KR20210093969A - 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논 및 그의 유도체의 제조 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은
(a) 에탄올 및/또는 아세테이트를 탄소 사슬 신장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 제조하는 단계;
(b) (a)로부터, 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸을 포함하는 적어도 하나의 추출제를 수성 배지에서 사용하여 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 추출하는 단계; 및
(c) (b)로부터의 추출된 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 헥산산 및 궁극적으로 추가의 알칸산의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로의 화학적 케톤화를 위한 적합한 반응 조건 하에 적어도 하나의 케톤화 촉매 및 궁극적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산과 접촉시키는 단계
를 포함하는, 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 제조하는 방법에 관한 것이다.
(a) 에탄올 및/또는 아세테이트를 탄소 사슬 신장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 제조하는 단계;
(b) (a)로부터, 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸을 포함하는 적어도 하나의 추출제를 수성 배지에서 사용하여 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 추출하는 단계; 및
(c) (b)로부터의 추출된 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 헥산산 및 궁극적으로 추가의 알칸산의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로의 화학적 케톤화를 위한 적합한 반응 조건 하에 적어도 하나의 케톤화 촉매 및 궁극적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산과 접촉시키는 단계
를 포함하는, 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 제조하는 방법에 관한 것이다.
Description
발명의 분야
본 발명은 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 제조 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 조합된 생명공학 및 화학적 방법을 사용하여 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 제조하는 것에 관한 것이다.
발명의 배경
6-운데카논은 통상적으로 허브 및 향신료에서 발견되며, 오스만투스 프라그란스(Osmanthus fragrans)(스위트 오스만투스)의 구성성분이다. 6-운데카논은 화학식 (CH3(CH2)4)2CO를 갖는 디알킬 케톤이다. 이는 특히 식품 산업에서 향미 증진제로서 사용된다. 다른 산업에서는, 6-운데카논이 용매로 사용되고 페인트 및 코팅에 사용된다.
산업계에서, 6-운데카논은 통상적으로 승온에서 각각의 카르복실산을 다양한 금속 산화물 촉매와 접촉시킴으로써 카르복실산으로부터 제조된다. 예를 들어, 미국 특허 제4,754,074에는 프로피온산으로부터 디에틸 케톤의 생성에 사용될 수 있는 촉매의 다른 예들 중에서 알루미나 상에 지지된 이산화망가니즈를 사용하는 디알킬 케톤의 생성 공정이 기재되어 있다. 카르복실산으로부터의 케톤의 제조에서, 다른 촉매, 예컨대 납, 철, 지르코늄, 망가니즈, 토륨 및 네오디뮴의 산화물이 사용될 수 있다는 것은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 촉매는 상당한 탄소 손실 없이 사용될 수 있지만, 공정을 효율적으로 하기 위해 250 내지 450 ℃의 높은 반응 온도에서의 고압 수소 가스가 요구된다. 이러한 조건은 케톤의 제조 비용을 증가시킨다.
또한, 실시된 모든 이들 방법에서, 제조된 디알킬 케톤은 항상 출발 물질로서 카르복실산으로부터 형성된다. 예를 들어, 6-운데카논의 제조는 헥산산으로부터 시작한다. 헥산산은 주로 식물 및 동물성 오일 또는 지방으로부터 독점적으로 수득된다. 원료로서의 동물성 지방은 여전히 고객의 수용을 거의 충족시키지 못하며, 짧은-길이 및 중간-길이 카르복실산을 함유하는 식물 오일은 수득하기가 어렵거나, 또는 열대 지역에서만 제조되며, 종종 또한 열대우림의 파괴를 초래한다. 또한, 특정 식물 및 동물성 오일 또는 지방 원료는 구체적이지만 정해진 지방산 프로파일을 가져 커플링된 제조를 초래한다. 따라서, 6-운데카논의 제조를 위한 기질로서 순수한 헥산산을 수득하는 것은 어렵다.
따라서, 다른 출발 물질로부터 또는 다른 출발 지점에서 6-운데카논 및 다른 고차 알카논을 제조하기 위한 보다 효율적인 수단이 당업계에 필요하다. 특히, 제조를 효율적이고 유효하게 할 수 있는 또 다른 원료 공급원으로부터 6-운데카논을 제조하는 방법이 당업계에 필요하다.
본 발명의 도면
도 1은 (a) 클로스트리디움(Clostridium) 및 부티리비브리오(Butyrivibrio) 속에 의한 부티르산 (C4) 제조(문헌 [Kim BH, et al. Appl Environ Microbiol. 1984; 48 (4): 764-70]) 및 (b) 메가스파에라 엘스데니이(Megasphaera elsdenii) 및 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri)에서 추정되는 헥산산 제조(문헌 [Khan MA.. Melbourne: Victoria University; 2006])와 같은 탄소쇄 신장에 대한 미생물 대사 경로를 나타낸다.
발명의 설명
본 발명은 생명공학 및 화학적 수단 둘 다를 수반하는 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 제조를 위한 완전한 사이클을 제공함으로써 상기 문제를 해결하려고 시도한다. 특히, 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 제조는 생명공학 수단을 사용하여 에탄올 및/또는 아세테이트와 같은 간단한 기질로부터 출발하여 헥산산을 제조한다. 이어서, 제조된 헥산산이 추출되고, 추출된 헥산산이 헥산산을 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로 전환시키는 화학적 단계에 적용될 수 있다. 이 방법은 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 제조를 위한 저렴하고 용이하게 입수가능한 원료로부터 출발하는 이점을 갖는다. 원료 아세테이트 및/또는 에탄올은 또한 어떠한 동물 또는 식물도 죽이지 않는 수단을 사용하여 제조된다. 추가로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출 단계가 뒤 따르는 헥산산을 제조하기 위한 생명공학 단계를 사용하는 것은 헥산산의 높고 순수한 수율을 초래하고, 이는 이어서 화학 단계를 사용하는 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 제조에 용이하게 사용될 수 있다.
본 발명의 한 측면에 따르면,
(a) 에탄올 및/또는 아세테이트를 탄소 사슬 신장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 제조하는 단계;
(b) (a)로부터, 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸을 포함하는 적어도 하나의 추출제를 수성 배지에서 사용하여 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 추출하는 단계; 및
(c) (b)로부터의 추출된 헥산산 및/ 또는 그의 에스테르를 헥산산 및 궁극적으로 추가의 알칸산의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로의 화학적 케톤화를 위한 적합한 반응 조건 하에 적어도 하나의 케톤화 촉매 및 궁극적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산과 접촉시키는 단계
를 포함하는, 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 제조하는 방법이 제공된다.
본원에 사용된 용어 "고차 알카논/알칸올/알칸산"은 6개 이상의 탄소 원자를 포함하는 알카논/알칸올/알칸산을 지칭한다.
헥산산을 제조하기 위해 탄소 사슬 신장을 수행할 수 있는 (a)에서의 미생물은 도 1에 따라 탄소 사슬 신장이 가능할 수 있는 임의의 유기체일 수 있다 (문헌 [Jeon et al. Biotechnol Biofuels (2016) 9: 129]). 탄소 사슬 신장 경로는 또한 문헌 [Seedorf, H., et al., 2008]에 개시되어 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 또한 그의 야생형 형태에서 탄소 사슬 신장이 가능하지 않지만, 유전적 변형의 결과로서 이러한 형질을 획득한 미생물을 포함할 수 있다. 특히, (a) 에서의 미생물은 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxidivorans) 및 클로스트리디움 클루이베리로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 보다 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 클로스트리디움 클루이베리일 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 (b)에서의 추출 단계는 사용된 추출제의 양에 비해 수율에서의 증가를 가능하게 한다. 예를 들어, 50 중량% 미만의 추출제가 순수한 알칸만 사용된 것과 동일한 양의 헥산산을 추출하는데 사용될 수 있다. 따라서, 적은 부피의 추출제로, 더 큰 수율의 헥산산이 추출될 수 있다. 추출제는 또한 미생물에 해롭지 않다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 헥산산이 본 발명의 임의의 측면에 따라 생명공학적으로 제조될 때 존재할 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 수성 배지는, 특히 헥산산을 분리하는 단계(b) 후에, 다시 단계(a)로 재활용될 수 있다. 이러한 재활용 단계는 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제가 미생물에 대해 독성이 아니기 때문에 미생물이 재활용 및 재사용될 수 있게 한다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에서 수성 배지를 재활용시키는 이러한 단계는, 먼저 제1 사이클에서 단계(b)로부터 추출되지 않은 헥산산의 잔류물이 수성 배지가 재활용될 때 추가로 1회 또는 다수회 추출될 기회를 제공받을 수 있게 한다는 추가의 이점을 갖는다. 추가로, 헥산산은 증류에 의해 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제로부터 쉽게 분리될 수 있다. 이는 헥산산이 적어도 추출제보다 유의하게 더 낮은 비점에서 증류되고, 증류를 통한 분리 후, 추출제는 쉽게 재활용될 수 있기 때문이다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 단리된 헥산산을 수성 배지로부터 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 단리된 헥산산은 헥산산이 제조된 배지로부터 분리될 수 있는 헥산산을 지칭할 수 있다. 한 예에서, 헥산산은 수성 배지(예를 들어, 헥산산이 탄소 공급원으로부터 특정 세포에 의해 제조되는 발효 배지)에서 제조될 수 있다. 단리된 헥산산은 수성 배지로부터 추출된 헥산산을 지칭할 수 있다. 특히, 추출 단계는 수성 배지로부터 과량의 물의 분리를 가능하게 하여, 추출된 헥산산을 함유하는 혼합물의 형성을 초래한다.
추출제는 또한 "추출 배지" 또는 "추출하는 배지"로서 지칭될 수 있다. 추출제는 헥산산이 원래 제조된 수성 배지로부터 본 발명의 임의의 방법에 따라 제조된 헥산산을 추출/단리하는데 사용될 수 있다. 추출 단계가 끝났을 때, 수성 배지로부터의 과량의 물이 제거될 수 있어, 추출된 헥산산을 함유하는 추출제를 초래한다. 특히, 추출 단계가 끝났을 때, 헥산산이 추출되고 제거되면, 남은 것은 헥산산을 제조하기 위해 사용된 세포를 포함하는 발효 배지일 수 있고, 이어서 이들 세포는 발효 배지와 함께 단계(a)를 위해 재활용될 수 있다. 당업자는 제1 사이클 후에 발효 배지 및/또는 세포의 보충이 필요할 것인지를 결정할 수 있을 것이다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 제1 사이클은 단계(a) 내지 (c)의 1 라운드를 포함한다. 이어서 배지 및/또는 세포는 제2 사이클로부터 계속 재활용될 수 있다. 추출제는 수성 배지로부터 헥산산을 추출하는 효율적인 수단을 초래할 수 있는 화합물의 조합을 포함할 수 있다. 특히, 추출제는
- 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 12개 이상의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는
- 적어도 하나의 트리알킬아민 및 12개 이상의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸
을 포함할 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 헥산산을 추출제로 효율적으로 추출할 수 있다. 알킬-포스핀 옥시드 또는 트리알킬아민 및 적어도 하나의 알칸의 혼합물인 이러한 추출제는 혼합물이 발효 배지의 존재 하에 원하는 헥산산을 추출하는데 효율적으로 작동하기 때문에 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법에 적합한 것으로 간주될 수 있다. 특히, 알킬-포스핀 옥시드 또는 트리알킬아민 및 적어도 하나의 알칸의 혼합물은 헥산산의 추출을 위해 관련 기술분야에 현재 공지된 임의의 방법보다 더 잘 작용하는 것으로 간주될 수 있는데, 이는 임의의 특수한 장비를 수행할 필요가 없고 높은 생성물 수율로 수행하는 것이 비교적 용이하기 때문이다. 추가로, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 또한 단계(a)에 따른 미생물에 독성이 아니다.
추출제 내의 알칸은 적어도 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 알칸은 12-18개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 한 예에서, 알칸은 도데칸, 트리데칸, 테트라데칸, 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸 및 옥타데칸으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 예에서, 추출제는 알칸의 혼합물을 포함할 수 있다.
알킬-포스핀 옥시드는 OPX3의 일반식을 가지며, 여기서 X는 알킬이다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 적합한 알킬 포스핀 옥시드는 선형, 분지형 또는 시클릭 탄화수소로 구성된 알킬 기를 포함하며, 상기 탄화수소는 1 내지 약 100개의 탄소 원자 및 1 내지 약 200개의 수소 원자로 구성된다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 알킬 포스핀 옥시드와 관련하여 사용된 "알킬"은 1 내지 20개의 탄소 원자, 빈번하게는 4 내지 15개의 탄소 원자, 또는 6 내지 12개의 탄소 원자를 갖고 직쇄, 시클릭, 분지쇄, 또는 이들의 혼합물로 구성될 수 있는 탄화수소 기를 지칭할 수 있다. 알킬 포스핀 옥시드는 각각의 인 원자 상에 1 내지 3개의 알킬 기를 가질 수 있다. 한 예에서, 알킬 포스핀 옥시드는 P 상에 3개의 알킬 기를 갖는다. 일부 예에서, 알킬 기는 C4-C15 또는 C6-C12 알킬 기의 1개의 탄소 대신에 산소 원자를 포함할 수 있으며, 단 산소 원자는 알킬 포스핀 옥시드의 P에 부착되지 않는다. 전형적으로, 알킬 포스핀 옥시드는 트리-옥틸포스핀 옥시드, 트리-부틸포스핀 옥시드, 헥실-포스핀 옥시드, 옥틸포스핀 옥시드 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 더욱 더 특히, 알킬 포스핀 옥시드는 트리-옥틸포스핀 옥시드(TOPO)일 수 있다.
트리알킬아민은 암모니아(NH3)로부터 유래된 유기-화학 화합물이며, 그의 3개의 수소 원자가 알킬 라디칼에 의해 대체된다. 트리알킬아민의 예는 디메틸에틸아민, 메틸디에틸아민, 트리에틸아민, 디메틸-n-프로필아민, 디메틸-i-프로필아민, 메틸디-n-프로필아민, 디메틸부틸아민, 트리옥틸아민 등이다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제에 사용되는 트리알킬아민은 물에 가용성이 아닐 수 있고 트리옥틸아민일 수 있다.
한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 알킬-포스핀 옥시드 또는 트리알킬아민 및 적어도 하나의 알칸의 조합일 수 있다. 특히, 알칸은 적어도 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 보다 특히, 알칸은 12 내지 18개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 한 예에서, 알칸은 도데칸, 트리데칸, 테트라데칸, 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸 및 옥타데칸으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 추가의 예에서, 추출제는 알칸의 혼합물을 포함할 수 있다. 더욱 더 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 TOPO 및 테트라데칸 또는 헥사데칸의 조합일 수 있다.
트리옥틸포스핀 옥시드(TOPO)는 화학식 OP(C8H17)3을 갖는 유기인 화합물이다. TOPO는 본 발명의 임의의 측면에 따른 적어도 하나의 알칸과 함께 추출제의 일부일 수 있다. 특히, TOPO 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸의 혼합물은 알칸에 대한 TOPO의 약 1:100 내지 1:10 중량비를 포함할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제에서 TOPO 대 알칸의 중량비는 약 1:100, 1:90, 1:80, 1:70, 1:60, 1:50, 1:40, 1:30, 1:25, 1:20, 1:15, 또는 1:10일 수 있다. 더욱 더 특히, TOPO 대 알칸의 중량비는 1:90 내지 1:10, 1:80 내지 1:10, 1:70 내지 1:10, 1:60 내지 1:10, 1:50 내지 1:10, 1:40 내지 1:10, 1:30 내지 1:10 또는 1:20 내지 1:10의 범위 내에서 선택될 수 있다. TOPO 대 알칸의 중량비는 1:40 내지 1:15 또는 1:25 내지 1:15일 수 있다. 한 예에서, TOPO 대 알칸의 중량비는 약 1:15일 수 있다. 실시예에서, 알칸은 헥사데칸일 수 있고, 따라서 TOPO 대 헥사데칸의 중량비는 약 1:15일 수 있다.
또 다른 예에서, 추출제가 알킬-포스핀 옥시드 또는 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸에서 TOPO의 용해도에 비해 추출제에 사용되는 알칸에서 더 가용성인 트리알킬아민을 포함하는 경우, 알킬-포스핀 옥시드(TOPO 이외의 것) 또는 트리알킬아민 대 알칸의 중량비는 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1일 수 있다. 한 예에서, 추출제는 트리헥시-포스핀 옥시드일 수 있고, 트리헥시-포스핀 옥시드 대 알칸의 비는 1:1일 수 있다. 다른 예에서, 추출제는 저급 사슬 알킬-포스핀 옥시드일 수 있고, 저급 사슬 알킬-포스핀 옥시드 대 알칸의 비는 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1일 수 있다. 이 경우에, 저급 사슬 알킬-포스핀 옥시드는 C1-C4 알킬 기를 갖는 포스핀 옥시드를 지칭한다. 또 다른 예에서, 추출제는 트리알킬아민일 수 있으며, 이는 알칸에서 포스핀 옥시드보다 더 가용성인 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 트리알킬아민은 알칸과 1:1 이하의 비로 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제에 존재할 수 있는 트리옥틸아민(TOA)일 수 있다. 더 낮은 사슬 길이의 아민은 훨씬 더 높은 비로 사용될 수 있다. 다른 예에서, 추출제는 저급 사슬 트리알킬아민일 수 있고, 저급 사슬 트리알킬아민 대 알칸의 비는 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1 또는 10:1일 수 있다. 이 경우에, 저급 사슬 알킬-포스핀 옥시드는 C1-C4 알킬 기를 갖는 포스핀 옥시드를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 '약'은 20 퍼센트 내의 변화를 지칭한다. 특히, 본원에 사용된 용어 "약"은 주어진 측정치 또는 값의 +/-20 %, 보다 특히 +/-10 %, 보다 더 특히 +/-5 %를 지칭한다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(a)에서, 에탄올 및/또는 아세테이트를 탄소 사슬 신장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 제조한다. 한 예에서, 탄소 공급원은 아세테이트 및 부티레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 탄소 공급원과 조합된 에탄올일 수 있다. 특히, 탄소 공급원은 에탄올 및 아세테이트일 수 있다. 또 다른 예에서, 탄소 공급원은 에탄올과 부티르산의 조합물일 수 있다. 한 예에서, 탄소 기질은 에탄올 단독일 수 있다. 또 다른 예에서, 탄소 기질은 아세테이트 단독일 수 있다.
아세테이트 및/또는 에탄올의 공급원은 이용가능성에 따라 달라질 수 있다. 한 예에서, 에탄올 및/또는 아세테이트는 합성 가스의 발효 생성물 또는 당업계에 공지된 임의의 탄수화물일 수 있다. 특히, 아세테이트 및/또는 에탄올 제조를 위한 탄소 공급원은 알콜, 알데히드, 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 덱스트로스, 락토스, 크실로스, 펜토스, 폴리올, 헥소스, 에탄올 및 합성 가스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
공급원의 혼합물은 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다.
훨씬 더 특히, 탄소 공급원은 합성 가스일 수 있다. 합성 가스는 적어도 하나의 아세트산생성 박테리아의 존재하에 에탄올 및/또는 아세테이트로 전환될 수 있다.
이산화탄소 및/또는 일산화탄소를 포함하는 기질의 공급원과 관련하여, 당업자는 탄소 공급원으로서의 CO 및/또는 CO2의 제공을 위한 다수의 가능한 공급원이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 실제로, CO 및/또는 CO2의 공급원으로부터 아세테이트 및/또는 에탄올이 형성될 수 있도록, 충분한 양의 탄소를 미생물에 공급할 수 있는 임의의 가스 또는 임의의 가스 혼합물이 본 발명의 탄소 공급원으로서 사용될 수 있는 것으로 볼 수 있다.
일반적으로 본 발명의 아세트산생성 세포에 대해, 탄소 공급원은 50 중량% 이상, 70 중량% 이상, 특히 90 중량% 이상의 CO2 및/또는 CO를 포함하고, 여기서 중량 백분율 - %는 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포에 이용가능한 모든 탄소 공급원에 대한 것이다. 탄소 물질 공급원이 제공될 수 있다.
가스 형태의 탄소 공급원의 예는 효모 발효 또는 클로스트리디움 발효에 의해 제조된 배기 가스, 예컨대 합성 가스, 연도 가스 및 석유 정유 가스를 포함한다. 이들 배기 가스는 셀룰로스-함유 물질의 가스화 또는 석탄 가스화로부터 형성된다. 한 예에서, 이러한 배기 가스는 필수적으로 다른 공정의 부산물로서 제조되지 않을 수 있고, 본 발명의 혼합 배양물과 함께 사용하기 위해 특정하게 제조될 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(a)에서 사용되는 아세테이트 및/또는 에탄올의 제조를 위한 탄소 공급원은 합성 가스일 수 있다. 합성 가스는, 예를 들어 석탄 가스화의 부산물로서 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 폐기물인 물질을 유용한 자원으로 전환시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 합성 가스는 치환 및 비치환 유기 화합물을 제조하기 위해 본 발명의 혼합 배양물과 함께 사용하기 위한 널리 이용가능한 저비용 농업 원료의 가스화의 부산물일 수 있다.
거의 모든 형태의 식물이 이 목적에 사용될 수 있기 때문에, 합성 가스로 전환될 수 있는 원료의 수많은 예들이 존재한다. 특히, 원료는 다년생 목초, 예컨대 억새, 옥수수 잔류물, 처리 폐기물, 예컨대 톱밥 등으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일반적으로, 합성 가스는 주로 열분해, 부분 산화 및 증기 개질을 통해 건조된 바이오매스의 가스화 장치에서 수득될 수 있으며, 여기서 합성 가스의 주요 산물은 CO, H2 및 CO2이다. 합성가스는 또한 CO2의 전기분해의 산물일 수 있다. 당업자는 원하는 양의 CO를 포함하는 합성가스를 제조하기 위해 CO2의 전기분해를 수행하는 적합한 조건을 이해할 것이다.
통상적으로, 가스화 과정으로부터 수득된 합성 가스의 일부는 산물 수율을 최적화하고 타르의 형성을 피하기 위해 먼저 처리된다. 합성 가스 중 원치않는 타르 및 CO의 크래킹은 석회 및/또는 돌로마이트를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 방법의 전체 효율, 에탄올 및/또는 아세테이트 생산성 및/또는 전체 탄소 포획은 연속 가스 유동에서의 CO2, CO 및 H2의 화학량론에 따라 달라질 수 있다. 적용된 연속 가스 유동은 조성 CO2 및 H2일 수 있다. 특히, 연속 가스 유동에서, CO2의 농도 범위는 약 10-50 중량%, 특히 3 중량%일 수 있고, H2는 44 중량% 내지 84 중량%, 특히 64 내지 66.04 중량% 이내일 것이다. 또 다른 예에서, 연속 가스 유동은 또한 N2와 같은 불활성 가스를 50 중량%의 N2 농도까지 포함할 수 있다.
보다 특히, CO 및/또는 CO2를 포함하는 탄소 공급원은 연속 가스 유동에서 아세트산생성 세포와 접촉한다. 보다 더 특히, 연속 가스 유동은 합성 가스를 포함한다. 이들 가스는 예를 들어 수성 배지 내로 개방된 노즐, 프릿, 가스를 수성 배지 내로 공급하는 파이프 내의 막 등을 사용하여 공급될 수 있다.
당업자는 스트림의 조성 및 유속을 적절한 간격으로 모니터링하는 것이 필요할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 스트림의 조성의 제어는 목표하는 또는 원하는 조성을 달성하기 위해 스트림 구성성분의 비율을 변화시켜 달성될 수 있다. 블렌딩된 스트림의 조성 및 유속은 관련 기술분야에 공지된 임의의 수단에 의해 모니터링될 수 있다. 한 예에서, 시스템은 2개 이상의 스트림의 유속 및 조성을 연속적으로 모니터링하고 이들을 조합하여 최적의 조성의 연속 가스 유동으로 단일 블렌딩된 기질 스트림, 및 최적화된 기질 스트림을 발효기로 통과시키기 위한 수단을 생성하도록 적합화된다.
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 환원제, 예를 들어 수소가 탄소 공급원과 함께 공급될 수 있다. 특히, 이 수소는 CO 및/또는 CO2가 공급 및/또는 사용될 때 공급될 수 있다. 한 예에서, 수소 가스는 본 발명의 임의의 측면에 따라 존재하는 합성 가스의 일부이다. 또 다른 예에서, 합성 가스 중 수소 가스가 본 발명의 방법에 불충분한 경우에, 추가의 수소 가스가 공급될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "아세트산생성 박테리아"는 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로를 수행할 수 있고, 따라서 CO, CO2 및/또는 수소를 아세테이트로 전환시킬 수 있는 미생물을 지칭한다. 이들 미생물은, 야생형 형태에서는 우드-륭달 경로를 갖지 않지만 유전자 변형의 결과 이 형질을 획득하는 미생물을 포함한다. 이러한 미생물은 이. 콜라이(E. coli) 세포를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 이들 미생물은 또한 일산화탄소영양 박테리아로 공지되어 있을 수 있다. 현재, 21개의 상이한 아세트산생성 박테리아 속이 관련 기술분야에 공지되어 있고(문헌 [Drake et al., 2006]), 이들은 또한 일부 클로스트리디아(clostridia)를 포함할 수 있다(문헌 [Drake & Kusel, 2005]). 이들 박테리아는 탄소 공급원으로서의 이산화탄소 또는 일산화탄소를 에너지원으로서의 수소와 함께 사용할 수 있다(문헌 [Wood, 1991]). 추가로, 알콜, 알데히드, 카르복실산 뿐만 아니라 다수의 헥소스가 또한 탄소 공급원으로서 사용될 수 있다(문헌 [Drake et al., 2004]). 아세테이트의 형성으로 이어지는 환원성 경로는 아세틸-CoA 또는 우드-륭달 경로로 지칭된다. 특히, 아세트산생성 박테리아는 아세토아나에로비움 노테라(Acetoanaerobium notera) (ATCC 35199), 아세토네마 롱굼(Acetonema longum) (DSM 6540), 아세토박테리움 카르비놀리쿰(Acetobacterium carbinolicum) (DSM 2925), 아세토박테리움 말리쿰(Acetobacterium malicum) (DSM 4132), 아세토박테리움 종 446(Acetobacterium species no. 446) (문헌 [Morinaga et al., 1990, J. Biotechnol., Vol. 14, p. 187-194]), 아세토박테리움 위에링가에(Acetobacterium wieringae) (DSM 1911), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii) (DSM 1030), 알칼리바쿨룸 바치(Alkalibaculum bacchi) (DSM 22112), 아르카에오글로부스 풀기두스(Archaeoglobus fulgidus) (DSM 4304), 블라우티아 프로둑타(Blautia producta) (DSM 2950, 이전에 루미노코쿠스 프로둑투스(Ruminococcus productus), 이전에 펩토스트렙토코쿠스 프로둑투스(Peptostreptococcus productus), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum) (DSM 3468), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum) (DSM 1496), 클로스트리디움 오토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum) (DSM 10061, DSM 19630 및 DSM 23693), 클로스트리디움 카르복시디보란스(Clostridium carboxydivorans) (DSM 15243), 클로스트리디움 코스카티이(Clostridium coskatii) (ATCC 번호 PTA-10522), 클로스트리디움 드라케이(Clostridium drakei) (ATCC BA-623), 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum) (DSM 92), 클로스트리디움 글리콜리쿰(Clostridium glycolicum) (DSM 1288), 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii) (DSM 13528), 클로스트리디움 륭달리이 C-01(Clostridium ljungdahlii C-01) (ATCC 55988), 클로스트리디움 륭달리이 ERI-2(Clostridium ljungdahlii ERI-2) (ATCC 55380), 클로스트리디움 륭달리이 O-52(Clostridium ljungdahlii O-52) (ATCC 55989), 클로스트리디움 마이옴베이(Clostridium mayombei) (DSM 6539), 클로스트리디움 메톡시벤조보란스(Clostridium methoxybenzovorans) (DSM 12182), 클로스트리디움 라그스달레이(Clostridium ragsdalei) (DSM 15248), 클로스트리디움 스카톨로게네스(Clostridium scatologenes) (DSM 757), 클로스트리디움 종 ATCC 29797(Clostridium species ATCC 29797) (문헌 [Schmidt et al., 1986, Chem. Eng. Commun., Vol. 45, p. 61-73]), 데술포토마쿨룸 쿠즈네트소비이(Desulfotomaculum kuznetsovii) (DSM 6115), 데술포토마쿨룸 써모베조이쿰 아종. 써모신트로피쿰(Desulfotomaculum thermobezoicum subsp. Thermosyntrophicum) (DSM 14055), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum) (DSM 20543), 메타노사르시나 아세티보란스 C2A(Methanosarcina acetivorans C2A) (DSM 2834), 무렐라 종 Huc22-1(Moorella sp. HUC22-1) (문헌 [Sakai et al., 2004, Biotechnol. let., Vol. 29, p. 1607-1612]), 무렐라 써모아세티카(Moorella thermoacetica) (DSM 521, 이전에 클로스트리디움 써모아세티쿰(Clostridium thermoaceticum)), 무렐라 써모오토트로피카(Moorella thermoautotrophica) (DSM 1974), 옥소박터 프페니니기이(Oxobacter pfennigii) (DSM 322), 스포로무사 에리보란스(Sporomusa aerivorans) (DSM 13326), 스포로무사 오바타(Sporomusa ovata) (DSM 2662), 스포로무사 실바세티카(Sporomusa silvacetica) (DSM 10669), 스포로무사 스파에로이데스(Sporomusa sphaeroides) (DSM 2875), 스포로무사 테르미티다(Sporomusa termitda) (DSM 4440) 및 써모아나에로박터 키부이(Thermoanaerobacter kivui) (DSM 2030, 이전에 아세토게니움 키부이(Acetogenium kivui))로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
보다 특히, 클로스트리디움 카르복시디보란스의 균주 ATCC BAA-624가 사용될 수 있다. 더욱 더 특히, 예를 들어 미국 공개 2007/0275447 및 미국 공개 2008/0057554에 기재된 바와 같은 클로스트리디움 카르복시디보란스의 "P7" 및 "P11"로 표지된 박테리아 균주가 사용될 수 있다.
또 다른 특히 적합한 박테리아는 클로스트리디움 륭달리이일 수 있다. 특히, 클로스트리디움 륭달리이 PETC, 클로스트리디움 륭달리이 ERI2, 클로스트리디움 륭달리이 COL 및 클로스트리디움 륭달리이 O-52로 이루어진 군으로부터 선택된 균주는 합성 가스의 헥산산으로의 전환에 사용될 수 있다. 이들 균주는, 예를 들어 WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 및 ATCC 55989에 기재되어 있다.
한 예에서, 헥산산의 제조는 합성 가스로부터의 아세테이트 및/또는 에탄올로부터의 것이고, 탄소 사슬 신장이 가능한 미생물과 함께 아세트산생성 박테리아의 사용을 수반할 수 있다. 예를 들어, 클로스트리디움 융달리이가 클로스트리디움 클루이베리와 동시에 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 단일 아세트산생성 세포는 두 유기체의 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 아세트산생성 박테리아는 우드-융달 경로 및 탄소 사슬 신장 경로 둘 다를 수행할 수 있는 씨. 카르복시디보란스일 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(a)에서 사용되는 에탄올 및/또는 아세테이트는 합성 가스의 발효 생성물일 수 있거나 또는 다른 수단을 통해 수득될 수 있다. 이어서, 에탄올 및/또는 아세테이트를 단계(a)에서 미생물과 접촉시킬 수 있다.
본원에 사용된 용어 "접촉시키는"은 미생물과 에탄올 및/또는 아세테이트 사이의 직접 접촉을 일으키는 것을 의미한다. 한 예에서, 에탄올은 탄소 공급원이고, 단계(a)에서의 접촉은 에탄올을 단계(a)의 미생물과 접촉시키는 것을 포함한다. 접촉은 직접 접촉 또는 세포를 에탄올로부터 분리하는 막 등을 포함할 수 있는 간접 접촉일 수 있거나, 또는 여기서 세포 및 에탄올은 2개의 상이한 구획 등에서 유지될 수 있다. 예를 들어, 단계(b)에서 헥산산 및 추출 배지는 상이한 구획 내에 있을 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 헥산산을 제조할 수 있는 미생물은 박테리아를 배양하기 위해 당업계에 일반적으로 공지된 임의의 배양 배지, 기질, 조건, 및 공정과 함께 배양될 수 있다. 이는 생명공학 방법을 사용하여 헥산산이 제조될 수 있게 한다. 헥산산 제조에 사용되는 미생물에 따라, 적절한 성장 배지, pH, 온도, 교반 속도, 접종물 수준, 및/또는 호기성, 미세호기성 또는 혐기성 조건은 다양하다. 당업자는 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법을 수행하는데 필요한 다른 조건을 이해할 것이다. 특히, 용기(예를 들어 발효기) 내의 조건은 사용된 미생물에 따라 달라질 수 있다. 미생물의 최적 기능에 적합하도록 조건을 변화시키는 것은 당업자의 지식 내에 있다.
한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법, 특히 단계(a)는 5 내지 8, 5.5 내지 8 또는 5.5 내지 7의 pH를 갖는 수성 배지에서 수행될 수 있다. 압력은 1 내지 10 bar일 수 있다. 미생물을 약 20 ℃ 내지 약 80 ℃ 범위의 온도에서 배양할 수 있다. 한 예에서, 미생물을 37 ℃에서 배양할 수 있다.
일부 예에서, 미생물의 성장 및 헥산산의 제조를 위해, 수성 배지는 미생물을 성장시키거나 헥산산의 제조를 촉진하는데 적합한 임의의 영양소, 성분 및/또는 보충제를 포함할 수 있다. 특히, 수성 배지는 하기 중 적어도 하나를 포함할 수 있다: 탄소 공급원, 질소 공급원, 예컨대 암모늄 염, 효모 추출물, 또는 펩톤; 미네랄; 염; 보조인자; 완충제; 비타민; 및 박테리아의 성장을 촉진할 수 있는 임의의 다른 성분 및/또는 추출물. 사용될 배양 배지는 특정 균주의 요건에 적절해야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지의 기재는 "Manual of Methods for General Bacteriology"에 제공되어 있다.
용어 "수용액" 또는 "배지"는 물, 주로 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포를 적어도 일시적으로 대사 활성 및/또는 생존 상태로 유지하는 데 사용될 수 있는 용매로서의 물을 포함하는 임의의 용액을 포함하고, 필요한 경우, 임의의 추가의 기질을 포함한다. 당업자는 통상적으로 세포를 유지 및/또는 배양하는데 사용될 수 있는 배지, 예를 들어 이. 콜라이의 경우 LB 배지로서 지칭되는 다수의 수용액의 제조에 친숙하고, 씨. 융달리이의 경우 ATCC1754-배지가 사용될 수 있다. 생성물의 원치않는 부산물에 의한 불필요한 오염을 막기 위해, 복합 배지와 대조적으로 최소 배지, 즉, 세포를 대사적 활성 및/또는 생존 상태로 유지시키는데 필수적인 염 및 영양소로 이루어진 최소 세트만을 포함하는 합리적으로 단순한 조성의 배지를 수용액으로서 사용하는 것이 유리하다. 예를 들어, M9 배지가 최소 배지로서 사용될 수 있다. 세포는 원하는 생성물을 제조하기에 충분히 오래 탄소 공급원과 함께 인큐베이션된다. 예를 들어 적어도 1, 2, 4, 5, 10 또는 20시간 동안. 선택된 온도는 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포가 촉매 감음성 및/또는 대사 활성으로 유지되도록, 예를 들어 세포가 씨. 융달리이 세포인 경우에 10 내지 42 ℃, 바람직하게는 30 내지 40 ℃, 특히 32 내지 38 ℃이어야 한다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 수성 배지는 또한 헥산산이 제조되는 배지를 포함한다. 이는 주로 용액이 실질적으로 물을 포함하는 배지를 지칭한다. 한 예에서, 세포가 헥산산을 제조하는데 사용되는 수성 배지는 헥산산의 추출을 위해 추출제와 접촉하는 바로 그 배지이다.
본 발명의 임의의 측면에 따르면, 추출은 단계(b)에서 수행되는 반면, 발효는 단계(a)에서 동시에 수행되는 것이 바람직하다. 이는 단계(b)에서의 헥산산 및/또는 그의 에스테르의 계내 추출을 도시한다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(b)에서, 수성 배지에서 헥산산은 헥산산을 수성 배지로부터 추출제로 추출하기에 충분한 시간 동안 추출제와 접촉시킬 수 있다. 당업자는 분포 평형에 도달하는데 필요한 시간의 양 및 추출 공정을 최적화하는데 필요할 수 있는 적절한 기포 응집을 결정할 수 있다. 일부 예에서, 필요한 시간은 추출될 수 있는 헥산산의 양에 의존할 수 있다. 특히, 헥산산을 수성 배지로부터 추출제 내로 추출하는데 필요한 시간은 단지 수 분이 걸릴 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 단계(a)에서 발효가 일어나면서 추출이 단계(b)에서 수행되는 경우, 추출 시간은 발효 시간과 등가일 수 있다.
사용되는 추출제 대 추출되는 헥산산의 양의 비는 추출이 얼마나 빠르게 수행되는지에 따라 달라질 수 있다. 한 예에서, 추출제의 양은 헥산산을 포함하는 수성 배지의 양과 동등하다. 추출제를 수성 배지와 접촉시키는 단계 후에, 2개의 상(수성 및 유기)은 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 분리된다. 한 예에서, 분리 깔때기를 사용하여 2개의 상을 분리할 수 있다. 2개의 상은 또한 혼합기-침강기, 펄스 칼럼 등을 사용하여 분리될 수 있다. 한 예에서, 헥산산으로부터의 추출 배지의 분리는 헥산산이 추출제보다 유의하게 더 낮은 비점에서 증류된다는 사실을 고려하여 증류를 사용하여 수행될 수 있다. 당업자는 헥산산의 특징에 따라 단계(b)에서 원하는 헥산산으로부터 추출제를 분리하는 최선의 방법을 선택할 수 있다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(c)는 단계(b)로부터의 헥산산의 회수를 수반한다. 유기 추출제와 접촉되는 헥산산은 2개의 상의 형성을 초래하고, 2개의 상(수성 및 유기)은 당업계에 공지된 임의의 수단을 사용하여 분리된다. 한 예에서, 분리 깔때기를 사용하여 2개의 상을 분리할 수 있다. 2개의 상은 또한 혼합기-침강기, 펄스 칼럼, 열 분리 등을 사용하여 분리될 수 있다. 한 예에서, 알칸산이 헥산산인 경우, 헥산산으로부터의 추출 배지의 분리는 헥산산이 추출 배지보다 유의하게 더 낮은 비점에서 증류된다는 사실을 고려하여 증류를 사용하여 수행될 수 있다.
단계(b)는 재활용 또는 재사용하기 위해 다시 이용가능하게 된 유기 흡수제로 종료된다.
따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 헥산산의 추출 방법은 헥산산을 제조하는 임의의 생명공학 방법과 함께 사용될 수 있다. 이는 통상적으로 생물학적 방법을 사용하여 헥산산을 제조하는 발효 공정 동안, 헥산산이 수성 배지 내에 수집되도록 방치될 것이고, 발효 배지에서 특정 농도에 도달한 후, 바로 표적 생성물(헥산산)이 미생물의 활성 및 제조성을 억제할 수 있기 때문에 특히 유리하다. 따라서, 이는 발효 공정의 전체 수율을 제한한다. 이러한 추출 방법을 사용하여, 헥산산이 생성되면서 추출되고, 따라서 최종-생성물 억제가 극적으로 감소된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 또한 헥산산의 회수를 위한 증류 및/또는 침전에 대한 1차 의존이 없기 때문에, 특히 그것이 제조되는 발효 방법으로부터 헥산산을 제거하는 전통적인 방법보다 더 효율적이고 비용-효과적이다. 증류 또는 침전 공정은 더 높은 제조 비용, 더 낮은 수율, 및 더 높은 폐기물로 이어져 공정의 전체 효율을 감소시킬 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 이러한 단점을 극복하려고 시도한다.
특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물 및 탄소 공급원의 혼합물은 본 발명의 임의의 측면을 수행하기 위해 임의의 공지된 생물반응기 또는 발효기에서 사용될 수 있다. 한 예에서, 아세테이트 및/또는 에탄올로부터의 헥산산의 생명공학적 제조로 시작하고 헥산산의 추출로 끝나는 본 발명의 임의의 측면에 따른 완전한 방법이 단일 용기에서 일어난다. 따라서, 헥산산을 제조하는 단계와 헥산산을 추출하는 단계 사이에 분리 단계가 없을 수 있다. 이는 시간 및 비용을 절감시킨다. 특히, 발효 공정 동안, 미생물을 수성 배지에서 추출제의 존재 하에 성장시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 헥산산을 제조하는 원 포트 수단을 제공한다. 또한, 헥산산이 제조될 때 추출되기 때문에, 최종-생성물 억제가 일어나지 않아, 헥산산의 수율이 유지되도록 보장한다. 추가의 분리 단계를 수행하여 헥산산을 제거할 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 분리 방법, 예컨대 깔때기, 컬럼, 증류 등을 사용할 수 있다. 이어서, 남아있는 추출제 및/또는 세포를 재활용시킬 수 있다.
또 다른 예에서, 헥산산 추출 과정은 별개의 단계로서 및/또는 또 다른 포트에서 일어날 수 있다. 발효가 이루어진 후, 추출될 원하는 헥산산이 이미 생성된 경우, 본 발명의 임의의 측면에 따른 추출제는 발효 배지에 첨가될 수 있거나 발효 배지는 추출제를 포함하는 포트에 첨가될 수 있다. 이어서, 깔때기, 컬럼, 증류 등을 사용하는 것과 같은 당업계에 공지된 임의의 분리 방법에 의해 원하는 헥산산을 추출할 수 있다. 이어서 남아있는 추출제는 재활용될 수 있다. 세포를 갖는 발효 배지는 또한 재활용될 수 있다.
방법의 또 다른 이점은 추출제가 재활용될 수 있다는 것이다. 따라서, 일단 헥산산이 추출제로부터 분리되면, 추출제는 재활용되고 재사용되어 폐기물을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 방법의 단계(c)는 (c) (b)로부터의 추출된 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 헥산산의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로의 화학적 케톤화를 위한 적합한 반응 조건 하에 적어도 하나의 케톤화 촉매 및 궁극적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산과 접촉시키는 것을 포함한다.
용어 "1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산"은 헥산산을 포함하지 않는다. 바람직하게는 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산은 4 내지 18개, 바람직하게는 5 내지 12개의 탄소 원자를 포함하는 직쇄 알칸산으로부터 선택된다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 케톤화 촉매는 임의의 금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물일 수 있다. 케톤화는 헥산산을 추가의 알칸산 및/또는 헥산산과 반응시키고, 바람직하게는 2개의 헥산산 분자를 1개의 케톤 분자로 이량체화하여 1개의 물 및 1개의 이산화탄소를 제거한다. 헥산산 무수물((CH3(CH2)4)COOCO(CH2)4CH3)이 형성될 수 있는 헥산산의 케톤화에 수반될 수 있는 메카니즘은 적어도 문헌 [Woo, Y., Ind. Eng. Chem. Res. 2017, 56: 872-880.]에 개시되어 있다. 다양한 금속 산화물 촉매의 존재 하에서의 헥산산의 케톤화는 또한 문헌 [Wang, S. J. Phys. Chem. C 2017, 121, 18030-18046]에 나타나있다.
본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 케톤화 촉매는 단계(a)에 따라 생물학적으로 제조된 헥산산으로부터 더 높은 에너지 밀도의 케톤, 바람직하게는 C11의 효율적인 제조를 위한 불균질 촉매일 수 있다. 특히, 케톤화 촉매는 헤테로폴리산(H3PW12O40) 촉매, 니오븀 산화물(Nb2O5) 촉매, 티타늄 산화물(TiO2) 촉매, 세륨 산화물(CeO2) 촉매, 아연-크로뮴(Zn-Cr) 혼합 산화물 촉매, 망가니즈 산화물 (MnOx) 촉매, 란타넘 산화물(La2O3) 촉매, 마그네슘 산화물(MgO) 촉매, 철 산화물(FeO, FeO2, Fe2O3, Fe3O4, Fe4O5, Fe5O6, Fe5O7), 규소-알루미늄(SiyAlzO) 혼합 산화물 촉매, 알루미늄 산화물(Al2O3) 촉매 및 지르코니아(ZrO2) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택된 임의의 금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물일 수 있다. MnOx에서 "x"는 1, 2 또는 4일 수 있다. SiyAlzO에서 "y" 및 "z"는 비 z/y가 0 내지 1의 임의의 수인 임의의 수를 지칭할 수 있다. 한 예에서, 케톤화는 문헌 [Pham T. N., ACS Catal. 2013, 3: 2456-2473]에 개시된 바와 같이 적합한 불균질 수소화 금속 촉매 및 적합한 반응 조건을 사용하여 헥산산에서 수행된다. 개시된 바와 같은 조건은 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 유효 수율을 위해 사용되는 촉매에 따라 달라질 수 있다. 또 다른 예에서, MnO2 및/또는 Al2O3 촉매는 헥산산을 6-운데카논으로 케톤화하기 위해 문헌 [Glinski, M. et al, Polish J. Chem. 2004, 78: 299-302]에 개시된 것을 기초로 하여 사용될 수 있다. 추가의 예에서, Nb2O5 촉매는 6-운데카논으로의 헥산산의 케톤화에서 US 6,265,618 B1에, 특히 실시예 3에 개시된 바와 같이 사용될 수 있다. 당업자는 간단한 시행착오로, 최신 기술에 기초하여 헥산산 및 궁극적으로 또 다른 알칸산으로부터 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 생성하기 위한 적합한 촉매 및 적절한 조건을 확인할 수 있을 것이다. 문헌 [Orozco, L.M et al ChemSusChem, 2016, 9(17): 2430-2442] 및 문헌 [Orozco, L.M et al Green Chemistry, 2017, 19(6): 1555-1569]에는 또한 본 발명의 임의의 측면에 따른 케톤화 촉매로서 사용될 수 있는 다른 촉매가 개시되어 있다.
단계(c)에서 상이한 케톤화 촉매의 사용에 적합한 조건을 결정하는 것은 당업자의 지식 내에 있을 것이다. 특히, 케톤화 촉매는 지르코니아 에어로겔 촉매일 수 있고, 문헌 [Woo, Y., Ind. Eng. Chem. Res. 2017, 56: 872-880]에 개시된 바와 같이 헥산산의 케톤화에 사용될 수 있다. 지르코니아 에어로겔 촉매는 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 효율적으로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 또한 촉매의 침출을 피한다. 문헌 [Lee, Y. et al in Applied Catalysis A: General. 2015, 506: 288-293]은 상이한 케톤화 촉매 및 헥산산의 케톤화에서의 그의 유효성을 개시한다. 당업자는 문헌 [Lee Y., et al.]에 기재된 방법을 매우 용이하게 사용하여 헥산산의 케톤화에 사용하기에 적합한 케톤화 촉매 및/또는 조건을 결정할 수 있다. 특히, 단계(c)의 적합한 반응 조건은 100 ℃ - 500 ℃, 100 ℃ - 450 ℃, 100 ℃ - 400 ℃, 100 ℃ - 350 ℃, 100 ℃ - 300 ℃, 100 ℃ - 250 ℃, 100 ℃ - 200 ℃, 150 ℃ - 500 ℃, 150 ℃ - 450 ℃, 150 ℃ - 400 ℃, 150 ℃ - 350 ℃, 150 ℃ - 300 ℃, 150 ℃ - 250 ℃, 150 ℃ - 200 ℃, 200 ℃ - 500 ℃, 200 ℃ - 450 ℃, 200 ℃ - 400 ℃, 200 ℃ - 350 ℃, 200 ℃ - 300 ℃, 200 ℃ - 250 ℃, 250 ℃ - 500 ℃, 250 ℃ - 450 ℃, 250 ℃ - 400 ℃, 250 ℃ - 350 ℃, 250 ℃ - 300 ℃ 등의 반응 온도를 포함한다. 보다 특히, 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논은 150 ℃ - 250 ℃의 반응 온도에서 케톤화 촉매로서 지르코니아 에어로겔 촉매를 사용하여 헥산산으로부터 제조될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (d) 본 발명의 임의의 측면에 따라 제조된 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올로의 촉매적 수소화를 위한 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 제조하는 방법이 제공된다. 2급 알콜인 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올(C11H24O)은 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 촉매적 수소화의 결과이고, 수소 분자를 탄소-산소 이중 결합에 걸쳐 첨가하여 궁극적으로 최종 생성물로서 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 제공한다.
특히 본 발명의 이러한 측면은 (a) 에탄올 및/또는 아세테이트를 탄소 사슬 신장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 제조하는 단계; (b) (a)로부터, 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸을 포함하는 적어도 하나의 추출제를 수성 배지에서 사용하여 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 추출하는 단계; (c) (b)로부터의 추출된 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 헥산산 및 궁극적으로 추가의 알칸산의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로의 화학적 케톤화를 위한 적합한 반응 조건 하에 적어도 하나의 케톤화 촉매 및 궁극적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산과 접촉시키는 단계, 및 (d) 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올로의 촉매적 수소화를 위한 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함한다.
수소화 금속 촉매는 균질 또는 불균질 촉매일 수 있다. 균질 금속 촉매는 당업계에 공지된 금속 착물일 수 있다. 특히, 수소화 금속 촉매는 불균질 촉매일 수 있다. 고체 촉매를 사용하는 다중상 촉매 반응의 사용의 일부 이점은 촉매 및 생성물의 용이한 분리, 용이한 회수 및 촉매 재활용, 및 비교적 온화한 작동 조건을 포함한다. 불균질 촉매를 사용하는 것에 있어서 명백한 경제적 및 환경적 인센티브가 또한 존재한다. 특히, 수소화 금속 촉매는 루테늄(Ru) 촉매, 레늄(Re) 촉매, 니켈(Ni) 촉매, 철(Fe), 코발트(Co), 팔라듐(Pd) 촉매 및 백금(Pt) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 특히, 촉매는 Ni, Pd 및 Pt 촉매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 수소화 금속 촉매는 문헌 [Alonso, F. Tetrahedron, 2008, 64: 1847-52]에 기재된 바와 같이 니켈 나노입자일 수 있다. 또 다른 예에서, 문헌 [Gorgas, N., Organometallics, 2014, 33 (23): 6905-6914]에 개시된 바와 같이, 철(II) PNP 핀서 착물은 고차 알콜로의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로부터 6-운데칸올로의 수소화를 위한 수소화 금속 촉매로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 문헌 [Tariq Shah M., et al., ACS Applied Materials & Interfaces, 2015: 7(12), 6480-9]에 기재된 바와 같이 루테늄(Ru) 촉매, 레늄(Re) 촉매, 니켈(Ni) 촉매, 철(Fe), 코발트(Co), 팔라듐(Pd) 촉매 또는 백금(Pt) 촉매의 마그네타이트 나노입자가 본 발명의 임의의 측면에 따른 불균질 수소화 금속 촉매로서 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 구리-포스핀 착물은 문헌 [Chen, J-X., Tetrahedron, 2000, 56: 2153-2166]에 개시된 바와 같이 본 발명의 임의의 측면에 따른 균질 수소화 금속 촉매로서 사용된다. 추가의 예에서, 문헌 [Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2014, 388-389: 116-122]에 개시된 바와 같이 불균질 Pt 촉매, 특히 Pt/Al2O3 촉매를 고차 알콜로의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로부터 6-운데칸올로의 수소화에 사용할 수 있다. 문헌 [ChemSusChem, 2017: 10(11), 2527-2533]에는 또한 다양한 불균질 촉매 예컨대 Pt/C, Ru/C, 및 Pd/C가 개시되어 있으며, 이는 6-운데카논의 6-운데칸올로의 수소화를 위해 산 촉매와 함께 또는 그 없이 사용될 수 있다. 상기에 기초하여, 당업자는 고차 알카논으로부터 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데카논으로부터 6-운데칸올을 수득하기 위해 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 적합한 수소화 촉매를 결정할 수 있다.
당업자는 적합한 수소화 금속 촉매를 용이하게 결정할 수 있고, 따라서 6-운데카논의 수소화로부터 보다 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 효율적으로 제조하기 위한 조건을 변화시킬 수 있을 것이다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, (e) 본 발명의 임의의 측면에 따라 제조된 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 CO2 및 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 알칸산, 바람직하게는 라우르산으로 카르복실화할 수 있는 균질 카르복실화 촉매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 알칸산, 바람직하게는 라우르산을 제조하는 방법이 제공된다.
특히 본 발명의 이러한 측면은 (a) 에탄올 및/또는 아세테이트를 탄소 사슬 신장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 제조하는 단계; (b) (a)로부터, 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸을 포함하는 적어도 하나의 추출제를 수성 배지에서 사용하여 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 추출하는 단계; (c) (b)로부터의 추출된 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 헥산산 및 궁극적으로 추가의 알칸산의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로의 화학적 케톤화를 위한 적합한 반응 조건 하에 적어도 하나의 케톤화 촉매 및 궁극적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산과 접촉시키는 단계, 및 (d) 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올로의 촉매적 수소화를 위한 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 단계, 및 (e) 본 발명의 임의의 측면에 따라 제조된 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 CO2 및 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 알칸산, 바람직하게는 라우르산으로 카르복실화할 수 있는 균질 카르복실화 촉매와 접촉시키는 단계를 포함한다.
도데칸산으로도 공지된 알칸산, 바람직하게는 라우르산(C12H24O2)은 카르복실화 촉매의 존재 하에 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올로부터 제조될 수 있다. 가능한 방법은 적어도 반응식 1에 개시되어 있다.
반응식 1 헥산산으로부터의 6-운데카논, 6-운데칸올 및 라우르산의 형성
카르복실화 촉매는 Rh, Ni, Ru, Co, Pt, Pd 및 Fe 촉매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 당업자는 본 발명의 임의의 측면에 따라 제조된 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올의 알칸산, 바람직하게는 라우르산으로의 효과적이고 효율적인 전환을 위해 카르복실화 촉매와 함께 사용될 필요가 있을 수 있는 적합한 조건 및 리간드를 결정할 수 있을 것이다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 카르복실화 촉매는 균질 카르복실화 촉매일 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(e)는 (ei) 고차 알칸올의 고차 알칸산으로의, 바람직하게는 6-운데칸올의 라우르산으로의 카르복실화를 위해 본 발명의 임의의 측면에 따라 제조된 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 대기압에서 적어도 하나의 니켈 촉매 및 이산화탄소와 접촉시키는 단계를 포함한다. 단계(ei)는 형성되는 브로마이드 중간체를 포함할 수 있다. 단계(ei)의 방법의 세부사항은 문헌 [Julia-Hernandez, Nature, 2017, 545: 84-88]에 추가로 개시되어 있다.
또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(e)는 (eii) 본 발명의 임의의 측면에 따라 제조된 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 수소, CO2 및 고차 알칸올의 고차 알칸산으로의, 바람직하게는 6-운데칸올의 라우르산으로의 카르복실화를 위한 균질 Rh 촉매와 접촉시키는 단계를 포함한다. 이러한 촉매적 히드로카르복실화 방법(반응식 2)은 문헌 [Ostapowicz, T.G et al. Angew. Chem. Int, Ed., 2013, 52: 12119-23]에 추가로 상세히 기재되어 있다.
반응식 2 CO2에 의한 올레핀의 촉매적 히드로카르복실화.
특히, 단계(eii)는 승온의 존재 하에 수행될 수 있다. 보다 특히, 단계(eii)의 승온은 100 내지 300 ℃의 범위일 수 있다. 예를 들어, 단계(eii)를 위한 온도는 100-250, 100-200, 150-300, 또는 150-250 ℃의 범위 내일 수 있다. 또한, 단계(eii)에 적합한 조건은 CO2의 분압이 0.1 내지 200 bar 범위인 것을 포함할 수 있고, 특히 CO2의 분압이 0.1 내지 150, 0.1 내지 100, 0.1 내지 60 bar 등일 수 있다. 당업자는 카르복실화에 적합한 조건이 촉매를 억제하지 않고 고차 알칸올로부터의 고차 알칸산, 바람직하게는 6-운데칸올로부터의 라우르산의 우수한 수율을 생성하는 것을 결정할 수 있을 것이다.
본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(e)에서 사용될 수 있는 카르복실화 촉매의 다른 예는 적어도 문헌 [Journal of Molecular Catalysis A: Chemical, 2003, 197: 61-64, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107: 3568-3572, J. Am. Chem. Soc. 1985, 107: 3565-3567 및 Journal of Molecular Catalysts, 1987, 40: 71-82]에 기재되어 있다.
한 예에서, 단계(c)의 수소화 금속 촉매는 또한 본 발명의 임의의 측면에 따른 단계(e)의 카르복실화를 수행할 수 있다. 따라서, 단일 촉매는 고차 알카논으로부터 직접적으로 알칸산을, 바람직하게는 6-운데카논으로부터 직접적으로 라우르산을 형성할 수 있다. 특히, 고차 알카논을 알칸산으로 전환시키기 위해 사용될 수 있는 촉매, 바람직하게는 6-운데카논을 라우르산으로 전환시키기 위해(즉, 단계(d) 및 (e)) 사용될 수 있는 촉매가 균질 금속 촉매일 수 있다. 보다 특히, 단계(d) 및 (e)를 수행하는데 사용될 수 있는 균질 금속 촉매는 균질 Rh 촉매일 수 있다. 균질 Rh 촉매 및 사용에 적합한 조건의 가능한 예는 적어도 문헌 [Organic Letters, 2008, 10(20): 4697-4700, Organometallics, 2008, 27(21): 5494-5503, European Journal of Organic Chemistry, 2002, 10: 1685-1689, European Journal of Inorganic Chemistry, 2001, 1: 289-296 및 Angewandte Chemie, International Edition, 1998, 37(8): 1100-1103]에 기재되어 있다.
실시예
상기는 바람직한 실시양태를 기재하며, 이는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이 청구범위의 범주를 벗어나지 않으면서 설계, 구축 또는 작동에 있어서의 변동 또는 변형에 적용될 수 있다. 이들 변동은, 예를 들어 청구범위의 범주에 의해 포괄되는 것으로 의도된다.
실시예 1
아세테이트 및 에탄올로부터 헥산산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리
에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생체변환을 위해, 박테리아 클로스트리디움 클루이베리가 사용되었다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.
예비배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 DMSZ52 배지(pH = 7.0; 10 g/L K-아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/l NH4Cl, 0.20 g/l MgSO4x7 H2O, 1 g/L 효모 추출물, 0.50 mg/L 레사주린, 10 μl/l HCl (25 %, 7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2x4H2O, 70 μg/L ZnCl2x7H2O, 100 μg/L MnCl2x4H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2x6H2O, 2 μg/L CuCl2x6H2O, 24 μg/L NiCl2x6H2O, 36 μg/L Na2MO4x2H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3x5H2O, 4 μg/L Na2WO4x2H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HClx2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 0.25 g/L 시스테인-HClxH2O, 0.25 g/L Na2Sx9H2O)에 클로스트리디움 클루이베리의 냉동 동결배양액 5 ml를 접종하고, 37℃에서 144시간 동안 OD600nm >0.2로 인큐베이션하였다.
주 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 신선한 DMSZ52 배지에 예비배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm로 접종하였다. 이러한 성장 배양물을 37 ℃에서 27시간 동안 OD600nm >0.6으로 인큐베이션하였다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리하고, 제조 완충제(pH 6.0; 0.832 g/L K-아세테이트, 5.0 g/l 에탄올)로 세척하고, 다시 원심분리하였다.
제조 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 제조 완충제에 주 배양물로부터 세척된 세포를 0.2의 OD600nm로 접종하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 진탕 수조에서 37 ℃ 및 100 rpm에서 71시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 기간의 시작 및 종료 시에, 샘플을 취했다. 이들을 광학 밀도, pH 및 상이한 분석물(NMR에 의해 시험됨)에 대해 시험하였다.
결과는 제조 단계에서 아세테이트의 양이 0.54 g/l에서 0.03 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 5.6 g/l에서 4.9 g/l로 감소했음을 보여주었다. 또한, 부티르산의 농도는 0.05 g/l에서 0.28 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.03 g/l에서 0.79 g/l로 증가하였다.
실시예 2
부티르산 및 에탄올로부터 헥산산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리
에탄올 및 부티르산의 헥산산으로의 생체변환을 위해, 박테리아 클로스트리디움 클루이베리가 사용되었다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.
예비배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 DMSZ52 배지(pH = 7.0; 10 g/L K-아세테이트, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/l NH4Cl, 0.20 g/l MgSO4x7 H2O, 1 g/L 효모 추출물, 0.50 mg/L 레사주린, 10 μl/l HCl (25 %, 7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2x4H2O, 70 μg/L ZnCl2x7H2O, 100 μg/L MnCl2x4H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2x6H2O, 2 μg/L CuCl2x6H2O, 24 μg/L NiCl2x6H2O, 36 μg/L Na2MO4x2H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3x5H2O, 4 μg/L Na2WO4x2H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HClx2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 0.25 g/L 시스테인-HClxH2O, 0.25 g/L Na2Sx9H2O)에 클로스트리디움 클루이베리의 냉동 동결배양액 5 ml를 접종하고, 37 ℃에서 144시간 동안 OD600nm >0.3로 인큐베이션하였다.
주 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 신선한 DMSZ52 배지에 예비배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm로 접종하였다. 이러한 성장 배양물을 37 ℃에서 25시간 동안 OD600nm >0.4로 인큐베이션하였다. 이어서 세포 현탁액을 원심분리하고, 제조 완충제(pH 6.16; 4.16 g/L K-아세테이트, 10.0 g/l 에탄올)로 세척하고, 다시 원심분리하였다.
제조 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 제조 완충제에 주 배양물로부터 세척된 세포를 0.2의 OD600nm로 접종하였다. 제1 배양에서, 초기에 1.0 g/l의 부티르산을 제조 완충제에 첨가하고, 제2 배양에서, 부티르산을 제조 완충제에 첨가하지 않았다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 진탕 수조에서 37 ℃ 및 100 rpm에서 71시간 동안 인큐베이션하였다. 배양 기간의 시작 및 종료 시에, 샘플을 취했다. 이들을 광학 밀도, pH 및 상이한 분석물(NMR에 의해 시험됨)에 대해 시험하였다.
결과는 부티르산 보충된 배양물의 제조 단계에서 아세테이트의 양이 3.1 g/l에서 1.1 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 10.6 g/l에서 7.5 g/l로 감소했음을 보여주었다. 또한, 부티르산의 농도는 1.2 g/l에서 2.2 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.04 g/l에서 2.30 g/l로 증가하였다.
비-보충된 배양물의 제조 단계에서, 아세테이트 양은 3.0 g/l에서 1.3 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양은 10.2 g/l에서 8.2 g/l로 감소했다. 또한, 부티르산의 농도는 0.1 g/l에서 1.7 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.01 g/l에서 1.40 g/l로 증가하였다.
실시예 3
데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
클로스트리디움 클루이베리 박테리아를 에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생체변환을 위해 배양하였다. 제조된 헥산산의 계내 추출을 위해, 데칸과 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.
예비배양을 위해, 250 ml의 Veri01 배지(pH 7.0; 10 g/L 아세트산칼륨, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl /L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린)에 클로스트리디움 클루이베리의 살아있는 배양물 10 ml를 0.1의 개시 OD600nm로 접종하였다.
배양을 1000 mL 내압 유리병에서 37 ℃, 150 rpm에서 개방 수조 진탕기에서 100 % CO2로 1 L/h의 환기 속도로 671시간 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출하였다. 100 g/L NaOH 용액을 자동 첨가함으로써 pH를 6.2에서 유지하였다. 신선한 배지를 2.0 d-1의 희석률로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로®(KrosFlo®) 중공 섬유 폴리에테르술폰 막(스펙트럼랩스(SpectrumLabs), 미국 란초 도밍게즈)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내에 세포를 보유하였다.
주 배양을 위해 250 ml 병 내의 100 ml의 신선한 Veri01 배지에 예비배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm로 접종하였다. 데칸 중 6 % (w/w) TOPO의 추가의 혼합물 1 ml를 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 수조 진탕기에서 37 ℃ 및 150 rpm에서 43시간 동안 100 % CO2 분위기 하에 인큐베이션하였다.
배양 동안 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 반정량적 1H-NMR 분광법에 의해 생성물 농도를 결정하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트(T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.14 g/L에서 2.12 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.22 g/L에서 0.91 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 15.04에서 11.98 g/L로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 6.01에서 4.23 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 이 시간 동안 0.111에서 0.076으로 감소하였다.
실시예 4
테트라데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
클로스트리디움 클루이베리 박테리아를 에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생체변환을 위해 배양하였다. 제조된 헥산산의 계내 추출을 위해, 테트라데칸과 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.
클로스트리디움 클루이베리의 사전배양을 1000 mL 내압 유리병에서 250 ml의 EvoDM24 배지(pH 5.5; 0.429 g/L Mg-아세테이트, 0.164 g/l Na-아세테이트, 0.016 g/L Ca-아세테이트, 2.454 g/l K-아세테이트, 0.107 mL/L H3PO4 (8.5%), 0.7 g/L NH4아세테이트, 0.35 mg/L Co-아세테이트, 1.245 mg/L Ni-아세테이트, 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 폴산,10 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트, 50 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조에이트, 50 μg/L 리포산, 0.702 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 4 H2O, 1 ml/L KS-아세테이트(93,5 mM), 20 mL/L 에탄올, 0.37 g/L 아세트산)에서 37 ℃, 150 rpm에서 1 L/h의 환기 속도로 개방 수조 진탕기에서 25 % CO2 및 75 % N2의 혼합물로 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출하였다. 2.5 M NH3 용액을 자동 첨가함으로써 pH를 5.5에서 유지하였다. 신선한 배지를 2.0 d-1의 희석률로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 막(스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내에 세포를 보유하고 ~1.5의 OD600nm를 유지하였다.
주 배양을 위해 250 ml 병 내의 100 ml의 Veri01 배지(pH 6.5; 10 g/L 아세트산칼륨, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl /L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린, 2.5 mL/L HCL 25 %)에 예비배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm로 접종하였다. 테트라데칸 중 6 % (w/w) TOPO의 추가의 혼합물 1 ml를 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 수조 진탕기에서 37 ℃ 및 150 rpm에서 47시간 동안 100 % CO2 분위기 하에 인큐베이션하였다.
배양 동안 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 반정량적 1H-NMR 분광법에 의해 생성물 농도를 결정하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트(T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.05 g/L에서 3.78 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.09 g/L에서 4.93 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 15.52에서 9.36 g/L로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 6.36에서 2.49 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 이 시간 동안 0.095에서 0.685로 증가하였다.
실시예 5
헥사데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
클로스트리디움 클루이베리 박테리아를 에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생체변환을 위해 배양하였다. 제조된 헥산산의 계내 추출을 위해, 헥사데칸과 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.
예비배양을 위해, 250 ml의 Veri01 배지(pH 7.0; 10 g/L 아세트산칼륨, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl /L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린)에 클로스트리디움 클루이베리의 살아있는 배양물 10 ml를 0.1의 개시 OD600nm로 접종하였다.
배양을 1000 mL 내압 유리병에서 37 ℃, 150 rpm에서 개방 수조 진탕기에서 100 % CO2로 1 L/h의 환기 속도로 671시간 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출하였다. 100 g/L NaOH 용액을 자동 첨가함으로써 pH를 6.2에서 유지하였다. 신선한 배지를 2.0 d-1의 희석률로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 막(스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내에 세포를 보유하였다.
주 배양을 위해, 250 ml 병 내의 신선한 Veri01 배지 100 ml에 예비배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm로 접종하였다. 헥사데칸 중 6 % (w/w) TOPO의 추가의 혼합물 1 ml를 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 수조 진탕기에서 37 ℃ 및 150 rpm에서 43시간 동안 100 % CO2 분위기 하에 인큐베이션하였다.
배양 동안 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 반정량적 1H-NMR 분광법에 의해 생성물 농도를 결정하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트(T(M)SP)를 사용하였다.
주요 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.14 g/L에서 2.86 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.20 g/L에서 2.37 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 14.59에서 10.24 g/L로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 5.87에서 3.32 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 이 시간 동안 0.091에서 0.256으로 증가하였다.
실시예 6
헵타데칸 및 TOPO의 존재 하에서의 클로스트리디움 클루이베리의 배양
클로스트리디움 클루이베리 박테리아를 에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생체변환을 위해 배양하였다. 제조된 헥산산의 계내 추출을 위해, 헵타데칸과 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.
예비배양을 위해, 250 ml의 Veri01 배지(pH 7.0; 10 g/L 아세트산칼륨, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl /L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린)에 클로스트리디움 클루이베리의 살아있는 배양물 10 ml를 0.1의 개시 OD600nm로 접종하였다.
배양을 1000 mL 내압 유리병에서 37 ℃, 150 rpm에서 개방 수조 진탕기에서 100 % CO2로 1 L/h의 환기 속도로 671시간 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출하였다. 100 g/L NaOH 용액을 자동 첨가함으로써 pH를 6.2에서 유지하였다. 신선한 배지를 2.0 d-1의 희석률로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 막(스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내에 세포를 보유하였다.
주 배양을 위해, 250 ml 병 내의 신선한 Veri01 배지 100 ml에 예비배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm로 접종하였다. 헵타데칸 중 6 % (w/w) TOPO의 추가의 혼합물 1 ml를 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 수조 진탕기에서 37 ℃ 및 150 rpm에서 43시간 동안 100 % CO2 분위기 하에 인큐베이션하였다.
배양 동안 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 반정량적 1H-NMR 분광법에 의해 생성물 농도를 결정하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트(T(M)SP)를 사용하였다.
주요 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.15 g/L에서 2.82 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.19 g/L에서 2.85 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 14.34에서 9.58 g/L로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 5.88에서 3.20 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 이 시간 동안 0.083으로부터 0.363으로 증가하였다.
실시예 7
도데칸 및 TOPO의 존재하에 클로스트리디움 클루이베리의 배양
클로스트리디움 클루이베리 박테리아를 에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생체변환을 위해 배양하였다. 제조된 헥산산의 계내 추출을 위해, 도데칸과 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물을 배양에 첨가하였다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.
예비배양을 위해, 250 ml의 Veri01 배지(pH 7.0; 10 g/L 아세트산칼륨, 0.31 g/L K2HPO4, 0.23 g/L KH2PO4, 0.25 g/L NH4Cl, 0.20 g/L MgSO4 X 7 H2O, 10 μl /L HCl (7.7 M), 1.5 mg/L FeCl2 X 4 H2O, 36 μg/L ZnCl2, 64 μg/L MnCl2 X 4 H2O, 6 μg/L H3BO3, 190 μg/L CoCl2 X 6 H2O, 1.2 μg/L CuCl2 X 6 H2O, 24 μg/L NiCl2 X 6 H2O, 36 μg/L Na2MO4 X 2 H2O, 0.5 mg/L NaOH, 3 μg/L Na2SeO3 X 5 H2O, 4 μg/L Na2WO4 X 2 H2O, 100 μg/L 비타민 B12, 80 μg/L p-아미노벤조산, 20 μg/L D(+) 비오틴, 200 μg/L 니코틴산, 100 μg/L D-Ca-판토테네이트, 300 μg/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 μg/l 티아민-HCl x 2H2O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO3, 65 mg/L 글리신, 24 mg/L 히스티딘, 64.6 mg/L 이소류신, 93.8 mg/L 류신, 103 mg/L 리신, 60.4 mg/L 아르기닌, 21.64 mg/L L-시스테인-HCl, 21 mg/L 메티오닌, 52 mg/L 프롤린, 56.8 mg/L 세린, 59 mg/L 트레오닌, 75.8 mg/L 발린)에 클로스트리디움 클루이베리의 살아있는 배양물 10 ml를 0.1의 개시 OD600nm로 접종하였다.
배양을 1000 mL 내압 유리병에서 37 ℃, 150 rpm에서 개방 수조 진탕기에서 100 % CO2로 1 L/h의 환기 속도로 671시간 동안 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출하였다. 100 g/L NaOH 용액을 자동 첨가함으로써 pH를 6.2에서 유지하였다. 신선한 배지를 2.0 d-1의 희석률로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 막(스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내에 세포를 보유하였다.
주 배양을 위해, 250 ml 병 내의 신선한 Veri01 배지 100 ml에 예비배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD600nm로 접종하였다. 도데칸 중 6 % (w/w) TOPO의 혼합물 1 ml를 추가로 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 수조 진탕기에서 37 ℃ 및 150 rpm에서 43시간 동안 100 % CO2 분위기 하에 인큐베이션하였다.
배양 동안 OD600nm, pH 및 산물 형성을 결정하기 위해 여러 5 mL 샘플을 취하였다. 반정량적 1H-NMR 분광법에 의해 생성물 농도를 결정하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트(T(M)SP)를 사용하였다.
주 배양 동안, 부티레이트의 농도는 0.14 g/L에서 2.62 g/L로 증가하였고, 헥사노에이트의 농도는 0.22 g/L에서 2.05 g/L로 증가한 반면, 에탄올의 농도는 14.62에서 10.64 g/L로 감소하였고, 아세테이트의 농도는 5.92에서 3.54 g/L로 감소하였다.
OD600nm는 이 시간 동안 0.091에서 0.259로 증가하였다.
실시예 8
물과 헥사데칸과 TOPO의 혼합물 사이의 헥산산에 대한 분포 계수의 결정
실험의 모든 단계 동안, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 헥산산의 농도 및 pH의 결정을 위해 두 상으로부터의 샘플을 취하였다. 5 g/kg 헥산산의 수용액 100 g 및 헥사데칸 중 6 % 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물 33 g을 분리 깔때기에 충전하고 37 ℃ 에서 1분 동안 혼합하였다. 이어서, 깔때기를 트리포드 고리에 넣고, 에멀젼을 자발적으로 분리되도록 방치하였다. 수성 상의 pH를 측정하였다. 이어서, 1M NaOH 용액을 깔때기에 첨가하고, 혼합하였다. 분리 및 샘플링 단계를 수성 상에서 6.2의 pH에 도달할 때까지 반복하였다. 이 시점에서 후기 분석을 위해 두 상 모두로부터의 샘플을 취하였다. 수성 상을 HPLC에 의해 직접 분석할 수 있었다. 유기 상의 분석을 위해, 희석된 헥산산을 먼저 물로 재추출한 후(1M NaOH의 첨가에 의해 pH 12.0), HPLC에 의해 분석하였다. 물 시스템 내의 헥산산 및 헥사데칸 내의 6 % TOPO의 분포 계수 KD를 양쪽 상의 헥산산의 농도로부터 계산하였다.
pH 6.2에서의 물 시스템 내의 헥산산 및 헥사데칸 내의 6 % TOPO에 대한 KD는 4.7이었다.
실시예 9
물과 헵타데칸과 TOPO의 혼합물 사이의 헥산산에 대한 분포 계수의 결정
실험의 모든 단계 동안, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 에 의한 헥산산의 농도 및 pH의 결정을 위해 두 상으로부터의 샘플을 취하였다. 5 g/kg 헥산산의 수용액 100 g 및 헵타데칸 중 6 % 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물 33 g을 분리 깔때기에 충전하고 37 ℃ 에서 1분 동안 혼합하였다. 이어서, 깔때기를 트리포드 고리에 넣고, 에멀젼을 자발적으로 분리되도록 방치하였다. 수성 상의 pH를 측정하였다. 1M NaOH 용액을 깔때기에 첨가하고, 혼합하였다. 분리 및 샘플링 단계를 수성 상에서 6.2의 pH에 도달할 때까지 반복하였다. 이 시점에서 후기 분석을 위해 두 상 모두로부터의 샘플을 취하였다. 수성 상을 HPLC에 의해 직접 분석할 수 있었다. 유기 상의 분석을 위해, 희석된 헥산산을 먼저 물로 재추출한 후(1M NaOH의 첨가에 의해 pH 12.0), HPLC에 의해 분석하였다. 물 시스템 내의 헥산산 및 헵타데칸 내의 6 % TOPO의 분포 계수 KD를 양쪽 상의 헥산산의 농도로부터 계산하였다.
pH 6.2에서의 물 시스템 내의 헥산산 및 헵타데칸 내의 6 % TOPO에 대한 KD는 5.0이었다.
실시예 10
물과 테트라데칸과 TOPO의 혼합물 사이의 헥산산에 대한 분포 계수의 결정
실험의 모든 단계 동안, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)에 의한 헥산산의 농도 및 pH의 결정을 위해 두 상으로부터의 샘플을 취하였다. 5 g/kg 헥산산 플러스 0.5 g/kg 아세트산의 수용액 130 g 및 테트라데칸 중 6 % 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물 15 g을 분리 깔때기에 충전하고 37 ℃ 에서 1분 동안 혼합하였다. 이어서, 깔때기를 트리포드 고리에 넣고, 에멀젼을 자발적으로 분리되도록 하였다. 수성 상의 pH를 측정하였다. 1M NaOH 용액을 깔때기에 첨가하고, 혼합하였다. 분리 및 샘플링 단계를 수성 상에서 6.2의 pH에 도달할 때까지 반복하였다. 이 시점에서 후기 분석을 위해 두 상 모두로부터의 샘플을 취하였다. 수성 상을 HPLC에 의해 직접 분석할 수 있었다. 유기 상의 분석을 위해, 희석된 헥산산을 먼저 물로 재추출한 후(1M NaOH의 첨가에 의해 pH 12.0), HPLC에 의해 분석하였다. 시스템 물 내의 헥산산 및 테트라데칸 내의 6 % TOPO의 분포 계수 KD를 양쪽 상의 헥산산의 농도로부터 계산하였다.
pH 6.9에서 시스템 물 내의 헥산산 및 테트라데칸 내의 6 % TOPO에 대한 KD는 1.3이었다.
실시예 11
헥산산의 계내 추출과 함께 클로스트리디움 클루이베리의 배양
클로스트리디움 클루이베리 박테리아를 에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생체변환을 위해 배양하였다. 제조된 헥산산의 계내 추출을 위해, 테트라데칸과 트리옥틸포스핀옥시드(TOPO)의 혼합물을 계속 배양에 통과시켰다. 모든 배양 단계를 부틸 고무 마개로 기밀 밀폐될 수 있는 내압성 유리 병에서 혐기성 조건 하에 수행하였다.
클로스트리디움 클루이베리의 사전배양을 1000 mL 내압 유리병에서 250 ml의 EvoDM45 배지 (pH 5.5; 0.004 g/L Mg-아세테이트, 0.164 g/l Na-아세테이트, 0.016 g/L Ca-아세테이트, 0.25 g/l K-아세테이트, 0.107 mL/L H3PO4 (8.5%), 2.92 g/L NH4아세테이트, 0.35 mg/L Co-아세테이트, 1.245 mg/L Ni-아세테이트, 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 폴산,10 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트, 50 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조에이트, 50 μg/L 리포산, 0.702 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 4 H2O, 1 ml/L KS-아세테이트(93,5 mM), 20 mL/L 에탄올, 0.37 g/L 아세트산)에서 37 ℃, 150 rpm에서 1 L/h의 환기 속도로 개방 수조 진탕기에서 25 % CO2 및 75 % N2의 혼합물로 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출하였다. 2.5 M NH3 용액을 자동 첨가함으로써 pH를 5.5에서 유지하였다. 신선한 배지를 2.0 d-1의 희석률로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 0.2 μm의 세공 크기를 갖는 크로스플로® 중공 섬유 폴리에테르술폰 막(스펙트럼랩스, 미국 란초 도밍게즈)을 통해 반응기로부터 연속적으로 제거하여 반응기 내에 세포를 보유하고 ~1.5의 OD600nm를 유지하였다.
주 배양을 위해, 1000 ml 병내의 150 ml의 EvoDM39 배지(pH 5.8; 0.429 g/L Mg-아세테이트, 0.164 g/l Na-아세테이트, 0.016 g/L Ca-아세테이트, 2.454 g/l K-아세테이트, 0.107 mL/L H3PO4 (8.5%), 1.01 mL/L 아세트산, 0.35 mg/L Co-아세테이트, 1.245 mg/L Ni-아세테이트, 20 μg/L d-비오틴, 20 μg/L 폴산,10 μg/L 피리독신-HCl, 50 μg/L 티아민-HCl, 50 μg/L 리보플라빈, 50 μg/L 니코틴산, 50 μg/L Ca-판토테네이트, 50 μg/L 비타민 B12, 50 μg/L p-아미노벤조에이트, 50 μg/L 리포산, 0.702 mg/L (NH4)2Fe(SO4)2 x 4 H2O, 1 ml/L KS-아세테이트(93,5 mM), 20 mL/L 에탄올, 8.8 mL NH3 용액(2,5 mol/L), 27.75 ml/L 아세트산(144 g/L))에 예비배양물로부터의 100 ml 세포 브로쓰를 0.71의 OD600nm로 접종하였다.
37 ℃, 150 rpm에서 1 L/h의 환기 속도로 개방 수조 진탕기에서 65시간 동안 25 % CO2 및 75 % N2의 혼합물로 배양을 수행하였다. 가스를 반응기의 헤드스페이스로 배출하였다. 2.5 M NH3 용액을 자동 첨가함으로써 pH를 5.8로 유지하였다. 신선한 배지를 0.5 d-1의 희석률로 반응기에 연속적으로 공급하고, 발효 브로쓰를 ~0.5의 OD600nm를 유지함으로써 반응기로부터 연속적으로 제거하였다. 테트라데칸 중 6 % (w/w) TOPO의 혼합물 120 g을 발효 브로쓰에 추가로 첨가하였다. 이어서, 이 유기 혼합물을 반응기로 연속적으로 공급하고, 유기 상을 또한 1 d-1의 희석률로 반응기로부터 연속적으로 제거하였다.
배양 동안, 수성 상 및 유기 상 둘 다로부터의 여러 5 mL 샘플을 취하여 OD600nm, pH 및 생성물 형성을 결정하였다. 반정량적 1H-NMR 분광법에 의해 생성물 농도를 결정하였다. 내부 정량화 표준물로서 소듐 트리메틸실릴프로피오네이트(T(M)SP)를 사용하였다.
수성 상에서의 주 배양 동안, 8.18 g/L 에탄올, 3.20 g/L 아세테이트, 1.81 g/L 부티레이트 및 0.81 g/L 헥사노에이트의 정상 상태 농도에 도달하였다. OD600nm는 0.5에서 안정하게 유지되었다. 유기상에서 0.43 g/kg 에탄올, 0.08 g/kg 아세테이트, 1.13 g/kg 부티레이트 및 8.09 g/kg 헥사노에이트의 정상 상태 농도에 도달하였다. 실험 후, 세포를 추가 배양물로 옮기는 동안 생존가능하게 유지하였다.
시스템 수성 배지 중 기질 및 생성물 및 테트라데칸 중 6 % TOPO의 분포 계수 KD를 두 상의 농도로부터 계산하였다.
정상 상태에서의 KD는 에탄올의 경우에 0.05이고, 아세트산의 경우에 0.03이고, 부티르산의 경우에 0.62이고, 헥산산의 경우에 9.99였다.
실시예 12
헥산산의 케톤화
케톤화는 가열된 연속 유동층 반응기에서 수행하였다. 먼저, 반응기에 실리카 상의 산화마그네슘(50 중량%, 14.00 g)을 충전하고, 아르곤 유동(54 mL/분)하에 330 ℃에서 1시간 동안 가열하였다. 온도를 360 ℃로 상승시켰다. 테트라데칸 중 헥산산의 혼합물(v/v: 3/1)을 3.3 mL/h의 속도로 반응기에 연속적으로 공급하였다. 가스상 유출 스트림을 물 및 드라이 아이스와 이소프로판올의 혼합물로 냉각된 2개의 냉각 트랩에 의해 수집하였다. 수집된 분획을 칭량하고, 그의 조성에 대해 가스 크로마토그래피(GC)에 의해 분석하였다. 총 370.65 g의 헥산산을 반응기에 공급하였고, 이는 부산물로서 271.70 g의 6-운데카논 및 28.75 g의 물 및 70.21 g의 이산화탄소의 최대 이론적 수율과 동등하였다. 6-운데카논의 수득된 양은 267.67 g이었고 물의 양은 28.32 g이었다. 이는 완전 전환에서 99 % 질량 회수에 상응하였다. 미량의 헥산산만이 검출되었고 부산물은 검출되지 않았기 때문에, 높은 생산성 및 선택성을 일반적 GC 측정에 의해 확인하였다.
실시예 13
팔미트산과의 헥산산의 교차 케톤화.
교차 케톤화의 기술적 절차는 기질 공급물의 조성을 제외하고는 헥산산의 단독 케톤화 (실시예 12)와 동일하다. 공급물은 기질로서 헥산산(116.16 g, 1.00 mol) 및 팔미트산(256.43 g, 1.00 mol) 및 내부 표준물로서 테트라데칸(124.20 g)으로 이루어진다. 기질 공급물을 3.3 mL/h의 속도로 첨가하고, 360 ℃ 의 온도에서 반응시켰다. 2종의 알칸산의 존재는 3종의 케톤: 6-운데카논, 6-헤니코사논 및 16-헨트리아콘타논의 2종의 생성물 혼합물을 생성한다. 완전 전환에서, 수득된 양은 42.58 g의 6-운데카논, 155.29 g의 6-헤니코사논 및 112.71 g의 16-헨트리아콘타논이었다.
실시예 14
아세트산과의 헥산산의 교차 케톤화.
교차 케톤화의 기술적 절차는 기질 공급물의 조성을 제외하고는 헥산산의 단독 케톤화 (실시예 12)와 동일하다. 공급물은 기질로서 헥산산(232.32 g, 2.00 mol) 및 아세트산(120.10 g, 2.00 mol) 및 내부 표준물로서 테트라데칸(117.47 g) 으로 이루어진다. 기질 공급물을 3.3 mL/h의 속도로 첨가하고, 360 ℃ 의 온도에서 반응시켰다. 2종의 알칸산의 존재는 3종의 케톤: 2-프로파논, 2-헵타논 및 6-운데카논의 2종의 생성물 혼합물을 생성한다. 완전 전환에서, 수득된 양은 29.04 g의 2-프로파논, 114.19 g의 2-헵타논 및 85.15 g의 6-운데카논이었다.
Claims (15)
- (a) 에탄올 및/또는 아세테이트를 탄소 사슬 신장을 수행할 수 있는 적어도 하나의 미생물과 접촉시켜 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 제조하는 단계;
(b) (a)로부터, 적어도 하나의 알킬-포스핀 옥시드 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸; 또는 적어도 하나의 트리알킬아민 및 적어도 12개의 탄소 원자를 포함하는 적어도 하나의 알칸을 포함하는 적어도 하나의 추출제를 수성 배지에서 사용하여 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 추출하는 단계; 및
(c) (b)로부터의 추출된 헥산산 및/또는 그의 에스테르를 헥산산 및 궁극적으로 추가의 알칸산의 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논으로의 화학적 케톤화를 위한 적합한 반응 조건 하에 적어도 하나의 케톤화 촉매 및 궁극적으로 1 내지 22개의 탄소 원자를 포함하는 추가의 알칸산과 접촉시키는 단계
를 포함하는, 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 제조하는 방법. - 제1항에 있어서, (c)의 케톤화 촉매가 금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물인 방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 금속 산화물 촉매 또는 그의 혼합물이 헤테로다중산(H3PW12O40) 촉매, 산화티타늄(TiO2) 촉매, 산화세륨(CeO2) 촉매, 아연-크로뮴(Zn-Cr) 혼합 산화물 촉매, 산화망가니즈(MnO2) 촉매, 산화란타넘(La2O3) 촉매, 산화마그네슘(MgO) 촉매, 산화철(FeO, FeO2, Fe2O3, Fe3O4, Fe4O5, Fe5O6, Fe5O7), 규소-알루미늄(Si-Al) 혼합 산화물 촉매 및 지르코니아(ZrO2) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 케톤화 촉매가 지르코니아 에어로겔 촉매인 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계(c)의 적합한 반응 조건이 150 ℃ - 350 ℃의 반응 온도를 포함하는 것인 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, (a)에서의 미생물이 클로스트리디움 카르복시디보란스 및 클로스트리디움 클루이베리로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬-포스핀 옥시드가 트리옥틸포스핀 옥시드, 헥실포스핀 옥시드, 옥틸포스핀 옥시드 및 그의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 알칸이 펜타데칸, 헥사데칸, 헵타데칸, 옥타데칸 및 테트라다칸으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 알킬-포스핀 옥시드가 트리옥틸포스핀 옥시드(TOPO)이고 알칸이 테트라다칸인 방법.
- 제8항에 있어서, TOPO 대 테트라다칸의 중량비가 1:100 내지 1:10인 방법.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, (b)에서 수성 배지의 pH가 5.5 내지 8로 유지되는 것인 방법.
- (d) 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따라 제조된 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논을 고차 알카논, 바람직하게는 6-운데카논의 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올로의 촉매적 수소화를 위한 적어도 하나의 수소화 금속 촉매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 제조하는 방법.
- 제11항에 있어서, 수소화 금속 촉매가 루테늄(Ru) 촉매, 레늄(Re) 촉매, 니켈(Ni) 촉매, 철(Fe), 코발트(Co) 및 백금(Pt) 촉매로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
- (e) 제11항 또는 제12항에 따라 제조된 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 CO2 및 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 알칸산, 바람직하게는 라우르산으로 카르복실화할 수 있는 균질 카르복실화 촉매와 접촉시키는 단계를 포함하는, 에탄올 및/또는 아세테이트로부터 알칸산, 바람직하게는 라우르산을 제조하는 방법.
- 제13항에 있어서, 단계(e)가
(ei) 고차 알칸올의 고차 알칸산으로의, 바람직하게는 6-운데칸올의 라우르산으로의 카르복실화를 위해 제11항 또는 제12항에 따라 제조된 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 대기압에서 적어도 하나의 니켈 촉매 및 이산화탄소와 접촉시키는 단계; 또는
(eii) 제8항 또는 제9항에 따라 제조된 고차 알칸올, 바람직하게는 6-운데칸올을 수소, CO2 및 고차 알칸올의 고차 알칸산으로의, 바람직하게는 6-운데칸올의 라우르산으로의 카르복실화를 위한 균질 Rh 촉매와 접촉시키는 단계
를 포함하는 것인 방법. - 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 추출제가 재활용되는 것인 방법.
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