KR20170028360A

KR20170028360A - 콜베 합성과 조합된 미생물을 이용한 알칸의 생산 방법

Info

Publication number: KR20170028360A
Application number: KR1020177000957A
Authority: KR
Inventors: 토마스 하스; 우베 파울만; 지몬 베크
Original assignee: 에보니크 데구사 게엠베하
Priority date: 2014-07-17
Filing date: 2015-07-16
Publication date: 2017-03-13
Also published as: SG10201810616RA; EP2975131A1; CN106795529B; CN106795529A; EP3169789B1; SG11201700047RA; US20180208947A1; EP3169789A1; ES2893399T3; WO2016008979A1; CA2954099A1

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 알칸을 생산하는 방법에 관한 것이고, 여기서 방법은 유전자 변형된 미생물을 이용하여 탄소 공급원으로부터 적어도 하나의 카르복실산을 생산하고, 카르복실산에 대해 콜베 전기분해를 수행하여 알칸을 생산하는 것을 포함하고, 여기서, 알칸은 적어도 6개의 탄소 원자를 포함하고, 카르복실산은 적어도 4개의 탄소 원자를 포함하고, 탄소 공급원은 에탄올, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레레이트, 헥사노에이트 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 미생물은 에탄올-카르복실레이트 발효를 이용하여 카르복실산을 생산할 수 있다.

Description

콜베 합성과 조합된 미생물을 이용한 알칸의 생산 방법 {PROCESS FOR PRODUCING ALKANES USING MICROORGANISMS COMBINED WITH KOLBE SYNTHESIS}

본 발명은 합성 가스로부터 분지형, 비분지형 및 장쇄 알칸을 합성하는 방법에 관한 것이다. 특히, 방법은 생명공학 방법이다.

알칸은 알칸의 탄소 원자수 및 구조 (즉, 분지형, 선형, 환형 등)에 따라 다양한 용도를 갖는 포화 탄화수소이다. 처음 4개의 알칸 (CH₄ 내지 C₄H₈)은 난방 및 취사 목적을 위해 및 일부 국가에서 발전을 위해 주로 사용된다.

펜탄, 헥산, 헵탄 및 옥탄은 상당히 휘발성인 액체이다. 이들은 연소의 균일 성을 저해할 소적을 형성하지 않으면서 연소실 내로 도입될 때 쉽게 기화되기 때문에, 대체로 내연 기관의 연료로서 사용된다. 상기 기능을 위해, 분지쇄 알칸은 그의 직쇄 대응물에 비해 노킹(knocking)을 유발하는 조기 점화의 경향이 훨씬 더 작기 때문에 바람직하다. 상기 조기 점화 경향은 예를 들어 2,2,4-트리메틸펜탄 (이소옥탄)이 100의 임의의 값을 갖고 헵탄이 0의 값을 갖는 연료의 옥탄가에 의해 측정된다. 연료로서 그의 용도와 별도로, 상기 알칸의 군은 비극성 물질에 대한 좋은 용매이다.

노난으로부터, 예를 들어 헥사데칸 (16개의 탄소 원자를 갖는 알칸)까지의 알칸은 고점도 액체로서, 가솔린에서 사용하기에 보다 덜 적합하다. 이들은 디젤 및 항공 연료의 주요 부분을 대신 형성한다. 디젤 연료는 그의 세탄가를 특징으로 하고, 여기서 세탄은 헥사 데칸의 이전 이름이다.

헥사데칸으로부터 위쪽으로의 알칸은 연료유 및 윤활유의 가장 중요한 성분을 형성한다. 그의 소수성 특성은 물이 금속 표면에 도달할 수 없음을 의미하기 때문에, 윤활유 기능에서 이들은 방청제로도 동시에 작용한다. 많은 고체 알칸은 파라핀 왁스, 예를 들어 초로서 사용된다. 그러나, 이것은 주로 에스테르로 구성된 진정한 왁스와 혼동하지 않아야 한다. 사슬 길이가 약 35개 이상의 탄소 원자인 알칸은 예를 들어 노면 포장에 사용되는 역청에서 발견된다. 그러나, 고급 알칸은 가치가 거의 없고, 대체로 크래킹(cracking)에 의해 저급 알칸으로 분할된다.

따라서, 모든 길이의 알칸은 일상적인 생활에서 매우 유용하다. 현재, 알칸의 전통적인 제조는 석유 기반의 중간체를 사용한다. 그러나, 이러한 알칸은 환경에 나쁜 가솔린 또는 석유를 크래킹하여 얻는다. 또한, 이러한 알칸에 대한 비용은 장래 석유 가격의 예상된 증가와 함께 석유 가격에 연결될 것이기 때문에, 알칸 가격도 역시 석유 가격의 증가에 비례하여 증가할 수 있다.

따라서, 환경에 대한 손상을 보다 적게 유발하는, 순수 석유계 원료 이외의 다른 지속가능한 원료로부터 알칸을 생산하는 다른 방법을 찾는 것이 바람직하다.

지속가능한 원료, 예컨대 합성 가스에서 알칸을 포함하는 재생가능 연료를 생산하기 위해 많은 노력이 진행되고 있다. 관련 기술 분야에 공지된 하나의 방법은 트리글리세리드로부터 바이오디젤 연료 (주로 지방산 에틸 또는 메틸 에스테르)를 생산하는 것이다. 또 다른 방법은 바이오디젤 및/또는 디젤 연료에 첨가될 수 있는 글리세롤 에테르를 형성하기 위해 글리세롤을 사용하는 것이다. 그러나, 각각의 상기 방법은 그 자체의 단점이 있다. 따라서, 합성 가스를 포함하는 재생가능 연료로부터 중쇄 또는 장쇄 알칸을 효율적으로 생산하는 알려진 방법은 아직 존재하지 않는다.

발명의 설명

본 발명은 재생가능 연료로부터 중쇄 또는 장쇄 알칸을 생산하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명의 방법은 적어도 두 단계의 생명공학 공정을 이용하여 분지형, 선형 및/또는 환형 알칸을 생산하기 위해 합성 가스를 사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 적어도 미생물을 이용하여 합성 가스를 적어도 하나의 카르복실산으로 전환하는 제1 단계 및 카르복실산을 전기분해에 적용하여 카르복실산을 각각의 알칸으로 전환하는 제2 단계를 적어도 포함할 수 있다. 특히, 사용되는 전기분해는 콜베 전기분해일 수 있고, 이산화탄소는 부산물로서 생성될 수 있다.

본 발명의 한 측면에 따르면, 적어도 하나의 알칸을 생산하는 방법이 제공되고, 이 방법은

- 미생물을 이용하여 탄소 공급원으로부터 적어도 하나의 카르복실산을 생산하고,

- 카르복실산에 대해 콜베 전기분해를 수행하여 알칸을 생산하는 것

을 포함하고, 여기서, 알칸은 적어도 6개의 탄소 원자를 포함하고, 카르복실산은 적어도 4개의 탄소 원자를 포함한다.

탄소 공급원은 이산화탄소 또는 일산화탄소로서 그의 가장 단순한 형태일 수 있다. 특히, 탄소 공급원은 그 내에 탄소를 갖는 임의의 복잡한 분자일 수 있다. 보다 특히, 탄소 공급원은 알콜, 알데히드, 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 덱스트로스, 락토스, 크실로스, 펜토스, 폴리올, 헥소스, 에탄올 및 합성 가스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 훨씬 더 특히, 탄소 공급원은 에탄올 및/또는 합성 가스일 수 있다. 한 예에서, 탄소 공급원은 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레레이트 및 헥사노에이트로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 다른 탄소 공급원과 조합된 에탄올일 수 있다. 특히, 탄소 공급원은 에탄올 및 아세테이트일 수 있다. 또 다른 예에서, 탄소 공급원은 프로피온산 및 에탄올, 아세테이트 및 에탄올, 이소 부티르산 및 에탄올 또는 부티르산 및 에탄올의 조합일 수 있다.

한 예에서, 에탄올은 탄소 공급원이고, 미생물은 에탄올-카르복실레이트 발효 경로를 이용하여 적어도 하나의 카르복실산을 생산할 수 있는 임의의 미생물일 수 있다. 에탄올-카르복실레이트 발효 경로는 적어도 문헌 [Seedorf, H., et al., 2008]에 상세하게 설명되어 있다. 유기체는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri), 씨.카르복시디보란스(C. Carboxidivorans), 씨.파루스(C.pharus) 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이러한 미생물은 야생형 형태에서는 에탄올-카르복실레이트 발효 경로를 갖지 않지만 유전자 변형의 결과로서 상기 형질을 획득한 미생물을 포함한다. 특히, 미생물은 클로스트리디움 클루이베리일 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 유전자 변형된 미생물일 수 있다. 유전자 변형된 세포 또는 미생물은 야생형 세포 또는 미생물과 유전적으로 상이할 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 미생물과 야생형 미생물 사이의 유전적 차이는 야생형 미생물에 존재하지 않을 수 있는 전체 유전자, 아미노산, 뉴클레오티드 등이 유전자 변형된 미생물에 존재하는 것일 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 미생물은 미생물이 적어도 하나의 카르복실산을 생산할 수 있도록 하는 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 유전자 변형된 미생물에 비해 야생형 미생물은 유전자 변형된 미생물이 적어도 하나의 카르복실산을 생산할 수 있게 하는 효소의 활성을 전혀 또는 검출가능한 활성을 갖지 않을 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, '유전자 변형된 미생물'이라는 용어는 '유전자 변형된 세포'라는 용어와 교환가능하게 사용될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형은 미생물의 세포에 대해 수행된다.

본원에서 세포 또는 미생물과 관련하여 사용되는 문구 "야생형"은 야생에서 자연적으로 보이는 형태의 게놈 구성을 갖는 세포를 나타낼 수 있다. 이 용어는 전체 세포 및 개별 유전자 둘 모두에 적용될 수 있다. 따라서, "야생형"이라는 용어는 유전자 서열이 재조합 방법을 사용하여 인간에 의해 적어도 부분적으로 변형된 상기 세포 또는 상기 유전자를 포함하지 않는다.

통상의 기술자는 세포 또는 미생물을 유전자 변형시키는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 사용할 수 있을 것이다. 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 유전자 변형된 세포는 규정된 시간 간격에서, 2시간 내, 특히 8시간 또는 24시간 내에, 야생형 세포보다 적어도 2배, 특히 적어도 10배, 적어도 100배, 적어도 1000배 또는 적어도 10000배 더 많은 카르복실산 및/또는 각각의 카르복실산 에스테르를 형성하도록 유전자 변형될 수 있다. 생성물 형성의 증가는 예를 들어 본 발명의 임의의 측면에 따른 세포 및 야생형 세포를 적합한 영양 배지 내에서 특정 시간 동안 동일한 조건 (동일한 세포 밀도, 동일한 영양 배지, 동일한 배양 조건) 하에 각각 별개로 배양한 후, 영양 배지에서 표적 생성물 (카르복실산)의 양을 결정함으로써 결정될 수 있다.

한 예에서, 미생물은 E₁ 내지 E₁₀으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 발현하는 야생형 유기체일 수 있고, 여기서 E₁은 알콜 데히드로게나제 (adh)이고, E₂는 아세트알데히드 데히드로게나제 (ald)이고, E₃은 아세토아세틸-CoA 티올라제 (thl)이고, E₄는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제 (hbd)이고, E₅는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드라타제 (crt)이고, E₆은 부티릴-CoA 데히드로게나제 (bcd)이고, E₇은 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 (etf)이고, E₈은 조효소 A 트랜스퍼라제 (cat)이고, E₉는 아세테이트 키나제 (ack)이고, E₁₀은 포스포트랜스아세틸라제 (pta)이다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 야생형 미생물은 적어도 E₂, E₃ 및 E₄를 발현할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 야생형 미생물은 적어도 E₄를 발현할 수 있다.

또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 야생형 미생물에 비해 E₁ 내지 E₁₀으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소의 증가된 발현을 갖는 유전자 변형된 유기체일 수 있고, 여기서 E₁은 알콜 데히드로게나제 (adh)이고, E₂는 아세트알데히드 데히드로게나제 (ald)이고, E₃은 아세토아세틸-CoA 티올라제 (thl)이고, E₄는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제 (hbd)이고, E₅는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드라타제 (crt)이고, E₆은 부티릴-CoA 데히드로게나제 (bcd)이고, E₇은 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 (etf)이고, E₈은 조효소 A 트랜스퍼라제 (cat)이고, E₉는 아세테이트 키나제 (ack)이고, E₁₀은 포스포트랜스아세틸라제 (pta)이다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 미생물은 적어도 효소 E₂, E₃ 및 E₄를 발현할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 미생물은 적어도 E₄를 발현할 수 있다. 효소 E₁ 내지 E₁₀은 클로스트리디움 클루이베리로부터 단리될 수 있다.

본원에서 사용되는 문구 "효소의 증가된 활성"은 증가된 세포 내 활성으로 이해되어야 한다. 기본적으로, 효소 활성의 증가는 강한 프로모터를 사용하여 효소를 코딩하는 유전자 서열 또는 유전자 서열들의 카피수를 증가시키거나, 증가된 활성을 갖는 대응하는 효소를 코딩하는 유전자 또는 대립유전자를 사용함으로써, 또는 임의로 이들 수단을 조합함으로써 달성될 수 있다. 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 유전자 변형된 세포 또는 미생물은 예를 들어 원하는 유전자, 이 유전자의 대립 유전자 또는 그의 일부를 포함하는 벡터 및 이들 유전자의 발현을 가능하게 하는 벡터를 사용한 형질전환, 형질도입, 접합 또는 이들 방법의 조합에 의해 생산된다. 이종 발현은 특히 세포의 염색체에 유전자 또는 대립유전자가 통합되거나 또는 염색체 외에서 복제하는 벡터에 의해 달성된다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 세포는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법에 따라 유전적으로 형질전환된다. 특히, 세포는 WO/2009/077461에 개시된 방법에 따라 생산될 수 있다.

본원에서 사용되는 문구 '유전자 변형된 세포가 그의 야생형에 비해 증가된 효소 활성을 갖는다'는 각각의 효소의 활성이 적어도 2, 특히 적어도 10, 보다 특히 적어도 100, 보다 더 특히 적어도 1000, 훨씬 더 특히 적어도 10000배 증가한 것을 의미한다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 효소의 증가된 발현은 야생형 세포 내의 효소의 발현에 비해 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 더 많을 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 효소의 감소된 발현은 야생형 세포 내의 효소의 발현에 비해 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100% 더 적을 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₁은 에탄올 데히드로게나제일 수 있다. 특히, E₁은 알콜 데히드로게나제 1, 알콜 데히드로게나제 2, 알콜 데히드로게나제 3, 알콜 데히드로게나제 B 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 구체적으로, E₁은 CKL_1075, CKL_1077, CKL_1078, CKL_1067, CKL_2967, CKL_2978, CKL_3000, CKL_3425 및 CKL_2065로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 훨씬 더 특히, E₁은 CKL_1075, CKL_1077, CKL_1078 및 CKL_1067로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₂는 아세트알데히드 데히드로게나제일 수 있다. 특히, E₂는 아세트알데히드 데히드로게나제 1, 알콜 데히드로게나제 2 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, E₂는 CKL_1074, CKL_1076 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₂는 CKL_1074 및 CKL_1076으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₃은 아세토아세틸-CoA 티올라제 A1, 아세토아세틸-CoA 티올라제 A2, 아세토아세틸-CoA 티올라제 A3 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, E₃은 CKL_3696, CKL_3697, CKL_3698 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₃은 CKL_3696, CKL_3697 및 CKL_3698로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₄는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제, 1,3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제 2 등일 수 있다. 특히, E₄는 폴리펩티드 CKL_0458, CKL_2795 등에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₄는 폴리펩티드 CKL_0458 또는 CKL_2795에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₅는 3-히드록시부티릴-CoA 데히드라타제, 1,3-히드록시부티릴-CoA 데히드라타제2 및 이들의 조합일 수 있다. 특히, E₅는 CKL_0454, CKL_2527 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₅는 CKL_0454 및 CKL_2527로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₆은 부티릴-CoA 데히드로게나제 1, 부티릴-CoA 데히드로게나제 2 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, E₆은 CKL_0455, CKL_0633 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₆은 CKL_0455 및 CKL_0633으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₇은 전자 전달 플라보단백질 알파 서브유닛 1, 전자 전달 플라보단백질 알파 서브유닛 2, 전자 전달 플라보단백질 베타 서브유닛 1 및 전자 전달 플라보단백질 베타 서브유닛 2로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, E₇은 CKL_3516, CKL_3517, CKL_0456, CKL_0457 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₇은 CKL_3516, CKL_3517, CKL_0456 및 CKL_0457로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₈은 코엔자임 트랜스퍼라제 (cat)일 수 있다. 특히, E₈은 부티릴-CoA: 아세테이트 CoA 트랜스퍼라제, 숙시닐-CoA:코엔자임 A 트랜스퍼라제, 4-히드록시부티릴-CoA: 코엔자임 A 트랜스퍼라제 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 특히, E₈은 CKL_3595, CKL_3016, CKL_3018 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₈은 CKL_3595, CKL_3016 및 CKL_3018로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₉는 아세테이트 키나아제 A (ack A)일 수 있다. 특히, E₉는 CKL_1391 등의 폴리펩티드 서열에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₉는 CKL_1391의 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, E₁₀은 포스포트랜스아세틸라제 (pta)일 수 있다. 특히, E₁₀은 CKL_1390 등의 폴리펩티드 서열에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, E₁₀은 CKL_1390의 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

한 예에서, 야생형 또는 유전자 변형된 미생물은 E₁-E₁₀을 발현한다. 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 야생형 미생물에 비해 E₁, E₂, E₃, E₄, E₅, E₆, E₇, E₈, E₉, E₁₀ 또는 이들의 조합물의 증가된 발현을 가질 수 있다. 한 예에서, 유전자 변형된 미생물은 야생형 미생물에 비해 E₁, E₂, E₃, E₄, E₅, E₆, E₇, E₈, E₉ 및 E₁₀의 증가된 발현을 가질 수 있다. 보다 특히, 임의의 효소 E₁-E₁₀의 조합물은 적어도 하나의 카르복실산이 생산될 수 있도록 유기체에 존재할 수 있다. 한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 유전자 변형된 유기체는 유기체가 적어도 1 또는 2 또는 3종류의 카르복실산을 동시에 생산할 수 있게 하는 임의의 효소 E₁-E₁₀의 조합물을 포함될 수 있다. 예를 들어, 미생물은 헥산산, 부티르산 및/또는 아세트산을 동시에 생산할 수 있다. 유사하게, 미생물은 유기체가 한 종류의 카르복실산 또는 다양한 카르복실산을 생산할 수 있게 하는 효소 E₁-E₁₀의 조합물을 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 위의 모든 경우에, 미생물은 야생형이거나 유전자 변형될 수 있다.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 유전자 변형된 미생물은 야생형 미생물에 비해 히드로게나제 성숙 단백질 및/또는 전자 수송 복합 단백질의 증가된 발현을 갖는다. 특히, 히드로게나제 성숙 단백질 (hyd)은 hydE, hydF 및 hydG로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, hyd는 CKL_0605, CKL_2330, CKL_3829 등으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드에 적어도 50%의 서열 동일성을 포함할 수 있다. 보다 특히, 본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 hyd는 CKL_0605, CKL_2330 및 CKL_3829로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드에 적어도 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 94, 95, 98 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 프로피온산 및 에탄올의 탄소 공급원으로부터 적어도 발레르산 및/또는 헵탄산을 생산할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 아세테이트 및 에탄올의 탄소 공급원으로부터 적어도 부티르산을 생산할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 이소부티르산 및 에탄올의 탄소 공급원으로부터 적어도 이소헥산산을 생산할 수 있다. 추가의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 부티르산 및 에탄올의 탄소 공급원 또는 아세테이트 및 에탄올의 탄소 공급원으로부터 적어도 헥산산을 생산할 수 있다.

본원 전체에 걸쳐, 임의의 데이타베이스 코드는 달리 특정되지 않는 한, NCBI 데이타베이스, 보다 구체적으로 2014년 6월 12일 온라인 버전으로부터 이용가능한 서열을 의미하고, 상기 서열이 뉴클레오티드 서열인 경우 이를 번역하여 얻은 폴리펩티드 서열을 포함한다.

또 다른 예에서, 유전자 변형된 미생물은 임의의 탄소 공급원을 사용하는 말로닐-CoA 의존성 및 말로닐-ACP 비의존성 아실-CoA 대사 경로를 사용하여 카르복실산을 생산할 수 있다. 탄소 공급원은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 탄소 공급원일 수 있다. 특히, 탄소 공급원은 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 덱스트로스, 락토스, 크실로스, 펜토스, 폴리올, 헥소스 및 합성 가스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, 탄소 공급원은 합성 가스일 수 있다.

이 예에 따르면, 유전자 변형된 미생물은

- 야생형 미생물에 비해 아세토아세틸-CoA 신타제 (E₁₁), 케토아실-CoA 신타제 (또는 이롱가제) (E₁₂), 케토아실-CoA 티올라제 (E₁₃), 에노일-CoA 리덕타제 (E₁₄), 케토아실-CoA 리덕타제 (E₁₅) 및 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제 (E₁₆)로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소의 증가된 발현; 및

- 야생형 미생물에 비해 아세토아세틸-CoA 티올라제 (E₁₇)의 감소된 발현

을 갖는다.

특히, 유전자 변형된 미생물은 미생물이 적어도 카르복실산을 생산할 수 있게 하는 적어도 하나의 유전자 돌연변이를 포함한다. 특히, 돌연변이는 미생물이 말로닐-CoA 의존성 및 말로닐-ACP 비의존성 아실-CoA 대사 경로에 의해 적어도 하나의 카르복실산을 생산할 수 있게 할 수 있다. 보다 특히, 야생형 미생물에 비해 미생물에서 말로닐-CoA 의존성 및 말로닐-ACP 비의존성 아실-CoA 대사 경로의 효소 활성이 증가한다.

미생물은 미생물의 말로닐-CoA 의존성 말로닐-ACP 비의존성 아실-CoA 대사 경로에서 증가된 효소 활성을 위해 유전자 변형될 수 있다. 이 경로는 본원에서 말로닐-CoA 의존성이지만 말로닐-ACP 비의존성인 아실-CoA 대사 경로로도 지칭된다. 미생물의 말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 비의존성 아실-CoA 대사 경로의 상기 증가는 아세토아세틸-CoA 티올라제의 발현 또는 활성의 감소와 함께, 아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 신타제 (또는 이롱가제), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제 및/또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를 포함하는 유전자 또는 경로의 증가된 활성 또는 발현에 의해 달성될 수 있다. 별법으로, 미생물의 말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 비의존성 아실-CoA 대사 경로의 증가된 활성은 아세토아세틸-CoA 티올라제의 발현 또는 활성의 감소와 함께, 아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제 및/또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를 포함하는 유전자 또는 경로의 증가된 발현에 의해 달성될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따라 카르복실산을 생산하는 미생물을 유도할 수 있는, 효소 또는 효소 활성에 대한 비-제한적인 유전자 변형의 목록은 US20140051136의 표 2에 제시되어 있다. 특히, 본 발명의 미생물에서 카르복실산 생합성 경로는 전구체 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA를 사용한다.

한 예에서, 상기 폴리펩티드의 감온성 형태를 코딩하는 핵산 서열은 천연 효소 대신에 도입될 수 있고, 이러한 유전자 변형된 미생물이 승온 (이 온도에서, 상기 열불안정성 폴리펩티드는 단백질 구조의 변화 또는 완전한 변성으로 인해 부분적으로 또는 완전히 불활성화됨)에서 배양되는 경우, 화학적 생성물의 증가가 관찰된다. 예를 들어, 이. 콜라이(E. coli)에서, 상기 감온성 돌연변이체 유전자는 특히 fabl^ts(S241F), fabB^ts(A329V) 또는 fabD^ts(W257Q)를 포함할 수 있다. 이러한 예의 대부분에서, 유전자 변형은 모든 바이오매스에 걸쳐 천연 경로를 통한 말로닐-CoA의 카르복실산으로의 감소된 전환, 및 이에 비례하여 말로닐-CoA 의존성 및 말로닐-ACP 비의존성 경로를 통한 탄소 공급원의 카르복실산 또는 카르복실산 유래 생성물을 포함하는 화학적 생성물로의 더 큰 전환이 이루어지도록 말로닐-CoA 이용을 증가시킬 수 있다. 또한, 일부 예에서는 말로닐-CoA 생산을 증가시키는 것과 같은 추가의 유전자 변형이 이루어질 수 있다.

다른 예에서, 효소, 에노일-아실 운반체 단백질 리덕타제 (EC No. 1.3.1.9, 에노일-ACP 리덕타제로도 언급됨)는 말로닐-CoA로부터의 카르복실산 생합성을 위한 주요 효소이다. 에셔리키아 콜라이(Escherichia coli)에서, 상기 효소 Fabl은 fabl 유전자에 의해 코딩된다 (Richard J. Heath et al., 1995).

한 예에서, 피루베이트 옥시다제 유전자의 발현 수준 (Chang et al., 1983, Abdel-Ahmid et al., 2001)은 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물에서 감소되거나 기능적으로 결실될 수 있다. 피루베이트 옥시다제 유전자는 예를 들어, EC 1.2.3.3의 효소를 코딩할 수 있다. 특히, 피루베이트 옥시다제 유전자는 poxB 유전자일 수 있다.

한 예에서, 락테이트 데히드로게나제 유전자 (Mat-Jan et al., Bunch et al., 1997)의 발현 수준은 감소되거나 기능적으로 결실될 수 있다. 일부 예에서, 락테이트 데히드로게나제 유전자는 예를 들어 EC 1.1.1.27의 효소를 코딩한다. 락테이트 데히드로게나제 유전자는 NAD-연결된 발효 D-락테이트 데히드로게나제 유전자일 수 있다. 특히, 락테이트 데히드로게나제 유전자는 IdhA 유전자이다.

한 예에서, 유전자 돌연변이는 피드백 저항성 효소의 증가된 발현을 초래하는 미생물의 적어도 하나의 피드백 저항성 효소 내에 있을 수 있다. 특히, 상기 효소는 판토테네이트 키나제, 피루베이트 데히드로게나제 등일 수 있다. 이. 콜라이에서, 상기 피드백 저항성 돌연변이 유전자는 coaA(R106A) 및/또는 lpd(E354K)를 포함할 수 있다.

추가의 예에서, 미생물의 말로닐-CoA 의존성이지만 말로닐-ACP 비의존성인 아실-CoA 대사 경로의 증가는 아세토아세틸-CoA 티올라제 활성 및/또는 트리거(trigger) 인자 활성 및/또는 세포 분열에 관여하는 분자 샤페론(chaperone)의 활성의 감소를 통해 발생할 수 있다. 한 예에서, 세포는 tig 유전자 내에 유전자 돌연변이를 포함할 수 있다.

한 예에서, 미생물의 유전자 돌연변이는 야생형 세포에 비해 NADPH-의존성 트랜스히드로게나제 경로의 효소 활성을 증가시킬 수 있다. 이 결과는 뉴클레오티드 트랜스히드로게나제 활성을 코딩하는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산 서열의 도입에 의해 발생할 수 있다.

또 다른 예에서, 미생물의 유전자 돌연변이는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법을 통해 카르복실릭 아실-CoA 신테타제 및/또는 리가제 활성의 감소된 발현을 초래할 수 있다.

또 다른 예에서, 미생물의 유전자 돌연변이는 아세틸-CoA 카르복실라제 활성을 갖는 효소의 과다발현을 유도할 수 있다.

한 예에서, 미생물은 시아나제 및/또는 탄산 안히드라제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 이종성 핵산 서열의 도입에 의해 유도되는 세포내 비카르보네이트 수준의 증가를 나타낼 수 있다.

보다 특히, 미생물의 임의의 측면에 따른 유전자 돌연변이는 아실-CoA 티오에스테라제 활성의 증가 및/또는 감소된 수준을 야기할 수 있다. 이 결과는 사슬 길이 특이적 아실-CoA 티오에스테라제 활성 수준을 증가시키고 바람직하지 않은 카르복실산 사슬 길이에 대한 아실-CoA 티오에스테라제 활성을 감소시킴으로써 목적하는 카르복실산 생성물의 사슬 길이 특이성을 증가시킬 수 있다. 한 예에서, 카르복실산 또는 카르복실산 유래 생성물의 증가된 사슬 길이 특이성은 사슬 길이 특이적인 케토아실-CoA 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제 또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제 활성을 개별적으로 또는 조합하여 증가시킴으로써 발생할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물의 유전자 돌연변이는 상기 언급된 효소 목록으로부터 선택된 단지 하나의 효소의 발현의 증가 또는 감소 또는 상기 언급된 효소의 조합물의 발현의 증가 또는 감소를 초래할 수 있다.

또 다른 예에서, 미생물의 유전자 돌연변이는 아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 신타제 (또는 이롱가제), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제, 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제 및 아세토아세틸-CoA 티올라제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소 내에 존재할 수 있다. 보다 특히, 미생물의 유전자 돌연변이는 아세토아세틸-CoA 티올라제의 발현 또는 활성의 감소와 함께, 아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 신타제 (또는 이롱가제), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제 및 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제의 발현을 증가시킬 수 있다. 특히, 에노일-CoA 리덕타제 및/또는 케토아실-CoA 리덕타제는 보조인자 NADH 및/또는 NADPH를 이용할 수 있다.

특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물의 유전자 변형은 효소 아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 신타제 (또는 이롱가제), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제 및/또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제 및 아세토아세틸-CoA 티올라제와 조합하여 표 2에 제시된 임의의 효소를 포함할 수 있고, 여기서 효소 아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 신타제 (또는 이롱가제), 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제 및 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제의 발현 또는 활성은 증가하고, 아세토아세틸-CoA 티올라제의 활성은 감소된다.

또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물에서 말로닐-CoA 의존성, 말로닐-ACP 비의존성 아실-CoA 대사 경로는 아세토아세틸-CoA 티올라제의 발현 또는 활성의 감소와 함께 아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제 및/또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제를 포함하는 유전자 또는 경로의 증가된 발현에 의해 달성될 수 있다.

특히, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물의 유전자 변형은 아세토아세틸-CoA 티올라제의 발현 또는 활성의 감소와 함께 효소 아세토아세틸-CoA 신타제, 케토아실-CoA 티올라제, 에노일-CoA 리덕타제, 케토아실-CoA 리덕타제 및/또는 3-히드록시아실-CoA 데히드라타제와 조합하여 US20140051136의 표 2에 제시된 임의의 효소를 포함할 수 있다.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 효소 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA:ACP 트랜스아실라제 (FabD), β-케토아실-ACP 신타제 III, β-케토아실-ACP 신타제 I (FabB), β-케토아실-ACP 신타제 II (FabF), 3-옥소아실-ACP-신타제 I 및 에노일 ACP 리덕타제와 조합하여 표 2에 제시된 임의의 효소에 유전자 변형을 포함할 수 있다.

보다 특히, 유전자 돌연변이는 야생형 미생물에 비해 아세틸-CoA 카르복실라제, 말로닐-CoA:ACP 트랜스아실라제 (FabD), β-케토아실-ACP 신타제 III, β-케토아실-ACP 신타제 I (FabB), β-케토아실-ACP 신타제 II (FabF), 3-옥소아실-ACP-신타제 I 및 에노일 ACP 리덕타제로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소의 발현을 증가시킬 수 있다. 특히, 유전자 돌연변이는 야생형 미생물에 비해 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물에서 말로닐-CoA 의존성 및 말로닐-ACP 비의존성 아실-CoA 대사 경로의 효소 활성의 증가에 의해 미생물이 카르복실산을 생산할 수 있게 하는, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물에서 하나 초과의 효소의 발현을 증가시킬 수 있다.

하나의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물에서 β-케토아실-ACP 신타제 및 3-옥소아실-ACP-신타제의 발현이 증가할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물에서 β-케토아실-ACP 신타제 및 말로닐-CoA-ACP 트랜스아실라제의 발현이 증가할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물에서 β-케토아실-ACP 신타제 및 에노일 ACP 리덕타제의 발현이 증가할 수 있다. 하나의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물에서 β-케토아실-ACP 신타제, 말로닐-CoA-ACP 트랜스아실라제 및 에노일 ACP 리덕타제의 발현이 증가할 수 있다. 모든 예에서, 에노일 ACP 리덕타제 및/또는 아실-CoA 티오에스테라제의 발현이 증가할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 유전자 변형 유기체는 탄소 공급원으로부터 적어도 하나의 카르복실산을 생산할 수 있는 적어도 하나의 아세트산생성 (acetogenic) 박테리아 및/또는 수소 산화 박테리아일 수 있다. 탄소 공급원은 관련 기술 분야에 공지된 합성 가스 또는 임의의 탄수화물일 수 있다. 특히, 탄소 공급원은 알콜, 알데히드, 글루코스, 수크로스, 프룩토스, 덱스트로스, 락토스, 크실로스, 펜토스, 폴리올, 헥소스, 에탄올 및 합성 가스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 훨씬 더 특히, 탄소 공급원은 합성 가스일 수 있다.

대체로, 가스화 공정으로부터 얻은 합성 가스의 일부는 생성물 수율을 최적화하고 타르의 형성을 피하기 위해 먼저 처리된다. 합성 가스 내의 바람직하지 않은 타르 및 CO의 크래킹은 석회 및/또는 백운석을 사용하여 수행될 수 있다. 이 과정은 예를 들어 문헌 [Reed, 1981]에 상세하게 설명되어 있다.

합성 가스는 적어도 하나의 아세트산생성 박테리아 및/또는 수소 산화 박테리아의 존재 하에 카르복실산으로 전환될 수 있다. 특히, 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 카르복실산은 적어도 하나의 원핵생물에 의해 합성 가스로부터 생산될 수 있다. 특히, 원핵생물은 속 에셔리키아(Escherichia), 예컨대 에셔리키아 콜라이; 속 클로스트리디아(Clostridia), 예컨대 클로스트리디움 륭달리이(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디움 아우토에타노게눔(Clostridium autoethanogenum), 클로스트리디움 카르복시디보란스 또는 클로스트리디움 클루이베리; 속 코리네박테리아(Corynebacteria), 예컨대 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum); 속 쿠프리아비두스(Cupriavidus), 예컨대 쿠프리아비두스 네카토르(Cupriavidus necator) 또는 쿠프리아비두스 메탈리두란스(Cupriavidus metallidurans); 속 슈도모나스(Pseudomonas), 예컨대 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescens), 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida) 또는 슈도모나스 올레아보란스(Pseudomonas oleavorans); 속 델프티아(Delftia), 예컨대 델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans); 속 바실루스(Bacillus), 예컨대 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtillis); 속 락토바실루스(Lactobacillus), 예컨대 락토바실루스 델브루에키이(Lactobacillus delbrueckii); 또는 속 락토코쿠스(Lactococcus), 예컨대 락토코쿠스 락티스(Lactococcus lactis)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또 다른 예에서, 카르복실산은 하나 이상의 진핵생물에 의해 합성 가스로부터 생산될 수 있다. 본 발명의 임의의 측면에서 사용되는 진핵생물은 속 아스페르길루스 (Aspergillus), 예컨대 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger); 속 사카로마이세스(Saccharomyces), 예컨대 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae); 속 피키아(Pichia), 예컨대 피키아 파스토리스(Pichia pastoris); 속 야로위아(Yarrowia), 예컨대 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica); 속 이사첸키아(Issatchenkia), 예컨대 이사텐키아 오리엔탈리스(Issathenkia orientalis); 속 데바리오마이세스(Debaryomyces), 예컨대 데바리오마이세스 한세니이(Debaryomyces hansenii); 속 아륵술라(Arxula), 예컨대 아륵술라 아데노이니보란스(Arxula adenoinivorans); 속 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 예컨대 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)로부터 선택될 수 있다.

카르복실산은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 카르복실산일 수 있다. 특히, 카르복실산은 부탄산 (CH₃(CH₂)₂COOH), 펜탄산 (CH₃(CH₂)₃COOH), 헥산산 (CH₃(CH₂)₄COOH), 헵탄산 (CH₃(CH₂)₅COOH 및 옥탄산 (CH₃(CH₂)₆COOH)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 한 예에서, 카르복실산은 부티르산, 발레르산, 이소발레르산, 헥산산, 이소헥산산, 헵탄산, 이소헵탄산, 옥탄산 및 이소옥탄산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

한 예에서, 카르복실산은 헥산산일 수 있다. 특히, 헥산산은 문헌 [Steinbusch, 2011], [Zhang, 2013], [Van Eerten-Jansen, M. C. A. A, 2013], [Ding H. et al. 2010], [Barker H.A., 1949], [Stadtman E.R., 1950], [Bornstein B. T., et al., 1948] 등에 개시된 임의의 방법에 의해 합성 가스로부터 생산될 수 있다. 훨씬 더 특히, 헥산산은 적어도 클로스트리디움 클루이베리의 존재 하에서 합성 가스로부터 생산될 수 있다.

본원에 사용된 용어 "아세트산생성 박테리아"는 우드-륭달(Wood-Ljungdahl) 경로를 수행할 수 있고, 따라서 CO, CO₂ 및/또는 수소를 아세테이트로 전환시킬 수 있는 미생물을 의미한다. 이러한 미생물은 야생형에서 우드-륭달 경로가 없는 미생물을 포함하지만, 유전자 변형의 결과로서 상기 형질을 획득하였다. 상기 미생물은 이. 콜라이 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 현재, 아세트산생성 박테리아의 21개의 다른 속이 관련 기술 분야에 알려져 있고 (Drake et al., 2006), 이들은 또한 몇몇 클로스트리디아를 포함할 수 있다 (Drake & Kusel, 2005). 상기 박테리아는 수소를 에너지원으로 이용하는 탄소 공급원으로서 이산화탄소 또는 일산화탄소를 사용할 수 있다 (Wood, 1991). 또한, 탄소 공급원으로서 알콜, 알데히드, 카르복실산 및 많은 헥소스가 사용될 수 있다 (Drake et al., 2004). 아세테이트의 형성을 유도하는 환원 경로는 아세틸-CoA 또는 우드-륭달 경로로 언급된다.

특히, 아세트산생성 박테리아는 클로스트리디움 아우토테노게눔(Clostridium autothenogenum) DSMZ 19630, 클로스트리디움 락스달레이(Clostridium ragsdahlei) ATCC no. BAA-622, 클로스트리디움 아우토에타노게눔, 클로스트리디움 카르복시디보란스 DSM 15243, 무렐라(Moorella) sp HUC22-1, 무렐라 테르모아세티쿰(Moorella thermoaceticum), 무렐라 테르모아우토트로피카(Moorella thermoautotrophica), 루미코쿠스 프로둑투스(Rumicoccus productus), 아세토아나에로붐(Acetoanaerobum), 옥소박터 페니기이(Oxobacter pfennigii), 메타노사르시나 바르케리(Methanosarcina barkeri), 메타노사르시나 아세티보란스(Methanosarcina acetivorans), 카르복시도테르무스(Carboxydothermus), 데술포토마쿨룸 쿠츠네초비이(Desulfotomaculum kutznetsovii), 피로코쿠스(Pyrococcus), 펩토스트렙토코쿠스(Peptostreptococcus), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum) ATCC 33266, 클로스트리디움 포르미코아세티쿰(Clostridium formicoaceticum), 클로스트리디움 부티리쿰(Clostridium butyricum), 락토바실루스 델브루키이(Laktobacillus delbrukii), 프로피오니박테리움 아시도프르피리오니시(Propionibacterium acidoprprionici), 프로프리오니스페라 아르보리스(Proprionispera arboris), 아나에로비에르스피릴룸 숙시니프로두센스(Anaerobierspirillum succiniproducens), 박테리오이데스 아밀로필루스(Bacterioides amylophilus), 벡테리오이데스 루미니콜라(Becterioides ruminicola), 테르모아나에로박터 키부이(Thermoanaerobacter kivui), 아세토박테리움 우디이(Acetobacterium woodii), 아세토아나에로비움 노테라(Acetoanaerobium notera), 클로스트리디움 아세티쿰(Clostridium aceticum), 부티리박테리움 메틸로트로피쿰(Butyribacterium methylotrophicum), 무렐라 테르모아세티카(Moorella thermoacetica), 유박테리움 리모숨(Eubacterium limosum), 펩토스트렙토코쿠스 프로둑투스(Peptostreptococcus productus), 클로스트리디움 륭달리이, 클로스트리디움 ATCC 29797 및 클로스트리디움 카르복시디보란스로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 보다 특히, 클로스트리디움 카르복시디보란스의 균주 ATCC BAA-624가 사용될 수 있다. 훨씬 더 특히, 예를 들어 US2007/0275447 및 US2008/0057554에 기재된 바와 같은 클로스트리디움 카르복시디보란스의 "P7" 및 "P11"로 표지된 박테리아 균주가 사용될 수 있다.

또 다른 특히 적합한 박테리아는 클로스트리디움 륭달리이일 수 있다. 한 예에서, 합성 가스로부터 헥산산을 생산할 때, 클로스트리디움 륭달리이 PETC, 클로스트리디움 륭달리이 ERI2, 클로스트리디움 륭달리이 COL 및 클로스트리디움 륭달리이 O-52로 이루어진 군으로부터 선택되는 균주를 사용할 수 있다. 이러한 균주는 예를 들어 WO 98/00558, WO 00/68407, ATCC 49587, ATCC 55988 및 ATCC 55989에 기재되어 있다.

아세트산생성 박테리아는 수소 산화 박테리아와 함께 사용될 수 있다. 한 예에서, 아세트산생성 박테리아 및 수소 산화 박테리아 둘 모두가 합성 가스로부터 카르복실산을 생산하는데 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 아세트산생성 박테리아만이 합성 가스를 대사시켜 합성 가스로부터 카르복실산을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 또 다른 예에서, 수소 산화 박테리아만이 반응에 사용될 수 있다.

수소 산화 박테리아는 아크로모박터(Achromobacter), 아시디티오바실루스(Acidithiobacillus), 아시도보락스(Acidovorax), 알칼리게네스(Alcaligenes), 아나베나(Anabena), 아퀴펙스(Aquifex), 아르트로박터(Arthrobacter), 아조스피릴룸(Azospirillum), 바실루스, 브라디리조븀(Bradyrhizobium), 쿠프리아비두스, 데륵시아(Derxia), 헬리코박터(Helicobacter), 헤르바스피릴룸(Herbaspirillum), 히드로게노박터(Hydrogenobacter), 히드로게노바쿨룸(Hydrogenobaculum), 히드로게노파가(Hydrogenophaga), 히드로게노필루스(Hydrogenophilus), 히드로게노테르무스(Hydrogenothermus), 히드로게노비브리오(Hydrogenovibrio), 이데오넬라(Ideonella) 종 O1,, 키르피디아(Kyrpidia), 메탈로스파에라(Metallosphaera), 메타노브레비박터( Methanobrevibacter), 미오박테리움(Myobacterium), 노카르디아(Nocardia), 올리고트로파(Oligotropha), 파라코쿠스(Paracoccus), 펠로모나스(Pelomonas), 폴라로모나스(Polaromonas), 슈도모나스, 슈도노카르디아(Pseudonocardia), 리조븀(Rhizobium), 로도코쿠스(Rhodococcus), 로도슈도모나스(Rhodopseudomonas), 로도스피릴룸(Rhodospirillum), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 티오캅사(Thiocapsa), 트레포네마(Treponema), 바리오보락스(Variovorax), 크산토박터(Xanthobacter) 및 와우테르시아(Wautersia)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

합성 가스로부터 카르복실산을 생산할 때, 박테리아의 조합이 사용될 수 있다. 하나 이상의 수소 산화 박테리아와 조합하여 하나 초과의 아세트산생성 박테리아가 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 단지 하나 초과의 종류의 아세트산생성 박테리아가 존재할 수 있다. 또 다른 예에서, 단지 하나 초과의 수소 산화 박테리아가 존재할 수 있다.

본 발명의 어느 한 측면에 따른 방법은 전기분해를 수행하기 전에 합성 가스로부터 생산된 카르복실산을 먼저 추출하는 단계를 포함할 수 있다. 카르복실산을 추출하는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 특히, 카르복실산의 추출 방법의 한 예가 문헌 [Byoung, S.J et al. 2013]의 섹션 2.3에 제시되어 있다. 다른 예는 문헌 [Kieun C., et al., 2013]의 섹션 'Extraction Model' 하에 개시된 방법일 수 있다.

이어서, 카르복실산은 콜베 전기분해 또는 광-콜베 조건에 적용될 수 있다. 이 반응은 각각의 알칸, 이산화탄소 및 수소의 형성을 초래할 수 있다. 생산된 알칸은 보다 비혼화성일 수 있다. 이는 본 발명의 임의의 측면에 따라 생산된 알칸의 용이한 분리를 허용한다. 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 고도로 선택적인 것으로 고려 될 수 있고, 생산된 알칸이 고순도를 갖도록 할 수 있다. 한 예에서, 헥산산이 콜베 전기분해에 적용될 수 있을 때, 데칸 (C₁₀H₂₂) 및 수소가 소량의 펜탄과 함께 형성된다. 헥산은 발효 브로쓰와 섞이지 않아 쉽게 분리될 수 있다.

콜베 전기분해 조건은 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 백금 전극, 붕소가 도핑된 화학 기상 증착 다이아몬드 전극과 같은 다양한 전극을 갖는 소노-에멀전 (Wadhawan J.D., et al., 2001), 중합체 전극 등을 포함한다. 콜베 지방산 또는 카르복실산 전기분해와 동의어인 콜베 전기분해는 카르복실산의 산화적 탈카르복실화의 수단이다. 콜베 전기분해는 일반적으로 산 자체보다는 카르복실레이트 음이온과 함께 작용한다.

특히, 콜베 전기분해는 전기화학 전지에서 발생하는 유기 산화환원 반응의 한 예이다. 이 방법은 예를 들어 전극의 전위를 제어할 가능성을 포함하는 몇 가지 이점을 가지고 있다. 이것은 환원제 또는 산화제를 필요로 하지 않기 때문에 간단한 반응으로 간주될 수도 있다. 콜베 전기분해에서, 산화는 화학적으로 일어나지 않고, 전기분해로 일어난다. 알칸은 생성된 라디칼을 하기 반응에 따라 이량체화함으로써 형성된다.

콜베 전기분해는 또한 카르베늄 이온 및 그의 후속 재배열을 유도하는 후속 산화의 용이성에 의존하는 부산물을 생성하는 것으로 알려져 있다:

한 예에서, 콜베 전기분해는 본 발명의 임의의 측면에 따른 방법의 단계 (i)에서 카르복실산 생산에 사용된 발효 브로쓰 자체에 대해 수행된다. 이는 알칸 생성물이 발효 브로쓰로부터 분리되도록 할 수 있다. 이어서, 알칸은 경사 분리, 증류 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 수단에 의해 쉽게 분리될 수 있다. 따라서, 연속 또는 반-연속 공정이 사용될 수 있고, 여기서 합성 가스는 알칸이 형성되는 동안 시스템에 첨가되고, 알칸은 예를 들어 발효 브로쓰로부터 증발 증류, 경사 분리 등을 사용하여 제거될 수 있다. 아세트산생성 박테리아 및/또는 수소 산화 박테리아에 의한 (i) 카르복실산 생산 및 (ii) 생성된 카르복실산에 대한 콜베 전기분해의 단계 둘 모두는 단일 발효기에서 수행될 수 있고, 두 단계 모두 동시에 수행될 수 있다. 단계 (i)과 (ii) 사이에 카르복실산의 분리가 필요하지 않을 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따르면, 콜베 전기분해는 염, 대체로 카르복실산의 알칼리 염, 물 및 2개의 금속 전극의 존재를 포함할 수 있다. 적어도 1V의 전압 및 전류가 두 전극 사이에서 이용가능하다.

또 다른 예에서, 콜베 전기분해는 물 대신 메탄올에서 수행될 수 있다. 백금 전극이 상기 예에서 사용될 수 있다. 탁월한 전환율 및 연속 전기분해가 가능하기 때문에 메탄올의 사용이 유리하게 고려될 수 있다. 전기분해의 선택도는 콜베 전기분해에서 메탄올의 사용으로 개선될 수 있다.

특히, 콜베 전기분해는 전기분해 매질에서 수행될 수 있다. 전기분해 매질은 물, 메탄올 또는 이들 둘의 혼합물일 수 있다. 한 예에서, 이들 둘의 혼합물은 전기분해 매질이 약 0.5 부피% 내지 약 50 부피%의 물을 포함함을 의미할 수 있다.

또 다른 예에서, 발효가 먼저 완료된 후, 콜베 전기분해가 수행되기 전에 카르복실산 이온이 임의로 단리될 수 있다. 카르복실산은 예를 들어 용매로 연속적으로 추출함으로써 발효 브로쓰로부터 제거될 수 있다. 이 경우, 콜베 전기분해 또는 광-콜베 전기분해가 발효가 일어난 후에 발생하기 때문에, 아세트산생성 박테리아는 예를 들어 발효 배지의 경사 분리 또는 여과에 의해 수집될 수 있고, 합성 가스를 함유하는 새로운 배치의 물이 아세트산생성 박테리아와 배합될 수 있다. 따라서, 아세트산생성 박테리아는 재활용될 수 있다. 카르복실산을 포함하는 발효 배지는 콜베 전기분해 또는 광-콜베 전기분해에 적용될 수 있고, 생성되는 생성물 (각각의 알칸, 부산물 알칸, 수소 및 이산화탄소)은 발효 수용액으로부터 쉽게 분리되기 때문에, 이들은 예를 들어 가스 (부산물 알칸, 이산화탄소 및 수소)를 수집하고 이들을 그의 성분들로 분리하고, 각각의 알칸을 경사 분리 또는 증류시킴으로써 단리될 수 있다. 이어서, 수용액은 필요한 경우 발효기로 재순환되거나, 그렇지 않으면 폐기할 수 있다. 이 예에서, 두 단계는 모두 단일 발효기 또는 개별 발효기에서 수행될 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 또한 발효 단계 및 콜베 전기분해 단계 둘 모두로부터 유래된 수소 공급원을 제공할 수 있다. 이 공정에 의해 생성된 수소는 연료 전지에서, 피셔-트롭쉬(Fischer-Tropsch) 반응기에서, 연료로서 또는 수소의 다른 적절한 용도로 사용될 수 있다. 피셔-트롭쉬 합성으로부터 유도된 가솔린, 제트 연료 및 디젤 연료는 모두 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 이 과정에서 생성된 이산화탄소는 조류에 의해 포획되어 트리글리세리드 생산에 사용될 수 있다. 트리글리세리드는 예를 들어 바이오 디젤 연료를 생산하는 데 사용될 수 있다.

하나의 예에서, 하나 이상의 카르복실산은 콜베 전기분해 또는 광-콜베 전기분해 단계에 동시에 적용될 수 있다. 이들 카르복실산은 카르복실산 기가 상기 제시된 바와 같이 부착된 알킬기의 라디칼을 형성할 것이다. 이들 라디칼은 카르복실산의 탈카르복실화에 의해 형성된 임의의 알킬 라디칼과 반응할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 카르복실산은 포화, 불포화 및/또는 분 지형 또는 비분지형일 수 있다. 따라서, 생성되는 알칸은 또한 사용되는 카르복실산에 따라 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 대칭 또는 비대칭일 수 있다. 대칭 알칸은 분자의 절반이 다른 절반의 거울상인 알칸일 수 있다.

특히, 본 발명의 임의의 측면에 따르면, 알칸 및 카르복실산은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(a) 6개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 4개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;

(b) 8개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 5개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;

(c) 8개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 4개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;

(d) 10개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;

(e) 10개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 5개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;

(f) 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;

(g) 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;

(h) 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 9개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 5개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;

(i) 14개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;

(j) 14개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;

(k) 16개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 9개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;

(l) 9개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 5개의 탄소 원자를 갖는 제1 카르복실산 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;

(m) 11개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;

(n) 13개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산; 및

(o) 15개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산.

보다 특히, 알칸 및 카르복실산은 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다:

(a) 10개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;

(b) 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산; 및

(c) 14개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에서 사용되는 카르복실산은 적어도 4개의 탄소 원자 (부탄산/부티르산)를 포함할 수 있다. 부티르산이 콜베 전기분해에 적용될 때, 생성되는 알칸은 적어도 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 헥산일 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 부티르산의 제1 카르복실산 및 프로피온산 (3개의 탄소 원자)의 제2 카르복실산을 포함할 때, 생성되는 알칸은 적어도 5개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 펜탄일 수 있다. 헥산 및 부탄과 같은 부산물이 또한 이 예에서 형성될 수 있다.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에서 사용되는 카르복실산은 적어도 5개의 탄소 원자 (펜탄산/발레르산)를 포함할 수 있다. 펜탄산이 콜베 전기분해에 적용될 때, 생성되는 알칸은 적어도 8개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 옥탄일 수 있다. 추가의 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 펜탄산의 제1 카르복실산 및 프로피온산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 6개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 헥산일 수 있다. 옥탄 및 부탄과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 펜탄산의 제1 카르복실산 및 부탄산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 7개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 헵탄일 수 있다. 옥탄 및 헥산과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에서 사용되는 카르복실산은 적어도 6개의 탄소 원자 (헥산산/카프로산)를 포함할 수 있다. 헥산산이 콜베 전기분해에 적용될 때, 생성되는 알칸은 적어도 10의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 데칸일 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 헥산산의 제1 카르복실산 및 프로피온산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 7개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 헵탄일 수 있다. 데칸 및 부탄과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 헥산산의 제1 카르복실산 및 부탄산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 8개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 옥탄일 수 있다. 데칸 및 헥산과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 헥산산의 제1 카르복실산 및 펜탄산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 9개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 노난일 수 있다. 데칸 및 옥탄과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다.

한 가지 예에서, 본 발명의 임의의 측면에서 사용되는 카르복실산은 적어도 7개의 탄소 원자 (헵탄산/에난트산)를 포함할 수 있다. 헵탄산이 콜베 전기분해에 적용될 때, 생성되는 알칸은 적어도 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 도데칸일 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 헵탄산의 제1 카르복실산 및 프로피온산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 8개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 옥탄일 수 있다. 도데칸 및 부탄과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 헵탄산의 제1 카르복실산 및 부탄산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 9개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 노난일 수 있다. 도데칸 및 헥산과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 헵탄산의 제1 카르복실산 및 펜탄산의 제2 카르복실산을 포함할 때, 생성되는 알칸은 적어도 10개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 데칸일 수 있다. 도데칸 및 옥탄과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 헵탄산의 제1 카르복실산 및 헥산산의 제2 카르복실산을 포함할 때, 생성되는 알칸은 적어도 11개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 운데칸일 수 있다. 도데칸 및 데칸과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다.

한 예에서, 본 발명의 임의의 측면에서 사용되는 카르복실산은 적어도 8개의 탄소 원자 (옥탄산/카프릴산)를 포함할 수 있다. 옥탄산이 콜베 전기분해에 적용될 때, 생성되는 알칸은 적어도 14개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 테트라데칸일 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 옥탄산의 제1 카르복실산 및 프로피온산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 9개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 노난일 수 있다. 테트라데칸 및 부탄과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 옥탄산의 제1 카르복실산 및 부탄산의 제2 카르복실산을 포함할 때 생성되는 알칸은 적어도 10개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 데칸일 수 있다. 테트라데칸 및 헥산과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 옥탄산의 제1 카르복실산 및 펜탄산의 제2 카르복실산을 포함할 때, 생성되는 알칸은 적어도 11개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 운데칸일 수 있다. 테트라데칸 및 옥탄과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 추가의 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 옥탄산의 제1 카르복실산 및 헥산산의 제2 카르복실산을 포함할 때, 생성되는 알칸은 적어도 12개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 도데칸일 수 있다. 테트라데칸 및 데칸과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다. 또 다른 예에서, 카르복실산의 조합물이 적어도 옥탄산의 제1 카르복실산 및 헵탄산의 제2 카르복실산을 포함할 때, 생성되는 알칸은 적어도 13개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 특히, 생성되는 알칸은 트리데칸일 수 있다. 테트라데칸 및 도데칸과 같은 부산물이 또한 상기 예에서 형성될 수 있다.

특히, 본 발명의 임의의 측면에서 사용되는 카르복실산은 적어도 6, 7 또는 14개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 산이 콜베 전기분해에 적용될 때, 생성되는 알칸은 각각 적어도 10, 12 또는 14개의 탄소 원자를 포함할 수 있다. 카르복실산의 조합물이 본 발명의 임의의 측면에서 사용될 수 있다. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 카르복실산이 콜베 전기분해에 적용될 수 있다. 어떤 제1 산이 제2 산과 이량체를 형성하는지에 따라 알칸의 혼합물이 형성될 수 있다. 통상의 기술자는 원하는 알칸 (들)을 생산하기 위해 콜베 전기분해를 수행할 카르복실산을 선택할 수 있을 것이다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 에탄올을 형성하는데 사용된 것과 동일한 출발 물질로부터, 단위 부피당 보다 높은 에너지를 갖는 가솔린 범위 내의 탄화수소를 제공하기 때문에 유리하다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 발효를 수행하기 위해 섬유층 생물 반응기 (FBB)와 같은 고정된 세포 생물 반응기에 보유될 수 있다. 그러나, 임의의 공지된 발효기가 사용될 수 있다. 통상의 기술자는 카르복실산을 수득하기 위해 사용된 방법, 생성된 카르복실산의 종류, 미생물의 성장 조건 등에 기초하여 사용하기에 가장 적합한 발효기를 용이하게 결정할 수 있다.

고정된 세포 생물 반응기의 사용은 박테리아의 재사용을 돕는다. 그러나, 콜베 전기분해 및/또는 광-콜베 전기분해가 발효 배지에서 수행되는 경우에, 알칸은 반응 매질로부터 쉽게 제거될 것이기 때문에, 박테리아의 고정은 상기 경우에 문제가 되지 않을 것이다. 박테리아가 고정되지 않을 때, 박테리아는 예를 들어 원심분리에 의한 박테리아 재활용을 이용하여 단리될 수 있다. 알칸의 지속적인 경사 분리, 증발 제거 또는 추출은 발효 배지가 연속적으로 멸균되고 물 사용을 최소화하도록 할 수 있다. 발효 공정의 논스톱 특성으로 인해, 기질 농도가 항상 최적 수준으로 유지되므로 발효 효율성이 최대화될 수 있다.

발효 중에 형성된 카르복실산(들)은 콜베 전기분해를 통해 알칸으로 전환될 수 있다. 콜베 전기분해는 카르복실레이트 음이온의 애노드 산화 과정이다. 라디칼은 형성된 후, 탈카르복실화된다. 생성되는 라디칼은 다른 라디칼과 조합되어 이량체를 형성한다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 측면에 따라 형성된 카르복실산은 1몰의 이산화탄소를 잃어서 알킬 라디칼을 생산할 수 있고, 그 중 2개가 조합되어 알칸을 형성할 것이다. 콜베 전기분해의 효율은 물에 민감하다. 따라서, 한 예에서, 반응은 (거의) 물이 없는 조건에서 수행될 수 있다.

한 예에서, 콜베 전기분해는 임의로 발효기에 존재할 수 있는 이온성 액체에서 수행될 수 있다. 다른 예에서, 음이온 교환막은 고체 고분자 전해질로서 사용된다 (http://www.pca-gmbh.com/appli/spe.htm). 적합한 전극 시스템의 일례는 모넬(monel) 캐소드 및 백금 시트 또는 백금 거즈 애노드이다.

콜베 전기분해에서, 카르복실산을 알켄, 이산화탄소 및/또는 수소로 전환시키는 제거 반응과 같은 일부 경쟁 반응이 있다. 낮은 온도 (즉, 30-40℃) 및 전극을 통한 높은 유속은 제거보다는 파라핀 형성을 선호하는 경향이 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 알칸은 적어도 하나의 산화된 알칸 생성물을 생산하기 위해 사용될 수 있고, 이 방법은 본 발명의 임의의 측면에 따른 알칸을, 알칸을 각각의 산화된 알칸 생성물로 전환시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 미생물과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 산화된 알칸 생성물은 각각의 알콜, 카르복실산 및 디카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 미생물은 이. 콜라이, 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 야로위아 리폴리티카, 및 슈도모나스 푸티다로 이루어진 군으로부터 선택된다.

하나의 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따른 미생물은 알칸을 각각의 산화된 생성물 중 임의의 하나로 산화시킬 수 있도록 추가로 유전자 변형될 수 있다. 또 다른 예에서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 생산되는 알칸은 알칸의 산화를 수행할 수 있는 제2 미생물에 공급된다.

본 발명의 임의의 하나의 측면에 따른 제2 미생물은 이. 콜라이, 칸디다 트로피칼리스, 야로위아 리폴리티카, 슈도모나스 푸티다 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 특히, 제2 미생물은 알칸을 산화시킬 수 있는 적어도 하나의 효소의 발현을 증가시키도록 유전자 변형될 수 있다. 하나의 예에서, 제2 미생물은 재조합 알칸 히드록실라제를 발현하도록 유전자 변형될 수 있다. 특히, 알칸 히드록실라제는 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제일 수 있다. 용어 "CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제"는 본원에서 알칸 결합 부위 및 알칸을 히드록실화하는 능력을 갖는 페레독신 및 페레독신 리덕타제를 또한 포함하는 3-성분계의 일부인 시토졸 옥시다제를 지칭할 수 있다. 보다 특히, CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제는 알카니보락스 보르쿠멘시스(Alcanivorax borkumensis) SK2로부터의 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 (데이터베이스 코드 YP_691921)와 적어도 80, 90, 95 또는 99%의 폴리펩티드 서열 동일성을 가질 수 있다. 제2 미생물은 알칸 히드록실라제 활성을 추가로 가질 수 있다.

특히, 본원에서 사용되는 용어 "알칸 히드록실라제 활성"은 적어도 6개, 특히 적어도 12개의 탄소 라디칼을 포함하는 알칸 또는 비치환된 선형 알킬 라디칼의 히드록실화를 촉매하는 능력을 나타낸다. 용어 "CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제"는 알칸에 대한 결합 부위, 적어도 5개, 또는 특히 12개의 탄소 라디칼 또는 모노히드록실화된 알칸을 포함하는 비치환된 선형 알킬 라디칼을 포함하고 그의 폴리펩티드 사슬이 모티프 LL(I/L)(V/I)GGNDTTRN을 포함하는 비-막 결합된 옥시다제를 의미한다. 한 예에서, 본원에 사용되는 "CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제"는 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2로부터의 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제 (데이터베이스 코드 YP_691921) 또는 바람직하게는 알칸 히드록실라제 활성을 갖는 변이체이다.

본 발명의 임의의 측면에 따라 사용되는 효소는 재조합 효소일 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "재조합체"는 대응하는 핵산 분자가 천연 세포에 존재하지 않을 수 있고/있거나 유전공학적 방법을 사용하여 생산될 수 있다는 가능성을 의미한다. 한 예에서, 단백질은 대응하는 폴리펩티드가 재조합 핵산에 의해 코딩된다면 재조합으로 불린다. 유사하게, 본원에서 사용되는 재조합 세포는 적어도 하나의 재조합 핵산 또는 하나의 재조합 폴리펩티드를 갖는 세포를 의미한다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 재조합 분자 또는 세포를 생산하기에 적합한 공정을 잘 알고 있다. 재조합 효소는 예를 들어 통상의 기술자에게 공지된 pET- 또는 pGEX-벡터 시스템을 사용하여 과다발현될 수 있다.

일례로, 환원제, 바람직하게는 NADH로부터의 전자를 최적 방법으로 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제를 공급하기 위해, 상기 모노옥시게나제와 기능적으로 상호작용하는 페레독신 리덕타제 및 페레독신과 함께 모노옥시게나제를 발현하는 세포를 사용할 수 있다. 폴리펩티드는 단리될 수 있거나, 전체 세포 촉매를 사용할 때, 동시-발현되거나, 또는 폴리펩티드는 CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제에 N-말단 또는 C-말단이 융합될 수 있다. 통상의 기술자는 환원제가 알칸 기질 및 3개의 폴리펩티드의 존재 하에서 산화되는지 여부에 따라 페레독신 리덕타제 또는 페레독신이 CYP153 패밀리의 제시된 시토크롬 P450 모노옥시게나제와 기능적으로 상호작용하는지의 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 별법으로, 기능적으로 상호작용하는 폴리펩티드의 경우에 반응 속도의 뚜렷한 증가를 나타내는, 문헌 [Scheps, D. et al. (2011)]에 기재된 효소 검정을 사용할 수 있다. 한 예에서, CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제, 페레독신 및 페레독신 리덕타제는 동일한 유기체로부터 유래한다. 또 다른 예에서, 페레독신 리덕타제는 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2의 것 (데이터베이스 코드 YP_691923)일 수 있거나 그의 변이체일 수 있고, 페레독신은 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2의 것 (데이터베이스 코드 YP_691920)일 수 있거나 그의 변이체이고, CYP153 패밀리의 시토크롬 P450 모노옥시게나제는 알카니보락스 보르쿠멘시스 SK2에서 유래된 것 (데이터베이스 코드 YP_691921)일 수도 있거나 그의 변이체이다.

또 다른 예에서, 알칸 히드록실라제는 AlkB 모노옥시게나제일 수 있다. AlkB는 슈도모나스 푸티다 Gpo1 AlkBGT 시스템으로부터 처음 공지된 옥시도리덕타제이고, 또 다른 2개의 폴리펩티드, 즉 AlkG 및 AlkT 의존성이다. AlkT는 NADH로부터 AlkG로 전자를 전달하는 FAD-의존성 루브레독신(rubredoxin) 리덕타제로 특징지어진다. AlkG는 AlkB의 직접 전자 공여자 역할을 수행하는 철 함유 레독스 단백질인 루브레독신이다. 본원에서 사용되는 용어 "AlkB 모노옥시게나제"는 슈도모나스 푸티다 Gpo1 AlkB (데이터베이스 코드: CAB54050.1)의 서열에, 선호도가 증가하는 순서로 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 96%, 98% 또는 99%의 서열 상동성을 갖는 폴리펩티드를 의미할 수 있고, 이 폴리펩티드는 알칸을 산화시킬 수 있다. 한 예에서, AlkB 모노옥시게나제는 슈도모나스 푸티다 Gpo1 AlkG (CAB54052.1) 및 AlkT (CAB54063.1) 폴리펩티드와 함께 기능적으로 작용하는 알칸-산화 옥시도리덕타제일 수 있다. AlkB 알칸 히드록실라제에 전자를 최적으로 공급하기 위해, 모노옥시게나제를, 그와 기능적으로 상호작용하는 보조 단백질, 특히 슈도모나스 푸티다 Gpo1 AlkG (CAB54052.1) 및 AlkT (CAB54063.1) 폴리펩티드로부터의 AlkG 및/또는 AlkT 또는 이들의 각각의 변이체와 함께 발현하는 세포가 사용될 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용되는 제2 미생물이 기질을 산화시키는 능력은 알칸 히드록실라제의 대안으로서 또는 그의 추가로 알콜 데히드로게나제를 발현하는 제2 미생물에 의해 향상될 수 있다. 특히, 본원에서 사용되는 용어 "알콜 데히드로게나제"는 알데히드 또는 케톤을 대응하는 1차 또는 2차 알콜로 산화시키는 효소를 의미한다. 그 예는 랄스토니아 유트로파(Ralstonia eutropha) (ACB78191.1), 락토바실루스 브레비스(Lactobacillus brevis) (YP_795183.1), 말 간에서 유래된 락토바실루스 케피리(Lactobacillus kefiri) (ACF95832.1), 파라코쿠스 판토트로푸스(Paracoccus pantotrophus) (ACB78182.1) 및 스핑고븀 야노이쿠야에(Sphingobium yanoikuyae) (EU427523.1) 및 이들의 각각의 변이체의 알콜 데히드로게나제를 포함한다. 따라서, 본 발명의 임의의 측면에 따라 생산된 알칸은 적어도 하나의 산화된 알칸 생성물을 생산하기 위해 제2 미생물에 대한 탄소 공급원으로서 쉽게 사용될 수 있다. 이 방법은 산화된 생성물을 생산하기 위해 보다 순수한 알칸 공급원이 사용되어, 산화된 알칸 생성물을 생산하고 부산물은 덜 형성되는 보다 특이적인 공정이 수행되도록 할 수 있다.

본 발명의 임의의 측면에 따른 방법은 알칸을 단리하는 추가 단계를 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 임의의 측면에 따라 생산된 알칸은 반응 혼합물과 상이한 상일 수 있다. 따라서, 알칸의 단리는 통상의 기술자에게 공지된 간단한 분리 수단, 예를 들어 원심분리 및 이어서 경사 분리에 의해 이루어질 수 있다. 한 예에서, 적어도 하나의 올레핀이 카르복실산의 콜베 전기분해 후에 생성된다. 또 다른 예에서, 알칸은 가솔린 또는 가솔린 조성물의 성분을 형성하기 위해 접촉 개질(catalytic reforming) 및/또는 이성체화에 추가로 적용된다.

실시예

상기 내용은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 이해되는 바와 같이 청구범위의 범위를 벗어나지 않으면서 설계, 구성 또는 작동의 변경 또는 변형이 적용될 수 있는 바람직한 실시양태를 설명한다. 예를 들어, 이러한 변경은 청구범위의 범위에 포함되는 것으로 의도된다.

실시예 1

아세테이트 및 에탄올로부터 부티르산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리

에탄올 및 아세테이트의 부티르산으로의 생체 전환을 위해, 박테리아 클로스트리디움 클루이베리가 사용되었다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개를 사용하여 밀폐할 수 있는 내압 유리병 내에서 혐기 조건 하에서 수행하였다.

예비 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 DMSZ52 배지 (pH = 7.0; 10 g/L K-아세테이트, 0.31 g/L K₂HPO₄, 0.23 g/L KH₂PO₄, 0.25 g/l NH₄Cl, 0.20 g/l MgSO₄x7 H₂O, 1 g/L 효모 추출물, 0.50 mg/L 레사주린, 10 ㎕/l HCl (25%, 7.7 M), 1.5 mg/L FeCl₂x4H₂O, 70 ㎍/L ZnCl₂x7H₂O, 100 ㎍/L MnCl₂x4H₂O, 6 ㎍/L H₃BO₃, 190 ㎍/L CoCl₂x6H₂O, 2 ㎍/L CuCl₂x6H₂O, 24 ㎍/L NiCl₂x6H₂O, 36 ㎍/L Na₂MO₄x2H₂O, 0.5 mg/L NaOH, 3 ㎍/L Na₂SeO₃x5H₂O, 4 ㎍/L Na₂WO₄x2H₂O, 100 ㎍/L 비타민 B12, 80 ㎍/L p-아미노벤조산, 20 ㎍/L D(+) 비오틴, 200 ㎍/L 니코틴산, 100 ㎍/L D-Ca-판토테네이트, 300 ㎍/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 ㎍/l 티아민-HClx2H₂O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO₃, 0.25 g/L 시스테인-HClxH₂O, 0.25 g/L Na₂Sx9H₂O)에 클로스트리디움 클루이베리의 냉동 동결배양액 5 ml를 접종하고, 37℃에서 144 h 동안 OD_{600 nm} > 0.2로 인큐베이팅하였다.

주 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 신선한 DMSZ52 배지에 예비 배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD_{600 nm}로 접종하였다. 이 성장하는 배양물을 37℃에서 27 h 동안 OD_{600 nm} >0.6으로 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리하고, 생산 완충제 (pH 6.0; 8.32 g/L K-아세테이트, 0.5 g/l 에탄올)로 세척하고, 다시 원심분리하였다.

생산 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 생산 완충제에 주 배양물로부터 세척된 세포를 0.2의 OD_{600 nm}까지 접종하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 진탕 수조에서 37℃ 및 100 rpm에서 71 h 동안 인큐베이팅하였다. 배양 기간의 시작 및 종료시에 샘플을 채취하였다. 이들을 광학 밀도, pH 및 상이한 분석물 (NMR에 의해 시험됨)에 대해 시험하였다.

결과는 생산 단계에서 아세테이트의 양이 5.5 g/l에서 5.0 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 0.5 g/l에서 0.0 g/l로 감소했음을 보여주었다. 또한, 부티르산의 농도는 0.05 g/l에서 0.8 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.005 g/l에서 0.1 g/l로 증가하였다.

실시예 2

아세테이트 및 에탄올로부터 헥산산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리

에탄올 및 아세테이트의 헥산산으로의 생체 전환을 위해, 박테리아 클로스트리디움 클루이베리가 사용되었다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개를 사용하여 밀폐할 수 있는 내압 유리병 내에서 혐기 조건 하에서 수행하였다.

주 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 신선한 DMSZ52 배지에 예비 배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD_{600 nm}로 접종하였다. 이 성장하는 배양물을 37℃에서 27 h 동안 OD_{600 nm} >0.6으로 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리하고, 생산 완충제 (pH 6.0; 0.832 g/L K-아세테이트, 5.0 g/l 에탄올)로 세척하고, 다시 원심분리하였다.

결과는 생산 단계에서 아세테이트의 양이 0.54 g/l에서 0.03 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 5.6 g/l에서 4.9 g/l로 감소했음을 보여주었다. 또한, 부티르산의 농도는 0.05 g/l에서 0.28 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.03 g/l에서 0.79 g/l로 증가하였다.

실시예 3

부티르산 및 에탄올로부터 헥산산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리

에탄올 및 부티르산의 헥산산으로의 생체 전환을 위해, 박테리아 클로스트리디움 클루이베리가 사용되었다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개를 사용하여 밀폐할 수 있는 내압 유리병 내에서 혐기 조건 하에서 수행하였다.

예비 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 DMSZ52 배지 (pH = 7.0; 10 g/L K-아세테이트, 0.31 g/L K₂HPO₄, 0.23 g/L KH₂PO₄, 0.25 g/l NH₄Cl, 0.20 g/l MgSO₄x7 H₂O, 1 g/L 효모 추출물, 0.50 mg/L 레사주린, 10 ㎕/l HCl (25%, 7.7 M), 1.5 mg/L FeCl₂x4H₂O, 70 ㎍/L ZnCl₂x7H₂O, 100 ㎍/L MnCl₂x4H₂O, 6 ㎍/L H₃BO₃, 190 ㎍/L CoCl₂x6H₂O, 2 ㎍/L CuCl₂x6H₂O, 24 ㎍/L NiCl₂x6H₂O, 36 ㎍/L Na₂MO₄x2H₂O, 0.5 mg/L NaOH, 3 ㎍/L Na₂SeO₃x5H₂O, 4 ㎍/L Na₂WO₄x2H₂O, 100 ㎍/L 비타민 B12, 80 ㎍/L p-아미노벤조산, 20 ㎍/L D(+) 비오틴, 200 ㎍/L 니코틴산, 100 ㎍/L D-Ca-판토테네이트, 300 ㎍/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 ㎍/l 티아민-HClx2H₂O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO₃, 0.25 g/L 시스테인-HClxH₂O, 0.25 g/L Na₂Sx9H₂O)에 클로스트리디움 클루이베리의 냉동 동결배양액 5 ml를 접종하고, 37℃에서 144 h 동안 OD_{600 nm} > 0.3로 인큐베이팅하였다.

주 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 신선한 DMSZ52 배지에 예비 배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD_{600 nm}로 접종하였다. 이 성장하는 배양물을 37℃에서 25 h 동안 OD_{600 nm} >0.4로 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리하고, 생산 완충제 (pH 6.16; 4.16 g/L K-아세테이트, 10.0 g/l 에탄올)로 세척하고, 다시 원심분리하였다.

생산 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 생산 완충제에 주 배양물로부터 세척된 세포를 0.2의 OD_{600 nm}까지 접종하였다. 1차 배양에서는, 초기에 1.0 g/l의 부티르산을 생산 완충제에 첨가하였고, 2차 배양에서는 부티르산을 생산 완충제에 첨가하지 않았다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 진탕 수조에서 37℃ 및 100 rpm에서 71 h 동안 인큐베이팅하였다. 배양 기간의 시작 및 종료시에 샘플을 채취하였다. 이들을 광학 밀도, pH 및 상이한 분석물 (NMR에 의해 시험됨)에 대해 시험하였다.

결과는 부티르산 보충된 배양물의 생산 단계에서 아세테이트의 양이 3.1 g/l에서 1.1 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 10.6 g/l에서 7.5 g/l로 감소했음을 보여주었다. 또한, 부티르산의 농도는 1.2 g/l에서 2.2 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.04 g/l에서 2.30 g/l로 증가하였다.

비-보충된 배양물의 생산 단계에서, 아세테이트 양은 3.0 g/l에서 1.3 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양은 10.2 g/l에서 8.2 g/l로 감소했다. 또한, 부티르산의 농도는 0.1 g/l에서 1.7 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.01 g/l에서 1.40 g/l로 증가하였다.

실시예 4

이소부티르산 및 에탄올로부터 이소헥산산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리

에탄올 및 이소부티르산의 이소헥산산으로의 생체 전환을 위해, 박테리아 클로스트리디움 클루이베리가 사용되었다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개를 사용하여 밀폐할 수 있는 내압 유리병 내에서 혐기 조건 하에서 수행하였다.

예비 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 DMSZ52 배지 (pH = 7.0; 10 g/L K-아세테이트, 0.31 g/L K₂HPO₄, 0.23 g/L KH₂PO₄, 0.25 g/l NH₄Cl, 0.20 g/l MgSO₄x7 H₂O, 1 g/L 효모 추출물, 0.50 mg/L 레사주린, 10 ㎕/l HCl (25%, 7.7 M), 1.5 mg/L FeCl₂x4H₂O, 70 ㎍/L ZnCl₂x7H₂O, 100 ㎍/L MnCl₂x4H₂O, 6 ㎍/L H₃BO₃, 190 ㎍/L CoCl₂x6H₂O, 2 ㎍/L CuCl₂x6H₂O, 24 ㎍/L NiCl₂x6H₂O, 36 ㎍/L Na₂MO₄x2H₂O, 0.5 mg/L NaOH, 3 ㎍/L Na₂SeO₃x5H₂O, 4 ㎍/L Na₂WO₄x2H₂O, 100 ㎍/L 비타민 B12, 80 ㎍/L p-아미노벤조산, 20 ㎍/L D(+) 비오틴, 200 ㎍/L 니코틴산, 100 ㎍/L D-Ca-판토테네이트, 300 ㎍/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 ㎍/l 티아민-HClx2H₂O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO₃, 0.25 g/L 시스테인-HClxH₂O, 0.25 g/L Na₂Sx9H₂O)에 클로스트리디움 클루이베리의 냉동 동결배양액 5 ml를 접종하고, 37℃에서 144 h 동안 OD_{600 nm} > 0.3으로 인큐베이팅하였다.

생산 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 생산 완충제에 주 배양물로부터 세척된 세포를 0.2의 OD_{600 nm}까지 접종하였다. 처음에는, 1.0 g/l 이소부티르산을 생산 완충제에 첨가하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 진탕 수조에서 37℃ 및 100 rpm에서 71 h 동안 인큐베이팅하였다. 배양 기간의 시작 및 종료시에 샘플을 채취하였다. 이들을 광학 밀도, pH 및 상이한 분석물 (NMR에 의해 시험됨)에 대해 시험하였다.

결과는 생산 단계에서 아세테이트의 양이 3.7 g/l에서 1.0 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 12.7 g/l에서 7.8 g/l로 감소하였고, 이소부티르산의 양은 1.30 g/l에서 0.98 g/l로 감소했음을 보여주었다. 또한, 부티르산의 농도는 0.1 g/l에서 1.6 g/l로 증가하였고, 헥산산의 농도는 0.02 g/l에서 1.80 g/l로 증가하였고, 이소헥산산의 농도는 0.00 g/l에서 0.07 g/l로 증가하였다.

실시예 5

프로피온산 및 에탄올로부터 발레르산 및 헵탄산을 형성하는 클로스트리디움 클루이베리

에탄올 및 프로피온산의 발레르산 및 헵탄산으로의 생체 전환을 위해, 박테리아 클로스트리디움 클루이베리가 사용되었다. 모든 배양 단계는 부틸 고무 마개를 사용하여 밀폐할 수 있는 내압 유리병 내에서 혐기 조건 하에서 수행하였다.

예비 배양을 위해, 250 ml 병 내의 100 ml의 DMSZ52 배지 (pH = 7.0; 10 g/L K-아세테이트, 0.31 g/L K₂HPO₄, 0.23 g/L KH₂PO₄, 0.25 g/l NH₄Cl, 0.20 g/l MgSO₄x7 H₂O, 1 g/L 효모 추출물, 0.50 mg/L 레사주린, 10 ㎕/l HCl (25%, 7.7 M), 1.5 mg/L FeCl₂x4H₂O, 70 ㎍/L ZnCl₂x7H₂O, 100 ㎍/L MnCl₂x4H₂O, 6 ㎍/L H₃BO₃, 190 ㎍/L CoCl₂x6H₂O, 2 ㎍/L CuCl₂x6H₂O, 24 ㎍/L NiCl₂x6H₂O, 36 ㎍/L Na₂MO₄x2H₂O, 0.5 mg/L NaOH, 3 ㎍/L Na₂SeO₃x5H₂O, 4 ㎍/L Na₂WO₄x2H₂O, 100 ㎍/L 비타민 B12, 80 ㎍/L p-아미노벤조산, 20 ㎍/L D(+) 비오틴, 200 ㎍/L 니코틴산, 100 ㎍/L D-Ca-판토테네이트, 300 ㎍/L 피리독신 히드로클로라이드, 200 ㎍/l 티아민-HClx2H₂O, 20 ml/L 에탄올, 2.5 g/L NaHCO₃, 0.25 g/L 시스테인-HClxH₂O, 0.25 g/L Na₂Sx9H₂O)에 클로스트리디움 클루이베리의 냉동 동결배양액 5 ml를 접종하고, 37℃에서 119 h 동안 OD_{600 nm} > 0.2로 인큐베이팅하였다.

주 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 신선한 DMSZ52 배지에 예비 배양물로부터 원심분리된 세포를 0.1의 OD_{600 nm}로 접종하였다. 이 성장하는 배양물을 37℃에서 21 h 동안 OD_{600 nm} >0.4로 인큐베이팅하였다. 이어서, 세포 현탁액을 원심분리하고, 생산 완충제 (pH 6.0; 1.0 g/L 프로피온산, 2.5 g/l 에탄올)로 세척하고, 다시 원심분리하였다.

생산 배양을 위해, 500 ml 병 내의 200 ml의 생산 완충제에 주 배양물로부터 세척된 세포를 0.2의 OD_{600 nm}까지 접종하였다. 배양물을 부틸 고무 마개로 막고, 개방 진탕 수조에서 37℃ 및 100 rpm에서 68 h 동안 인큐베이팅하였다. 배양 기간의 시작 및 종료시에 샘플을 채취하였다. 이들을 광학 밀도, pH 및 상이한 분석물 (NMR에 의해 시험됨)에 대해 시험하였다.

결과는 생산 단계에서 프로피온산의 양이 1.08 g/l에서 0.04 g/l로 감소하였고, 에탄올의 양이 2.5 g/l에서 1.5 g/l로 감소하였음을 보여주었다. 또한, 발레르산의 농도는 0.05 g/l에서 0.95 g/l로 증가하였고, 헵탄산의 농도는 0.00 g/l에서 0.29 g/l로 증가하였다.

실시예 6

물에서 헥산산의 콜베 전기분해

0.5 eq KOH를 사용한 1 M 헥산산의 콜베-전기분해는 백금 전극으로 물에서 수행되었다. 3구 플라스크를 냉각 트랩에 연결하고, 발생한 가스는 -80℃에서 응축시켰다. 실험의 목적은 질량 균형을 가능한 한 정확하게 얻는 것이었다. 헥산산은 c = 1 M에서 물에 완전히 용해되지는 않기 때문에, 변환 시작시에 두 개의 층이 관찰될 수 있었다. 공정 중에 반응 혼합물은 유백색 (거의 단 하나의 층)으로 변하였고, 종료시에 2개의 층이 다시 관찰될 수 있었다. 휘발성 생성물과의 응축상, 수성층 및 반응 혼합물의 유기층의 3상 모두를 GC-MS 및 ¹H-NMR로 분석하였다. 전기분해의 파라미터 및 결과는 표 1에 제시된다.

<표 1> 물 중에서의 헥산산의 콜베 전기분해.

* 휘발성 분획은 응축되고, CDCl₃ 또는 C₆D₆에 포획되었다.

실시예 7

물에서 헥산산의 콜베 전기분해. 출발 물질의 농도에 대한 의존성.

상이한 농도의 물 내의 헥산산을 사용한 일련의 실험을 수행하였다. 반응 용기를 다시 냉각 트랩에 연결하여 휘발성 화합물을 수집하였다. 반응이 완료되면, 수성층을 ¹H-NMR로 분석한 후, 층을 분리하여 분석하거나 (고농도에서의 반응의 경우) 또는 2개로 분할하여 절반은 GC-MS 분석을 위해 펜탄으로 추출하고, 나머지 절반은 ¹H-NMR 분석을 위해 CDCl₃ 또는 C₆D₆로 추출하였다. 그 결과를 하기 표 2에 제시한다. 모든 실험은 백금 전극을 사용하여 0.5 eq의 KOH (pH ~5)를 함유하는 헥산산으로 수행하였다. 헥산산의 초기 농도 c < 1 M에서, 콜베 전기분해는 더 이상 선택적이지 않았고, 경쟁 공정의 새로운 생성물이 더 중요해졌다. 알데히드 및 에스테르의 형성은 모든 농도에서 관찰되었다.

<표 2> 다양한 농도의 물 중에서의 헥산산의 콜베 전기분해.

* 휘발성 분획은 응축되고, CDCl₃ 또는 C₆D₆에 포획되었다.

실시예 8

물에서 헵탄산의 콜베 전기분해

0.5 eq KOH를 사용한 1 M 헵탄산의 콜베-전기분해는 3구 플라스크에서 백금 전기분해를 사용하여 물에서 수행되었다. 실험의 목적은 질량 균형을 가능한 한 정확하게 얻는 것이었다. 헵탄산은 c = 1 M에서 물에 완전히 용해되지는 않기 때문에, 전기분해 시작시에 두 개의 층이 관찰될 수 있었다. 공정 중에 반응 혼합물은 유백색 (거의 단 하나의 층)으로 변하였고, 종료시에 2개의 층이 다시 관찰될 수 있었다. 약 90%의 전환 후, 전기분해를 중단하였다. 분리된 유기층의 수율은 표 3에 나타낸 바와 같이 79%이었다. 수성층 및 유기층을 GC-MS 및 ¹H-NMR로 분석하였다. 유기층은 주로 도데칸 및 옥탄을 갖고, 다른 결정되지 않은 알칸 및 미량의 알켄을 가졌다. 수성층은 주로 미반응 헵탄산 및 콜베-생성물로도 설명될 수 있는 미량의 더 짧은 카르복실산 (예를 들어, 헥산산), 알콜 (예를 들어, 펜탄올) 및 에스테르로 구성되었다.

<표 3> 물 중에서의 헵탄산의 콜베 전기분해.

실시예 9

메탄올에서 헥산산의 콜베 전기분해.

0.5 eq의 NaOMe를 사용한 1M 헥산산의 콜베 전기분해는 높은 전류 밀도에서 백금 전극으로 메탄올 내에서 수행하였다. 이러한 조건은 수 분 내에 전극의 패시베이션(passivation)을 초래하고, 결국 전기분해 속도를 느리게 만들었다. 전극의 임의의 패시베이션을 피하기 위해, 전극의 자동 극성 반전을 사용하여 우수한 전환율 및 연속적인 전기분해가 이루어졌다. 상기 종류의 처리는 메탄올에서 높은 데칸 선택성을 유도하였다. 본 실시예는 동일한 조건 하에서 전기분해의 선택성이 물보다 메탄올에서 훨씬 더 높음을 보여주었다. 반응이 종결되면, 전해질을 ¹H-NMR로 분석하였고, 그 결과를 표 4에 나타내었다.

<표 4> 메탄올 중에서의 헵탄산의 콜베 전기분해.

참고 문헌

Wadhawan J.D., et al., 2001, Pure and Applied Chemistry, 73(12):1947-1955, Steinbusch, 2011, Zhang, 2013, Van Eerten-Jansen, M. C. A. A, 2013, Ding H. et al, 2010, Barker H.A., 1949, Stadtman E.R., 1950, Bornstein B. T., et al., 1948, Byoung, S.J et al. 2013, Seedorf, H., et al., 2008, PNAS 105 (6): 2128-2133, 'Extraction Model' in Kieun C., et al., 2013, Mat-Jan et al., Bunch et al., 1997, Richard J. Heath et al., 1995, Chang et al., 1983, Abdel-Ahmid et al., 2001, Reed, 1981, Drake et al., 2006, Drake & Kusel, 2005, Wood, 1991, Drake et al., 2004, Scheps, D., Malca, H., Hoffmann, B., Nestl, B. M, and Hauer, B. (2011) Org. Biomol. Chem., 9, 6727, US20140051136, WO/2009/077461, WO 98/00558, WO 00/68407, WO2007/0275447, US2008/0057554

Claims

- 적어도 하나의 미생물을 이용하여 탄소 공급원으로부터 적어도 하나의 카르복실산을 생산하고,
- 카르복실산에 대해 콜베 전기분해를 수행하여 알칸을 생산하는 것
을 포함하고, 여기서, 알칸은 적어도 6개의 탄소 원자를 포함하고, 카르복실산은 적어도 4개의 탄소 원자를 포함하고, 탄소 공급원은 에탄올, 아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레레이트, 헥사노에이트 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되고, 미생물은 에탄올-카르복실레이트 발효를 이용하여 카르복실산을 생산할 수 있는 것인, 적어도 하나의 알칸의 생산 방법.
제1항에 있어서, 미생물이 알콜 데히드로게나제 E₁, 아세트알데히드 데히드로게나제 E₂, 아세토아세틸-CoA 티올라제 E₃, 3-히드록시부티릴-CoA 데히드로게나제 E₄, 3-히드록시부티릴-CoA 데히드라타제 E₅, 부티릴-CoA 데히드로게나제 E₆, 전자 전달 플라보단백질 서브유닛 E₇, 조효소 A 트랜스퍼라제 E₈, 아세테이트 키나제 E₉ 및 포스포트랜스아세틸라제 E₁₀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소를 발현하는 것인 방법.
제2항에 있어서, 미생물이 E₁, E₂, E₃, E₄, E₅, E₆, E₇, E₈, E₉ 및 E₁₀을 발현하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri) 및 씨.카르복시디보란스(C. Carboxidivorans)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 히드로게나제 성숙 단백질 및/또는 전자 수송 복합 단백질을 발현하는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 미생물이 유전자 변형되고, 유전자 변형된 미생물이 야생형 미생물에 비해 E₁, E₂, E₃, E₄, E₅, E₆, E₇, E₈, E₉, E₁₀, 히드로게나제 성숙 단백질 및/또는 전자 수송 복합 단백질로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 효소의 증가된 발현을 갖는 것인 방법.
제6항에 있어서, 유전자 변형된 미생물이 야생형 미생물에 비해 E₁, E₂, E₃, E₄, E₅, E₆, E₇, E₈, E₉ 및 E₁₀의 증가된 발현을 갖는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 알칸이 분지형 또는 비분지형인 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 알칸 및 카르복실산이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
(a) 6개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 4개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;
(b) 8개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 5개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;
(c) 8개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 4개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;
(d) 10개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;
(e) 10개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 5개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;
(f) 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;
(g) 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;
(h) 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 9개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 5개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;
(i) 14개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;
(j) 14개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;
(k) 9개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 5개의 탄소 원자를 갖는 제1 카르복실산 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산;
(l) 11개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산; 및
(m) 13개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 제1 카르복실산 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 제2 카르복실산.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 알칸 및 카르복실산이 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법:
(a) 10개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 6개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산;
(b) 12개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 7개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산; 및
(c) 14개의 탄소 원자를 포함하는 알칸 및 8개의 탄소 원자를 포함하는 카르복실산.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 알칸을 단리하는 추가의 단계를 포함하는 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 콜베 전기분해를 메탄올을 포함하는 전기분해 매질에서 수행하는 것인 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항의 방법에 따라 생산된 알칼을, 알칸을 각각의 산화된 알칸 생성물로 산화시킬 수 있는 적어도 하나의 제2 미생물과 접촉시키는 것을 포함하고, 여기서 산화된 알칸 생성물은 각각의 알콜, 카르복실산 및 디카르복실산으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 제2 미생물은 이. 콜라이(E. coli), 칸디다 트로피칼리스(Candida tropicalis), 야로위아 리폴리티카(Yarrowia lipolytica) 및 슈도모나스 푸티다(Pseudomonas putida)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 적어도 하나의 산화된 알칸 생성물의 생산 방법.