CN106834374A - 一种酶催化制备l‑天冬氨酸（2,3,3‑d3）的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种酶催化制备L‑天冬氨酸(2,3,3‑D3)的方法，其步骤如下：(1)依次将L‑天冬氨酸或其盐、α‑酮戊二酸(或α‑酮戊二酸钠)置于三口瓶中，氩气氛下油泵置换三次，然后在氩气氛下加入氘水，用氘氧化钠溶液/碳酸锂氘水溶液/无水三乙胺调节反应液pD值为8.0‑9.0，在32‑42℃下保温，然后加入谷草转氨酶20‑100U，保温1‑5天；(2)将上述反应液用微孔滤膜过滤，减压蒸去大部分氘水并回收，然后调节pH值至2.5‑3.0，静置冷却结晶，过滤干燥，得到产品。本发明具有的优点为直接采用廉价的氨基酸为底物，氘水为氘源，直接得到手性的L‑天冬氨酸(2,3,3‑D3)纯品。
Description
技术领域
本发明涉及一种合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，尤其涉及一种直接以廉价的L-天冬氨酸、氘水为原料合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法。
背景技术
L-天冬氨酸(2,3,3-D3)是重要的稳定同位素标记氨基酸，在医学、生物学、药学及化学等方面具有广泛的应用。L-天冬氨酸(2,3,3-D3)可用于合成稳定同位素标记多肽化合物，在多肽等的生物代谢、疾病诊断与治疗和氨基酸在细胞培养中的机理及作用时具有重要意义。同时，L-天冬氨酸(2,3,3-D3)也是合成其他氘代L-氨基酸的重要原料，如L-赖氨酸(2,3,3-D3)、L-亮氨酸(2,3,3-D3)、L-精氨酸(2,3,3-D3)等；或者合成氘代非生物体L-氨基酸、氘代非生物体β-氨基酸等的重要原料。
目前合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)主要有以下几种方法：
1、以丁炔二酸二甲酯为原料，先还原成丁烯二酸二甲酯(2,3-D2)，然后水解形成丁烯二酸(2,3-D2)，最后在氘代氨水存在的条件下利用细菌生物合成形成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)；
本方法先由丁炔二酸二酯，用氘气还原或氘水存在下用三苯基膦催化得到丁烯二酸二酯(2,3-D2)，随后将二酯水解成酸后，在细菌的作用下与氘代氨水进行生物合成而得到L-天冬氨酸(2,3,3-D3)，综合产率为40-50％。此方法直接采用氘水和氘代氨水合成，具有氘利用率高的特点，但此方法反应路线较长，特别是使用细菌进行合成时需要对细菌进行培养和处理，过程较为繁琐。
2、用氘代溴代乙酸乙酯或氘代碘代乙酸乙酯与氨基酸合成子如乙酰氨基丙二酸二乙酯、二苯亚甲基氨基乙腈等结合，然后在氘水或氘代盐酸存在的条件下水解得到L-天冬氨酸(2,3,3-D3)或DL-天冬氨酸(2,3,3-D3)。但此种方法步骤较长，且手性合成子合成成本高，非手性合成子则需要进行拆分，同时过多的无机盐需要用树脂进行纯化，过程较为繁琐。
综上可知，目前合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法均较为繁琐，或需要进行拆分，或综合产率严重偏低，且需要用树脂进行纯化。
发明内容
针对上述缺点，本发明的目的在于提供一种一种酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，该方法价格低廉，反应过程简单易控，反应条件温和，产品提纯方便，产率高，成本低。
一种酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，包括以下步骤：
在碱性条件下，L-天冬氨酸或其盐和氘水在谷草转氨酶和酶辅剂的作用下发生酶催化反应，反应结束后，经过后处理得到所述的L-天冬氨酸(2,3,3-D3)。
本发明通过采用谷草转氨酶和酶辅剂作为酶催化剂，直接采用L-天冬氨酸为原料，以价廉易得的氘水为氘源，不需要拆分，一步直接合成L-天冬氨酸(2,3,3-D3)，整个操作过程简单易控，最后得到的产品的氘丰度高。
本发明的具体的合成路线如下：
pD值会对产品的氘丰度产生较大的影响，作为优选，所述的碱性条件下的pD值为8.0-9.0。
作为优选，所述的碱为氘氧化钠氘水溶液、碳酸锂氘水溶液或三乙胺氘水溶液；为了提高纯化效率和节省反应成本，反应过程中可以采用碳酸锂、无水三乙胺调节溶液pH值，从而降低氘用量。
作为优选，所述的酶辅剂为α-酮戊二酸或α-酮戊二酸盐。
酶催化反应的温度和时间也会对氘丰度产生较大的影响，作为优选，所述的酶催化反应的温度为32-42℃，所述的酶催化反应的时间为1～5天。
作为优选，所述的谷草转氨酶的用量为20-100U，所述的辅酶剂与所述L-天冬氨酸或其盐的摩尔比为1：0.01～0.2。
本发明中，所述的后处理过程如下：先采用微孔滤膜过滤除去酶，然后减压蒸馏回收大部分氘水，再用稀盐酸调节pH值约为2.5-3.2，然后采用无水醇进行结晶得到所述的L-天冬氨酸(2,3,3-D3)。其中，后处理过程所使用的酸和醇都是普通的酸和醇，不需要采用氘代试剂。
作为优选，所述的醇为无水乙醇或无水甲醇，用量为1～50倍体积。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明直接使用价廉易得的L-天冬氨酸为起始原料，氘水为单一氘源一步氢-氘交换合成了L-天冬氨酸(2,3,3-D3)，步骤简单，反应条件温和；
(2)本发明避免使用树脂纯化，极大地简化了纯化步骤，节省了大量的溶剂和合成成本；
(3)本发明避免使用细胞或细菌进行催化转化，省去了细胞或细菌的生物培养过程，直接采用酶，简单高效；
(4)本发明避免使用低温或高温，这对于避免发生手性消旋引起旋光度下降或者因密封问题引起的氘氢交换而引起氘丰度下降具有很重要的意义。
具体实施方式
实施例1
向连有氩气保护气、温度计的100ml三口烧瓶中，依次加入300mg L-天冬氨酸、10mgα-酮戊二酸，油泵置换三次，然后加入10mL氘水，再先加入2-5滴氘氧化钠溶液(10％)使固体溶清，然后再用氘氧化钠溶液调节其pD值为8.0-9.0，最后加入20-50U的谷草转氨酶(GOT)，密封下保温至32-36℃反应3-5天，LC-MS监控反应。反应结束后，先用微孔滤膜过滤除去少量固体及酶，然后减压蒸馏回收氘水，约蒸去70-80％氘水，再用稀盐酸调节溶液pH值至2.5-3.0，静置冷藏结晶(0-10℃)，析出白色固体。过滤，滤饼用冰水洗涤，干燥，得到产品约210mg，产率68.9％，产品用手性柱测定ee值>98％，纯度>98％，LC-MS和1HNMR确定氘丰度>96％。
实施例2
向连有氮气保护气、温度计的100ml三口烧瓶中，依次加入500mg L-天冬氨酸二钠盐、10mgα-酮戊二酸二钠盐，油泵置换三次，然后加入15mL氘水使固体溶清，然后再用氘氧化钠溶液调节其pD值为8.0-9.0，最后加入20-50U的谷草转氨酶(GOT)，密封下保温至32-39℃反应1-3天，LC-MS监控反应。反应结束后，先用微孔滤膜过滤除去少量固体及酶，然后减压蒸馏回收氘水，约蒸去70-80％氘水，再用稀盐酸调节溶液pH值至2.5-3.0，静置冷藏结晶(0-10℃)，析出白色固体。过滤，滤饼用冰水洗涤，干燥，得到产品约400mg，产率79.2％，产品用手性柱测定ee值>99％，纯度>98％，LC-MS和1HNMR确定氘丰度>97％。
实施例3
向连有氩气保护气、温度计的100ml三口烧瓶中，依次加入300mg L-天冬氨酸、10mgα-酮戊二酸、167mg碳酸锂，油泵置换三次，然后加入10mL氘水使固体溶清，期间会有气体产生，然后再用碳酸锂氘水溶液调节其pD值为8.0-9.0，最后加入20-50U的谷草转氨酶(GOT)，密封下保温至34-40℃反应2-4天，LC-MS监控反应。反应结束后，先用微孔滤膜过滤除去少量固体及酶，然后减压蒸馏回收氘水，约蒸去70-80％氘水，再用稀盐酸调节溶液pH值至2.5-3.0，加入10倍体积的无水乙醇，静置冷藏结晶(0-10℃)，析出白色固体。过滤，滤饼用冷无水乙醇洗涤，干燥，得到产品约275mg，产率90.8％，产品用手性柱测定ee值>98％，纯度>99％，LC-MS和1HNMR确定氘丰度>97％。
对比例1
向连有氩气保护气、温度计的100ml三口烧瓶中，依次加入300mg L-天冬氨酸、10mg吡哆醛盐酸盐，油泵置换三次，然后加入10mL氘水，再先加入2-5滴氘氧化钠溶液(10％)使固体溶清，然后再用氘氧化钠溶液调节其pD值为8.0-9.0，最后加入20-50U的谷草转氨酶(GOT)，密封下保温至35-38℃反应5-6天，采用LC-MS监控反应。反应结束之后，先用水相微孔滤膜过滤除去少量固体以及酶，然后减压蒸馏以回收氘水，约蒸去70-80％氘水后，再用稀盐酸调节残余溶液pH值至2.5-3.0，静置冷藏(0-10℃)结晶，析出白色固体。过滤，滤饼用冰水-无水乙醇洗涤，干燥，得到产品约200mg，产率65.8％，纯度>98％，LC-MS和1HNMR确定氘丰度约为87％。
Claims (8)
1.一种酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在碱性条件下，L-天冬氨酸或其盐和氘水在谷草转氨酶和酶辅剂的作用下发生酶催化反应，反应结束后，经过后处理得到所述的L-天冬氨酸(2,3,3-D3)。
2.根据权利要求1所述的酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，其特征在于，所述的碱性条件下的pD值为8.0-9.0。
3.根据权利要求1所述的酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，其特征在于，所述的酶辅剂为α-酮戊二酸或α-酮戊二酸盐。
4.根据权利要求1所述的酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，其特征在于，所述的碱为氘氧化钠氘水溶液、碳酸锂氘水溶液或三乙胺氘水溶液。
5.根据权利要求1所述的酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，其特征在于，所述的酶催化反应的温度为32-42℃，所述的酶催化反应的时间为1～5天。
6.根据权利要求1所述的酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，其特征在于，所述的谷草转氨酶的用量为20-100U。
7.根据权利要求1所述的酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，其特征在于，所述的后处理过程如下：先采用微孔滤膜过滤除去酶，然后减压蒸馏回收大部分氘水，再用稀盐酸调节pH值约为2.5-3.2，然后采用无水醇进行结晶得到所述的L-天冬氨酸(2,3,3-D3)。
8.根据权利要求7所述的酶催化制备L-天冬氨酸(2,3,3-D3)的方法，其特征在于，所述的醇为无水乙醇或无水甲醇。
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| JENKINS等: "Solvent and substrate deuterium isotope effects on a transamination reaction catalyzed by pig heartaspartate aminotransferase", 《ARCHIVES OF BIOCHEMISTRY AND BIOPHYSICS》 * |
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