 | ||
| 预混料 | 4.00 | ||
| 总计 | 100.00 |
注：4％预混料为每公斤全价料提供铜6mg、碘0.12mg、铁110mg、锰5mg、硒0.4mg、锌112mg、VA1780IU、VD 3200IU、VE 13IU、VK 0.5mg、泛酸11mg、烟酸14mg、生物素0.05mg、叶酸0.4mg、VB12 18.0μg、胆碱0.6g、吡哆醇1.6mg、核黄素4.0mg和硫胺素1.0mg。
2)测定指标：
生产性能测定指标：采食量、日增重、料重比、粪便形态率(腹泻率)。在试验开始与结束时以重复为单味对仔猪进行称重、记录每个重复仔猪的采食量，计算出平均日增重、平均日采食量和料重比。另外，每天观察仔猪排粪情况，记录腹泻仔猪个数和持续时间，最后以每重复仔猪发生腹泻的头日数除以总的饲养头日数计算出腹泻率。
抗氧化指标：试验结束当天早晨对仔猪进行空腹前腔静脉采血，每头10-15mL。每重复随机抽取1头，每组4头。将所采血液用3000r/min离心机离心10min，制备血清样品，用于谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)的测定。
3)试验结果：
添加本发明产品对仔猪生产性能的影响(详见表8)。
表8本发明实施例2组合物对断奶仔猪生长性能的影响
与空白对照组相比，试验处理组平均日采食量提高了1.7％，平均日增重提高了7.0％，料肉比降低了6.5％，腹泻率降低了34％。说明本发明产品具有促进仔猪生长，提高日增重，降低料重比，在预防仔猪腹泻方面效果比较好。
4、添加本发明产品对仔猪血清抗氧化指标的影响(详见表9)：
表9本发明实施例2组合物对断奶仔猪血液抗氧化指标的影响
| 项目 | |||
| 空白对照组 | 146.21±8.52 | 101.23±8.53 | 6.35±1.36 |
| 试验处理组 | 160.45±7.56 | 3.98±0.99 | |
| 抗生素组 | 152.78±6.35 | 4.11±0.79 |
注a表示与对照组相比，p<0.05。
与对照组相比较，添加本产品后可显著提高GSH-PX、SOD的含量，MDA含量显著降低。说明本发明的组合物具有和抗生素相当的抗氧化活性，均可提高仔猪血清的抗氧化能力。
结论：仔猪日粮中添加本发明组合物能够促进仔猪生长，提高日增重，降低料重比，预防仔猪腹泻，提高仔猪抗氧化功能，减轻过氧化对机体的损伤；从而提高仔猪的生长性能。
小结：本发明组合物具有较好的抑菌、抗氧化活性，作为饲料添加剂能够提高畜禽的生产性能、抗氧化功能，可以作为抗生素替代品应用于畜禽养殖中。
Claims (10)
1.一种用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于：所述天然产物组合物主要由忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制而成；
所述忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制过程中二者之间加入量的质量比例为1～8：1。
2.根据权利要求1所述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于：所述忍冬叶活性成分组和连翘叶活性成分组混合配制过程中二者之间加入量的质量比例为4～8：1。
3.根据权利要求1或2所述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于，所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的10～20倍，然后加热至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；提取后所得提取液进行过滤，滤液浓缩至相对密度为1.1～1.2；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取上清液，浓缩到无醇味，然后采用浓盐酸、硫酸或磷酸调节所得溶液的pH值为1～5，调节pH值过程中控制溶液温度为20～40℃；将调节后所得溶液上大孔树脂柱，采用水进行洗脱，洗至洗脱液为中性，接着采用质量百分浓度为30～80％的乙醇进行洗脱，所得30～80％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩，浓缩至相对密度为1.0～1.1，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，即得忍冬叶活性成分组。
4.根据权利要求1或2所述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于，所述忍冬叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料忍冬叶中加入水，水的体积加入量为原料忍冬叶重量的10～20倍，然后加热至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.1～1.2，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用有机溶剂进行萃取3～4次，萃取后所得萃取液进行减压浓缩和真空干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，得到忍冬叶活性成分组。
5.根据权利要求1或2所述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于，所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的10～20倍，然后加热至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至相对密度为1.1～1.2，所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用有机溶剂进行萃取3～4次，萃取后所得萃取液进行减压浓缩和真空干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，得到连翘叶活性成分组。
6.根据权利要求1或2所述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于，所述连翘叶活性成分组的提取方法为：
首先在原料连翘叶中加入水，水的体积加入量为原料连翘叶重量的10～20倍，然后加热至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；所得提取液进行过滤，过滤后所得溶液浓缩至原料连翘叶的4～8倍，所得浓缩液上聚酰胺柱，首先采用水进行洗脱，洗至洗脱液无颜色，再用质量百分浓度为30～80％的乙醇洗脱，所得30～80％乙醇洗脱液进行低温减压浓缩，浓缩至相对密度为1.0～1.1，浓缩后所得溶液进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，得到连翘叶活性成分组。
7.一种用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于：所述天然产物组合物是由忍冬叶和连翘叶按照3～12:1的质量比混合后，对所得混合物进行提取所得。
8.根据权利要求7所述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于，对所得混合物进行提取的方法为：
首先将忍冬叶与连翘叶按照权利要求7所述的质量比进行混合，混合后加入水，水的加入体积量为总原料质量的10～20倍，然后加热升温，升温至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；提取后所得提取液进行过滤，所得溶液浓缩至相对密度为1.1～1.2；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取上清液减压浓缩至相对密度为1.0～1.1，所得产品进行喷雾干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，得到忍冬叶和连翘叶混合提取的组合物。
9.根据权利要求7所述的用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物，其特征在于，对所得混合物进行提取的方法为：
首先将忍冬叶与连翘叶按照权利要求7所述的质量比进行混合，混合后加入水，水的加入体积量为总原料质量的10～20倍，然后加热升温，升温至提取温度60～100℃进行提取，提取次数为2～3次，每次提取时间为1～2h；提取后所得提取液进行过滤，所得溶液浓缩至相对密度为1.1～1.2；所得浓缩液加入95％乙醇进行醇沉，醇沉浓度为60～90％，醇沉时间为10～14h；醇沉后取其上清液浓缩至无醇味，所得浓缩液采用有机溶剂萃取3～4次，萃取后所得萃取液依次进行减压浓缩和真空干燥，干燥后物料的含水率为3～5％，得到忍冬叶和连翘叶混合提取的组合物。
10.一种权利要求1或7所述用于畜禽饲料添加剂的天然产物组合物在饲料添加剂中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20170620 |