CN101062416A - 葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料及其制备方法，其化学反应式为：。葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料，其有效粒径为93.1±2.2nm，半峰宽为26.7±1.3nm，Zeta电位为正，分散度为0.083±0.011，磁响应性为26.0±1.1emu/g。它克服了现有的制备方法均较复杂、成本较高，不能较好地兼顾好粒径的大小和磁响应性高低的关系的不足。本发明制备方法简单易行、成本低廉、粒径微小、磁响应性高的葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料。该磁性纳米微粒与基因分子相结合，在外加磁场的导向下，高度浓集、作用于肿瘤细胞。

Description

葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种医药载体材料，更具体地说它是一种葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料，本发明还涉及这种磁性纳米材料的制备方法和应用。

背景技术

传统的基因载体主要包括两大类：病毒载体和非病毒载体。病毒载体是迄今为止实验室里最有效的基因转移方法，其转移效率甚至可以达到90％。然而由于其局限性，尤其是安全问题的存在，其在临床上的应用受到限制。非病毒载体因而得到了快速发展，但其转染效率一直不如病毒载体系统。

随着纳米技术、生物工程技术的不断进步，非病毒载体的研究也发展到了一个新的阶段。目前，药物/核酸转运系统已经发展到靶向转运系统。该系统将能携带效应分子，主动或被动地转运到机体的靶部位发挥治疗作用，而对其它部位的毒副作用很低。国内外的研究显示，在四氧化三铁晶粒表面包附一层生物大分子(如蛋白质，脂质体，多糖等)，能够得到良好的生物相容性和生物安全性。而且这种磁性微球具有磁响应性，在外加梯度磁场作用下能够趋向运动，可以作为携带药物或核酸分子的载体骨架进行肿瘤的磁控靶向治疗。其中，多糖类高分子聚合物更具有可生物降解、几乎无免疫原性的优点。而且其良好的亲水性使其可以制备成亲水凝胶状的纳米颗粒。这种天然的亲水表面能减弱机体内巨噬细胞的吞噬作用，延长其在血液中的循环时间，因此很适合用于生物大分子类药物的传递。

四氧化三铁(Fe₃O₄)磁性微粒毒性低，具有磁响应性。当磁性微粒的粒径足够小时，具有超顺磁性，即在外加磁场中有较强的磁性，撤离磁场时磁性很快消失，剩磁为零，不会被永久磁化。因此，四氧化三铁磁性微粒成为目前生物磁性材料领域的一个研究热点。

葡聚糖(dextran)，又名右旋糖苷，是具有线状主链的一类多糖，主要由1，6-α-D-吡喃糖苷连接在一起，本身及其在体内的降解产物(CO₂、H₂O)对人体无毒，在临床上已被用作血容量扩增剂。经葡聚糖包被的磁性纳米微粒，既可以通过大分子上的活性基团连接具有生物活性的物质，又能通过布朗运动保持其在溶液中的稳定性。因此，葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料(DCIONPs)在医学领域将有着广阔的应用前景。

上个世纪八十年代以来，人们不断尝试制备粒径更小、磁响应性更强的葡聚糖磁性微粒，然而迄今为止相关的制备方法均较复杂、成本较高，不能较好地兼顾好粒径的大小和磁响应性高低的关系，尚没有形成成熟统一的制备方法。本实验拟采用简单易行、成本低廉的方法研制粒径微小、磁响应性高的葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料。并将该磁性纳米微粒与基因分子相结合，在外加磁场的导向下，高度浓集、作用于肿瘤细胞。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有背景技术的不足之处，而提供一种磁响应性强、粒径小且分布均一的葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料。

本发明的另一个目的在于提供一种上述葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的制备方法。

本发明的再一个目的是提供上述葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的应用，检测其与DNA分子的结合效率，以及在磁场导向下转染肿瘤细胞的能力。

制备葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的方法，其特征在于其化学反应式为：

具体步骤如下：

①、4.0g Dextran T-10溶于20ml三蒸去离子水，在通入氮气的同时，加入2.33mmol FeCl₃·6H₂O和1.26mmol FeCl₂·4H₂O；

②、溶液经超声波，功率200瓦作用3分钟后，加大功率至325瓦，逐滴加入25％~30％氨水1.2ml；

③、调整超声波功率至300瓦，持续模式作用于反应液30分钟，脉冲模式作用30分钟；

④、冷却后得到黑色胶体混悬液；

⑤、将所得黑色胶体混悬液置于5×10³高斯磁场中作用1h，即得本发明葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料。

在上述技术方案中，所述步骤①、②、③中的反应容器均置于冰水浴中。

根据上述方法制备的葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料，微粒多呈球形或椭圆形，有效粒径为93.1±2.2nm，半峰宽为26.7±1.3nm，Zeta电位为正，分散度为0.083±0.011，在外加场强为10⁴Oe、温度为18℃的条件下微粒的磁响应强度为26.0±1.1emu/g，撤除磁场时剩磁为零。

葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的应用，将其作为医药载体在制药中的应用。

本发明葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料具有如下优点：制备方法简单，采用一步法即可制成，成本低廉，有利于推广。微粒有效粒径小、粒径分布窄以及磁响应性高。微粒能够较好的与质粒DNA相结合，起到基因载体的作用。在外加磁场的作用下，其早期转染效率得到显著提高。

附图说明

图1不同铁含量制得的DCIONPs的磁响应性。

图2不同葡聚糖含量制得的DCIONPs的粒径大小。

图3Fe/dextran比值与颗粒大小的关系。

图4Fe/dextran比值与磁响应性的关系。

图5葡聚糖磁液形态。

图6葡聚糖磁性微粒的扫描电镜观。

图7DCIONPs粒径分析

图8DCIONPs粒径分析(95％粒径分布)

图9DCIONPs粒径分析(99％粒径分布)。

图10DCIONPs的Zeta电位检测

图11DCIONPs原子力显微镜照片(二维观)

图12DCIONPs原子力显微镜照片(三维观)

图13不同质量比(DCIONPs(Fe)∶pGenesil-1)琼脂糖凝胶电泳情况

图14不同质量比与DCIONPs/pGenesil-1结合率的关系曲线

图15细胞转染后绿色荧光蛋白表达情况(4小时，外加磁场)

图16细胞转染后绿色荧光蛋白表达情况(48小时，外加磁场)

图17细胞转染后绿色荧光蛋白表达情况(4小时，不加磁场)

图18细胞转染后绿色荧光蛋白表达情况(48小时，不加磁场)

具体实施方式

实施例：

葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的制备及葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料分析：

一、材料

(一)试剂：

水合氯化亚铁(FeCl₂·4H₂O)

水合氯化铁(FeCl₃·6H₂O)

25-30％氨水(NH₃·H₂O)

氮气(N₂)

以上均为国产分析纯。

葡聚糖T-10 Dextran T-10(Pharmacia公司产)

实验用水均为双蒸水及三蒸水。

(二)仪器：

JY-9211型超声细胞粉碎仪(宁波科学生物仪器厂)

JJ-3控温定时电动搅拌器(常州国华电器有限公司)

RE-52C旋转蒸发器(巩义市英峪予华仪器厂)

Anke TGL-16G型台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)

钕-铁-硼(Nd-Fe-B)永磁体0-5000高斯(包头磁铁厂)

501型超级恒温器(上海实验仪器厂)

CTS24型霍尔效应数字磁强计(上海震宏实业公司)

PHSJ-4A型实验室PH计(上海精密科学仪器有限公司)

JA1003型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)

SZ-97型自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)

NanoScope IV原子力显微镜(Veeco Instruments，USA。武汉理工大学测量中心)

JSM-5610LV扫描电镜(JEOL，Japan。武汉理工大学测量中心)

Zeta-PALS激光粒度分析仪(Brookhaven Instruments Corporation，USA。武汉理工大学复合材料国家重点实验室)

3257-35DC磁性测试仪(YOKOGAWA Ltd.，Japan。日本横河电机株式会社)

二、方法

(一)正交法筛选制备DCIONPs的影响因素

以反应液中总铁含量、葡聚糖含量、反应温度为影响因素，每一因素分为3个水平，进行正交设计，依据L9(3³)安排实验，见表1。实验结果按以下3个指标进行评估：1.样品有效粒径(Effective Diameter，Eff.Diam.)；2.样品粒径分散度(Poly-dispersity)；3.样品饱和磁化强度(SaturationMagnetization，Ms)。每种试验条件重复3次，制备出的样品评估指标取平均值。

表1  正交试验因素水平(L9＝3³)

水平	因素
				A	B	C
	123	0.030.060.12	51020				205080

A：总铁含量(mmol/ml)；B：葡聚糖含量(wt％)；C：反应温度(℃)

(二)制备与纯化

根据上述正交设计法，分析优选试验条件，采用化学共沉淀法一步合成葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料(DCIONPs)。在适量葡聚糖的存在下，依据化

学反应式：

经超声波的粉碎空化作用，并通入氮气防止二价铁的氧化，在液相条件下合成微粒。利用其磁响应性，在外加磁场的作用下分离纯化磁性微粒。具体步骤如下：

①、4.0g Dextran T-10溶于20ml三蒸去离子水，在通入氮气的同时，加入2.33mmolFeCl₃·6H₂O和1.26mmolFeCl₂·4H₂O；

②、溶液经超声波，功率200瓦作用3分钟后，加大功率至325瓦，逐滴加入25％-30％氨水1.2ml；

③、调整超声波功率至300瓦，持续模式作用于反应液30分钟，脉冲模式作用30分钟；

④、冷却后得到黑色胶体混悬液；

⑤、将所得黑色胶体混悬液置于5×10³高斯磁场中作用1h，即得本发明葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料。

所述步骤①、②、③中的反应容器均置于冰水浴中，以利于良好的散热。

若要获得固态样品，可置于旋转蒸发器中进行真空干燥。

(三)葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的理化性质检测：

1.外观形态：室温条件下，肉眼观察微粒及磁液的外观形态。

2.扫描电镜观察：将样品适度稀释后经常规处理，置于扫描电镜下观察微粒的形态及大小。

3.激光光散射粒度分析仪检测：将磁液样品用过膜三蒸水稀释至无色透明后，在激光光散射粒度分析仪中检测颗粒有效粒径、粒径分布及Zeta电位。重复检测三次，每次进行一分钟，取平均值。

4.原子力显微镜观察：滴一滴样品于干净盖玻片上，于层流室中自然晾干，然后置于原子力显微镜下，选择“tapping”模式，观察微粒大小及表面形态。

5.磁响应性检测：将样品装于平底容器中，在外加场强为10⁴Oe、温度为18℃条件下进行检测。重复测试三次，取平均值。

结果

(一)正交法分析制备DCIONPs的影响因素

根据表2.1的正交设计进行试验，结果见表2。

表2  不同试验条件制备DCIONPs的方案及结果

样品编号	影响因素			评估指标
							A	B	C	X1	X2	X3
	DX1DX2DX3DX4DX5DX6DX7DX8DX9	0.030.030.030.060.060.060.120.120.12	510205102051020	205080508020802050	256.3161.1105.4768.1280.1132.2538.1205.0124.8	0.1010.1710.1960.2530.1160.1330.2140.1550.205							25.425.324.326.826.425.328.828.127.4

影响因素(自变量)：A：总铁含量(mmol/ml)；B：葡聚糖含量(wt％)；C：反应温度(℃)评估指标(因变量)：X1：样品有效粒径(nm)；X2：样品多分散性；X3：样品饱和磁化强度(emu/g)

根据上述实验方案得到的结果显示：影响微粒性质的因素主要有两个：即A、反应液中总铁含量；B、反应液中葡聚糖的含量。从上表可以看出，当反应液中铁的含量越高，制得的样品磁响应性越高(见图1)；当反应液中葡聚糖的含量越高，样品的有效粒径越小、分散度越好(见图2)。而反应的温度对实验结果无显著影响。可见，对于制备性质稳定、粒子粒径小、磁响应性高的磁性纳米微粒，反应物的含量是关键。

在医学应用中，人们往往需要粒径足够小、磁响应性足够高的磁性微粒，但这却是一对矛盾。磁微粒的粒径太小则磁响应性就会较低，反之亦然。那么，如何使二者达到一个平衡，使其微粒够小、磁性较高？将Fe/dextran的比值作为横坐标，分别将粒径(size)、饱和磁响应强度(Ms)作为纵坐标作图(图3，图4)。

(二)葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的理化性质

1.外观形态：改良制备的葡聚糖磁性微粒为黑色胶体混悬液(图5)，密封常温保存3个月性质不改变。

2.扫描电镜观察：颗粒以椭圆形和球形居多，另有少许不规则形，边界明显。颗粒中心部位颜色较深，而周边颜色较浅，提示有壳核结构存在。镜下观，颗粒大小多为200nm左右(图6)。

3.激光光散射粒度分析仪检测：经三次重复检测，测得有效粒径为93.1±2.2nm；分散度为0.083±0.011，分散性好；半峰宽为26.7±1.3nm，粒径分布图显示为单峰分布，峰型窄，提示该样品大小较均一(图7)。进一步分析，显示该样品95％的粒子其粒径小于102.51纳米(图8)，99％的粒子其粒径小于122.26纳米(图9)。Zeta电位检测显示该微粒表面带正电(图10)。

4.原子力显微镜观察：显示多数大小约为200nm左右的大颗粒是由数个球形或卵圆形微粒黏附在一起，每个微粒的粒径普遍在50nm以下。另外，颗粒表面比较粗糙，似有绒毛样结构。因此，通过原子力显微镜观察，可以认为该方法制备出的微粒的实际大小为50nm以下，甚至更小(图11、12)。

5.磁性微粒的磁响应性分析：在外加场强为10⁴Oe的情况下，微粒的饱和磁响应强度为26.0±1.1emu/g，撤除磁场后剩磁为零，提示此法制备的葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料具有良好的超顺磁性(superparamagnetism)。

磁性基因复合物的合成及特性研究材料和方法

一、材料

(一)试剂

pGenesil-1质粒载体购自武汉市晶赛生物工程技术有限公司

Lipofactamine2000转染试剂购自Invitrogen

Sofast梭华转染试剂购自厦门太阳马生物工程有限公司

DCIONPs为本课题组自制(有效粒径为93.1±2.2nm，半峰宽为26.7±1.3nm，磁响应性为26.0±1.1emu/g)

DMEM高糖细胞培养基购自Invitrogen公司

小牛血清购自Hyclone公司

胰蛋白酶购自Amresco公司

青霉素、链霉素购自华北制药厂

实验用水均为双蒸水及三蒸水。

(二)细胞株

人大肠癌Lovo细胞株由武汉大学生命科学院细胞培养室提供。

(三)仪器

JY-9211型超声细胞粉碎仪(宁波科学生物仪器厂)

JJ-3控温定时电动搅拌器(常州国华电器有限公司)

Anke TGL-16G型台式高速离心机(上海安亭科学仪器厂)

钕-铁-硼(Nd-Fe-B)永磁体0-5000高斯(包头磁铁厂)

JA1003型精密电子天平(上海良平仪器仪表有限公司)

SZ-97型自动三重纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂)

XW-80A型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)

YDS-10型液氮生物容器(成都金凤液氮容器有限公司)

DZF型真空干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)

BB16UV CO2气体培养箱(Heraeus公司)

BHC-1360IIA/B3型生物安全柜(哈尔滨东联电子技术开发有限公司)

XD-101型倒置生物显微镜(南京江南光电集团股份有限公司)

OPTON EM10C型透射电镜(同济医学院超微病理教研室)

倒置荧光显微镜(OLYMPUS公司)

二、方法

(一)磁性基因复合物的合成

1.配制梯度浓度的DCIONPs磁液。

2.以不同浓度相同体积的DCIONPs与一定量的pGenesil-1质粒载体充分混合作用。

3.按DCIONPs(Fe)∶pGenesil-1质量比分成5组(1∶1，5∶1，10∶1，15∶1，20∶1)，并设置单纯质粒(不加磁液)作为对照组。

4.充分混合、吹打，并于常温下水平摇床振荡作用5分钟，溴化乙锭(EB)染色。

5.琼脂糖凝胶电泳30分钟，紫外光下显影。

6.BANDSCAN软件分析结合率。

(二)大肠癌lovo细胞株的复苏、传代培养及接种

1.细胞复苏

(1)从液氮罐中取出冻存管。

(2)立即置于37℃水浴中，持续摇晃使其尽快融化。

(3)酒精消毒瓶颈后，用吸管吸出lovo细胞悬液，注入离心管并滴加约10倍培养液混合。

(4)800rpm离心5分钟后，除去上清液。

(5)重复上述步骤，用培养液再洗涤一到两次。

(6)弃上清后，加入1ml DMEM培养液并吹打成细胞悬液。

(7)用吸管吸出细胞悬液，滴入25ml培养瓶中，加入含10％小牛血清的DMEM培养液稀释。

(8)放入37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.当细胞生长到覆盖培养瓶壁大部分面积时，可进行细胞的传代培养

(1)倒掉培养瓶中陈旧培养液。

(2)加入PBS液冲洗1-2次。

(3)加入适量0.25％的胰蛋白酶，37℃消化3-5分钟。

(4)倒置显微镜下观察，细胞间隙增大、形状渐变圆即加入培养液停止消化。

(5)吸管吸取培养液，轻轻吹打瓶壁至细胞脱落、瓶壁透明为止。

(6)移取细胞悬液于无菌试管中，1000bpm离心5分钟，倒掉上清液。

(7)加入含小牛血清的培养液，小心吹打制成细胞混悬液。

(8)分装入若干个25ml无菌培养瓶中，置于培养箱中继续培养。

3.细胞种板

(1)如上述方法将lovo细胞消化脱壁后终止消化。

(2)吸取细胞于无菌试管中离心弃上清。

(3)加入培养液后小心吹打制成细胞混悬液。

(4)滴一滴混悬液于细胞计数板上，于倒置显微镜下观察计数。

(5)调整混悬液细胞浓度至约为10⁵/ml，接种于96孔板。

(6)补充培养液至每孔200μl，置于培养箱中培养。

(三)磁性转染效率的检测

以不同的基因载体(包括Lipofactamine2000、Sofast梭华及自行制备的DCIONPs)载附相等量的pGenesil-1空质粒(含绿色荧光蛋白表达框)体外转染大肠癌细胞-Lovo细胞。分别给予外加磁场(5×10³高斯)和不加磁场作用1小时后，于不同时间点(1h，2h，4h，8h，16h，24h，48h)在倒置荧光显微镜下观察细胞的绿色荧光蛋白的表达，比较其转染效率。

结果

(一)磁性基因复合物结合率的检测

当质粒DNA与磁性纳米微粒结合后，其空间构象发生改变，不能与溴化乙啶(Ethidium Bromide，EB)结合显色；而没能结合上的质粒DNA可以与EB结合而显色。因此，可以通过琼脂糖凝胶电泳的显色亮度来观察磁性纳米微粒与核酸的结合情况。

电泳结果显示，随着DCIONPs的含量逐渐增加，与其结合的pGenesil-1逐渐增多，没能结合而显影的DNA逐渐减少(图13)。BANDSCAN软件分析显示，当二者的质量比从1增加到5时，二者结合率有一个快速升高的过程。而继续增加磁性微粒的含量，结合率升高的过程趋缓(图14)。当质量比为20∶1时，pGenesil-1结合率达到50％。

(二)磁性转染的效率比较

Lovo细胞中绿色荧光蛋白(eGFP)的检测结果显示，在外加磁场作用组，早期DCIONPs的转染效率与Lipofactamine2000无显著性差异，但均比Sofast梭华为高(图15)。8h及以后，DCIONPs的转染效率渐低于Lipofactamine2000，48h时与Sofast梭华的转染效率无显著性差异(图16)。

在不加磁场组，早期及晚期的转染效率Lipofactamine2000均高于后两者，DCIONPs与Sofast梭华无显著性差异(图17，18)。对于Lipofactamine2000及Sofast，有无磁场在相同时间点时无显著差异。

对于DCIONPs，8小时前的转染效率外加磁场组明显高于无磁场组，8小时后二者渐趋一致。

Claims (4)

1、葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的制备方法，其特征在于其化学反应式为：

具体步骤如下：

①、4.0g Dextran T-10溶于20ml三蒸去离子水，在通入氮气的同时，加入2.33mmolFeCl₃·6H₂O和1.26mmolFeCl₂·4H₂O；

②、溶液经超声波，功率200瓦作用3分钟后，加大功率至325瓦，逐滴加入25％-30％氨水1.2ml；

③、调整超声波功率至300瓦，持续模式作用于反应液30分钟，脉冲模式作用30分钟；

④、冷却后得到黑色胶体混悬液；

⑤、将所得黑色胶体混悬液置于5×10³高斯磁场中作用1h，即得本发明葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料。

2、根据权利要求1所述的葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的方法，其特征在于所述步骤①、②、③中的反应容器均置于冰水浴中。

3、根据权利要求1或2所述制备方法所制得的葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料，其特征在于其有效粒径为93.1±2.2nm，半峰宽为26.7±1.3nm，Zeta电位为正，分散度为0.083±0.011，磁响应性为26.0±1.1emu/g。

4、葡聚糖四氧化三铁磁性纳米材料的应用，其特征在于将其作为医药载体在制药中的应用。

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