CN106795529B - 使用微生物联合kolbe合成制备烷烃的方法 - Google Patents

使用微生物联合kolbe合成制备烷烃的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生产至少一种烷烃的方法，该方法包括‑使用基因修饰的微生物从碳源产生至少一种羧酸，以及‑对所述羧酸进行Kolbe电解反应以产生烷烃，其中所述烷烃包含至少6个碳原子，且所述羧酸包含至少4个碳原子，并且其中所述碳源选自下组：乙醇、乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐、己酸盐及其组合，且所述微生物能够使用乙醇‑羧酸盐发酵产生羧酸。

Description

使用微生物联合KOLBE合成制备烷烃的方法
技术领域
本发明涉及从合成气合成支化，未支化和长链烷烃的方法.特别地，该方法是生物技术方法。
背景技术
烷烃是具有各种应用的饱和烃，应用取决于碳原子的数目和烷烃的结构(即支链，直链，环状等).前四种烷烃(CH4至C4H8)主要用于加热和烹饪目的，并且在一些国家用于发电。
戊烷，己烷，庚烷和辛烷是相当易挥发的液体。它们通常在内燃机中用作燃料，因为它们在进入燃烧室时容易蒸发而不形成液滴，液滴会损害燃烧的均匀性。因为这一功效，相比于它们的直链对应物，优选支链烷烃，因为它们更不容易发生能够引起爆震的过早点燃.这种过早点燃的倾向通过燃料的辛烷值评定，其中例如2，2，4-三甲基戊烷(异辛烷)具有100的任意值，庚烷的值为零。除了将它们用作燃料之外，这组烷烃也是非极性物质的良好溶剂.
从壬烷向上，例如，到十六烷(具有十六个碳原子的烷烃)的烷烃是较高粘度的液体，越来越不适合用作汽油.替代地，它们形成了柴油和航空燃料的主要部分。柴油燃料的特征在于其十六烷值，十六烷(cetane)是十六烷(hexadecane)的旧称。
从十六烷向上的烷烃是组成燃料油和润滑油的最重要的组分。在后一功能中，它们同时用作抗腐蚀剂，因为它们的疏水性质意味着水不能到达金属表面.许多固体烷烃用作石蜡，例如在蜡烛中。然而，这不应该与主要由酯组成的真正的蜡混淆。具有链长为约35个或更多个碳原子的烷烃存在于沥青中，例如用于路面铺设。然而，高级烷烃几乎没有价值，并且通常通过裂解分裂成低级烷烃。
因此，所有长度的烷烃在我们的日常世界中都是非常有用的.目前，传统的烷烃制造使用基于石油的中间体.然而，通过裂解汽油或石油获得烷烃对环境不利.此外，由于这些烷烃的成本将与石油的价格相关，随着未来石油价格可预期的上涨，烷烃价格也可能随着石油价格的上涨而上涨。
据此，希望找到其它从更可持续的原料生产烷烃的方法，而不是仅从石油基原料，这也将对环境造成较小的损害.
正在进行多种努力来生产可再生燃料，包括来自可持续原料，如合成气的烷烃.本领域中已知的一种方法是从甘油酸三酯生成生物柴油燃料(主要是脂肪酸乙酯或甲酯).另一种方法是利用甘油形成甘油醚，其可以加入到生物柴油和/或柴油燃料中.然而，这些方法中的每一种都具有其自身的缺点.因此，仍然没有从可再生燃料(包括合成气)中有效生产中链或长链烷烃的方法。
发明内容
本发明提供了一种由可再生燃料生产中链或长链烷烃的方法。特别地，本发明的方法可以使用合成气采用至少两步生物技术方法来生产支链、直链和/或环烷烃。本发明的方法可以至少包括使用至少一种微生物将合成气转化为至少一种羧酸的第一步骤和通过将羧酸经历电解使其转化为相应烷烃的第二步骤.特别地，所使用的电解可以是Kolbe电解反应，同时作为双产物产生二氧化碳。
根据本发明的一个方面，提供了一种生产至少一种烷烃的方法，该方法包括：
-利用微生物从碳源生产至少一种羧酸，以及
-对所述羧酸进行Kolbe电解反应以产生烷烃，
其中所述烷烃包含至少6个碳原子，并且所述羧酸包含至少4个碳原子.
碳源可以是其最简单的形式，如二氧化碳或一氧化碳。特别地，碳源可以是其中具有碳的任何复杂分子.更特别地，碳源可以选自下组：醇、醛、葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖(dextrose)、乳糖、木糖、戊糖、多元醇、己糖、乙醇和合成气.甚至更特别地，碳源可以是乙醇和/或合成气.在一个实例中，碳源可以是乙醇与至少一种选自下组的其它碳源组的组合：乙酸根、丙酸根、丁酸根、异丁酸根、戊酸根和己酸根.特别地，碳源可以是乙醇和乙酸根.在另一个实例中，碳源可以是丙酸和乙醇，乙酸根和乙醇，异丁酸和乙醇或丁酸和乙醇的组合。
在一个实例中，乙醇是碳源，并且微生物可以是能够利用乙醇-羧酸根发酵途径产生至少一种羧酸的任何微生物.乙醇-羧酸根发酵途径至少在Seedorf，H.，等人，2008中有详细描述.所述生物体可以选自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)、carboxidivorans梭菌(C.carboxidivorans)、帕鲁斯梭菌(C.pharus)等组成的组.这些微生物包括在其野生型形式中不具有乙醇-羧化物发酵途径但是已经通过基因修饰而获得该性状的微生物.特别地，微生物可以是克氏梭菌.
根据本发明任一方面的微生物可以是经基因修饰的微生物.所述经基因修饰的细胞或微生物可以在遗传上不同于野生型细胞或微生物.根据本发明任一方面的经基因修饰的微生物与野生型微生物之间的遗传差异可以是在经基因修饰的微生物中存在的而可能在野生型微生物中不存在的完整基因、氨基酸、核苷酸等.在一个实例中，根据本发明任一方面的经基因修饰的微生物可包含能使微生物产生至少一种羧酸的酶.相对于本发明的经基因修饰的微生物的野生型微生物可以没有或没有可检测到的使得经基因修饰的微生物产生至少一种羧酸的酶的活性。如本文所使用的，术语“经基因修饰的微生物”可以与术语“经基因修饰的细胞”互换使用.根据本发明任何方面的基因修饰是在微生物的细胞上实施的。
如本文所使用的与细胞或微生物联合的短语“野生型”可以指具有在野生状态天然可见形式的基因组组成的细胞.该术语可以适用于全细胞和个体基因.因此术语“野生型”不包括这类细胞或这类基因，其中基因序列已经经由人使用重组方法而被至少部分的改变.
本领域技术人员将能够使用本领域中已知的任何方法来基因修饰细胞或微生物。根据本发明任一方面，经基因修饰的细胞可以被基因修饰以便于在限定的时间间隔内，在2小时内，特别是在8小时或24小时内，其形成比野生型细胞至少两倍，特别是至少10倍，至少100倍，至少1000倍或至少10000倍更多的羧酸和/或各自的羧酸酯.产物形成的增加可以被确定，例如通过在相同的条件(相同的细胞密度，相同的营养培养基，相同的培养条件)下在适宜的营养培养基中分别培养根据本发明任何方面的细胞和野生型细胞特定的时间间隔，然后确定营养培养基中的目标产物(羧酸)的量.
在一个实例中，微生物可以是表达选自E1至E10的至少一种酶的野生型生物体，其中E1是醇脱氢酶(adh)，E2是乙醛脱氢酶(aid)，E3是乙酰乙酰辅酶A硫解酶(th1)，E4是3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)，E5是3-羟基丁酰-CoA脱水酶(crt)，E6是丁酰-CoA脱氢酶(bcd)，E7是电子转移黄素蛋白亚基(etf)，E8是辅酶A转移酶(cat)，E9是乙酸激酶(ack)和E10是磷酸转乙酰酶(pta)。特别地，根据本发明的任一方面的野生型微生物可以至少表达E2，E3和E4。甚至更特别地，根据本发明的任何方面的野生型微生物可以至少表达E4。
在另一个实施例中，根据本发明任何方面的微生物可以是经基因修饰的生物体，其具有相对于选自E1至E10的至少一种酶的野生型微生物增加的表达，其中E1是醇脱氢酶(adh)，E2是乙醛脱氢酶(aid)，E3是乙酰乙酰基-辅酶A硫解酶(th1)，E4是3-羟基丁酰辅酶A脱氢酶(hbd)，E5是3-羟丁酰辅酶A脱水酶(crt)，E6是丁酰辅酶A脱氢酶(bcd)，E7是电子转移黄素蛋白亚基(etf)，E8是辅酶A转移酶(cat)，E9是乙酸激酶(ack)并且E10是磷酸转乙酰酶(pta)。特别地，根据本发明的任一方面的基因修饰的微生物至少表达酶E2、E3和E4。甚至更特别地，根据本发明的任一方面的基因修饰的微生物可以至少表达E4。酶E1至E10可以从克氏梭菌分离。
如本文所使用的短语“增加的酶活性”应被理解为增加的细胞内活性。基本上，酶活性的增加可以是通过使用强启动子或使用编码具有增加活性的相应酶的基因或等位基因来增加编码该酶的一个或多个基因序列的拷贝数来实现的，并且任选的通过组合这些措施。在根据本发明的方法中使用的经基因修饰的细胞或微生物是例如通过转化、转导、缀合或这些方法与包含所需基因、该基因的等位基因或其部分的载体和使该基因表达成为可能的载体组合而产生的。异源性表达特别是通过整合细胞染色体中的基因或等位基因或一个染色体外复制载体而实现的。
根据本发明任一方面的细胞可以利用本领域已知的任何方法进行基因转化。特别地，可以根据WO/2009/077461中公开的方法制备细胞。
如本文所用的短语“经基因修饰的细胞与其野生型相比在酶中具有增加的活性”是指相应酶的活性增加至少2倍，特别是至少10倍，更特别是至少100倍，还更特别是至少1000倍，甚至更特别是至少10000倍。在一个实例中，根据本发明任一方面的酶的表达量的增加相对于野生型细胞中酶的表达量增加了5％，10％，15％，20％，25％，30％，25％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。在一个实例中，根据本发明任一方面的酶的表达量降低相对于所述酶在野生型细胞中的表达量降低了5％，10％，15％，20％，25％，30％，25％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。
根据本发明的任一方面，E1可以是乙醇脱氢酶。特别地，E1可以选自下组：醇脱氢酶1、醇脱氢酶2、醇脱氢酶3、醇脱氢酶B及其组合。更特别地，E1可以包含与选自CKL_1075，CKL_1077，CKL_1078，CKL_1067，CKL_2967，CKL_2978，CKL_3000，CKL_3425和CKL_2065的多肽具有至少50％的序列同一性的序列。甚至更特别地，E1可以包含与选自由CKL_1075，CKL_1077，CKL_1078和CKL_1067组成的组的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
根据本发明的任一方面，E2可以是乙醛脱氢酶。特别地，E2可以选自下组：乙醛脱氢酶1、醇脱氢酶2及其组合。特别地，E2可以包含与选自CKL_1074，CKL_1076等的多肽具有至少50％的序列同一性的序列。更特别地，E2可以包含与选自由CKL_1074和CKL_1076组成的组的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽
根据本发明的任一方面，E3可以选自下组：乙酰乙酰辅酶A硫解酶A1、乙酰乙酰辅酶A硫解酶A2、乙酰乙酰辅酶A硫解酶A3及其组合。特别地，E3可以与选自由CKL_3696，CKL_3697，CKL_3698等的多肽具有至少50％的序列同一性。更特别地，E3可以包含与选自由CKL_3696，CKL_3697和CKL_3698组成的组的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，85％，90％，95％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
根据本发明的任一方面，E4可以是3-羟基丁酰-CoA脱氢酶1，3-羟基丁酰-CoA脱氢酶2等。特别地，E4可以含有与多肽CKL_0458，CKL_2795等具有至少50％的序列同一性的多肽。更特别地，E4组包含与多肽CKL_0458或CKL_2795具有至少50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
根据本发明的任一方面，E5可以是3-羟基丁酰-CoA脱水酶1，3-羟基丁酰-CoA脱水酶2及其组合。特别地，E5可以与选自CKL_0454，CKL_2527等的多肽具有至少50％的序列同一性的多肽。更特别地，E5可以包含与选自由CKL_0454和CKL_2527组成的组的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，85％，90％，95％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
根据本发明的任一方面，E6可以选自下组：丁酰-CoA脱氢酶1，丁酰-CoA脱氢酶2等。特别地，E6可以与选自CKL_0455，CKL_0633等的多肽具有至少50％的序列同一性的多肽。更特别地，E6可以包含与选自由CKL_0455和CKL_0633组成的组的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
根据本发明的任一方面，E7可以选自下组：电子转移黄素蛋白α亚基1，电子转移黄素蛋白α亚基2，电子转移黄素蛋白β亚基1和电子转移黄素蛋白β亚基2。特别地，E7可以与选自CKL_3516，CKL_3517，CKL_0456，CKL_0457等的多肽具有至少50％的序列同一性的多肽。更特别地，E7可以包含与选自由CKL_3516，CKL_3517，CKL_0456和CKL_0457组成的组的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，85％，90％，95％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
根据本发明的任一方面，E8可以是辅酶转移酶(cat)。特别地，E8可以选自下组：丁酰-CoA：乙酸CoA转移酶，琥珀酰-CoA：辅酶A转移酶，4-羟基丁酰-CoA：辅酶A转移酶等。更特别地，E8可以与选自CKL_3595，CKL_3016，CKL_3018等的多肽具有至少50％的序列同一性的多肽。更特别地，E8可以包含与选自由CKL_3595，CKL_3016和CKL_3018组成的组的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，85％，90％，95％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
根据本发明的任一方面，E9可以是乙酸激酶A(ackA)。特别地，E9可以与CKL_1391等的多肽序列等具有至少50％的序列同一性的序列。更特别地，E9可以包含与CKL_1391的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
根据本发明的任一方面，E10可以是磷酸转乙酰酶(pta)。特别地，E10可以与CKL_1390等的多肽序列等具有至少50％的序列同一性。更特别地，E10可以包含与CKL_1390的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
在一个实例中，野生型或基因修饰的微生物表达E1-E10。特别地，根据本发明任一方面的微生物相对于野生型微生物，E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8，E9，E10或其组合可以具有增加的表达。在一个实例中，基因修饰的微生物相对于野生型微生物，E1，E2，E3，E4，E5，E6，E7，E8，E9，E10具有增加的表达。更特别地，存在于生物体中的E1-E10的任意组合可以使其能够产生至少一种羧酸。在一个实例中，根据本发明的任一方面使用的基因修饰的生物体可包含酶E1-E10的任意组合，其能使生物体在同时产生至少一种，或两种或三种类型的羧酸。例如，该微生物可以能够同时产生己酸，丁酸和/或乙酸。类似地，基因修饰的微生物可以表达酶E1-E10的组合，使该生物体能够产生单一类型的羧酸或多种羧酸。在上述所有情况下，微生物可以是其野生型形式或经基因修饰的形式。
在一个实例中，根据本发明任一方面的基因修饰的微生物相对于野生型微生物，其氢化酶成熟蛋白和/或电子传递复合蛋白的表达量增加。特别地，氢化酶成熟蛋白(hyd)可以选自由hydE，hydF或hydG组成的组。特别地，所述hyd可以与选自CKL_0605，CKL_2330，CKL_3829等的多肽具有至少50％的序列同一性。更特别地，根据本发明的任一方面使用的hyd可以包含与选自CKL_0605，CKL_2330和CKL_3829的多肽具有至少50％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，91％，94％，95％，98％或100％的序列同一性的多肽。
在一个实例中，根据本发明的任一方面的微生物能够以丙酸和乙醇作为碳源至少产生戊酸和/或庚酸。在另一个实例中，根据本发明任一方面的微生物能够以乙酸盐和乙醇作为碳源至少产生丁酸。在另一个实例中，根据本发明任一方面的微生物能够以异丁酸和乙醇作为碳源至少产生异己酸。在另一个实例中，根据本发明任一方面的微生物能够以丁酸和乙醇作为碳源或以乙酸盐和乙醇作为碳源至少产生己酸。
在本申请中，除非相反指明，否则任何数据库代码是指可从NCBI数据库获得的序列，更具体地是指2014年6月12日的在线版本，并且包括，如果这样的序列是核苷酸序列，通过翻译前者获得多肽序列。
在另一个实例中，基因修饰的微生物能够利用任何碳源使用丙二酰辅酶A依赖性和丙二酰-ACP非依赖性酰基-CoA代谢途径生产羧酸。碳源可以是本领域已知的任何碳源。特别地，碳源可以选自下组：葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、木糖、戊糖、多元醇、己糖和合成气。更特别地，碳源可以是合成气。
根据该实例，经基因修饰的微生物具有
-相对于野生型微生物至少一种选自下组的酶增加的表达：乙酰乙酰辅酶A合酶(E11)、酮酰基-CoA合酶(或延伸酶)(E12)、酮酰基-CoA硫解酶(E13)、烯酰基-CoA还原酶(E14)、酮酰基-CoA还原酶(E15)和3-羟基酰基-CoA脱水酶(E16)；和
-相对于野生型微生物的乙酰乙酰辅酶A硫解酶(E17)的表达降低。
特别地，经基因修饰的微生物包含至少一个使该微生物至少产生羧酸的基因突变。特别地，该突变使微生物能够通过丙二酰辅酶A依赖性和丙二酰-ACP非依赖性酰基-CoA代谢途径的方式产生至少一种羧酸。更具体地，相对于野生型微生物，在该微生物中丙二酰辅酶A依赖性和丙二酰-ACP非依赖性酰基-CoA代谢途径中的酶活性增加。
可以对微生物进行基因修饰以增加微生物的丙二酰辅酶A依赖性、丙二酰-ACP非依赖性、酰基辅酶A代谢途径中的酶活性。该途径在本文中也称为丙二酰辅酶A依赖性、但丙二酰-ACP非依赖性、酰基辅酶A代谢途径。微生物中丙二酰辅酶A依赖性、丙二酰-ACP非依赖性酰基-CoA代谢途径的增加可以通过增加下述基因或途径的活性或表达与降低乙酰乙酰辅酶A硫解酶的表达或活性相组合来实现，所述基因或途径包含乙酰乙酰辅酶A合酶，酮脂酰辅酶A合酶(或延伸酶)，烯酰基辅酶A还原酶，酮酯酰辅酶A还原酶和/或3-羟酰辅酶A脱水酶。可替代地，微生物的丙二酰辅酶A依赖性，丙二酰-ACP非依赖性酰基-CoA代谢途径活性的增加可以通过增加下述基因或途径的表达与降低乙酰乙酰辅酶A硫解酶的表达或活性来实现，所述基因或途径包含乙酰乙酰辅酶A合酶、酮酯酰辅酶A硫解酶、烯酰基CoA还原酶、酮酯酰-CoA还原酶和/或3-羟基酰基-CoA脱水酶。
使微生物产生根据本发明的任一方面的羧酸的酶或酶活性的非限制性基因修饰的列表，已由US20140051136的表2中提供。特别地，本发明的微生物的羧酸生物合成途径使用前体乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A。
在一个实例中，可以引入编码这些多肽的温度敏感形式的核酸序列来代替天然酶，并且当在升高的温度(在该温度下这些热不稳定多肽由于蛋白质结构的改变或完全变性部分或完全失活)下培养这种经基因修饰的微生物时，可以观察到化学产物的增加。例如，在大肠杆菌中，这些温度敏感性突变基因可以尤其包括fablts(S241F)，fabBts(A329V)或fabDts(W257Q)等。在大多数这些实例中，实施基因修饰可以增加丙二酰辅酶A的利用，使得通过天然途径的丙二酰辅酶A向羧酸转化的总生物量降低，并且碳源转化成化学产物的比例更大，该化学产物包括通过丙二酰辅酶A依赖和丙二酰-ACP非依赖途径产生的羧酸或羧酸衍生产物。此外，对于一些实例，可以进行额外的基因修饰，例如用以增加丙二酰辅酶A的产量。
在另一个实例中，酶，烯酰-酰基载体蛋白还原酶(EC No.1.3.1.9，也称为烯酰基-ACP还原酶)是来自丙二酰辅酶A的羧酸生物合成的关键酶。在大肠杆菌中，该酶，Fabl由基因fabl编码(Richard J.Heath等人，1995)。
在一个实例中，根据本发明任一方面的微生物中丙酮酸氧化酶基因(Chang等，1983，Abdel-Ahmid等，2001)的表达水平降低或功能缺失。丙酮酸氧化酶基因可以编码例如EC1.2.3.3的酶。特别地，丙酮酸氧化酶基因可以是poxB基因。
在一个实例中，乳酸脱氢酶基因(Mat-Jan等，Bunch等，1997)的表达水平降低或功能缺失。在一些实例中，乳酸脱氢酶基因编码例如EC 1.1.1.27的酶。乳酸脱氢酶基因可以是NAD连接的发酵性D-乳酸脱氢酶基因。特别地，乳酸脱氢酶基因是IdhA基因。
在一个实例中，可以在微生物的至少一种反馈抑制酶中发生基因突变，使该反馈抑制酶的表达水平增加。特别地，酶可以是泛酸激酶，丙酮酸脱氢酶等。在大肠杆菌中，这些反馈抑制突变基因可以包括coaA(R106A)和/或Ipd(E354K)。
在另一个实例中，微生物的丙二酰辅酶A依赖性、但丙二酰-ACP非依赖性酰基-CoA代谢途径的增加可通过乙酰乙酰辅酶A硫解酶活性和/或触发因子活性和/或参与细胞分裂的分子伴侣的活性的降低实现。在一个实例中，细胞可以在tig基因中包含基因突变。
在一个实例中，相对于野生型细胞，微生物中的基因突变可导致NADPH依赖性转氢酶途径中的酶活性增加。该结果可通过引入编码具有核苷酸转氢酶活性的多肽的异源核酸序列实现。
在另一个实例中，通过本领域已知的任何方法的微生物中的基因突变可导致羧酰-CoA合成酶和/或连接酶活性的降低的表达。
在另一个实例中，微生物中的基因突变可导致具有乙酰辅酶A羧化酶活性的酶的过量表达。
在一个实例中，微生物可具有通过引入编码具有氰化酶和/或碳酸酐酶活性的多肽的异源核酸序列使其细胞内重碳酸(盐)水平提高。
更具体地，根据微生物的任一方面的基因突变可以导致酰基-CoA硫酯酶活性水平的提高和/或降低。该结果可以通过提高链长特异性酰基辅酶A硫酯酶活性的水平并降低针对非目的羧酸链长度的酰基辅酶A硫酯酶活性来增加所需羧酸产物的链长度特异性。在一个实例中，羧酸或羧酸衍生物的提高的链长度特异性可通过增加各个链长特异性酮脂酰基-CoA硫解酶、烯酰基-CoA还原酶、酮脂酰基-CoA还原酶或3-羟基酰基-CoA脱水酶或它们的组合的活性水平而实现。
根据本发明任一方面的微生物中的基因突变可导致仅一种选自上述列表中的酶或它们的组合的表达量提高或降低。
在另一个实例中，微生物中的基因突变可以发生在至少一种选自下组的酶中：乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A合酶(或延伸酶)、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶、3-羟酰基-CoA脱水酶和乙酰乙酰辅酶A硫解酶。更特别地，微生物中的基因突变可以导致乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰-CoA合酶(或延伸酶)、烯酰辅酶A还原酶，酮脂酰辅酶A还原酶和3-羟酰辅酶A脱水酶的表达量增加并结合乙酰乙酰辅酶A硫解酶的表达或活性降低。特别地，烯酰辅酶A还原酶和/或酮酰基-CoA还原酶可以利用辅因子NADH和/或NADPH。
特别地，根据本发明的任一方面的微生物中的基因修饰可以包括表2中所列的任何酶与以下酶的组合：乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A合酶(或延伸酶)、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰基-CoA还原酶和/或3-羟基酰基-CoA脱水酶和乙酰乙酰辅酶A硫解酶，其中乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰基-CoA合酶(或延伸酶)、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰辅酶A还原酶和3-羟基酰基-CoA脱水酶的酶活性增强而乙酰乙酰辅酶A硫解酶的活性降低。
在另一个实例中，根据本发明任一方面的微生物中丙二酰辅酶A依赖性、丙二酰基-ACP非依赖性酰基-CoA代谢途径可以通过以下基因或途径的提高表达并结合乙酰乙酰辅酶A硫解酶的表达或活性的降低来实现，所述基因或途径包含乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰-CoA硫解酶、烯酰基-CoA还原酶、酮脂酰基-CoA还原酶和/或3-羟基酰基-CoA脱水酶。
特别地，根据本发明任一方面的微生物中的基因修饰可以包含US20140051136的表2中列出的任何酶与以下酶的组合：乙酰乙酰辅酶A合酶、酮脂酰辅酶A硫解酶、烯酰辅酶A还原酶、酮脂酰-CoA还原酶和/或3-羟基酰基-CoA脱水酶的组合，并结合乙酰乙酰辅酶A硫解酶表达或活性的降低。
在一个实例中，根据本发明的任一方面的微生物可以包含表2所列任意酶与以下酶的组合中的基因修饰：乙酰辅酶A羧化酶，丙二酰辅酶A：ACP转酰酶(FabD)、β-酮脂酰-ACP合酶III、β-酮脂酰-ACP合酶I(FabB)、β-酮脂酰-ACP合酶II(FabF)、3-氧代酰基-ACP合酶I和烯酰基ACP还原酶。
更具体地，所述基因突变可以导致相对于野生型微生物选自下组的至少一种酶的表达增加：乙酰辅酶A羧化酶、丙二酰辅酶A：ACP转酰基酶(FabD)、β-酮脂酰-ACP合酶III、β-酮脂酰-ACP合酶I(FabB)、β-酮脂酰-ACP合酶II(FabF)、3-氧代酰基-ACP合酶I和烯酰基ACP还原酶。特别地，所述基因突变可以导致根据本发明任一方面的微生物中超过一种酶的表达增加，其使该微生物能够通过相对于野生型微生物的丙二酰辅酶A依赖性和丙二酰-ACP非依赖性酰基-CoA代谢途径在微生物中增加的酶活性的方式生产羧酸。
在一个实例中，在根据本发明任一方面的微生物中可发生β-酮脂酰-ACP合酶和3-氧代酰基-ACP合酶的表达增加。在另一个实例中，在根据本发明任一方面的微生物中可发生β-酮脂酰-ACP合酶和丙二酰辅酶A-ACP转酰酶的表达增加。在另一个实例中，在根据本发明任一方面的微生物中可发生β-酮脂酰-ACP合酶和烯酰基ACP还原酶的表达增加。在一个实例中，在根据本发明任一方面的微生物中可发生β-酮脂酰-ACP合酶、丙二酰-CoA-ACP转酰基酶和烯酰ACP还原酶的表达增加。在所有实例中，烯酰基ACP还原酶和/或酰基辅酶A硫酯酶的表达增加。
根据本发明的任一方面，经基因修饰的生物体可以是至少能够从碳源产生至少一种羧酸的至少一种产乙酸细菌和/或氢氧化细菌。碳源可以是合成气或本领域已知的任何碳水化合物。特别地，碳源可以选自下组：醇、醛、葡萄糖、蔗糖、果糖、右旋糖、乳糖、木糖、戊糖、多元醇、己糖、乙醇和合成气。甚至更特别地，碳源可以是合成气。
通常，首先处理从气化过程获得的合成气的一部分，以优化产量并避免焦油的形成。可以使用石灰和/或白云石裂解合成气中不期望的焦油和CO。这些方法在例如，Reed，1981中有详细描述。
合成气可以在至少一种产乙酸细菌和/或氢氧化细菌的存在下转化为羧酸。特别地，可以使用本领域已知的任何方法。可以通过至少一种原核生物将合成气生成羧酸。特别地，原核生物可以选自下组：埃希氏菌属(Escherichia)如大肠杆菌(Escherichia coli)；选自梭菌属(Clostridia)例如杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，autoethanogenum梭菌(Clostridium autoethanogenum)，carboxidivorans梭菌或克氏梭菌；选自棒状菌属(Corynebacteria)如谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)；选自贪铜菌属(Cupriavidus)如钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)或metallidurans贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)；选自假单胞菌属(Pseudomonas)如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或食油假单胞菌(Pseudomonas oleavorans)；选自代尔夫特菌属(Delftia)如食酸代尔夫特菌(Delftiaacidovorans)；选自芽孢杆菌属(Bacillus)如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)；选自乳杆菌属(Lactobacillus)如德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)；或选自乳球菌属(Lactococcus)如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。
在另一个实例中，可以通过至少一种真核生物将合成气生成羧酸。用于本发明任一方面的真核生物可以选自曲霉属(Aspergillus)如黑曲霉(Aspergillus niger)，选自酿酒酵母属(Saccharomyces)如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)；选自毕赤酵母属(Pichia)如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)；选自解脂耶氏酵母属(Yarrowia)如解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)；选自伊萨酵母属(Issatchenkia)如Issathenkiaorientalis；选自德巴利酵母属(Debaryomyces)如汉逊德巴利酵母(Debaryomyceshansenii)；选自Arxula属如Arxula adenoinivorans；或选自克鲁维酵母属(Kluyveromyces)如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)。
所述羧酸可以是本领域已知的任何羧酸。特别地，所述羧酸可以选自下组：丁酸(CH3(CH2)2COOH)、戊酸(CH3(CH2)3COOH)、己酸(CH3(CH2)4COOH)、庚酸(CH3(CH2)5COOH)和辛酸(CH3(CH2)6COOH)。在一个实例中，所述羧酸可以选自下组：丁酸、戊酸、异戊酸、己酸、异己酸、庚酸、异庚酸、辛酸和异辛酸。
在一个实例中，所述羧酸可以是己酸。特别地，己酸可以通过Steinbusch，2011，Zhang，2013，Van Eerten-Jansen，M.C.A.A，2013，Ding.H.等人，2010，Barker H.A.，1949，Stadtman E.R.1950，Bornstein B.T.，等人，1948等中公开的任何方法利用合成气制备。甚至更特别地，可以在至少克氏梭菌存在下从合成气制备己酸。
本文所用的术语“产乙酸细菌”是指能够通过Wood-Ljungdah1途径将CO、CO2和/或氢转化为乙酸盐的微生物。这些微生物包括在其野生型中不具有Wood-Ljungdah1途径，通过基因修饰获得该性状的微生物。这样的微生物包括但不限于大肠杆菌细胞。目前，本领域已知21种不同的产乙酸细菌属(Drake等人，2006)，并且这些细菌也可包括一些梭菌(Drake&Kuse1，2005)。这些细菌能够利用二氧化碳或一氧化碳作为碳源，氢气作为能源(Wood，1991)。此外，醇、醛、羧酸以及许多己糖也可以作为碳源(Drake等人，2004)。产生乙酸(盐)的还原途径称为乙酰-CoA或Wood-Ljungdah1途径。
特别地，产乙酸细菌可以选自下组：autothenogenum梭菌DSMZ 19630、Clostridium ragsdahlei ATCC no.BAA-622、autoethanogenum梭菌、Carboxidivorans梭菌DSM 15243、穆尔氏菌属(Moorella sp)HUC22-1、热醋穆尔氏菌(Moorellathermoaceticum)、热自养穆尔氏菌(Moorella thermoauto trophica)、产生瘤胃球菌(Rumicoccus productus)、厌氧醋菌属(Acetoanaerobum)、Oxobacter pfennigii、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、噬乙酸甲烷八叠球菌(Methanosarcinaacetivorans)、氧化碳嗜热菌属(Carboxydothermus)、库氏脱硫肠状菌(Desulfotomaculumkutznetsovii)、火球菌属(Pyrococcus)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、食甲基丁酸杆菌(Butyribacterium methylotrophicum)ATCC 33266、蚁酸醋酸梭菌(Clostridiumformicoaceticum)、丁酸梭菌(Clostridium butyricum)、德氏乳杆菌(Laktobacillusdelbrukii)、产丙酸丙酸杆菌(Propionibacterium acidoprprionici)、栖树丙酸螺菌(Proprionispera arboris)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobierspirillumsucciniproducens)、Bacterioides amylophilus、栖瘤胃拟杆菌(Becterioidesruminicola)、凯伍热厌氧菌(Thermoanaerobacter kivui)、伍氏醋酸杆菌(Acetobacterium woodii)、潮湿厌氧醋菌(Acetoanaerobium notera)、醋酸梭菌(Clostridium aceticum)、食甲基丁酸杆菌、热醋穆尔氏菌(Moorella thermoacetica)、粘液真杆菌(Eubacterium limosum)、产生消化链球菌(Peptostreptococcus productus)、杨氏梭菌、梭菌ATCC 29797和Carboxidivorans梭菌。更具体的，可以使用Carboxidivorans梭菌的ATCC BAA-624菌株。甚至更具体地，可以使用标记为“P7”和“P11”的细菌菌株，其为在例如US2007/0275447和US2008/0057554中描述的Carboxidivorans梭菌。
另一种特别合适的细菌可以是杨氏梭菌。在一个实例中，从合成气生成己酸时，可以使用选自下组的菌株：杨氏梭菌PETC，杨氏梭菌ERI2，杨氏梭菌COL和杨氏梭菌0-52。这些菌株描述于例如WO 98/00558，WO 00/68407，ATCC 49587，ATCC 55988和ATCC 55989中。
产乙酸细菌可以与氢氧化细菌联合使用。在一个实例中，利用产乙酸细菌和氢氧化细菌将合成气生成羧酸。在另一个实例中，仅产乙酸细菌可以用于代谢合成气，从而将合成气产生成羧酸。在另一个实例中，仅氢氧化细菌可以用于该反应。
氢氧化细菌可以选自下组：无色杆菌属(Achromobacter)、嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus)、食酸菌属(Acidovorax)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、太湖念珠藻属(Anabena)、产液菌属(Aquifex)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮螺菌属(Azospirillum)、杆菌属(Bacillus)、Bradyrhizobium、贪铜菌属(Cupriavidus)、德氏菌属(Derxia)、螺杆菌(Helicobacter)、草螺菌属(Herbaspirillum)、氢杆菌属(Hydrogenobacter)、Hydrogenobaculum、氢噬胞菌属(Hydrogenophaga)、Hydrogenophilus、Hydrogenothermus、氢弧菌属(Hydrogenovibrio)、艾德昂菌属(Ideonella sp.)01、Kyrpidia、生金球菌属(Metallosphaera)、短杆菌(Methanobrevibacter)、分支杆菌(Myobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、寡养菌属(Oligotropha)、副球菌属(Paracoccus)、Pelomonas、Polaromonas、假单胞菌属(Pseudomonas)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)、根瘤菌(Rhizobium)、红球菌属(Rhodococcus)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、红螺菌属(Rhodospirillum)、链霉菌属(Streptomyces)、荚硫菌属(Thiocapsa)、密螺旋体属(Treponema)、贪噬菌属(Variovorax)、黄色杆菌属(Xanthobacter)和Wautersia。
从合成气生产羧酸时，可以使用细菌的组合。可能有一种或多种产乙酸细菌与一种或多种氢氧化细菌组合使用。在另一个实例中，可以仅存在多于一种类型的产乙酸细菌。在另一个实例中，可以仅存在多于一种氢氧化细菌。
根据本发明的任一方面的方法可以包括在进行电解之前首先提取从合成气中产生的羧酸的步骤。可以使用本领域已知的任何提取羧酸的方法。特别地，一个提取羧酸的方法的实例由在Byoung，S.J.等人2013的2.3部分提供。另一个例子是由Kieun C.等人在2013年的“提取模型”部分公开的方法。
然后可以将羧酸置于Kolbe电解反应或光-Kolbe反应条件下。该反应可以导致相应烷烃、二氧化碳和氢气的形成。所生产的烷烃更不易混溶。这使根据本发明的任一方面生产的烷烃容易被分离。可以认为根据本发明的任一方面的方法选择性高，并且可以使所产生的烷烃的纯度高。在一个实例中，当用己酸进行Kolbe电解反应时，形成癸烷(C10H22)和氢气以及少量的戊烷。己烷与发酵液不混溶，并且容易被分离。
Kolbe电解反应的条件是本领域已知的，包括铂电极，具有多种电极的超声乳液，例如掺杂硼的化学气相沉积金刚石电极(Wadhawan J.D.等人，2001)，聚合物电极等。与Kolbe脂肪酸或羧酸电解反应同义的Kolbe电解反应是羧酸的氧化脱羧手段。Kolbe电解反应通常与羧酸盐阴离子而不是酸本身一起反应。
特别地，Kolbe电解反应是在电化学电池中发生的有机氧化还原反应的实例。该方法具有几个优点，包括例如可能控制电极电位。它也因为不需要还原剂或氧化剂而被认为是简单的反应。在Kolbe电解反应中，氧化反应不是化学反应而是电解反应。根据下面所示的反应产生的基团进行二聚作用形成烷烃。
Figure BPA0000238477200000151
也已知Kolbe电解反应产生副产物，其取决于导致碳正离子及其随后重排的后续氧化的容易度：
Figure BPA0000238477200000161
在一个实例中，在发酵液中进行Kolbe电解反应，其用于生产根据本发明任一方面的方法的步骤(i)中的羧酸。这允许从发酵液中分离烷烃产物。然后可以通过倾析、蒸馏或本领域已知的其它方法容易地分离烷烃。因此，可以采用连续或半连续方法，其中在产生烷烃的同时将合成气加入系统中，然后使用例如蒸发蒸馏、倾析等从发酵液中除去烷烃。通过产乙酸菌和/或氢氧化细菌生产羧酸的步骤(i)和对产生的羧酸进行Kolbe电解的步骤(ii)均可在单个发酵罐中进行并且这两个步骤可以同时进行。在步骤(i)和(ii)之间不需要分离羧酸。
根据本发明的任一方面，Kolbe电解反应可以包括盐的存在，通常是羧酸的碱金属盐，水和两个金属电极。在两个电极之间可获得电流和至少1V电压。
在另一个实例中，可以在甲醇而不是水中进行Kolbe电解反应。在该实例中可以使用铂电极。可以认为使用甲醇有利于产生优异的转化率和电解连续性。在Kolbe电解反应中使用甲醇可以改善电解反应的选择性。
特别地，可以在电解介质中进行Kolbe电解反应。电解介质可以是水、甲醇或两者的混合物。在一个实例中，两者的混合物可以表示电解介质包含约0.5体积％至约50体积％的水。
在另一个实例中，首先完成发酵，然后可以在进行Kolbe电解反应之前任选地分离羧酸离子。可以从发酵液中除去羧酸，例如利用溶剂连续提取。在这种情况下，由于在发酵发应后发生Kolbe电解反应或光-Kolbe电解反应，可以通过例如倾析或过滤发酵培养基来收集产乙酸细菌，并且可以将新一批含有合成气的水与产乙酸细菌合并。产乙酸细菌可就此回收。包含羧酸的所述发酵培养基可以进行Kolbe电解反应或光-Kolbe电解反应，并且由于很容易将所得到的产物(对应的烷烃，双产物烷烃，氢气和二氧化碳)与水性发酵溶液分离，所以它们可以容易地通过例如气体收集(双产物烷烃，二氧化碳和氢气)并将其分开成它们的组分，和通过倾析或蒸馏相应的烷烃。如果需要，含水溶液可以之后再循环到发酵罐中，或者以其他方式处理。在该实例中，可以在单个发酵罐或不同的发酵罐中进行这两个步骤。
根据本发明的任一方面的方法还可以提供源自发酵步骤和Kolbe电解步骤的氢源。由该方法产生的氢气可用于燃料电池，作为燃料用于费-托反应器中，或用于氢的任何其它合适的用途。从费-托合成反应获得的汽油、喷气燃料和柴油燃料都是本领域技术人员公知的。由该方法产生的二氧化碳可以被藻类捕获，并用于产生甘油三酯。甘油三酯可用于例如生产生物柴油燃料。
在一个实例中，一种或多种羧酸可以同时进行Kolbe电解或光-Kolbe电解反应步骤。这些羧酸将形成如上所示与羧基连接的烷基的基团。这些基团可以与通过羧酸的脱羧反应形成的任何烷基反应。
根据本发明的任一方面使用的羧酸可以是饱和的、不饱和的和/或支链或非支链的。因此，所得烷烃还可以是支链或非支链的，这取决于所使用的羧酸。特别地，所得烷烃可以是对称的或不对称的。对称烷烃可以是其中一半分子是另一半的镜像的烷烃。
特别地，根据本发明的任一方面，烷烃和羧酸选自下组：
(a)包含6个碳原子的烷烃和包含4个碳原子的羧酸；
(b)包含8个碳原子的烷烃和包含5个碳原子的羧酸；
(c)包含8个碳原子的烷烃和包含6个碳原子的第一羧酸和包含4个碳原子的第二羧酸；
(d)包含10个碳原子的烷烃和包含6个碳原子的羧酸；
(e)包含10个碳原子的烷烃和包含5个碳原子的第一羧酸和包含7个碳原子的第二羧酸；
(f)包含12个碳原子的烷烃和包含7个碳原子的羧酸；
(g)包含12个碳原子的烷烃和包含8个碳原子的第一羧酸和包含6个碳原子的第二羧酸；
(h)包含12个碳原子的烷烃和包含9个碳原子的第一羧酸和包含5个碳原子的第二羧酸；
(i)包含14个碳原子的烷烃和包含8个碳原子的羧酸；和
(j)包含14个碳原子的烷烃和包含6个碳原子的第一羧酸和包含8个碳原子的第二羧酸；
(k)包含16个碳原子的烷烃和包含9个碳原子的羧酸；
(l)包含9个碳原子的烷烃和包含5个碳原子的第一羧酸和包含6个碳原子的第二羧酸；
(m)包含11个碳原子的烷烃和包含6个碳原子的第一羧酸和包含7个碳原子的第二羧酸；和
(n)包含13个碳原子的烷烃和包含7个碳原子的第一羧酸和包含8个碳原子的第二羧酸；和
(o)包含15个碳原子的烷烃和包含7个碳原子的第一羧酸和包含8个碳原子的第二羧酸。
更特别地，烷烃和羧酸选自下组：
(a)包含10个碳原子的烷烃和包含6个碳原子的羧酸；
(b)包含12个碳原子的烷烃和包含7个碳原子的羧酸；和
(c)包含14个碳原子的烷烃和包含8个碳原子的羧酸；
在一个实例中，用于本发明任一方面的羧酸可包含至少4个碳原子(丁烷酸/丁酸)。当将丁酸进行Kolbe电解反应时，所得烷烃可包含至少6个碳原子。特别地，所得烷烃可以是己烷。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸丁酸和第二羧酸丙酸(3个碳原子)时，所得烷烃可以包含至少5个碳原子。特别地，所得烷烃可以是戊烷。在该实例中也可能形成诸如己烷和丁烷的双产物。
在一个实例中，用于本发明任一方面的羧酸可包含至少5个碳原子(戊烷酸/戊酸)。当将戊酸进行Kolbe电解反应时，所得烷烃可以包含至少8个碳原子。特别地，所得烷烃可以是辛烷。在另一实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸戊酸和第二羧酸丙酸时，所得烷烃可包含至少6个碳原子。特别地，所得烷烃可以是己烷。在该实施例中也可能形成诸如辛烷和丁烷的双产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸戊酸和第二羧酸丁酸时，所得烷烃可以包含至少7个碳原子。特别地，所得烷烃可以是庚烷。在该实施例中也可能形成诸如辛烷和己烷的双产物。
在一个实例中，用于本发明任一方面的羧酸可包含至少6个碳原子(己烷酸/己酸)。当将己酸进行Kolbe电解反应时，所得到的烷烃可以包含至少10个碳原子。特别地，所得烷烃可以是癸烷。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸己酸和第二羧酸丙酸时，所得烷烃可以包含至少7个碳原子。特别地，所得烷烃可以是庚烷。在该实例中也可以形成诸如癸烷和丁烷的双产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸己酸和第二羧酸丁酸时，所得烷烃可以包含至少8个碳原子。特别地，所得烷烃可以是辛烷。在该实例中，也可以形成癸烷和己烷的副产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸己酸和第二羧酸戊酸时，所得烷烃可以包含至少9个碳原子。特别地，所得烷烃可以是壬烷。在本实施例中，也可以形成诸如癸烷呵辛烷等双产物。
在一个实例中，用于本发明任一方面的羧酸可包含至少7个碳原子(庚烷酸/庚酸)。当将庚酸进行Kolbe电解反应时，所得烷烃可以包含至少12个碳原子。特别地，所得烷烃可以是十二烷。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸庚酸和第二羧为丙酸时，所得烷烃可以包含至少8个碳原子。特别地，所得烷烃可以是辛烷。在该实例中也可以生成如十二烷和丁烷的双产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸庚酸和第二羧酸丁酸的组合时，所得烷烃可以包含至少9个碳原子。特别地，所得烷烃可以是壬烷。在该实例中也可以形成如十二烷和己烷的双产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸庚酸和第二羧酸戊酸时，所得烷烃可以包含至少10个碳原子。特别地，所得烷烃可以是癸烷。在该实例中也可以形成如十二烷和辛烷的双产物。在另一实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸庚酸和第二羧酸己酸时，所得烷烃可包含至少11个碳原子。特别地，所得烷烃可以是十一烷。在该实例中也可以形成如十二烷和癸烷的双产物。
在一个实例中，用于本发明任一方面的羧酸可包含至少8个碳原子(辛烷酸/辛酸)。当将辛酸进行Kolbe电解反应时，所得烷烃可以包含至少14个碳原子。特别地，所得烷烃可以是十四烷。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸辛酸和第二羧酸丙酸时，所得烷烃可以包含至少9个碳原子。特别地，所得到的烷烃可以是壬烷。在该实例中也可以形成如十四烷和丁烷的双产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸辛酸和第二羧酸丁酸时，所得烷烃可以包含至少10个碳原子。特别地，所得烷烃可以是癸烷。在本实例中也可以形成如十四烷和己烷的双产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸辛酸和第二羧酸戊酸时，所得烷烃可以包含至少11个碳原子。特别地，所得烷烃可以是十一烷。在本实例中也可以形成如十四烷和辛烷的双产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸辛酸和第二羧酸己酸时，所得烷烃可以包含至少12个碳原子。特别地，所得烷烃可以是十二烷。在该实例中也可以形成如十四烷和癸烷的双产物。在另一个实例中，当羧酸组合物包含至少第一羧酸辛酸和第二羧酸庚酸时，所得烷烃可以包含至少13个碳原子。特别地，所得烷烃可以是十三烷。在本实例中也可以形成如十四烷和十二烷的双产物。
特别地，在本发明的任一方面中使用的羧酸可以包含至少6，7或14个碳原子。当将该酸进行Kolbe电解反应时，所得烷烃可分别包含至少10，12或14个碳原子。羧酸的组合可用于本发明的任一方面。可以将2个，3个，4个，5个，6个，7个，8个，9个，10个或更多羧酸进行Kolbe电解反应。烷烃混合物的形成取决于哪种第一酸与哪种第二酸二聚化。本领域技术人员能够选择不同的羧酸进行Kolbe电解反应以产生所需的烷烃。
根据本发明的任一方面的方法是有利的，因为它在汽油范围内提供烃，从与形成乙醇的起始原料相同的起始原料得来，但是每单位体积能量更高。
根据本发明任一方面的微生物可以存在于固定的细胞生物反应器中进行发酵，例如纤维床生物反应器(FBB)。然而，可以使用任何已知的发酵罐。技术人员能够容易地基于用于获得羧酸的方法，所产生的羧酸的类型，微生物生长的条件等来确定所使用的最合适的发酵罐。
使用固定的细胞生物反应器有助于重新利用细菌。然而，在发酵培养基上进行Kolbe电解和/或光-Kolbe电解反应的实例中，可以很容易地从反应介质中去除烷烃，因此在这种情况下细菌的固定不再是问题。当细菌不被固定时，可以使用例如离心细菌进行回收来分离细菌。连续倾析，蒸发去除或提取烷烃可以将发酵培养基连续灭菌并最小化水的使用。发酵过程的不间断允许底物浓度恒定地保持在最佳水平，因此发酵效率最大化。
发酵形成的羧酸可以通过Kolbe电解反应转化为烷烃。Kolbe电解反应是羧酸盐阴离子的阳极氧化过程。形成基团，然后脱羧。所得的基团与另一个结合形成二聚体。例如，根据本发明的任一方面形成的羧酸可以失去摩尔量二氧化碳以产生烷基，两个烷基结合形成烷烃。Kolbe电解反应的效率对水敏感。因此，在一个实例中，反应可以在(几乎)无水条件下进行。
在一个实例中，可在离子液体中进行Kolbe电解反应，离子液体可任选地存在于发酵罐中。在另一个实例中，使用阴离子交换膜作为固体聚合物电解质(http：//www.pca-gmbh.com/appli/spe.htm)。合适的电极系统的一个实例是蒙乃尔阴极和铂片或铂丝网阳极。
在Kolbe电解反应中存在竞争反应，例如将羧酸转化为烯烃，二氧化碳和/或氢的消除反应。电极上的低温(即30-40℃)和高流速倾向于促进石蜡的形成，而不是消除。
根据本发明任一方面的烷烃可用于生产至少一种氧化烷烃产物，其中所述方法包括使根据本发明任一方面的烷烃与至少一种能够将烷烃氧化成相应的氧化烷烃产物第二微生物接触，其中所述氧化烷烃产物选自由各自的醇，羧酸和二羧酸组成的组，并且所述第二微生物选自大肠杆菌、热带假丝酵母、解脂耶氏酵母和恶臭假单胞菌组成的组。
在一个实例中，根据本发明的任一方面的微生物可以进一步经基因修饰以能够将烷烃氧化成相应氧化产物中的任一种。在另一个实例中，将根据本发明的任一方面产生的烷烃补料到能够进行烷烃氧化的第二微生物中。
根据本发明任一方面的第二微生物可以选自大肠杆菌、热带假丝酵母、解脂耶氏酵母、恶臭假单胞菌等组成的组。特别地，第二微生物可经基因修饰来增加能够氧化烷烃的至少一种酶的表达量。在一个实例中，基因修饰的第二微生物可以表达重组烷烃羟化酶。特别地，烷烃羟化酶可以是CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶。术语“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”在本文中可以指胞质氧化酶，其是3-组分系统的一部分，该系统还包含具有烷烃结合位点和羟基化烷烃的能力的铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶。更具体地，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶可以与来自博氏炭疽病菌(Alcanivoraxborkumensis)SK2的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶(数据库代码YP_691921)具有至少80，90，95或99％的多肽序列同一性。第二微生物可以进一步具有烷烃羟化酶活性。
特别地，本文所用的术语“烷烃羟化酶活性”是指催化烷烃或包含至少六个，更特别是至少十二个碳基团的未取代的直链烷基的羟基化的能力。术语“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”是指一种非膜结合氧化酶，其包含烷烃，含有至少五个或特别是十二个碳基团的未取代的直链烷基或单羟基化烷烃的一个结合位点，并且该酶的多肽链包含基序LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN。在一个实例中，本文使用的“CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶”是来自博氏炭疽病菌SK2(数据库代码YP_691921)的CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶或其优选具有烷烃羟化酶活性的变体。
根据本发明的任一方面使用的酶可以是重组酶。本文所用的术语“重组”是指相应的核酸分子在天然细胞中不存在和/或使用基因工程方法产生的可能性。在一个实例中，如果相应的多肽由重组核酸编码，则该蛋白质被称为重组的。类似地，本文所用的重组细胞是指具有至少一种重组核酸或一种重组多肽的细胞。本领域技术人员熟知适于产生重组分子或细胞的方法。通过使用本领域技术人员已知的例如pET-或pGEX-载体系统过表达重组酶。
在一个实例中，为了以最佳方式从还原剂(优选NADH)向CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶提供电子，细胞同时表达单加氧酶以及铁氧还蛋白还原酶和铁氧还蛋白，这两种蛋白可与所述使用的单加氧酶在功能上相互作用。该多肽可以是分离的多肽，或者当使用全细胞催化剂时，共表达的多肽或N末端或C末端融合到CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶上的多肽。本领域技术人员可以容易地通过在烷烃底物和三种多肽存在时还原剂是否被氧化确定铁氧还蛋白还原酶或铁氧还蛋白是否与CYP153家族的给定细胞色素P450单加氧酶在功能上相互作用。或者，使用Scheps，D.等人(2011)描述的酶测定方法，其显示出在多肽在功能上相互作用时反应速率的显着增加。在一个实例中，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶，铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶来自相同的生物体。在另一个实例中，铁氧还蛋白还原酶可能源自博氏炭疽病菌SK2(数据库代码YP_691923)或为其变体，铁氧还蛋白可能源来自博氏炭疽菌SK2(数据库代码YP_691920)或为其变体，CYP153家族的细胞色素P450单加氧酶可能源自博氏炭疽病菌SK2(数据库代码YP_691921)或为其变体。
在另一个实例中，烷烃羟化酶可以是AlkB单加氧酶。AlkB是首先从恶臭假单胞菌Gpol AlkBGT系统中首次分离出的氧化还原酶，其依赖于另两个多肽，AlkG和AlkT。AlkT是将电子从NADH传递到AlkG的FAD依赖性红细胞氧还蛋白还原酶。AlkG是一种红细胞氧还蛋白，一种作为AlkB的直接电子供体的含铁的氧化还原蛋白。本文所用的术语“AlkB单加氧酶”可指与恶臭假单胞菌Gpol AlkB(数据库代码：CAB54050.1)的序列具有至少，以递增优先级的顺序，75，80，85，90，92，94，96，98或99％的序列同源性的多肽，该多肽能够氧化烷烃。在一个实例中，AlkB单加氧酶可以是烷烃-氧化氧化还原酶，其与恶臭假单胞菌GpolAlkG(CAB54052.1)和AlkT(CAB54063.1)的多肽共同作用。为了更好地向AlkB烷烃羟化酶供应电子，细胞表达单加氧酶和与其在功能上相互作用的辅助蛋白，特别是使用AlkG和/或AlkT或它们各自的变体，其为来自恶臭假单胞菌Gpol(CAB54052.1)的AlkG和AlkT(CAB54063.1)。
可通过在第二微生物中表达醇脱氢酶来替代或补充烷烃羟化酶以增强用于本发明方法中的第二微生物氧化底物的能力。特别地，本文所用的术语“醇脱氢酶”是指将醛或酮氧化成相应的伯醇或仲醇的酶。醇脱氢酶的实例包括真养产碱杆菌(ACB78191.1)，短乳杆菌(YP_795183.1)，来自马肝的高加索酸奶乳杆菌(lactobacillus kefiri)(ACF95832.1)，泛养副球菌(Paracoccus pantotrophus)(ACB78182.1)和Sphingobiumyanoikuyae(EU427523.1)的醇脱氢酶，以及它们各自的变体。因此，根据本发明的任一方面产生的烷烃可以容易地用作第二微生物的碳源以产生至少一种相应的氧化烷烃产物。该方法为生产氧化产物提供了更纯的烷烃来源，从而形成了产生副产物更少的生产氧化烷烃产物的更具体的方法。
根据本发明任一方面的方法可包括分离烷烃的进一步的步骤。例如，根据本发明的任一方面产生的烷烃可以具有与反应混合物不同的相。因此，可以通过本领域技术人员已知的简单分离方法分离烷烃，例如离心和倾析。在一个实例中，在Kolbe电解羧酸之后产生至少一种石蜡。在另一个实例中，进一步将烷烃进行催化重整和/或异构化以形成汽油或汽油组合物的组分。
实施例
先前描述了优选实施例，如本领域技术人员将理解的，在不脱离权利要求的范围的情况下，可以对其设计，构造或操作进行变化或修改。这些变化，例如，也将被权利要求的范围所覆盖。
实施例1
克氏梭菌从乙酸和乙醇生成丁酸
使用细菌克氏梭菌将乙醇和乙酸(盐)生物转化为丁酸。所有培养步骤在厌氧条件下在可用丁基橡胶塞密封的耐压玻璃瓶中进行。
预培养时，在250ml培养瓶中加入100ml DMSZ52培养基(pH＝7.0；10g/L K-乙酸盐，0.31g/L K2HPO4，0.23g/L KH2PO4，0.25g/l NH4Cl，0.20g/l MgSO4×7H2O，1g/L酵母提取物，0.50mg/L刃天青，10μl/L HCl(25％，7.7M)，1.5mg/L FeCl2×4H2O，70μg/L ZnCl2×7H2O，100μg/L MnCl2×4H2O，6μg/L H3BO3，190μg/L CoCl2×6H2O，2μg/L CuCl2×6H2O，24μg/L NiCl2×6H2O，36μg/L Na2MO4×2H2O，0.5mg/L NaOH，3μg/L Na2SeO3×5H2O，4μg/L Na2WO4×2H2O，100μg/L维生素B12，80μg/L的p-氨基苯甲酸，20μg/L D(+)生物素，200μg/L烟酸，100μg/L D-泛酸钙，300μg/L盐酸吡哆醇，200μg/L硫铵-HCl×2H2O，20ml/L乙醇，2.5g/LNaHCO3，0.25g/L半胱氨酸-HClxH2O，0.25g/L Na2S×9H2O)，然后接种5ml冷冻保存的克氏梭菌，并在37℃下孵育144小时至OD600nm＞0.2。
主培养阶段，在500ml培养瓶中加入200ml新鲜DMSZ52培养基，接种来自预培养的离心细胞至OD600nm为0.1。将该生长培养物在37℃孵育27小时至OD600nm＞0.6。然后将细胞悬浮液离心，以生产缓冲液洗涤沉淀(pH6.0；8.32g/L的K-醋酸，0.5g/L乙醇)并再次离心。
产物培养阶段，向500ml瓶中加入200ml生产缓冲液，然后接种来自主培养阶段的洗涤后的细胞至OD600nm为0.2。将培养物用丁基橡胶塞盖住，并在37℃和100rpm下在开放摇动水浴中孵育71小时。在培养期的开始和结束时取样。测试它们的光密度，pH和不同的分析物(通过NMR测试)。
结果表明，在产物生产阶段，乙酸盐的量从5.5g/l降至5.0g/l，乙醇的量从0.5g/l降至0.0g/l。此外，丁酸的浓度从0.05g/l增至0.8g/l，己酸的浓度从0.005g/l增加到0.1g/l。
实施例2
克氏梭菌从乙酸盐和乙醇生成己酸
使用细菌克氏梭菌将乙醇和乙酸盐生物转化为己酸。所有培养步骤在厌氧条件下在可用丁基橡胶塞密封的耐压玻璃瓶中进行。
预培养时，在250ml培养瓶中加入100ml DMSZ52培养基(pH＝7.0；10g/L K-乙酸盐，0.31g/L K2HPO4，0.23g/L KH2PO4，0.25g/l NH4Cl，0.20g/l MgSO4x7H2O，1g/L酵母提取物，0.50mg/L刃天青，10μl/L HCl(25％，7.7M)，1.5mg/L FeCl2x4H2O，70μg/L ZnCl2x7H2O，100μg/L MnCl2×4H2O，6μg/L H3BO3，190μg/L CoCl2x 6H2O，2μg/L CuCl2x6H2O，24μg/LNiCl2×6H2O，36μg/L Na2MoO4x 2H2O，0.5mg/L NaOH，3μg/L Na2SeO3x 5H2O，4μg/LNa2WO4x2H2O，100μg/L维生素B12，80μg/L的p-氨基苯甲酸，20μg/L D(+)生物素，200μg/L烟酸，100μg/L D-泛酸钙，300μg/L盐酸吡哆醇，200μg/L硫铵-HClx2H2O，20ml/L乙醇，2.5g/LNaHCO3，0.25g/L半胱氨酸-HCl x H2O，0.25g/L Na2Sx9H2O)，然后接种5ml冷冻保存的克氏梭菌，并在37℃下孵育144小时至OD600nm＞0.2。
主培养阶段，在500ml培养瓶中加入200ml新鲜DMSZ52培养基，接种来自预培养的离心细胞至OD600nm为0.1.将该生长培养物在37℃孵育27小时至OD600nm＞0.6。然后将细胞悬浮液离心，以生产缓冲液洗涤沉淀(pH6.0；0.832g/L的K-醋酸，5.0g/L乙醇)并再次离心。
产物培养阶段，向500ml瓶中加入200ml生产缓冲液，然后接种来自主培养阶段的洗涤后的细胞至OD600nm为0.2。将培养物用丁基橡胶塞盖住，并在37℃和100rpm下在开放摇动水浴中孵育71小时。在培养期的开始和结束时取样。测试它们的光密度，pH和不同的分析物(通过NMR测试)。
结果表明，在产物生产阶段，乙酸盐的量从0.54g/l降至0.03g/l，乙醇的量从5.6g/l降至4.9g/l。此外，丁酸的浓度从0.05g/l增至0.28g/l，己酸的浓度从0.03g/l增加到0.79g/l。
实施例3
克氏梭菌从丁酸和乙醇生成己酸
使用细菌克氏梭菌将乙醇和丁酸盐生物转化为己酸。所有培养步骤在厌氧条件下在可用丁基橡胶塞密封的耐压玻璃瓶中进行。
预培养时，在250ml培养瓶中加入100ml DMSZ52培养基(pH＝7.0；10g/L K-乙酸盐，0.31g/L K2HPO4，0.23g/L KH2PO4，0.25g/l NH4Cl，0.20g/l MgSO4x7H2O，1g/L酵母提取物，0.50mg/L刃天青，10μl/L HCl(25％，7.7M)，1.5mg/L FeCl2x4H2O，70μg/L ZnCl2x7H2O，100μg/L MnCl2×4H2O，6μg/L H3BO3，190μg/L CoCl2x 6H2O，2μg/L CuCl2x6H2O，24μg/LNiCl2×6H2O，36μg/L Na2MO4x 2H2O，0.5mg/L NaOH，3μg/L Na2SeO3x 5H2O，4μg/LNa2WO4x2H2O，100μg/L维生素B12，80μg/L的p-氨基苯甲酸，20μg/L D(+)生物素，200μg/L烟酸，100μg/L D-泛酸钙，300μg/L盐酸吡哆醇，200μg/L硫铵-HClx2H2O，20ml/L乙醇，2.5g/LNaHCO3，0.25g/L半胱氨酸-HCl x H2O，0.25g/L Na2Sx9H2O)，然后接种5ml冷冻保存的克氏梭菌，并在37℃下孵育144小时至OD600nm＞0.3。
主培养阶段，在500ml培养瓶中加入200ml新鲜DMSZ52培养基，接种来自预培养的离心细胞至OD600nm为0.1。将该生长培养物在37℃孵育25小时至OD600nm＞0.4。然后将细胞悬浮液离心，以生产缓冲液洗涤沉淀(pH6.16；4.16g/L的K-醋酸，10.0g/L乙醇)并再次离心。
产物培养阶段，向500ml瓶中加入200ml生产缓冲液，然后接种来自主培养阶段的洗涤后的细胞至OD600nm为0.2。在第一次培养中，开始时将1.0g/l丁酸加入生产缓冲液中，在第二次培养中，不向生产缓冲液中加入丁酸。将培养物用丁基橡胶塞盖住，并在37℃和100rpm下在开放摇动水浴中孵育71小时。在培养期的开始和结束时取样。测试它们的光密度，pH和不同的分析物(通过NMR测试)。
结果表明，在产物生产阶段，在补充丁酸的培养物中乙酸盐的量从3.1g/l降至1.1g/l，乙醇的量从10.6g/l降至7.5g/l。此外，丁酸的浓度从1.2g/l增至2.2g/l，己酸的浓度从0.04g/l增加到2.30g/l。
在未补充培养物的生产阶段中，乙酸盐的量从3.0g/l降至1.3g/l，乙醇的量从10.2g/l降至8.2g/l。此外，丁酸的浓度从0.1g/l增加到1.7g/l，己酸的浓度从0.01g/l增加到1.40g/l。
实施例4
克氏梭菌从异丁酸和乙醇生成异己酸
使用细菌克氏梭菌将乙醇和异丁酸生物转化为异己酸。所有培养步骤在厌氧条件下在可用丁基橡胶塞密封的耐压玻璃瓶中进行。
预培养时，在250ml培养瓶中加入100ml DMSZ52培养基(pH＝7.0；10g/L K-乙酸盐，0.31g/L K2HPO4，0.23g/L KH2PO4，0.25g/l NH4Cl，0.20g/l MgSO4x7H2O，1g/L酵母提取物，0.50mg/L刃天青，10μl/L HCl(25％，7.7M)，1.5mg/L FeCl2x4H2O，70μg/L ZnCl2x7H2O，100μg/L MnCl2×4H2O，6μg/L H3BO3，190μg/L CoCl2x 6H2O，2μg/L CuCl2x6H2O，24μg/LNiCl2×6H2O，36μg/L Na2MO4x 2H2O，0.5mg/L NaOH，3μg/L Na2SeO3x 5H2O，4μg/LNa2WO4x2H2O，100μg/L维生素B12，80μg/L的p-氨基苯甲酸，20μg/L D(+)生物素，200μg/L烟酸，100μg/L D-泛酸钙，300μg/L盐酸吡哆醇，200μg/L硫铵-HClx2H2O，20ml/L乙醇，2.5g/LNaHCO3，0.25g/L半胱氨酸-HCl x H2O，0.25g/L Na2Sx9H2O)，然后接种5ml冷冻保存的克氏梭菌，并在37℃下孵育144小时至OD600nm＞0.3。
主培养阶段，在500ml培养瓶中加入200ml新鲜DMSZ52培养基，接种来自预培养的离心细胞至OD600nm为0.1。将该生长培养物在37℃孵育25小时至OD600nm＞0.4。然后将细胞悬浮液离心，以生产缓冲液洗涤沉淀(pH6.16；4.16g/L的K-醋酸，10.0g/L乙醇)并再次离心。
产物培养阶段，向500ml瓶中加入200ml生产缓冲液，然后接种来自主培养阶段的洗涤后的细胞至OD600nm为0.2。开始时将1.0g/l异丁酸加入生产缓冲液中。将培养物用丁基橡胶塞盖住，并在37℃和100rpm下在开放摇动水浴中孵育71小时。在培养期的开始和结束时取样。测试它们的光密度，pH和不同的分析物(通过NMR测试)。
结果表明，在产物生产阶段，乙酸盐的量从3.7g/l降至1.0g/l，乙醇的量从12.7g/l降至7.8g/l，异丁酸的量从1.30g/l降至0.98g/l.此外，丁酸的浓度从0.1g/l增加到1.6g/l，己酸的浓度从0.02g/l增加到1.80g/l，异己酸的浓度从0.00g/l增加至0.07g/l。
实施例5
克氏梭菌从丙酸和乙醇生成戊酸和庚酸
使用细菌克氏梭菌将乙醇和丙酸生物转化为戊酸和庚酸。所有培养步骤在厌氧条件下在可用丁基橡胶塞密封的耐压玻璃瓶中进行。
预培养时，在250ml培养瓶中加入100ml DMSZ52培养基(pH＝7.0；10g/L K-乙酸盐，0.31g/L K2HPO4，0.23g/L KH2PO4，0.25g/l NH4Cl，0.20g/l MgSO4x7H2O，1g/L酵母提取物，0.50mg/L刃天青，10μl/L HCl(25％，7.7M)，1.5mg/L FeCl2x4H2O，70μg/L ZnCl2x7H2O，100μg/L MnCl2×4H2O，6μg/L H3BO3，190μg/L CoCl2x 6H2O，2μg/L CuCl2x6H2O，24μg/LNiCl2×6H2O，36μg/L Na2MO4x 2H2O，0.5mg/L NaOH，3μg/L Na2SeO3x 5H2O，4μg/LNa2WO4x2H2O，100μg/L维生素B12，80μg/L的p-氨基苯甲酸，20μg/L D(+)生物素，200μg/L烟酸，100μg/L D-泛酸钙，300μg/L盐酸吡哆醇，200μg/L硫铵-HClx2H2O，20ml/L乙醇，2.5g/LNaHCO3，0.25g/L半胱氨酸-HCl x H2O，0.25g/L Na2Sx9H2O)，然后接种5ml冷冻保存的克氏梭菌，并在37℃下孵育119小时至OD600nm＞0.2。
主培养阶段，在500ml培养瓶中加入200ml新鲜DMSZ52培养基，接种来自预培养的离心细胞至OD600nm为0.1。将该生长培养物在37℃孵育21小时至OD600nm＞0.4。然后将细胞悬浮液离心，以生产缓冲液洗涤沉淀(pH6.0；1.0g/L的丙酸，2.5g/L乙醇)并再次离心。
产物培养阶段，向500ml瓶中加入200ml生产缓冲液，然后接种来自主培养阶段的洗涤后的细胞至OD600nm为0.2。将培养物用丁基橡胶塞盖住，并在37℃和100rpm下在开放摇动水浴中孵育68小时。在培养期的开始和结束时取样。测试它们的光密度，pH和不同的分析物(通过NMR测试)。
结果表明，在产物生产阶段，丙酸的量从1.08g/L降低至0.04g/L，乙醇的量从2.5g/L降低至1.5g/L。此外，戊酸的浓度从0.05g/L增加到0.95g/L，庚酸的浓度从0.00g/L增加到0.29g/L。
实施例6
在水中通过Kolbe电解反应电解己酸。
在具有铂电极的水中用1M己酸与0.5eqKOH进行Kolbe电解反应。将三颈烧瓶连接至冷阱，在其中将所产生的气体在-80℃下冷凝。该实验的目的是获得尽可能准确的质量平衡。在转化开始时，可以观察到两层，因为己酸在c＝1M时不完全溶于水。在反应过程中反应混合物变成乳状(几乎只有一层)，反应最后可以再次观察到两层。使用GC-MS和H-NMR分析所有三个相，即具有挥发性产物的冷凝相，水层和反应混合物的有机层。电解的参数和结果列于表1中。
Figure BPA0000238477200000281
Figure BPA0000238477200000291
表1.在水中通过Kolbe电解反应电解己酸。
*将挥发性组分冷凝并在CDCl3或C6D6中捕获
实施例7
在水中通过Kolbe电解反应电解己酸。与起始材料的浓度的依赖性。
在水中进行一系列不同浓度的己酸的实验。将反应容器再次连接到冷却阱，以收集挥发性化合物。一旦反应完成，通过1H-NMR分析水层，然后分离和分析层(在高浓度的反应的情况下)或将其分成两部分：用戊烷萃取的一半用于GC-MS分析，另一半用CDCl3或C6D6提取后用于1H-NMR分析。结果示于下表2中。使用铂电极，利用用含有0.5eq KOH(
Figure BPA0000238477200000293
)的己酸进行所有实验。初始己酸浓度为c＜1M时，Kolbe电解反应不具有选择性，来自竞争性反应的新产物变得更为重要。在所有浓度下均观察到生成醛和酯。
Figure BPA0000238477200000292
表2.水中不同浓度的己酸进行Kolbe电解反应。
*将挥发性组分冷凝并在CDCl3或C6D6中捕获
实施例8
在水中进行Kolbe电解反应电解庚酸
在含有铂电极和水的三颈烧瓶中将含有0.5eq KOH的1M庚酸进行Kolbe电解反应。该实验的目的是获得尽可能准确的质量平衡。在电解反应开始时，可以观察到两层，因为庚酸在c＝1M时不完全溶于水。在反应过程中，反应混合物变成乳状(几乎只有一层)，反应最后可以再次观察到两层。在约90％的转化完成之后，停止电解反应。如表3所示，分离的有机层的产率为79％。用GC-MS和1H-NMR分析水层和有机层。有机层主要是十二烷和辛烷，以及其它未确定的烷烃和微量烯烃。水层主要由未反应的庚酸和微量的较短羧酸(例如己酸)，醇(例如戊醇)和酯组成，其也可以被解释为Kolbe产物。
C<sub>init</sub>[M] 1
转化率 92％
pH 5.5-9.0
电流密度[mA/cm<sup>2</sup>] 1000
细胞电压<sub>起始-最终</sub>[V] 30-11
水层<sup>*</sup> 未反应酸8％
有机层 79％烷烃(其中含有42％的十二烷)
<sup>*</sup>未确定成分 例如短链脂肪酸，醇，酯……
表3.在水中通过Kolbe电解反应电解庚酸。
实施例9
在甲醇中通过Kolbe电解反应电解己酸。
在具有铂电极的甲醇中和高电流密度下将1M己酸与0.5eqNaOMe进行Kolbe电解反应。这样的条件导致在几分钟内电极发生钝化，并且电解反应减速结束。为了避免电极钝化，使用自动极性反转的电极达到优异的转化率和连续电解。这种处理导致甲醇中的癸烷选择性高。该实施例表明在相同条件下在甲醇中的电解选择性比在水中高得多。一旦反应完成，通过1H-NMR分析电解质，结果示于表4中。
C<sub>init</sub>[M] 1.0
转化率 50％
电流密度[mA/cm<sup>2</sup>] 1000
细胞电压<sub>起始-最终</sub>[V] 25-35
选择性 95％癸烷，＜5％其他(如甲酸)
微量成分 易挥发气体，酯，醛
表4.在甲醇中通过Kolbe电解反应电解庚酸。
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Claims (10)

1.生产至少一种烷烃的方法，该方法包括：
-使用至少一种微生物从碳源产生至少一种羧酸，和
-对所述羧酸进行Kolbe电解反应以产生烷烃，
其中所述烷烃包含至少6个碳原子，且所述羧酸包含至少4个碳原子，
其中所述碳源选自乙醇和选自由乙酸盐、丙酸盐、丁酸盐、异丁酸盐、戊酸盐和己酸盐组成的组的至少一种其他碳源的组合，并且
其中所述微生物选自克氏梭菌(Clostridium kluyveri)和Carboxidivorans梭菌(C.Carboxidivorans)组成的组。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物表达氢化酶成熟蛋白和/或电子传递复合蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述微生物是基因修饰的，并且所述基因修饰的微生物相对于野生型微生物，至少一种酶具有增加的表达，所述酶选自由氢化酶成熟蛋白和/或电子传递复合蛋白组成的组。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述烷烃是支链或非支链的。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述烷烃和羧酸选自下组：
(a)包含6个碳原子的烷烃和包含4个碳原子的羧酸；
(b)包含8个碳原子的烷烃和包含5个碳原子的羧酸；
(c)包含10个碳原子的烷烃和包含6个碳原子的羧酸；
(d)包含12个碳原子的烷烃和包含7个碳原子的羧酸；和
(e)包含14个碳原子的烷烃和包含8个碳原子的羧酸。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述烷烃和羧酸选自下组：
(a)包含10个碳原子的烷烃和包含6个碳原子的羧酸；
(b)包含12个碳原子的烷烃和包含7个碳原子的羧酸；和
(c)包含14个碳原子的烷烃和包含8个碳原子的羧酸。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中产生包含第一羧酸和第二羧酸的羧酸的组合，所述烷烃和羧酸的组合选自下组：
(a)所述烷烃包含8个碳原子，所述第一羧酸包含6个碳原子，所述第二羧酸包含4个碳原子；
(b)所述烷烃包含10个碳原子，所述第一羧酸包含5个碳原子，所述第二羧酸包含7个碳原子；
(c)所述烷烃包含12个碳原子，所述第一羧酸包含8个碳原子，所述第二羧酸包含6个碳原子；
(d)所述烷烃包含12个碳原子，所述第一羧酸包含9个碳原子，所述第二羧酸包含5个碳原子；
(e)所述烷烃包含14个碳原子，所述第一羧酸包含6个碳原子，所述第二羧酸包含8个碳原子；
(f)所述烷烃包含9个碳原子，所述第一羧酸包含5个碳原子，所述第二羧酸包含6个碳原子；
(g)所述烷烃包含11个碳原子，所述第一羧酸包含6个碳原子，所述第二羧酸包含7个碳原子；和
(h)所述烷烃包含13个碳原子，所述第一羧酸包含7个碳原子，所述第二羧酸包含8个碳原子。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述方法包括分离所述烷烃的进一步的步骤。
9.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述Kolbe电解反应在包含甲醇的电解介质中进行。
10.生产至少一种氧化烷烃产物的方法，其中所述方法包括根据权利要求1至9中任一项所述的方法产生烷烃,使所述烷烃与至少一种能够将所述烷烃氧化成相应的氧化烷烃产物的第二微生物接触，其中所述氧化烷烃产物选自由各自的醇、羧酸和二羧酸组成的组，并且所述第二微生物选自由大肠杆菌(E.coli)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)组成的组。
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