CN106834333A - 一种能高效表达中性蛋白酶的质粒、其构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种能高效表达蛋白酶的质粒pHP13N，包含所述质粒pHP13N的细菌的保藏编号为CGMCC No.11680,其包括以下结构部分：A.PAs基因表达盒，由噬菌体的A1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2构成；B.编码枯草芽孢杆菌蛋白酶NprE的基因nprE的编码区；C.质粒pHP13；其中A、B、C三个结构部分之间的结构关系为A与B拼接为AB，然后将AB插入C中。本发明还涉及所述质粒pHP13N的构建方法、包含所述质粒pHP13N的细菌(其保藏编号为CGMCC No.11680)以及上述细菌的构建方法。本发明的重组细菌可以用于食品生产、养殖、饲料生产以及蛋白酶生产等领域。

Description

一种能高效表达中性蛋白酶的质粒、其构建方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种能高效表达中性蛋白酶的质粒、其构建方法及其应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

蛋白酶是一类肽键水解酶，能够将蛋白质水解为多肽、短肽和氨基酸。从蛋白质的羧基末端(C端)逐个水解肽键的蛋白酶，称为羧肽酶；从蛋白质氨基末端(N端)逐个水解肽键的蛋白酶，称为氨基肽酶；二者都属于外肽酶。内肽酶则催化蛋白质内部的肽键水解，水解产物主要为多肽和短肽。内肽酶种类繁多、分布广泛，是具有广泛应用价值的蛋白酶。蛋白酶依据其催化机理科分为：金属蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。也可以根据其反应的最适pH值分为：中性蛋白酶、酸性蛋白酶和碱性蛋白酶。

中性蛋白酶是最适作用pH介于6.0-7.5之间的一类蛋白酶，作为一种生物催化剂，它具有催化的反应速度快，无工业污染等优点。由于中性蛋白酶的耐热性相对较低，中性蛋白酶在食物蛋白水解物的生产过程中成为控制酶活力的关键。大多数微生物中性蛋白酶含有金属元素，部分酶蛋白含有一分子锌，起着酶同底物之间的桥梁作用，有些酶的分子中尚含若干原子钙，钙离子能增加中性蛋白酶的稳定性。

中性蛋白酶是最早为人类所发现并应用于工业化生产的蛋自酶制剂之一。中性蛋白酶在食品、皮革、饲料、医药等领域都有广泛应用。如何获得新的产中性蛋白酶菌株、提高菌株产酶能力是当前的研究重点。传统诱变筛选育种具有速度快、收效大、方法简单等特点，但也有菌种易退化、产酶能力下降、发酵不稳定等问题。随着分子生物技术的广泛应用，中性蛋白酶的分子生物学研究逐步兴起，至今已经克隆出多种不同微生物来源的中性蛋白酶基因，并在细菌及酵母等各种宿主菌中得到了表达。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能高效表达蛋白酶的质粒及其构建方法，本发明的目的还在于提供一种包含上述质粒的高产蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌及其构建方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

本发明第一方面涉及一种能高效表达蛋白酶的质粒pHP13N，包含所述质粒pHP13N的细菌菌株为枯草芽孢杆菌，该菌株已于2015年11月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC No.11680。所述质粒pHP13N包括以下结构部分：

A.PAs基因表达盒，由噬菌体的A1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2构成；其中所述PAs为该基因表达盒的命名；

B.编码枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE的基因nprE的编码区；

C.质粒pHP13；

其中A、B、C三个结构部分之间的结构关系为A与B拼接为AB，然后将AB插入C中。

在本发明优选的实施方案中，所述噬菌体的A1启动子a1的碱基序列如SEQ IDNo.1所示；所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2的碱基序列如SEQ IDNo.2所示；所述结构部分B的碱基序列如SEQ ID No.3所示；所述结构部分C的碱基序列如SEQ ID No.4所示。

在本发明优选的实施方案中，其中所述a1与所述a2的结构关系为a1位于a2的上游；所述A与所述B的位置关系为A位于B的上游；所述AB在所述a1上游的酶切位点Pst I和所述B下游的酶切位点Xma I之间插入C。其中，沿转录进行的方向，将转录起始较早的部位定义为上游，较晚的部位定义为下游。

本发明第二方面涉及根据本发明第一方面所述的质粒pHP13N的构建方法，其包括以下步骤：

a.首先将所述噬菌体的A1启动子a1与所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2拼接，得到结构部分A；

该步骤的具体操作方法可以参照吕娟的硕士论文(吕娟，枯草芽孢杆菌lipA基因表达元件的修饰：[硕士学位论文]，天津；天津大学，2010.)中公开的方法。

b.然后将所述结构部分A与所述结构部分B拼接得到带有酶切位点的AB：设计引物P1和P2，在P1的5’端引入酶切位点Pst I，然后通过PCR扩增，获得扩增后的结构部分A；设计引物P3和P4,在P4的5’端引入酶切位点Xma I，然后通过PCR扩增，获得扩增后的结构部分B；其中P2为嵌合引物，能与结构部分B的5’端互补；然后通过一步PCR拼接法将所述扩增后的结构部分A与所述扩增后的结构部分B拼接，获得带有酶切位点的已修饰的编码枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE的基因nprE片段，即带有酶切位点的AB；其中，设计引物及酶切位点的添加为本领域常规技术手段，本文不再赘述；

c.将所述带有酶切位点的AB和C分别用限制性核酸内切酶进行双酶切并进行纯化；

d.通过DNA连接酶的作用，将经双酶切后的包含AB的基因片段与经双酶切后的C连接，即得到构建好的所述质粒pHP13N，其碱基序列如SEQ ID No.5所示；

其中所述引物P1和P2的序列如下：

P1：5’-AAAACTGCAGCTGAACCGACTTCTCCTT-3’

P2：5’-CAATTTCTTACCTAAACCCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA-3’

P3：5’-GTGGGTTTAGGTAAGAAATTG-3’

P4：5’-TCCCCCCGGGATGTGGACTGAATCATTAGC-3’

所述限制性核酸内切酶识别位点以加下划线的碱基表示。

在本发明优选的实施方案中，其各步骤中具体工艺条件如下:

步骤b的工艺条件如下：

(1)扩增片段A的PCR反应体系

(2)扩增片段A的PCR反应条件

(3)扩增片段B的PCR反应体系

(4)扩增片段B的PCR反应条件

(5)拼接片段A、B的PCR反应体系

其中上述工艺条件(1)(3)(5)中所述“10×全式HiFi DNA聚合酶缓冲液”表示的含义为：所用所述全式HiFi DNA聚合酶缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是DNA聚合酶能够正常催化反应的浓度；

(6)拼接片段A、B的PCR反应条件

步骤c的工艺条件如下：

(1)双酶切反应体系

其中，所述“10×Xma I缓冲液”表示的含义为：所用所述Xma I缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是两种限制性核酸内切酶能够正常催化反应的浓度；其中所述Xma I缓冲液购自ThermoFisher公司；

(2)DNA纯化

DNA纯化采用多功能DNA纯化回收试剂盒对得到的双酶切产物进行纯化以去除干扰的杂片段；

步骤d的工艺条件如下：步骤d反应体系

本发明第三方面涉及包含根据本发明第一方面所述的质粒pHP13N的细菌。本发明提供的菌株为枯草芽孢杆菌，该菌株已于2015年11月17日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，其保藏编号为CGMCC No.11680。

在本发明优选的实施方案中，宿主菌在分类系统中属于：门：Firmicutes；纲：Bacilli；目：Bacillales；科：Bacillaceae；属：Bacillus；种：subtilis。

在本发明优选的实施方案中，宿主菌是以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)DB104为出发菌，敲除了编码未知蛋白的基因yolA和yolB的细菌。

在本发明优选的实施方案中，所述宿主菌细胞大小为直径×长＝(0.7～0.8)×(2～3)微米，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动；芽孢大小为直径×长＝(0.6～0.9)×(1.0～1.5)微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

本发明第四方面涉及根据本发明第三方面所述的细菌的构建方法，其包括以下步骤：

a.将重组质粒pHP13N转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞中，将转化产物涂布于涂有异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)溶液和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)溶液的LBA₁₀₀平板上培养，约26h后，长出蓝色菌落和白色菌落，挑选若干个白色菌落并从每个白色菌落中挑取部分菌，提取其中的质粒进行双酶切，验证质粒的正确性；所述LBA₁₀₀培养基是在LB培养基灭菌后，加入终浓度为100μg/mL的氨苄霉素得到的；异丙基硫代半乳糖苷溶液为溶有20％异丙基硫代半乳糖苷的水溶液；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷溶液为溶有2％的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基酰胺溶液。其中正确重组质粒pHP13N的酶切产物应该为2038bp和4730bp两条带。如果从某个白色菌落中挑取的菌为正确转化子，则该菌落中的其余重组细菌也为正确转化子。

其中所述重组质粒pHP13N向大肠杆菌(Escherichia coli)中的转化方法，其包括以下步骤：

1、将10μL重组质粒pHP13N和100μL大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞混匀，置于冰上30min。

2、42℃水浴保温90s，置于冰上冷却2min。

3、加入1mL LB液体培养基，37℃振荡培养45min，13000r/min离心1min，浓缩菌体，弃上清，使离心管中还有少量LB培养基剩余。

4、将离心管中剩余的LB培养基重悬菌体涂布在LBA固体培养基上，37℃下恒温培养8-12h。

b.提取正确转化子中的重组质粒pHP13N再将其转化进入枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，得到重组细胞，用含氯霉素的LB平板筛选所述重组细胞；

其中重组质粒pHP13N向枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中的转化按照枯草芽孢杆菌的Spirizzen转化方法，其包括以下步骤：

1、挑取活化好的B.subtilis单菌落，接于5mL GMI培养基中，37℃、200r/min振荡培养14h～16h。

2、取500μL上述菌液转接于4.5mL GMI培养基中，37℃、200r/min振荡培养4.5h，使菌体生长至指数生长中后期。

3、取750μL上述菌液转接于4.25mL GMII培养基中，37℃、240r/min振荡培养1.5h，制得感受态细胞。

4、每毫升感受态细胞加入0.5μg所述重组质粒。混匀后，200r/min振荡培养1.5h。

5、将所得菌液13000r/min离心1min。除去900μL上清液，重悬菌体，涂布于抗性平板上。37℃培养14～18h，然后挑选转化子。

其中所述GMI液体培养基(体积为5mL)配方以下：取0.5mL 10×Spizizen基本培养基，0.1mL 2％酸水解酪素，取0.1mL 5％酵母抽提物，0.1mL 40％葡萄糖，50μL 0.5％L-色氨酸，5μL 20％MgSO₄·H₂O，蒸馏水定容至5mL。母液115℃分别灭菌25min。所述GMII液体培养基(体积为5mL)配方如下：取0.5mL 10×Spizizen基本培养基，0.1mL 40％葡萄糖，50μL2％酸水解酪素，40μL 20％MgSO₄·H₂O。蒸馏水定容至5mL。母液115℃分别灭菌25min。所述10×Spizizen基本培养基配方如下：称取2g(NH₄)₂SO₄，18.3g K₂HPO₄，6g KH₂PO₄，1.2g柠檬酸钠，蒸馏水定容至100mL。121℃灭菌15min。10×Spizizen基本培养基指的是所得培养基中各物质浓度为Spizizen基本培养基的10倍。

c.将得到的筛选后的重组细胞涂布于牛奶平板上划线，于37℃环境下培养24小时，得到有菌落周围有水解圈的菌株，即为所述重组质粒正确表达的转化子；其中所述脱脂牛奶平板包括1wt％的脱脂奶粉和2wt％的琼脂，余量为水，，115℃灭菌25min。

本发明第五方面涉及包含根据本发明第三方面所述的细菌的制剂。

本发明第六方面涉及根据本发明第三方面所述的细菌用于食品生产、养殖、饲料生产以及蛋白酶生产领域的用途。

如本文所用，下列术语将具有以下含义：

“PCR(聚合酶链式反应)”:是指DNA在体外95℃高温时变性会变成单链，低温(经常是60℃左右)时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适反应温度(72℃左右)，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链的反应。

“宿主菌”：是指将外源的质粒导入进去的细菌。

“质粒”：存在于细菌染色体以外的独立的DNA分子。

“感受态细胞”：是指处于能吸收外源DNA的生理状态的细胞。

“限制性内切核酸内切酶”：是一类能特异性地识别双链DNA序列并进行切割的酶。

“转化”：是指将外源的DNA导入到细菌内进行表达的过程。

“转化子”：宿主菌吸收了表达载体的DNA片段并把它组合到自己的基因组中，从而获得表达载体部分遗传性状，转化后的宿主菌称为转化子(transformant)。

“表达载体”：是指能将目的DNA片段带入宿主菌，并能进行扩增并进行表达的一类DNA分子，比较常用的是质粒。

“T4连接酶”：一种DNA连接酶。

如本文所用，下列英文缩写将具有以下含义：

dNTP 脱氧核糖核苷三磷酸,包括dATP,dGTP,dTTP,dCTP

DNA 脱氧核糖核酸

ddH2O 双蒸水

RNA 核糖核酸

RNase RNA水解酶

OD600 溶液在600nm波长处的吸光值

Tris 三羟甲基氨基甲烷

SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶电泳

Marker 分子量标准

kDa 千道尔顿

rpm 转/分钟

本发明的优点：本发明中构建了一种新的重组质粒，并将其导入细菌中得到重组基因工程菌，所得重组细菌可用于食品生产、养殖、饲料生产以及蛋白酶生产等领域，其中，在蛋白酶发酵领域，含有本发明所述质粒pHP13N的枯草芽孢杆菌发酵得到的蛋白酶酶活是野生型枯草芽孢杆菌发酵得到的蛋白酶酶活的16倍之多，具有很好的应用价值。

附图说明

图1为结构部分A和结构部分B的PCR产物电泳图；其中各泳道物质如下：

泳道1：结构部分A的PCR产物；

泳道2：结构部分B的PCR产物；

泳道3：DNA分子量标准。

图2为片段AB的PCR产物电泳图；其中各泳道物质如下：

泳道1：片段AB的PCR产物；

泳道2：DNA分子量标准。

图3为质粒pHP13及片段AB的PCR产物双酶切后纯化电泳图；其中各泳道物质如下：

泳道1:双酶切后的质粒pHP13(双酶切后的C)；

泳道2：双酶切后的片段AB的PCR产物；

泳道3：DNA分子量标准。

图4为本发明的所述质粒pHP13N的构建关系示意图。图中的1代表酶切位点Pst I；2代表酶切位点Xma I。

图5为本发明实施例1中构建的重组枯草芽孢杆菌基因工程菌发酵产生的蛋白酶的蛋白电泳图(SDS-PAGE)；其中各泳道含义如下：

泳道1：蛋白质Marker；

泳道2：中性蛋白酶NprE缺陷的枯草芽孢杆菌发酵液；

泳道3：野生型枯草芽孢杆菌发酵液；

泳道4：含有质粒pHP13N的枯草芽孢杆菌发酵液。

图6是本发明实施例1中大肠杆菌转化子中的质粒双酶切电泳图；其中各泳道物质如下：

泳道1-10:质粒双酶切产物；

泳道11：DNA分子量标准；其中泳道7和9中是正确的质粒，其它泳道都是错误质粒。

具体实施方式

下面通过对具体实施例的详细描述来进一步阐明本发明，但应理解，其并不是对本发明技术方案的限制。

实施例1-高产蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌的构建及鉴定

步骤一：重组质粒pHP13N的构建

所述质粒pHP13N包括以下结构部分(如图4所示)：

A.PAs基因表达盒，由噬菌体的A1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2构成；

B.编码枯草芽孢杆菌蛋白酶NprE的基因nprE的编码区；

C.质粒pHP13；按照CTAB法从带有质粒pHP13的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中提取该质粒；

所述CTAB法操作过程如下：

1、挑取平板上活化好的单菌落，接于5mL LB培养液中，37℃、220r/min振荡培养12h。

2、取1mL菌液于1.5mL的离心管，13000r/min离心2min。弃上清，加入200μL的STET溶液重悬菌体。

3、在上述溶液中，加入5μL的溶菌酶溶液(50g/L)，混匀后室温下静置5min。

4、将上述离心管于恒温混合器中99℃煮沸1min，然后13000r/min离心6min。

5、用牙签挑去离心管中的粘稠物，然后加入10μL CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)溶液，混匀后在室温下放置2min。

6、将上述溶液13000r/min离心8min，弃上清。加入300μL的NaCl溶液溶解沉淀，而后加入900μL的无水乙醇，混匀后于-20℃冰箱中放置20min。

7、将上述溶液，13000r/min离心8min，弃上清。于50℃烘箱中干燥沉淀。20μL无菌水溶解沉淀，混匀后于-20℃冰箱中保存。

其中A、B、C三个结构部分之间的结构关系为A与B拼接为AB，然后将AB插入C中。所述噬菌体的A1启动子a1的碱基序列如SEQ ID No.1所示；所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2的碱基序列如SEQ ID No.2所示；所述结构部分B的碱基序列如SEQ ID No.3所示；所述结构部分C的碱基序列如SEQ ID No.4所示。其中所述a1与所述a2的结构关系为a1位于a2的上游；所述A与所述B的位置关系为A位于B的上游；所述AB在所述a1上游的酶切位点Pst I和所述B下游的酶切位点Xma I之间插入C。

所述的质粒pHP13N的构建方法包括以下步骤：

a.首先将所述噬菌体的A1启动子a1与所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2拼接，得到结构部分A；

b.然后将所述结构部分A与所述结构部分B拼接得到带有酶切位点的AB；设计引物P1和P2，在P1的5’端引入酶切位点Pst I，然后通过PCR扩增，获得扩增后的结构部分A；设计引物P3和P4,在P4的5’端引入酶切位点Xma I，然后通过PCR扩增，获得扩增后的结构部分B；其中P2为嵌合引物，能与结构部分B的5’端互补；然后通过一步PCR拼接法将所述扩增后的结构部分A与所述扩增后的结构部分B拼接，获得带有酶切位点的已修饰的编码枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE的基因nprE片段，即带有酶切位点的AB；将扩增的片段以1％琼脂糖凝胶电泳验证扩增得到的片段大小正确；

c.将所述带有酶切位点的AB和C分别用限制性核酸内切酶进行双酶切，37℃体系下酶切3h，并进行纯化；纯化后利用琼脂糖凝胶电泳对酶切片段的长度进行验证，所得电泳图如图3所示。

d.通过DNA连接酶的作用，将经双酶切后的包含AB的基因片段与经双酶切后的C连接，即得到构建好的所述质粒pHP13N，其碱基序列如SEQ ID No.5所示；

其中所述引物P1、P2、P3和P4的序列如下：

P1：5’-AAAACTGCAGCTGAACCGACTTCTCCTT-3’

P2：5’-CAATTTCTTACCTAAACCCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA-3’

P3：5’-GTGGGTTTAGGTAAGAAATTG-3’

P4：5’-TCCCCCCGGGATGTGGACTGAATCATTAGC-3’

所述限制性核酸内切酶识别位点以加下划线的碱基表示。

其各步骤中具体工艺条件如下:

步骤b的工艺条件如下：

(1)扩增片段A的PCR反应体系

(2)扩增片段A的PCR反应条件

(3)扩增片段B的PCR反应体系

(4)扩增片段B的PCR反应条件

(5)拼接片段A、B的PCR反应体系

其中上述工艺条件(1)(3)(5)中所述“10×全式HiFi DNA聚合酶缓冲液”表示的含义为：所用所述全式HiFi DNA聚合酶缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是DNA聚合酶能够正常催化反应的浓度；

(6)拼接片段A、B的PCR反应条件

步骤c的工艺条件如下：

(2)双酶切反应体系

其中，所述“10×Xma I缓冲液”表示的含义为：所用所述Xma I缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是两种限制性核酸内切酶能够正常催化反应的浓度；其中所述Xma I缓冲液购自ThermoFisher公司；

(2)DNA纯化

DNA纯化采用多功能DNA纯化回收试剂盒对得到的双酶切产物进行纯化以去除干扰的杂片段；所述纯化包括以下步骤：

1、每100μLPCR扩增后的体系或酶切后体系中加入500μL溶胶/结合液DB，充分混匀。(如果初始体系小于100μL，应事先用双蒸水调至100μL)。

2、将上一步所得的溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，于室温下放置1min，然后12000rpm离心30～60秒，倒掉收集管中的废液。

3、向吸附柱中加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。

4、再向吸附柱中加入500μL漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液。

5、将吸附柱EC放入一个新的空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去残余的漂洗液，以免漂洗液中残留的乙醇抑制下游反应。

6、取出吸附柱EC，并将其放入一个干净的离心管中，在吸附膜中间部位加入50μL洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液需事先在65～70℃的水浴中加热)，室温放置2min，然后12000rpm下离心1分钟。

7、如果需要较多量的DNA片段，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，12000rpm下离心1分钟。

已经获得的双酶切后质粒pHP13和双酶切后PCR产物的两端均含有限制性核酸内切酶Pst I和Xma I的粘性末端，故运用T4DNA连接酶将含有PAs表达盒的重组nprE基因片段(AB)整合到质粒载体pHP13上从而获得重组质粒pHP13N，按照琼脂糖凝胶电泳所得到的两酶切产物的浓度，根据双酶切后质粒pHP13与双酶切后PCR产物摩尔比1:3的比例算出所加入两个酶切产物的体积。

步骤d的工艺条件如下：于24℃环境下过夜连接，获得重组质粒pHP13N，所得质粒pHP13L图谱见图4；

步骤d的工艺条件如下：

步骤d反应体系

宿主菌是以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)DB104为出发菌，敲除了编码未知蛋白的基因yolA和yolB的细菌。其中，基因敲除采用本领域常规技术手段，本文不在赘述；构建包含所述质粒pHP13N的高产蛋白酶的重组枯草芽孢杆菌，所述构建方法包括以下步骤：

a.将重组质粒pHP13N转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞中，将转化产物涂布于涂有异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)溶液和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)溶液的LBA₁₀₀平板上培养，约26h后，长出蓝色菌落和白色菌落，挑选若干个白色菌落并从每个白色菌落挑取部分菌，提取其中的质粒进行双酶切，验证质粒的正确性；如果从某个白色菌落中挑取的菌为正确转化子，则该菌落中的其余重组细菌也为正确转化子。所述LBA₁₀₀培养基是在LB培养基灭菌后，加入终浓度为100μg/mL的氨苄霉素得到的；异丙基硫代半乳糖苷溶液为溶有20％异丙基硫代半乳糖苷的水溶液；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷溶液为溶有2％的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基酰胺溶液。其中正确重组质粒pHP13N的酶切产物应该为2038bp和4730bp两条带，结果如图6所示。

b.提取正确转化子中的重组质粒pHP13N，再将其转化进入枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，得到重组细胞，用含氯霉素的LB平板筛选所述重组细胞；

按照枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的Spirizzen转化方法，将重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，得到重组细胞，并将得到的重组细胞涂布于含氯霉素(6μg/ml)的LB平板上培养约16h，筛选所述重组细胞；

c.将得到的筛选后的重组细胞涂布于脱脂牛奶平板上划线，于37℃环境下培养24小时，筛选在脱脂牛奶平板上产生水解圈的菌株，即为所述重组质粒正确表达的转化子；其中所述脱脂牛奶平板包括1wt％的脱脂奶粉和2wt％的琼脂，余量为水，115℃灭菌25min。

实施例2-发酵生产蛋白酶

培养基：(1)种子和平板固体培养基为LB培养基,每升所述LB培养基含有以下组分：胰蛋白胨10g，酵母抽提物5g，NaCl 10g，将pH调至7.5；固体培养基添加琼脂15g。(2)每升发酵培养基含有以下组分：葡萄糖24g、玉米浆干粉18g、烘焙豆粉20g、磷酸盐25g、MgSO₄0.2g、ZnSO₄ 0.2g、CaCl₂ 0.2g、Tween-80 1g、磷酸钾缓冲液0.06mol。

培养方法：挑取平板上新活化的实施例1中构建的重组细菌的单菌落，接种于装有5mL LB培养基的试管中，37℃、225r/min振荡培养12h(OD₆₀₀约为5-6)，得到种子液。将发酵培养基分装于500mL锥形瓶内，装液量为50mL。将上述种子液按1％接种量接种。36℃、225r/min振荡培养，发酵72h后测定酶活性。

以中性蛋白酶NprE缺陷的枯草芽孢杆菌和野生型枯草芽孢杆菌为对照菌，将对照菌和本发明的重组细菌分别按照相同的方法进行发酵，并将得到的发酵液通过蛋白电泳(SDS-PAGE)进行分析。本发明的重组细菌的发酵液通过蛋白电泳(SDS-PAGE)得到一条分子量大小约为40.9kDa的蛋白条带(见图5)，即为蛋白酶NprE；同时测定该重组菌发酵液中蛋白酶酶活为520U/mL，而中性蛋白酶NprE缺陷的枯草芽孢杆菌对照菌发酵液中无中性蛋白酶产生，野生型枯草芽孢杆菌对照菌发酵液中仅有微量中性蛋白酶产生，从图5中的蛋白条带可以看出，酶活远远低于本发明重组菌发酵液中的酶活。

蛋白酶酶活测定方法参照国标GB/T 23527-2009。

可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (12)

1.一种能高效表达中性蛋白酶的质粒pHP13N，包含所述质粒pHP13N的细菌的保藏编号为CGMCC No.11680，其特征在于，其包括以下结构部分：

A.PAs基因表达盒，由噬菌体的A1启动子a1以及枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2构成；

B.编码枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE的基因nprE的编码区；

C.质粒pHP13；

其中A、B、C三个结构部分之间的结构关系为A与B拼接为AB，然后将AB插入C中。

2.根据权利要求1所述的质粒pHP13N，其特征在于，所述噬菌体的A1启动子a1的碱基序列如SEQ ID No.1所示；所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2的碱基序列如SEQ ID No.2所示；所述结构部分B的碱基序列如SEQ ID No.3所示；所述结构部分C的碱基序列如SEQ ID No.4所示。

3.根据权利要求1所述的质粒pHP13N，其特征在于，其中所述a1与所述a2的结构关系为a1位于a2的上游；所述A与所述B的位置关系为A位于B的上游；所述AB在所述a1上游的酶切位点Pst I和所述B下游的酶切位点Xma I之间插入C。

4.一种根据权利要求1所述的质粒pHP13N的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

a.首先将所述噬菌体的A1启动子a1与所述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)aprE基因的稳定子a2拼接，得到结构部分A；

b.设计引物P1和P2，在P1的5’端引入酶切位点Pst I，然后通过PCR扩增，获得扩增后的结构部分A；设计引物P3和P4,在P4的5’端引入酶切位点Xma I，然后通过PCR扩增，获得扩增后的结构部分B；其中P2为嵌合引物，能与结构部分B的5’端互补；然后通过一步PCR拼接法将所述扩增后的结构部分A与所述扩增后的结构部分B拼接，获得带有酶切位点的已修饰的编码枯草芽孢杆菌中性蛋白酶NprE的基因nprE片段，即带有酶切位点的AB；

c.将所述带有酶切位点的AB和C分别用限制性核酸内切酶进行双酶切并进行纯化；

d.通过DNA连接酶的作用，将经双酶切后的包含AB的基因片段与经双酶切后的C连接，即得到构建好的所述质粒pHP13N，其碱基序列如SEQ ID No.5所示；

其中所述引物P1、P2、P3和P4的序列如下：

P1：5’-AAAACTGCAGCTGAACCGACTTCTCCTT-3’

P2：5’-CAATTTCTTACCTAAACCCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA-3’

P3：5’-GTGGGTTTAGGTAAGAAATTG-3’

P4：5’-TCCCCCCGGGATGTGGACTGAATCATTAGC-3’

所述限制性核酸内切酶识别位点以加下划线的碱基表示。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，其各步骤中具体工艺条件如下:

步骤b的工艺条件如下：

(1)扩增片段A的PCR反应体系

(2)扩增片段A的PCR反应条件

(3)扩增片段B的PCR反应体系

(4)扩增片段B的PCR反应条件

(5)拼接片段A、B的PCR反应体系

其中上述工艺条件(1)(3)(5)中所述“10×全式HiFi DNA聚合酶缓冲液”表示的含义为：所用所述全式HiFi DNA聚合酶缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是DNA聚合酶能够正常催化反应的浓度；

(6)拼接片段A、B的PCR反应条件

步骤c的工艺条件如下：

(1)双酶切反应体系

其中，所述“10×Xma I缓冲液”表示的含义为：所用所述Xma I缓冲液的浓度为其工作浓度的10倍，所述工作浓度指的是两种限制性核酸内切酶能够正常催化反应的浓度；其中所述Xma I缓冲液购自ThermoFisher公司；

(2)DNA纯化

DNA纯化采用多功能DNA纯化回收试剂盒对得到的双酶切产物进行纯化以去除干扰的杂片段；

步骤d的工艺条件如下：步骤d反应体系

6.一种包含根据权利要求1所述的质粒pHP13N的细菌，其保藏编号为CGMCC No.11680。

7.根据权利要求6所述的细菌，其特征在于，宿主菌在分类系统中属于：门：Firmicutes；纲：Bacilli；目：Bacillales；科：Bacillaceae；属：Bacillus；种：subtilis。

8.根据权利要求7所述的细菌，其特征在于，宿主菌是以枯草芽孢杆菌(B.subtilis)DB104为出发菌，敲除了编码未知蛋白的基因yolA和yolB的细菌。

9.根据权利要求7所述的细菌，其特征在于，所述宿主菌细胞大小为直径×长＝(0.7～0.8)×(2～3)微米，着色均匀，无荚膜，周生鞭毛，能运动；芽孢大小为直径×长＝(0.6～0.9)×(1.0～1.5)微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

10.根据权利要求6所述的细菌的构建方法，其特征在于，其包括以下步骤：

a.将重组质粒pHP13N转化进入大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞中，将转化产物涂布于涂有异丙基硫代半乳糖苷溶液和5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷溶液的LBA₁₀₀平板上培养，长出蓝色菌落和白色菌落，挑选若干个白色菌落并从每个白色菌落中挑取部分菌，提取其中的质粒进行双酶切，验证质粒的正确性；所述LBA₁₀₀培养基是在LB培养基灭菌后，加入终浓度为100μg/mL的氨苄霉素得到的；异丙基硫代半乳糖苷溶液为溶有20％异丙基硫代半乳糖苷的水溶液；5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷溶液为溶有2％的5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷的二甲基酰胺溶液；

b提取正确转化子中的重组质粒pHP13N，再将其转化进入枯草芽孢杆菌(B.subtilis)中，得到重组细胞，用含氯霉素的LB平板筛选所述重组细胞；

c.将得到的筛选后的重组细胞涂布于脱脂牛奶平板上划线，于37℃环境下培养24小时，筛选在脱脂牛奶平板上产生水解圈的菌株，即为所述重组质粒正确表达的转化子；其中所述脱脂牛奶平板包括1wt％的脱脂奶粉和2wt％的琼脂，余量为水。

11.一种包含根据权利要求6所述的细菌的制剂。

12.根据权利要求6所述的细菌用于食品生产、养殖、饲料生产以及蛋白酶生产领域的用途。