CN106841143B - 各物种亮度与浓度的获取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明实施例公开了一种各物种亮度与浓度的获取方法，所述方法包括：对所述溶液连续发射m次激光脉冲以激发物种的分子发出光子，并通过检测器接收所述光子，以获取光子流数据；基于获取的光子流数据统计各次激光脉冲所激发出的光子数量，以获取各光子数量的频数；根据各所述频数确定至少两种光子激发情况的出现概率；根据至少两种光子激发情况的出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系建立方程组，求解计算所述溶液中各物种的亮度与浓度。本发明实施例避免了荧光寿命相差不大的多个物种无法获取亮度与浓度的问题，实现了获取各物种亮度与浓度的有益效果。

Description

各物种亮度与浓度的获取方法
技术领域
本发明实施例涉及荧光分析领域，尤其涉及各物种亮度与浓度的获取方法。
背景技术
随着光学检测领域的快速发展，荧光相关光谱在对物质性质、分子间相互作用等检测方面受到重用。
荧光相关光谱(Fluorescence Correlation Spectroscopy，FCS)是一种常用的研究分子扩散及化学反应动力学的方法，可测定微区内(<10-15L)荧光团由于布朗运动或化学反应而导致的荧光强度涨落，是一种重要的单分子检测技术。
然而，当体系中存在多个物种时，传统的FCS分析方法得到的是所有物种行为的加和，无法对物种进行区分，也就无法获得物质性质的信息。虽然采用荧光寿命等参数可以对荧光物种进行区分，获取各物种的亮度与浓度，但是只适用于物种的荧光寿命有较大差别的情况，当多个物种的荧光寿命相差时无法获取。
发明内容
本发明实施例提供一种各物种亮度与浓度的获取方法，能够避免当多个物种的荧光寿命相差不大时无法获取各物种亮度与浓度的问题。
本发明实施例提供了一种各物种亮度与浓度的获取方法，所述溶液中包含至少两种物种的分子，包括：
对所述溶液连续发射m次激光脉冲以激发物种的分子发出光子，并通过检测器接收所述光子，以获取光子流数据；
基于获取的光子流数据统计各次激光脉冲所激发出的光子数量，以获取各光子数量的频数；
根据各所述频数确定至少两种光子激发情况的出现概率；
根据至少两种光子激发情况的出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系建立方程组，求解计算所述溶液中各物种的亮度与浓度。
本发明实施例提供了一种各物种亮度与浓度的获取方法，通过确定至少两种光子激发情况的出现概率，根据至少两种光子激发情况的出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系建立方程组，求解计算所述溶液中各物种的亮度与浓度，避免了荧光寿命相差不大的多个物种无法获取亮度与浓度的问题，实现了获取各物种亮度与浓度的有益效果。
附图说明
图1是本发明实施例中的一种各物种亮度与浓度的获取方法的流程图；
图2是本发明实施例中的Yl'非线性拟合曲线图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施例仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。另外还需要说明的是，为了便于描述，附图中仅示出了与本发明相关的部分而非全部结构。
图1为本发明实施例提供的一种各物种亮度与浓度的获取方法的流程图，本实施例可适用于各物种亮度与浓度的获取的情况，如图1所示，具体包括：
S110、对所述溶液连续发射m次激光脉冲以激发物种的分子发出光子，并通过检测器接收所述光子，以获取光子流数据。
本发明实施例采用TTTR(Time-tagged time resolved，时间标记时间分辨)模式和多通道模式，利用单分子荧光的反聚束效应(anti-bunching)的原理方法进行测试。其中，单分子荧光的反聚束效应，即当激发脉冲的时间短于荧光分子中电子从第一电子激发态跃迁到基态所需的时间时，单个荧光分子在该脉冲下发射的光子数不可能大于一个，因此每个脉冲内检测到的光子数与共聚焦微区内的各物种浓度与亮度密切相关，通过统计不同情况发光情况的概率计算各物种的浓度与亮度。
检测器包括光源、共聚焦光学系统、数据采集系统和光子检测器等部分。其中，共聚焦光学系统包括二色镜、透镜和滤光片；数据采集系统为时间相关单光子计数器；光子检测器通常为高灵敏度的单光子检测器。具体的，光源产生的激光光束经二色镜反射后由显微镜物镜聚焦在样品上，激发样品中的荧光分子，样品产生的荧光通过同一个物镜收集，并由单光子检测器检测。由于单光子检测器只能接收到一个光子，为单通道模式，因此在收集光子流数据时放置多个单光子检测器(例如，八个单光子检测器)，用于检测单个激光脉冲激发光子的条件下，多个单光子检测器接收到的光子。需要说明的是，当放置八个单光子检测器时，最多接收到单个激光脉冲激发的八个光子。
当一束激光照射与激光能量匹配的某荧光物质时，该物质的电子吸收能量后从基态跃迁到某一激发态上，由于在激发态上的电子具有不稳定性，因此，激发态上的电子再以辐射跃迁的形式回到基态并发出光子。连续发射m次激光脉冲以激发物种的分子发出光子，并通过检测器接收光子，以获取光子流数据。
S120、基于获取的光子流数据统计各次激光脉冲所激发出的光子数量，以获取各光子数量的频数。
其中，频数为统计的激光脉冲激发不同光子数情况的个数。例如，若连续发射10万个脉冲，那么统计激光脉冲激发出2个光子的脉冲个数则为一种光子数量的频数。
S130、根据各所述频数确定至少两种光子激发情况的出现概率。
由于光子检测器可检测到每个激光脉冲激发光子的数量，因此可以根据各光子数量的频数确定至少两种激发情况的出现概率。
在本发明实施例中，所述光子激发情况的出现概率为：在连续发射m个激光脉冲时，计算至少K次情况的出现概率，所述出现概率为依次选取连续至少一次激光脉冲激发的光子数量，其他激光脉冲的激发光子数量设定为0的概率。
(1)当K＝1时，采用如下公式计算出现概率：
其中，为所述出现概率，下标为m次激光脉冲中的各次激光脉冲时接收的光子数量，Mm为连续发射m个激光脉冲的情况下，各物种均不发光的概率；
那么，公式(2)的物理含义则为连续发射m个激光脉冲的情况下，选取第一个激光脉冲激发n个光子，其他激光脉冲的激发光子数为0的概率。
例如，当溶液中存在两个不同亮度的荧光物种a1与a2时，在连续m个激光脉冲激发光子情况下，溶液中a1物种产生一个光子(即n＝1，连续m个激光脉冲激发条件下，选取第一个激光脉冲接收一个光子，其它激光脉冲无光子的情况)的概率可用下列式子计算：
其中，分别表示a1，a2物种的分子个数。p的下角标分别表示物种和编号，例如表示a1物种任意位置的分子在共聚焦显微镜观察区域中心位置的发光概率。其中，在这种情况下，各物种均不发光的概率Mm为
为了简化公式(8)，采用表示同理可知，采用表示故可简化为
那么，溶液在连续m个激光脉冲激发光子情况下，激发一个光子的出现概率为：
经过推导，溶液在连续m个激光脉冲激发光子情况下，激发n个光子的出现概率为：
对上述公式(9)等号两边同时取对数，得到：
当m为已知值，以n为自变量，为因变量时，用公式(10)对实验数据(包括模拟数据)进行线性拟合，即可得到斜率的值。
(2)当K＝2时，采用如下公式计算出现概率：
公式(3)的物理含义为连续发射m个激光脉冲的情况下，选取第一个激光脉冲激发n-1个光子，第二个激光脉冲激发1个光子，其他激光脉冲的激发光子数为0的概率。
当溶液中存在两个不同亮度的荧光物种a1与a2时，激发n个光子的出现概率为：
结合公式(9)，计算得到：
其中，由此推导P'＝P/Mm其中，P'为K设定为不同值时的出现概率除以Mm，用于简化计算。
以为自变量，为因变量，对公式(12)进行线性拟合，即可得到斜率的值。
(3)当K＝3时，采用如下公式计算出现概率：
公式(4)的物理含义为连续发射m个激光脉冲的情况下，选取第一个激光脉冲激发n-2个光子，第二个激光脉冲激发1个光子，第三个激光脉冲激发1个光子，其他激光脉冲的激发光子数为0的概率。
当溶液中存在两个不同亮度的荧光物种a1与a2时，激发n个光子的出现概率为：
结合公式(9)与公式(11)，计算得到：
以为自变量，
为因变量，并将公式(10)与公式(12)经过计算拟合出的数据与代入公式(14)，经过线性拟合得到斜率的值。
(4)当K＝4时，采用如下公式计算出现概率：
其中，t的取值范围为小于等于m且大于等于1。
公式(5)的物理含义为连续发射m个激光脉冲的情况下，选取第一个激光脉冲激发n-3个光子，第二个激光脉冲激发1个光子，第三个激光脉冲激发1个光子，第四个激光脉冲激发1个光子，其他激光脉冲的激发光子数为0的概率。
当溶液中存在两个不同亮度的荧光物种a1与a2时，激发n个光子的出现概率为：
由于在统计m次激光脉冲激发的各光子数量的频数中，n值越大，实验误差越大，因此当n＝4时，直接将公式(10)、公式(12)以及公式(14)计算拟合出的数据
以及
代入公式(15)，得到的值。
(5)当K＝5时，采用如下公式计算出现概率：
其中，为K＝5时的出现概率；
C为排列组合中的数学运算符号。
公式(6)的物理含义为连续发射m个激光脉冲的情况下，选取前n(odd，奇数)次激光脉冲的激发光子数为1，其他激光脉冲的激发光子数为0的概率。
为了提高计算的各物种亮度与浓度的精确度，当溶液中存在两个不同亮度的荧光物种a1与a2时，在公式(6)中代入n＝5，通过上述计算方法即可求出的值。
(6)当K＝6时，采用如下公式计算出现概率：
为K＝6时的出现概率。
公式(7)的物理含义为连续发射m个激光脉冲的情况下，选取前n(even，偶数)次激光脉冲的激发光子数为1，其他激光脉冲的激发光子数设定为0的概率。
同理，为了提高计算的各物种亮度与浓度的精确度，当溶液中存在两个不同亮度的荧光物种a1与a2时，在公式(7)中代入n＝6，采用单点代入数学运算方法，即可求出的值。以此类推，通过数学运算，可以推导出一系列的值，其中，l可以取小于等于m且大于等于1的任意数值。
需要说明的是，当溶液中存在多于两个物种时，则需要求出更多光子激发情况的出现概率，以求出一系列的值，求值过程中可以采用线性拟合的数学运算方法，也可以采用单点代入的数学运算方法，其中，K的取值范围与物种个数有关。
S140、根据至少两种光子激发情况的出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系建立方程组，求解计算所述溶液中各物种的亮度与浓度。
在本发明实施例中，所述出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系为：
其中：
下标l的取值范围为小于等于m且大于等于1。
A是物种种类的数量，a是物种序号，a的取值范围大于等于1且小于等于A；
n为多次激光脉冲激发的总光子数量；
V为溶液的体积；
Na为a物种在溶液中的分子个数；
pa为溶液中a物种分子的整体发光概率；
pa,1为a物种任意位置的分子在共聚焦显微镜观察区域中心位置的发光概率；
Ia为a物种的亮度；
Sa为共聚焦显微镜观察区域体积中a物种分子的个数。
s的取值范围为小于等于m且大于等于1。
具体的，在连续发射m个激光脉冲的条件下，溶液中光子激发情况的出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系推导如下：
由于分子在溶液中处于自由扩散状态，故在共聚焦显微镜观察区域中，溶液中各物种分子的整体发光概率为任意分子在某一位置的发光概率在整个共聚焦体积内进行积分而得，具体为：
其中，Na为溶液中a物种分子的总数；
x，y，z为分子所处的位置；
wxy为共聚焦的横轴尺寸；
wz为共聚焦的纵轴尺寸；
V0为表观共聚焦体积。
结合公式(16)，对公式(17)进行简化运算，即可得到公式(1)。
需要说明的是，为了更便于计算和总结规律，引入一个中间量Yl'，
其中，Yl'可通过公式(1)为固定m、s为任意值，整理消元而得。最后，对简化后的Yl'方程进行非线性拟合，即可得到Ia与Sa值。
当溶液中存在两个不同亮度的荧光物种a1与a2时，代入公式(1)，得到的非线性拟合图像，如图2所示。
例如，以a1与a2两个荧光物种的动力学模拟数据为例，通过设定模拟参数得到一组光子流数据，其中量子产率浓度扩散常数对光子流数据进行统计，得到每个激光脉冲下所激发出的光子数量，并统计出各种情况下的出现概率与不发光概率Mm值。
当m＝6时，统计各个情况的出现概率如下表所示：
表一
将表一中的出现概率值，按照不同情况分类，分别带入公式(6)、公式(7)、公式(9)、公式(11)、公式(13)以及公式(15)即可得到 的值，通过非线性拟合方程可得到 的值。
如下表二所示，分别记录了的实际概率统计计算的实验值与通过非线性拟合计算的模拟理论值，由表二可知，通过本发明实施例的处理方法，得到的各物质的亮度与在共聚焦显微镜观察区域体积中物种分子的个数的误差较小。
表二
实验值 理论值 相对误差
I<sub>A</sub> 0.1417 0.1412 0.35％
I<sub>B</sub> 0.07681 0.07061 8.78％
S<sub>A</sub> 0.04820 0.04802 0.37％
S<sub>B</sub> 0.04337 0.04802 -9.68％
在本发明实施例中，所述各物种的浓度为：各物种在共聚焦显微镜观察区域中的分子的个数与共聚焦显微镜观察区域的体积相除所得之商。
通过非线性拟合后，只能得到的Sa为在共聚焦显微镜观察区域体积中a物种分子的个数，由于a物种的浓度为a物种在共聚焦显微镜观察区域中的分子的个数与共聚焦显微镜观察区域的体积相除所得之商，因此，可以计算出a物种的浓度。
本发明实施例通过确定至少两种光子激发情况的出现概率，根据至少两种光子激发情况的出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系建立方程组，求解计算所述溶液中各物种的亮度与浓度，避免了荧光寿命相差不大的多个物种无法获取亮度与浓度的问题，实现了获取各物种亮度与浓度的有益效果。
注意，上述仅为本发明的较佳实施例及所运用技术原理。本领域技术人员会理解，本发明不限于这里所述的特定实施例，对本领域技术人员来说能够进行各种明显的变化、重新调整和替代而不会脱离本发明的保护范围。因此，虽然通过以上实施例对本发明进行了较为详细的说明，但是本发明不仅仅限于以上实施例，在不脱离本发明构思的情况下，还可以包括更多其他等效实施例，而本发明的范围由所附的权利要求范围决定。

Claims (2)

1.一种溶液中各物种亮度与浓度的获取方法，所述溶液中包含至少两种物种的分子，其特征在于，包括：
对所述溶液连续发射m次激光脉冲以激发物种的分子发出光子，并通过检测器接收所述光子，以获取光子流数据；
基于获取的光子流数据统计各次激光脉冲所激发出的光子数量，以获取各光子数量的频数；
根据各所述频数确定至少两种光子激发情况的出现概率，其中，所述光子激发情况的出现概率为在连续发射m个激光脉冲时，计算至少K次情况的出现概率，所述出现概率为依次选取连续至少一次激光脉冲激发的光子数量，其他激光脉冲的激发光子数量设定为0的概率；
根据至少两种光子激发情况的出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系建立方程组，求解计算所述溶液中各物种的亮度与浓度，各物种的浓度为：各物种在共聚焦显微镜观察区域中的分子的个数与共聚焦显微镜观察区域的体积相除所得之商；所述出现概率与各物种的亮度以及浓度的量化关系为：
其中：
下标l的取值范围为小于等于m且大于等于1；
A是物种种类的数量，a是物种序号，a的取值范围为大于等于1且小于等于A；
n为多次激光脉冲激发的总光子数量；
V为溶液的体积；
Na为a物种在溶液中的分子个数；
pa为溶液中a物种分子的整体发光概率；
pa,1为a物种任意位置的分子在共聚焦显微镜观察区域中心位置的发光概率；
Ia为a物种的亮度；
Sa为共聚焦显微镜观察区域体积中a物种分子的个数；
s的取值范围为小于等于m且大于等于1。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，根据各所述频数确定光子激发情况的出现概率包括：
当K＝1时，采用如下公式计算出现概率：
其中，为所述出现概率，下标为m次激光脉冲中的各次激光脉冲接收的光子数量，Mm为连续发射m个激光脉冲的情况下，各物种均不发光的概率；
当K＝2时，采用如下公式计算出现概率：
当K＝3时，采用如下公式计算出现概率：
当K＝4时，采用如下公式计算出现概率：
其中，t的取值范围为小于等于m且大于等于1；
当K＝5时，采用如下公式计算出现概率：
其中，为K＝5时的出现概率；
C为排列组合中的数学运算符号；
当K＝6时，采用如下公式计算出现概率：
为K＝6时的出现概率。
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