CN106841595A - 一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法 - Google Patents

一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法，利用了二抗放大了检测信号，提高了实验分析的灵敏度，即通过测量氧化葡聚糖包被的四氧化三铁(Fe3O4@O‑dextran)包被抗原、Fe3O4@O‑dextran抗体即一抗与HRP标记的羊抗兔抗体即二抗，三者复合物的光学性号达到定量检测Fe3O4@O‑dextran的目的，该方法操作简单，可行性高，灵敏度高，检出限低，可实现高通量检测。

Description

一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测 方法
技术领域
本发明涉及纳米材料的定量检测领域，具体涉及一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法。
背景技术
纳米材料通常定义为具有非常小的组分和/或结构特征(例如颗粒和纤维)，其中至少一个尺寸在1～100nm范围内。纳米材料由于其尺寸处于纳米级别，与传统的材料相比具有优异的光学、热学、磁学、力学等性质。纳米材料的特殊性质，决定了纳米材料将有广泛的应用前景。
磁性纳米材料作为纳米材料中的一类特殊材料，不仅具有纳米材料的特殊性质，还具有其它纳米材料所不具有的性质——磁性。目前，磁性材料已经广泛的应用到各个领域，如生物医学应用、工业技术应用、环境治理应用等，特别是生物医学上的应用，磁性纳米材料可以作为磁共振成像的造影剂、药物载体以及磁性分离和纯化等。
近年来，人类饱受着各种疾病的折磨。如心血管疾病、糖尿病以及各种癌症。据世界卫生组织发布的《全球癌症报告2014》预测，全球癌症病例将呈现迅猛增长态势，将由2012年的1400万人，逐年递增至2025年的1900万人，到2035年，将可能达到2400万人。其中，报告显示，2012年全球新病例有一半发生在亚洲，其中大部分发生在中国。
传统的治疗癌症的主要手段是外科手术、放射疗法和化学疗法。其中化学疗法是非常普遍的一种治疗手段。化学疗法主要是利用抗癌药物抑制癌细胞的增长，从而达到治疗的效果。但是，抗癌药物在抑制癌细胞增长的同时也会对正常的组织细胞造成一定的伤害，故提高抗癌药物的靶向性对于减少抗癌药物的副作用，提高药效是十分必要的。
磁性纳米材料可以作为药物载体将药物靶向作用于病变部位，实现对癌症等疾病的有效治疗，但是纳米载体在应用时，其剂量尤为重要，不同的剂量可能导致不同效果或者副作用，准确的剂量对于优化纳米药物的功效是十分重要的，同时可以最大程度减小材料的毒性。
传统的对纳米材料的成分的分析方法主要有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱、电感耦合等离子体质谱法、X射线荧光光谱法、电子探针分析法等；纳米材料的结构分析方法主要有X射线衍射法、激光拉曼物相分析等；纳米材料的形貌和粒度分析主要有透射电子显微镜法、扫描电子显微镜法、激光粒度仪等；纳米材料表面与界面分析常用方法主要有X射线光电子能谱、俄歇电子能谱、静态二次离子质谱、离子散射谱等。其中原子吸收光谱适合对纳米材料中痕量金属杂质进行定量测定，但对非金属元素、难熔元素测定难。
这些传统的纳米材料的分析方法未能够很好的实现对纳米材料的定量分析。此外，2016年4月9-10日在厦门召开的全国环境纳米技术及生物效应学术研讨会上也有研究者提出了当前对于纳米材料的定量分析方法面临的挑战如：①生物体内纳米颗粒浓度<1ppm；②靶器官纳米颗粒浓度<ppb；③细胞中纳米颗粒浓度<1ppt；④纳米颗粒/蛋白/DNA复合物等。故实现纳米材料的定量分析是一项非常有挑战性的工作，尤其是对于应用在生物医学上的纳米材料。
氧化葡聚糖包被的四氧化三铁(Fe3O4@O-dextran)具有许多优异的性能如良好的水溶性、生物相容性、靶向性、强磁性等，这些优异的性能决定了Fe3O4@O-dextran在生物医学上具有巨大的应用潜力，如磁共振造影剂、靶向药物载体等。
发明内容
本发明提供了一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法，基于间接竞争酶联免疫分析法定量测定Fe3O4@O-dextran的浓度，利用了二抗放大了检测信号，提高了实验分析的灵敏度，即通过测量Fe3O4@O-dextran包被抗原、Fe3O4@O-dextran抗体即一抗与HRP标记的羊抗兔抗体即二抗，三者复合物的光学性号达到定量检测Fe3O4@O-dextran的目的，该方法快速、简洁、检测限低，可进行高通量测定。
本发明采取的技术方案为：
一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法，所述方法包括以下步骤：
a、制备Fe3O4@O-dextran包被抗原和免疫原；
b、制备Fe3O4@O-dextran抗体：
c、将Fe3O4@O-dextran包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液，以Fe3O4@O-dextran抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗，进行间接竞争酶联免疫分析法；
d、以Fe3O4@O-dextran标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，从而定量检测出Fe3O4@O-dextran的浓度。
所述标准曲线的线性方程为A＝1.17651-0.07137lgC，其中A为490nm处吸光度值，C为Fe3O4@O-dextran浓度。
所述步骤a具体包括以下步骤：
a-1、向Fe3O4@O-dextran的PBS溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和牛血清白蛋白，25℃温育2-4小时后，将得到溶液装入到透析袋中透析12h，即得到Fe3O4@O-dextran免疫原；
a-2、向Fe3O4@O-dextran的PBS溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和鸡卵清白蛋白，25℃温育2-4小时后，将得到溶液装入到透析袋中透析12h，即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原。
进一步地，所述步骤a具体包括以下步骤：
a-1、Fe3O4@O-dextran 50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL浓度为1～10mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1～10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液，震荡15～30min，加入0.2mL 1％牛血清白蛋白溶液，25℃反应2～4h，将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran免疫原；
a-2、Fe3O4@O-dextran 50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL浓度为1～10mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1～10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液，震荡15～30min，加入0.2mL 1％鸡卵清白蛋白溶液，25℃反应2～4h，将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原；
所述Fe3O4@O-dextran中含有的Fe3O4量为80mM；
所述羟基琥珀酰亚胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、牛血清白蛋白溶液、鸡卵清白蛋白溶液均为相应的PBS溶液。
所述步骤b具体包括以下步骤：
b-1、首次免疫：将Fe3O4@O-dextran免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合后，背部皮下多点注射到动物体内，注射8～10个点，注射量为1～2mL/只；首次免疫三周后进行加强免疫；
b-2、加强免疫：将Fe3O4@O-dextran免疫原与福氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到动物体内，注射量为1mL/只；此后每隔两周再进行一次加强免疫，期间采血测效价，直到抗体效价达到1:64000，进行最后一次加强免疫，从动物颈动脉采血，取血清部分制得Fe3O4@O-dextran抗体。
所述步骤c具体包括以下步骤：
c-1、包被：用包被缓冲液稀释将Fe3O4@O-dextran包被抗原溶液稀释200倍加入到96孔酶标板中，100μL/孔，4℃过夜；
c-2、封闭：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3min，然后加入1wt％酪蛋白封闭，每孔200μL，37℃温育1～2h；
c-3、加样竞争：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3min，然后将50μL不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液和50μLFe3O4@O-dextran抗体分梯度加入各孔中，37℃温育1.5～2h；
c-4、加酶：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，然后每孔加入100μLPBS稀释的稀释比为1/5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，37℃温育2～4h；
c-5：显色:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，然后每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应，37℃显色30min；
c-6、终止：每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值。
本发明建立了一种基于间接竞争酶联免疫分析法定量测定Fe3O4@O-dextran的新方法。利用免疫分析方法抗原和抗体的特异性反应达到检测抗原或抗体的目的。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)首次制备了Fe3O4@O-dextran多克隆抗体，为建立间接竞争酶联免疫分析法提供了核心试剂；
(2)建立了一种基于间接竞争酶联免疫分析法定量测定Fe3O4@O-dextran的新方法，为Fe3O4@O-dextran的生物医学应用提供了剂量测定方法，同时也为定量测定纳米材料提供了一种新方法；
(3)该方法具有简单、稳定、安全、检测限较低等特点。
具体实施方式
福氏完全佐剂、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体、牛血清白蛋白和鸡卵清白蛋白购买自生工生物工程(上海)股份有限公司。
其他试剂均可从市场上的销售厂家购买得到。
本发明涉及到的各溶液的制备方法为：
PBS缓冲液：称取NaCl 8.0g、KCl 0.1g、NaH2PO4·2H2O 0.29g、Na2HPO4·12H2O2.96g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL，即可得到0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液；
PBST溶液：在1000mL PBS中加入500μL Tween-20，混合均匀；
包被缓冲液CB：称取Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.94g溶解于蒸馏水中并定容至1000mL；即可得到0.05mol/L pH＝9.6的包被缓冲液；
邻苯二胺底物液：称取1.85g Na2HPO4·12H2O、0.51g C6H8O7溶解于蒸馏水中并定容至50mL，称取4mg邻苯二胺溶于10mL上述溶液中，临用前加入15μL 30％H2O2；
1wt％酪蛋白：称取1mg酪蛋白溶于1mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液中，混合均匀。
1％牛血清白蛋白溶液：1g牛血清白蛋白溶于100mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液中，混合均匀；
1％鸡卵清白蛋白溶液：1g鸡卵清白蛋白溶于100mL 0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲液中，混合均匀；
实施例1
一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法，包括以下步骤：
a、制备Fe3O4@O-dextran包被抗原和免疫原；
Fe3O4@O-dextran的制备参照文献J.Phys.Chem.C 2012，116，20558-20563公开的方法，其具体步骤如下：
取0.5g葡聚糖40(Mw＝40000)溶解在10mL去离子水中，然后加入7.5mL NaIO4(0.4g)水溶液，在80℃搅拌30分钟，移除加热器加入5mL的乙二醇阻止葡聚糖进一步氧化，最后用NaOH溶液调节pH为7；
FeCl3·6H2O(1mmol)和Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O(2mmol)混合溶解在10mL去离子水中，然后与氧化葡聚糖溶液混合，快速加入5mL NaOH(0.6g)溶液大力搅拌10分钟，转移到聚四氟乙烯内衬的高压釜中，160℃水热处理10h，最后冷却到室温离心或磁分离收集。即可得到Fe3O4@O-dextran。
Fe3O4@O-dextran(80mM Fe3O4)50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL浓度为1mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液，震荡15～30min，加入0.2mL 1％牛血清白蛋白溶液(10mg/mL)，25℃反应2～4h，将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran免疫原；
Fe3O4@O-dextran(80mM Fe3O4)50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL浓度为1mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液，震荡15～30min，加入0.2mL 1％鸡卵清白蛋白溶液(10mg/mL)，25℃反应2～4h，将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原；
所述羟基琥珀酰亚胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、牛血清白蛋白溶液、鸡卵清白蛋白溶液均为相应的PBS溶液。
b、制备Fe3O4@O-dextran抗体；
取4只体重2～2.5kg健康的雄性新西兰大白兔，其中一只作为空白对照，其他三只作为实验兔，空白对照组不做任何处理。
实验组的处理方法为：
将弗氏完全佐剂与Fe3O4@O-dextran免疫原按照体积比1:1混合乳化均匀，在雄性新西兰大白兔背部皮下注射约8～10个点，总量共1mL/只。疫接种的方式有注射免疫、口服免疫、气雾免疫等，其中注射免疫又有皮下注射、皮内注射、肌肉注射静脉注射等方式，背部皮下注射操作方便，药物扩散较慢，有利于刺激机体产生免疫应答，继而产生抗体；而雄兔作为免疫对象可以避免其生理周期对实验产生影响。
首次免疫三周后进行加强免疫，加强免疫是将弗氏不完全佐剂和Fe3O4@O-dextran免疫原按照体积比1:1混合均匀，注射过程同首次免疫注射一样，每次加强免疫之间间隔两周，中间周采血用间接竞争酶联免疫分析法测定抗血清的效价，直到抗体效价达到1:64000，进行最后一次加强免疫，对新西兰大白兔颈动脉采血，进行血清的纯化和分离，将得到的抗体储存在-80℃或-25℃待用。
弗氏不完全佐剂的制备是将液体石蜡和羊毛脂按照用量比2:1，即液体石蜡100mL，羊毛脂50g混合，用超声仪分多次超声，每次超声半小时冷却到室温，再继续超声，这样反复乳化混合，直到滴一滴混合物于冰水混合液中半分钟不扩散即为弗氏不完全佐剂制备成功。
抗血清效价的测定方法为：将Fe3O4@O-dextra包被抗原用包被缓冲液(CB)稀释50倍包被在96孔酶标板上过夜。第二天早上取出，用洗涤液(PBST)洗涤3次，每次3min，加入1wt％酪蛋白200μL/孔，37℃温育1h。待1h之后取出，用PBST洗涤3次，每次3min，加入用PBS稀释一系列稀释比1/2000～1/256000的抗血清，100μL/孔，37℃温育2h。待2h之后取出洗涤3次，每次3min，加入用PBS稀释的稀释比为1/5000的HRP标记的羊抗兔抗体lgG 100μL/孔，37℃温育2h。待2h之后取出洗涤3次，每次3min，加入底物液100μL/孔，37℃反应30min。30min之后取出加入2mol/L H2SO4 50μL/孔终止反应。用酶标仪测定490nm处的吸光度值。比较实验组与空白对照组在同一抗血清稀释倍数下的吸光值A，当A实验组≥2倍A对照组时对应的最大稀释倍数即抗血清的效价。
c、间接竞争酶联免疫分析法定量测定Fe3O4@O-dextran
c-1、包被：用包被缓冲液将Fe3O4@O-dextran包被抗原稀释200倍，包被于96孔酶标板中的24个孔中，即每行取3个孔进行实验，每孔100μL，冰箱4℃过夜；
c-2、封闭：PBST洗涤三次，每次3min拍干，加入1wt％酪蛋白200μL/孔进行封闭(减少非特异性吸附)，37℃温育1h；
c-3、加样竞争：PBST洗涤3次，每次3min，将50μL浓度分别为0.0232ng/mL、0.232ng/mL、2.32ng/mL、23.2ng/mL、232ng/mL、2320ng/mL的Fe3O4@O-dextran标准液依次加入到酶标板的各行中，即每个浓度梯度重复三次，然后向各孔中加入50μL Fe3O4@O-dextran抗体，37℃温育2h；
不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液的制备方法为：用0.01mol/L pH＝7.4的PBS缓冲溶液将Fe3O4@O-dextran稀释到指定的浓度；
c-4、加酶：PBST洗涤3次，每次3min，每孔加入100μLPBS稀释的稀释比为1/5000的HRP标记的羊抗兔抗体IgG，37℃温育3h；
c-5：显色:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3min，然后每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应，37℃温育30min；
c-6、终止：每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光度值，同一浓度梯度的取平均值计算吸光度值；
d、以Fe3O4@O-dextran标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，所得标准曲线的线性方程为：A＝1.17651-0.07137lgC，相关系数R＝-0.9991，线性范围为2.32×10-2～2.32×103，检出限为0.0297ng/mL。
e、重复以上各步骤，只是将步骤c-3中的不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液替换为未知浓度的Fe3O4@O-dextran待测液，然后在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光度值，求取平均吸光度值，根据上述标准曲线A＝1.17651-0.07137lgC，即可计算出Fe3O4@O-dextran待测液的浓度。
以上方法为多次实验验证后的最优的实验方法，此方法所得到的标准曲线的线性关系最好，线性范围最宽。
上述参照实施例对氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种氧化葡聚糖包被的四氧化三铁磁性纳米材料的定量检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a、制备氧化葡聚糖包被的四氧化三铁(Fe3O4@O-dextran)包被抗原和免疫原；
b、制备Fe3O4@O-dextran抗体；
c、将Fe3O4@O-dextran包被抗原经包被液稀释后包被于酶标板中，封闭、加入不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液，以Fe3O4@O-dextran抗体作为一抗，HRP标记的羊抗兔抗体作为二抗，进行间接竞争酶联免疫分析法；
d、以Fe3O4@O-dextran标准液浓度的对数为横坐标，吸光度值为纵坐标建立标准曲线，从而定量检测出Fe3O4@O-dextran的浓度。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述标准曲线的线性方程为A＝1.17651-0.07137lgC，其中A为490nm处吸光度值，C为Fe3O4@O-dextran浓度。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a具体包括以下步骤：
a-1、向Fe3O4@O-dextran的PBS溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和牛血清白蛋白，25℃温育2-4小时后，将得到溶液装入到透析袋中透析12h，即得到Fe3O4@O-dextran免疫原；
a-2、向Fe3O4@O-dextran的PBS溶液中，加入羟基琥珀酰亚胺、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺和鸡卵清白蛋白，25℃温育2-4小时后，将得到溶液装入到透析袋中透析12h，即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤a具体包括以下步骤：
a-1、Fe3O4@O-dextran 50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL浓度为1～10mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1～10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液，震荡15～30min，加入0.2mL 1％牛血清白蛋白溶液，25℃反应2～4h，将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran免疫原；
a-2、Fe3O4@O-dextran 50μL溶于4mL PBS溶液中或100μL溶于3mL PBS溶液中，然后加入0.1mL浓度为1～10mg/mL的羟基琥珀酰亚胺溶液和0.2mL浓度为1～10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液，震荡15～30min，加入0.2mL 1％鸡卵清白蛋白溶液，25℃反应2～4h，将所得溶液装入透析袋中，用蒸馏水4℃透析12h收集，即得到Fe3O4@O-dextran包被抗原；
所述Fe3O4@O-dextran中含有的Fe3O4量为80mM；
所述羟基琥珀酰亚胺溶液、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺溶液、牛血清白蛋白溶液、鸡卵清白蛋白溶液均为相应的PBS溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b具体包括以下步骤：
b-1、首次免疫：将Fe3O4@O-dextran免疫原与福氏完全佐剂等体积比混合后，背部皮下多点注射到动物体内，注射8～10个点，注射量为1～2mL/只；首次免疫三周后进行加强免疫；
b-2、加强免疫：将Fe3O4@O-dextran免疫原与福氏不完全佐剂等体积比混合后，采取同样的方式注射到动物体内，注射量为1mL/只；此后每隔两周再进行一次加强免疫，期间采血测效价，直到抗体效价达到1:64000，进行最后一次加强免疫，从动物颈动脉采血，取血清部分制得Fe3O4@O-dextran抗体。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c具体包括以下步骤：
c-1、包被：用包被缓冲液将Fe3O4@O-dextran包被抗原溶液稀释200倍加入96孔酶标板中，100μL/孔，4℃过夜；
c-2、封闭：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3min，然后加入1wt％酪蛋白封闭，每孔200μL，37℃温育1～2h；
c-3、加样竞争：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3min，然后将50μL不同浓度的Fe3O4@O-dextran标准液和50μLFe3O4@O-dextran抗体分梯度加入各孔中，37℃温育1.5～2h；
c-4、加酶：PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，然后每孔加入100μLPBS稀释的稀释比为1/5000的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体，37℃温育2～4h；
c-5：显色:PBST溶液洗涤96孔酶标板3次，每次3～5min，然后每孔加入100μL邻苯二胺底物液进行显色反应，37℃显色30min；
c-6、终止：每孔加入50μL 2mol/L的H2SO4终止反应，在酶标仪上测定各孔在490nm处的吸光值。
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