CN106795522A - 定向克隆的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了将插入DNA片段在靶载体中定向克隆的方法。该方法包含将靶载体、插入DNA片段、限制酶和DNA连接酶混合以产生重组DNA分子的步骤。

Description

定向克隆的方法
序列表
与本申请相关的序列表以代替纸制副本的文本格式来提供，并且在此以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为Sequence_listing_SDS1_0004PCT.txt(序列表SDS1_0004PCT)。该文本文件约为27KB，创建于2014年9月15日。
技术领域
本发明涉及重组技术。具体来说，本发明涉及定向克隆的方法。
背景技术
分子克隆是一种用来构建重组DNA分子的方法。形成重组DNA的组分包括克隆载体、小DNA片段、复合酶和活细胞。克隆载体为在活细胞内进行复制的DNA分子。小DNA片段含有将被克隆的基因。在克隆过程中，使用不同的方法将基因和载体结合以形成重组DNA分子。然后，将重组DNA分子转化为活细胞，然后对活细胞进行筛选和复制。然而，传统的分子克隆技术涉及不同条件下的多种方法。因此，需要一种简单、高效、便宜的将DNA片段分子克隆至靶分子的方法。
发明内容
本文描述了将插入DNA片段(insert DNA segment)定向克隆至载体的方法。不同的实施例包括提供靶载体和插入脱氧核糖核酸(DNA)片段。可以在容器中将靶载体和插入DNA片段与一定量的限制酶和一定量的DNA连接酶混合，以在第一温度下切割靶细胞并在第二温度下将插入DNA片段的至少一部分连接至靶细胞。在一些实施例中，第一温度与第二温度相同或基本相同。
在一些实施例中，可以将插入DNA片段连接至靶载体，以产生重组DNA分子，该重组DNA分子包括靶载体的至少一部分和插入DNA片段的至少一部分。在这些例子中，重组DNA为表达载体。在一些实施例中，插入DNA片段可以包括插入DNA片段的至少一部分和包括限制酶识别位点的DNA序列。在一些实施例中，靶载体可以包括限制酶(例如，II型限制酶)的识别位点。
在一些实施例中，当混合靶载体、插入DNA片段、一定量的限制酶、一定量的DNA连接酶的时候，容器中的靶载体分子基本上为闭环质粒。在一些实施例中，在单个容器内，将靶载体、插入DNA片段、一定量的限制酶和一定量的DNA连接酶混合预定的时间段。例如，预定的时间段可以包括从约1分钟至20分钟的时间段。
在一些实施例中，限制酶可以包括II型限制酶。在这些例子中，II型限制酶可以包括BsaI、BbsI、BsmBI、AarI、Alw26I或LguI的至少一种。在一些实施例中，DNA连接酶可以包括T4 DNA连接酶或大肠杆菌DNA连接酶的至少一种。
在一些实施例中，插入DNA片段可以包括聚合酶链式反应(PCR)产物。在一些实施例中，第一温度和/或第一温度为预定温度。例如，预定温度可以在约16℃至约37℃的范围内。
提供了本概述从而以简化的形式引入将在以下详细描述中进一步描述的概念选择。本概述并非旨在识别出要求保护的主题的所有关键特征或必要特征，并非旨在用于限定要求保护的主题的范围。
附图说明
参考附图来对该详细说明进行描述。
图1为显示了DNA片段定向克隆至载体的示例性的流程图。
图2为显示了示例性质粒的图。
具体实施方式
定义
除另有定义，本文中所使用的所有科技术语与本发明所属领域一般技术人员所通常理解的具有相同的意义。尽管任何与在本文所描述的那些相似或等同的方法和材料可用于本发明的实行或测试，仍描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下术语如下所定义。
本文中所使用的冠词“一”或“一个”是指一个或多于一个(即至少一个)的冠词的语法对象。举例来说，“一个因子”意味着一个因子或多于一个的因子。
“约”是指与参比数量、水平、值、数字、频率、百分比、维数、尺寸、量、重量或长度相比，数量、水平、值、数字、频率、百分比、维数、尺寸、量、重量或长度的变化达30％、25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％。
“编码序列”指的是导致基因多肽产物编码的任何核酸序列。与之相比，术语“非编码序列”是指不会导致基因多肽产物编码的任何核酸序列。
在本发明书中，除了文中另有要求，词语“包含(comprise)”、“包含(comprises)”和“包含(comprising)”将被理解为意味包括声明的步骤或因子或步骤组或因子组，但不排除任何其它步骤或因子或步骤组或因子组。
“由...组成”指的是包括但不限于遵照短语“由...组成”的任何内容。因此，术语“由...组成”表示所列的因子是必需的或强制的而没有存在其它因子。
“主要由...组成”指的是包括短语后所列的任何因子，并限于那些对公开中说明的活性或作用不干扰或无贡献的其它因子。因而，短语“基本上由……组成”表明列出的因子是必需的或强制的，但是其它因子是任选的，依赖是否影响列出因子的活性或存在或不存在。
术语“互补的”和“互补性”是指碱基配对原则关联的多核苷酸(也就是说核苷酸的序列)。例如，序列“A‐G‐T”与序列“T‐C‐A”互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则来进行匹配。或，核酸之间可以是“完全”或“总体”的互补性。核酸链之间的互补程度显著影响着核酸链之间杂交的效率和强度。
“对应于(corresponds to)”或“对应于(corresponding to)”指的是(a)多核苷酸，该多核苷酸具有与参比多核苷酸序列的全部或一部分基本相同或互补的核苷酸序列，或编码与肽或蛋白中氨基酸序列相同的氨基酸；或(b)肽或多肽，该肽或多肽具有与参比肽或蛋白的氨基酸序列基本相同的氨基酸序列。
“衍生物”指的是通过本领域应当理解的修饰(例如通过与其它化学部分(例如，聚乙二醇化)结合或复合)或通过翻译后修饰的技术从基本序列衍生得到的多肽。术语“衍生物”也指的是通过修饰、例如通过与其它化学部分结合或复合(例如，聚乙二醇化)从基本结构衍生得到的化合物(例如，糖)。术语“衍生物”也包括：在其范围内已经对亲本序列/结构作出的的改变，该改变包括提供功能上等价的分子的添加或缺失。
正如在本文中所使用的，术语“功能”和“功能的”等等是指生物的、的或治疗的功能。
“基因”指的是在染色体中占据特异性位点并且由转录和/或翻译调节序列和/或编码区和/或非翻译序列(也就是内含子，5'和3'的非翻译序列)组成的遗传单位。
“同源性”是指相同的或构成保守性取代的氨基酸的百分比数字。可以使用诸如GAP的序列对比程序确定同源性(Deveraux等,1984,Nucleic Acids Research 12,387‐395)，其通过引用并入本文。在这一方式中，通过将缺口插入对比，与本文中那些引用的序列相似或基本上不同长度的序列将被对比，例如，通过GAP所使用的比较算法确定此类缺口。
术语“宿主细胞”包括可以是或已经是本发明任何重组的载体或分离的多核苷酸受体的个体细胞或者细胞培养物。宿主细胞包括单个宿主细胞的子代，并且该子代因正常的、随机的或有意的突变和/或变化而不必与原母细胞完全相同(在形态学上或总DNA互补上)。宿主细胞包括使用本发明重组载体或多核苷酸在体内或体外转染或感染的细胞。包含本发明重组载体的宿主细胞为重组宿主细胞。
“分离的”指的是基本上或实质上不含通常在其天然状态时与其一起出现的组分的物质。例如，正如本文中所使用的“分离的多核苷酸”是指已经与天然存在状态下的侧翼序列纯化分开的多核苷酸，例如，已经从正常邻近该片段的序列中除去的DNA片段。可选地，如本文中所使用的“分离的肽”或“分离的多肽”等等是指肽或多肽分子从其天然细胞环境中和从细胞其它组分缔合中的体外进行分离和/或纯化。
术语“调节”和“改变”包括相对于对照通常在统计学上显著或生理学上显著的数量或程度的“增加”和“提高”以及“减小”或“降低”。在具体的实施例中，相对于未修饰或不同修饰的干细胞，与血液代用品移植相关的免疫排斥减小了至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。
“增加的”或“提高的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包括1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括所有整数和之间的小数点且大于1，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的本文所述的量或水平的增加。
“减小的”或“降低的”或“更少的”量通常是“统计学上显著的”量，并且可以包括约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括所有整数和之间的小数点且大于1，例如1.5、1.6、1.7、1.8等)的本文所述的量或水平的减小。例如，在具体的实施例中，相对于未修饰或不同修饰的干细胞，与血液代用品移植相关的免疫排斥减小了至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％或至少1000％。
例如，“从...获得”指的是样品，诸如多核苷酸或多肽从特定源(诸如所需的生物或所需生物内特异性组织)分离或衍生得到的。“从...获得”也可以是指多核苷酸或多肽序列在其中从特定的生物或生物内组织分离或衍生得到的情形。例如，编码本文中所述的参比多肽的多核苷酸序列可以从多种原核或真核生物分离得到或从某些真核生物内特定组织或细胞总分离得到的。
正如本文中所使用的引述“多核苷酸”或“核酸”表示为mRNA、RNA、cRNA、rRNA、cDNA或DNA。术语通常是指至少10个碱基长度的核苷酸的聚合形式，可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或核苷酸任何一种形式的改性形式。例如，多核苷酸可以包括DNA分子和RNA分子的单链和/或双链形式。
DNA分子之所以被称为具有“5′端”和“3′端”是因为单核苷酸以一定方式反应生成寡核苷酸，从而单核苷酸戊糖环的5′磷酸盐通过磷酸二酯键在一个方向上连接在邻近的单核苷酸戊糖环的3′氧上。因此，假如它的5′磷酸盐没有连接在单核苷酸戊糖环的3′氧上，寡核苷酸的末端被称为“5′端”以及假如它的3′氧没有连接在随后的单核苷酸戊糖环的5′磷酸盐上，寡核苷酸的末端被称为“3′端”。正如本文中所使用的，核酸序列，即使位于更大寡核苷酸的内部，也可以说具有5'端和3′端。在线性或环状DNA分子中，分散的因子被称为是“下游”因子或3′因子的“上游”因子或5′因子。该术语反映的是转录在DNA链上按照从5′至3′的方式来进行。连锁基因直接转录的启动子和增强子因子通常位于编码区的5'端或上游。然而，即使增强子因子位于启动子和编码区的3'端的时候，增强子元件可发挥其作用。转录终止化信号和多腺苷酸化信号位于编码区的3′或下游。
正如本文中所使用的，术语“具有编码基因的核苷酸序列的多核苷酸”意指含有基因编码区的核酸序列或换句话说编码基因产物的核酸序列。编码区可以以cDNA、基因组DNA或RNA的形式所存在。当存在为DNA形式的时候，寡核苷酸可以是单链的(也就是说，有义链)或双链的。如果需要使转录适当地启始和/或初级RNA转录正确地进行，适当的调控因子诸如增强子/启动子、剪接点、聚腺苷酸化信号等可能放置于靠近基因的编码区。可选地，在本发明公开的载体中所用的编码区可以含有内源性增强子/启动子、剪接点、插入序列、多腺苷酸化信号等或内源与外源调控因子的组合。
核酸序列是指一系列的核苷酸，该核苷酸用一连串的字母来表示，该字母表示DNA分子(使用G、A、C和T)或RNA(使用G、A、C和U)分子内的核苷酸序列。根据惯例，核酸序列一般表现为从5'端至3'端。例如，DNA序列是指一系列在相邻戊糖的3'和5'碳之间通过磷酸二酯键彼此连接的核苷酸。
正如在本文中所使用的，本文中所使用的术语“重组DNA分子”是指包括通过分子生物技术将DNA结合在一起的多片段的DNA分子。本文中所使用的术语“重组蛋白”或“重组多肽”是指从重组DNA分子中表达的蛋白分子。
术语“多核苷酸变体”和“变体”等等是指与参比多核苷酸序列具有实质的序列一致性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参比序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过至少一个核苷酸的添加、缺失或取代来不同于参比多核苷酸的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括在其中一个或多个核苷酸已经用不同的核苷酸进行添加、缺失或取代的多核苷酸。在这点上，本领域所熟知的包括突变、添加、缺失和取代的某些变化可以作用于参比多核苷酸，而改变后的多核苷酸保持了参比多核苷酸的生物功能或活性，或具有与参比多核苷酸相关的增加的活性(也就是说，优化的)。多核苷酸变体包括，例如，多核苷酸，该多核苷酸与本文中所述的多核苷酸序列具有至少50％(和至少51％至至少99％和在其之间的所有整数百分比，例如90％、95％或98％)的序列一致性。术语“多核苷酸变体”和“变体”也包括编码这些酶的天然存在的等位变体和直向同源物。
对于多核苷酸，术语“外源性”是指在野生型细胞或生物不会天然存在的多核苷酸序列，但是其通常通过分子生物技术被引入细胞。外源性多核苷酸的实例包括载体、质粒和/或编码所需蛋白的人工核酸构建体。对于多核苷酸，术语“内源性”或“天然的”是指可以在给定野生型细胞或生物中发现的天然存在的多核苷酸序列，从第一生物中分离并通过分子生物技术转移至第二生物的特定多核苷酸也通常被认为是相对于第二生物的“外源性”多核苷酸。在具体的实施例中，通过分子生物技术，多核苷酸序列可被“引入”已经含有此类多核苷酸序列的微生物中，例如，以构建其它天然存在的多核苷酸序列的一个或多个额外的拷贝，从而促使所编码多肽的过表达。
本文中可替换使用的“多肽”、“多肽片段”、“肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物及其变异体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物(其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，诸如相应天然存在氨基酸的化学类似物)以及适用于天然存在氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括酶促多肽或“酶”，该“酶”通常催化不同的化学反应(例如，增加不同化学反应的速率)。
术语“参比序列”一般是指另一序列与之做对比的核酸编码序列或氨基酸序列。本文中所述的所有多肽和多核苷酸序列包括在参比序列中。
正如本文中所使用的，术语“限制性内切酶”和“限制酶”是指细菌酶，细菌酶中的每个在特异性核苷酸序列处或特异性核苷酸序列附近切割双链DNA。例如，“EcoR”或“BamH”在识别位点切割DNA分子。正如本文中所使用的，“识别位点”是指假如序列存在于双链DNA中或假如序列存在于单链RNA中由限制酶识别的特异性的碱基序列，假如RNA逆转录为cDNA并且该cDNA用作具有DNA聚合酶的模板以产生双链DNA或假如序列存在于单链DNA中将由限制酶识别的特异性的碱基序列，假如单链DNA用作具有DNA聚合酶的模板以产生双链DNA或假如序列存在于双链RNA中将由限制酶识别的特异性的碱基序列，假如RNA中任意一个链逆转录为cDNA并且该cDNA用作具有DNA聚合酶的模板以产生双链DNA将由限制酶识别的特异性的碱基序列。术语“独特的限制酶位点”表示用于特定限制酶的识别序列在核酸分子内出现一次。
DNA连接酶是指在一个DNA片段的3'端和另一个DNA片段的5'端之间构建磷酸二酯键的酶，而一个DNA片段的3'端和另一个DNA片段的5'端是与模板链碱基配对的。例如，DNA连接酶修复双链的断裂和/或在双螺旋DNA链中修复单链DNA的端。
本文中所使用的引述“序列一致性”(或，例如，包括“50％相同的序列”)是指在比较窗口内核甘酸紧接核甘酸的基础上或氨基酸紧接氨基酸的基础上序列相同的程度。因此，可以在比较窗口内通过比较两个最佳比对序列来计算“序列一致性的百分比”，确定在位置上两序列中出现的相同核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数字以获得配对位置的数字，通过在比较窗口(也就是说窗口大小)内位置的总数字将配对位置的数字划分，以及将结果乘以100以产生序列一致性的百分比。包括了具有与本文所述参比序列(参见，例如，序列表)任意一个至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、100％序列一致性的核苷酸和多肽，其中多肽变体通常保持有该参比多肽的至少一个生物活性。
“基本上”或“实质上”意味着接近全部或完全，例如，90％、95％、96％、97％、98％、99％或以上的一定的给定数量。
“转化”是指在外源DNA摄取和结合在宿主细胞基因组中得到的细胞中永久的、遗传的改变；同样，从生物转移到另一生物基因组中的外源性基因的转移。
正如在本文中所使用的，术语“选择性标记”或“选择性标记基因”是指编码酶促活性的基因应用，该酶促活性赋予了在缺乏其他情况下作为必需营养物(例如，酵母细胞中的TRP1基因)的培养基中生长的能力；此外，选择性标记可以在其中对选择性标记表达的细胞中赋予抗生素抗性或抗药性。选择性标记可以用于在宿主细胞上赋予特定的表型。当宿主细胞必须表达选择性标记以在选择性培养基中生长的时候，该标记被称为阳性选择性标记(例如，在合适抗生素存在下赋予生长能力的抗生素抗性基因)。选择性标记也可用于选择含有特定基因的宿主细胞(例如，sacB基因，假如表达的话，会杀死在含有5％蔗糖培养基中生长的细菌宿主细胞)。以这种方式使用的选择性标记被称为阴性选择性标记或反选择性标记。
“载体”指的是可在其中插入或克隆的多核苷酸分子(优选的DNA分子)，例如，衍生于质粒、噬菌体、酵母或病毒的分子。载体可以含有一个或多个单一限制位点并可在所定义的宿主细胞内自主复制，该宿主细胞包括其靶细胞或组织或祖细胞或组织，或在所定义宿主的基因组中整合从而使得所克隆的序列是可复制的。因此，载体可以是自主复制的载体(也就是说，作为染色体外实体存在的载体)不依赖于染色体复制的复制，例如，线性或闭环质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。载体可含有用以确保自我复制的任何工具。可选地，该载体是当被引入宿主细胞中的时候被整合到基因组并随已被整合的染色体一起复制。此类的载体可以包含特异性序列，该特异性序列允许宿主染色体的特定所需的位点的重组。载体系统可包括单个载体或质粒、两个或多个载体或质粒，它们都含有引入到宿主细胞基因组的总DNA或转座子。载体的选择通常取决于载体与其将要引入的宿主细胞的相容性。在这一情况下，载体优选为在干细胞中以可操作方式发挥功能的一种载体。载体可包括报告基因，诸如绿色荧光蛋白(GFP)，该报告基因可分别被表达或在框内与编码多肽的一个或多个融合。载体也可包括筛选标记，诸如可用于合适转化子筛选的抗生素抗性基因。
本文中所使用的“表达载体”是指重组DNA分子，该重组DNA分子含有所需的编码序列和适宜的核酸序列，该所需的编码序列和适宜的核酸序列在特定宿主生物中对于可操作方式连接的编码序列是必需的。原核细胞中表达所必需的核酸序列一般包括启动子、操作子(可选的)和核糖体结合位点，常常还有其它序列。真核细胞在利用启动子、增强子和终止化信号和多腺苷酸化信号中是已知的。
正如本文中所使用的，术语“PCR产物”是指使用聚合酶链式反应(PCR)基扩增的衍生于DNA模板的脱氧核苷三磷酸拷贝。
实施例
不同的实施例涉及了定向克隆方法，该方法允许插入DNA在特异性的取向中连接载体和/或防止载体的自连接。正如本文中所定义的，定向克隆是指设计的程序，该程序用于保证在确定和/或已知的取向中将插入DNA插入到靶载体分子中。例如，在靶载体内将插入DNA随后从启动子序列中转录的时候，可以需要该定向克隆。
在定向克隆相关的传统技术下，使用PCR仪执行多个热循环以产生所需的重组靶载体。在一些例子中，也执行亚克隆以识别所需的重组靶载体。本文中涉及的将靶载体切割和将一个或多个DNA插入DNA片段连接至靶载体的令人惊奇的或未意料的发现可以在基本相同温度下执行以形成重组的靶载体。
如图1所示，方法可以包括：在106处提供靶载体102和插入DNA片段104。在110处，可以在容器108中将靶载体102和插入DNA片段104与一定量的限制酶和一定量的DNA连接酶混合。在一些实施例中，在112处，可以通过限制酶消化并切割靶载体102，且将插入DNA片段104的至少一部分连接切割的靶载体102以形成重组DNA分子112。在这些例子中，插入DNA片段104的至少一部分被表示为已插入的DNA片段116。
在一些实施例中，重组DNA分子为表达载体，该表达载体可以包括靶载体的至少一部分和插入DNA片段的至少一部分。
在一些实施例中，插入DNA片段104可以包括已插入的DNA片段116和包括限制酶识别位点的一个或多个DNA序列。例如，插入DNA片段104的5'端可以包括限制酶的识别位点，从而限制酶可以除去识别位点并且已插入的DNA片段116可以连接至已切割的靶载体102以形成重组DNA分子112。在一些实施例中，可以由PCR基扩增反应产生插入DNA片段104。在一些实施例中，靶载体102可以包括限制酶(例如，II型限制酶)的识别位点。
在一些实施例中，可以在容器108(例如微量离心管)内混合靶载体102、插入DNA片段104、限制酶和DNA连接酶。在这些例子中，在第一温度下，通过限制酶消化并切割靶载体102和/或插入DNA片段104。第一温度与第二温度相同或基本相同，在第二温度下已插入的DNA片段116与已切割的靶载体102相连接。
在一些实施例中，可以在容器108内混合靶载体102、插入DNA片段104、限制酶和DNA连接酶。在这些例子中，在容器108中由限制酶消化且切割靶载体102分子之前，容器108中的靶载体102的分子基本上为闭环质粒。在一些实施例中，与传统技术不同，在相同的一个或多个条件参数下，本公开的实施例可以使用限制酶执行该消化，可以使用DNA连接酶执行该链接。条件参数可以包括反应温度、反应时间段和/或一定量的酶量。例如，可以在室温下于容器108中混合靶载体102、插入DNA片段104、限制酶和DNA连接酶并保温10分钟，从而在相同的条件参数下执行消化和连接。
在一些实施例中，在约16℃至约37℃的温度下，可以在容器108中混合靶载体102、插入DNA片段104、一定量的限制酶和一定量的DNA连接酶约1分钟至20分钟的时间段。
在一些实施例中，限制酶可以包括II型限制酶。例如，II型限制酶可以包括BsaI、BbsI、BsmBI、AarI、Alw26I或LguI。在一些实施例中，DNA连接酶可以包括T4 DNA连接酶或大肠杆菌DNA连接酶。
在一些实施例中，可以在容器108中混合靶载体102、插入DNA片段104的多拷贝、一定量的限制酶和一定量的DNA连接酶，以在第一温度下将靶载体102和/或插入DNA片段104的多拷贝切割并在第二温度下将插入DNA片段的至少一部分的多拷贝连接至靶载体。在一些例子中，第一温度与第二温度相同或基本相同。
在一些实施例中，可以混合靶载体102、插入DNA片段104、一定量的限制酶和一定量的DNA连接酶，以在第一温度下将靶载体102和/或插入DNA片段104和附加插入DNA片段切割并在第二温度下将插入DNA片段的至少一部分和附加插入DNA片段连接至靶载体。在一些例子中，插入DNA片段102的序列可以不同于附加插入DNA片段的序列一些例子中，第一温度与第二温度相同或基本相同。
实例
实例1：插入DNA片段的制备
插入DNA片段携带有所需的插入序列(SEQ ID NO:1)和由BsaI限制酶识别的限制位点(SEQ ID NO:2)。限制位点位于插入DNA的5'端和3'端。通过聚合酶链式反应(PCR)，对插入DNA进行扩增。在表1中提供了设计用于PCR的正向引物及反向引物序列和其它的序列。在PCR中使用的聚合酶包括Taq或高保真度的DNA聚合酶。扩增后，使用诸如Dpnl和/或DMT的酶，对PCR产物进行纯化。
表1
实例2：表达载体的产生
在单个试管中，对1-50纳克(ng)的已纯化的插入DNA片段与25ng的pSDS201质粒、10x缓冲液、包括20U的限制酶和5U的T4DNA连接酶(例如，1ul限制酶和1ul T4 DNA连接酶)的酶混合物和重蒸馏水(ddH2O)进行混合。更详细的信息如表2中所示。pSDS201质粒为约4600bp并包括BsaI的多个限制位点。正如图2中所示的，构建体200示出了pSDS201质粒的构建。在约16℃至37℃的温度下，对混合物保温10分钟，以获得包括重组DNA分子的反应产物。重组DNA分子中的单个重组DNA分子包括所需的插入序列和质粒。
表2
组分 体积
质粒 25ng
插入 1-50ng
10x缓冲液 2μl
酶混合物 2μl
ddH2O 高达20μl
总计 20μl
实例3：表达载体的转化和分析
保温后，将10μl的反应产物与100μl含有108单位的DH5α组分细胞的溶液混合以获得不同的转化子。基于pSDS201质粒中的选择性标记(例如，Kana)，首先对这些转化子进行筛选。还执行了菌落筛选方法，以选择包括表达载体(含有重组DNA分子)的转化子。菌落筛选方法包括菌落PCR、限制内切酶消化和/或DNA测序。
序列表
申请人组织
----------------------
Street : 上海张江高科哈雷路998号4号楼201室
City : 上海
State : 中国
Country : 中国
PostalCode :
PhoneNumber :
FaxNumber :
EmailAddress :
<110> OrganizationName : 上海斯丹赛生物技术有限公司
申请项目
-------------------
<120> Title : 定向克隆的方法
<130> AppFileReference :
<140> CurrentAppNumber :
<141> CurrentFilingDate : ____-__-__
Sequence
--------
<213> OrganismName : 希望插入序列
<400> PreSequenceString :
ctgacgccac catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg 60
tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg 120
atgccaccta cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc 180
cctggcccac cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg 240
accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc 300
gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg 360
gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca 420
tcctggggca caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca 480
agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg 540
tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc 600
ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg 660
atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc 720
tgtacaagta a 731
<212> Type : DNA
<211> Length : 731
SequenceName : 希望插入序列
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName : 限制性内切位点
<400> PreSequenceString :
ggtctcnnnn n 11
<212> Type : DNA
<211> Length : 11
SequenceName : 限制性内切位点
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName : 人工
<400> PreSequenceString :
ggggggtctc ttgacgccac catggtgagc aagg 34
<212> Type : DNA
<211> Length : 34
SequenceName : 正向引物
SequenceDescription :
Sequence
--------
<213> OrganismName : 人工
<400> PreSequenceString :
gccgggtctc ggagttggtc tcggagttta cttgtacagc tcgtccatgc c 51
<212> Type : DNA
<211> Length : 51
SequenceName : 反向引物
SequenceDescription :

Claims (14)

1.一种定向克隆的方法，所述方法包括：
提供靶载体和插入脱氧核糖核酸(DNA)片段；和
在容器中混合所述靶载体、所述插入DNA片段、一定量的限制酶和
一定量的DNA连接酶，以：
在第一温度下切割所述靶载体，和
在第二温度下将所述插入DNA片段的至少一部分连接至所述靶载体，其中所述第一温度与所述第二温度相同或基本相同。
2.根据权利要求1所述的方法，其中将所述插入DNA片段与所述靶载体的所述连接包括将所述插入DNA片段连接至所述靶载体，以产生包括所述靶载体的至少一部分和所述插入DNA片段的所述至少一部分的重组DNA分子。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述重组DNA分子为表达载体。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述插入DNA片段包括所述插入DNA片段的所述至少一部分和包括所述限制酶的识别位点的DNA序列。
5.根据权利要求2所述的方法，还包括：
在所述第一温度下切割所述插入DNA片段以产生所述插入片段的所述至少一部分。
6.根据权利要求2所述的方法，其中当混合所述靶载体、所述插入DNA片段、所述一定量的限制酶、所述一定量的DNA连接酶的时候，所述容器中的所述靶载体分子基本上为闭环质粒。
7.根据权利要求1所述的方法，其中对所述靶载体、所述插入DNA片段、所述一定量的限制酶、所述一定量的DNA连接酶的所述混合包括在单一容器内混合所述靶载体、所述插入DNA片段、所述一定量的限制酶、所述一定量的DNA连接酶。
8.根据权利要求1所述的方法，对所述靶载体、所述插入DNA片段、所述一定量的限制酶、所述一定量的DNA连接酶的所述混合包括在单一容器内混合所述靶载体、所述插入DNA片段、所述一定量的限制酶、所述一定量的DNA连接酶持续约5分钟至约20分钟的时间段。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述限制酶包括II型限制酶。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述II型限制酶可以包括BsaI、BbsI、BsmBI、AarI、Alw26I或LguI的至少一种。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA连接酶包括T4DNA连接酶或大肠杆菌DNA连接酶的至少一种。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述插入DNA片段包括聚合酶链式反应(PCR)产物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一温度为约16℃至约37℃的温度。
14.根据权利要求1所述的方法，还包括：
提供附加插入DNA片段，其中在所述第一温度下，在所述容器中对所述靶载体、所述插入片段、所述一定量的限制酶和所述一定量的DNA连接酶进行所述混合以切割所述靶细胞，在所述第二温度下，将所述插入DNA片段的所述至少一部分连接至所述靶细胞，其包括：
在所述容器中混合所述靶载体、所述插入DNA片段、所述附加插入DNA片段、所述一定量的所述限制酶和所述一定量的所述DNA连接酶，以：
在第一温度下切割所述靶载体，和
在所述第二温度下将所述插入DNA片段的所述至少一部分和所述附加插入DNA片段的至少一部分连接至所述靶载体。
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