CN106771155A - 一种禽肉中庆大霉素检测方法及检测卡 - Google Patents

一种禽肉中庆大霉素检测方法及检测卡 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种禽肉中庆大霉素检测方法，该方法为包括以下步骤：S1，取需要检测的新鲜禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉组织，将取得的肌肉组织进行粉碎处理；S2，取两只50ml的离心管，分别标记为管A和管B，使用天平称得2‑4g S1中切碎的组织样品，放入管A中待用；S3，向S2中的管A中加入5‑10ml的浓度为2‑3.3mol/L乙酸乙酯溶液，手动将管A剧烈震荡3min后，在25℃的环境中，将管A放入离心机中，转速调至4000r/min，定时5min。本发明能够有效的检测出禽肉中的庆大霉素，价格低廉，操作简单，适合作为庆大霉素大量筛选检测的检测方法使用。

Description

一种禽肉中庆大霉素检测方法及检测卡
技术领域
本发明涉及庆大霉素检测技术领域，具体为一种禽肉中庆大霉素检测方法及检测卡。
背景技术
庆大霉素是一种氨基糖苷类抗生素，主要用于治疗细菌感染，尤其是革兰氏阴性菌引起的感染，庆大霉素能与细菌核糖体30s亚基结合，阻断细菌蛋白质合成，由于其应用范围广、疗效好、价格低廉而被广泛用于兽医临床和动物饲料添加剂中，但是庆大霉素在应用过程中易产生较大的毒副作用，大剂量的不规范使用会导致动物性食品中的药物残留严重超标，其中以禽类较为普遍，人类食用这一类肉制品后会产生肾毒性、耳毒性、肌肉阻滞和过敏等一系列毒副作用，我国农业部第235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定庆大霉素在肉制品中的残留限量标准为100μg/Kg，所以需要严格把控肉制品中的庆大霉素残留量。
庆大霉素残留量常用的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、高效液相色谱质谱串联法(HPLC-MS/MS)液相色谱一质谱联用技术(LC-MS)薄层色谱法(TLC)、免疫测定法等，这些检测方法需要的器材价格昂贵，操作复杂，而且需要高技术的操作人员，需要耗费大量的人力物力，进而致使上述方法无法在大量筛选中应用，缺少一种操作简单，价格低廉，适合应用与大量筛选中的检测方法。
免疫层析法(immunochromatography)是近几年来国外兴起的一种快速诊断技术，其原理是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品（尿液或血清）后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique) 是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术，英文缩写为：GICT。胶体金是由氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，聚合成为特定大小的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态，称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种禽肉中庆大霉素检测方法。
本发明提出一种禽肉中庆大霉素检测方法，所述检测方法包括以下步骤：
S1，取需要检测的新鲜禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉组织，将取得的肌肉组织进行粉碎处理；
S2，取两只50ml的离心管，分别标记为管A和管B，使用天平称得2-4g S1中切碎的组织样品，放入管A中待用；
S3，向S2中的管A中加入5-10ml浓度为2-3.3mol/L的乙酸乙酯溶液，手动将管A剧烈震荡3min后，在25℃的环境中，将管A放入离心机中，转速调至4000r/min，定时5min；
S4，用滴管移取S3中管A离心得到的上清液1-3ml至管B中，氮气吹干或者使用65℃空气吹干；
S5，使用移液枪向管B中加入300-500μL浓度为1-1.5mol/L的PBS缓冲液和100-300μL浓度为1-1.5mmol/L的氯化钙溶液，轻轻吹打液体润洗管B内壁，吹打时应避免产生气泡；
S6，将管B放入离心机，在4000r/min下离心1min，用滴管取下层液体150μL作为待检样品；
S7，将S6中取得的待检样品滴入庆大霉素检测卡上的滴液区，观察反应结果，完成检测；
当检测卡上的质控线（C区）和检测线（T）均显示红色色带，无论颜色深浅均可判断检测样品为阴性；
当检测卡上的质控线（C区）显示为红色色带，检测线（T）不显示红色色带，初步判断检测样品为阳性；
当检测卡上的质控线（C区）不显示红色色带时，无论检测线（T）是否显示红色色带，该检测卡均判断为失效。
一种禽肉中庆大霉素检测卡，所述检测卡包括上壳和下壳，所述上壳的下沿设置有插块，所述下壳的上沿开设有插槽，所述插块与插槽插接，所述上壳上分别开设有滴液孔和观察窗，所述滴液孔位于观察窗的一侧，所述观察窗的内部粘接有透明保护壳，所述下壳的上表面对应滴液孔的位置设置有样品垫，所述样品垫靠近观察窗的一侧设置有胶体金结合垫，所述胶体金结合垫靠近观察窗的一侧设置有NC膜，所述NC膜远离胶体金结合垫的一侧设置有吸水垫，所述NC膜上沿着胶体金结合垫至吸水垫的方向依次包被有呈条状的庆大霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG。
优选的，所述胶体金结合垫上包被有抗庆大霉素单克隆抗体和胶体金的结合物，所述庆大霉素-载体蛋白偶联物和羊抗鼠IgG分别作为检测卡上的检测线T和质控线C。
优选的，所述样品垫远离观察窗的一侧面与胶体金结合垫的一侧面接触，所述胶体金结合垫的另一侧面与NC膜的一侧面接触，所述NC膜的另一侧面与吸水垫的一侧面接触。
优选的，所述透明保护壳为无色透明有机玻璃。
有益效果
本发明提供了一种禽肉中庆大霉素检测方法及检测卡，具备以下有益效果：
该禽肉中庆大霉素检测方法及检测纸，通过在切碎的待检组织样中加入5-10ml的乙酸乙酯，手动将管A剧烈震荡3min后，在25℃的环境中使用离心机进形离心后取上清液，能够有效的对样品肌肉组织进行纤维脱脂，有效降低脂肪对检测结果的影响，结合免疫层析法和免疫胶体金技术，样本中的庆大霉素在侧向移动的过程中与胶体金结合垫内的抗庆大霉素单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜检测线上庆大霉素-载体蛋白偶联物的结合，利用胶体金颜色的变化体现在NC膜上检测判断禽肉中是否含有庆大霉素，操作方便，价格低廉，适合作为庆大霉素大量筛选检测的检测方法。
附图说明
图1为本发明检测卡结构示意图；
图2为本发明检测卡剖视图。
图中：1上壳、2下壳、3插块、4插槽、5滴液孔、6观察窗、7保护壳、8样品垫、9胶合金结合垫、10 NV膜、11吸水垫、12庆大霉素-载体蛋白偶联物、13羊抗鼠IgG。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图来对本发明做进一步说明，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅附图1-2，本发明提供了一种技术方案，一种禽肉中庆大霉素检测卡，检测卡包括上壳1和下2壳，上壳1的下沿设置有插块3，下壳2的上沿开设有插槽4，插块3与插槽4插接，上壳1上分别开设有滴液孔5和观察窗6，滴液孔5位于观察窗6的一侧，观察窗6的内部粘接有透明保护壳7，透明保护壳7为无色透明有机玻璃，下壳2的上表面对应滴液孔5的位置设置有样品垫8，样品垫8靠近观察窗6的一侧设置有胶体金结合垫9，胶体金结合垫9靠近观察窗6的一侧设置有NC膜10，NC膜10远离胶体金结合垫9的一侧设置有吸水垫11，NC膜10上沿着胶体金结合垫9至吸水垫11的方向依次包被有呈条状的庆大霉素-载体蛋白偶联物12和羊抗鼠IgG 13，胶体金结合垫9上包被有抗庆大霉素单克隆抗体和胶体金的结合物，庆大霉素-载体蛋白偶联物12和羊抗鼠IgG13分别作为检测卡上的检测线T和质控线C，样品垫8远离观察窗6的一侧面与胶体金结合垫9的一侧面接触，胶体金结合垫9的另一侧面与NC膜10的一侧面接触，NC膜10的另一侧面与吸水垫11的一侧面接触。
实施例一
本发明提供了一种技术方案，一种禽肉中庆大霉素检测方法，检测方法包括以下步骤：
S1，取需要检测的新鲜禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉组织，将取得的肌肉组织进行粉碎处理；
S2，取两只50ml的离心管，分别标记为管A和管B，使用天平称得2g S1中切碎的组织样品，放入管A中待用；
S3，向S2中的管A中加入6ml浓度为2mol/L的乙酸乙酯溶液，手动将管A剧烈震荡3min后，在25℃的环境中，将管A放入离心机中，转速调至4000r/min，定时5min；
S4，用滴管移取S3中管A离心得到的上清液1ml至管B中，氮气吹干或者使用65℃空气吹干；
S5，使用移液枪向管B中加入300μL浓度为1.3mol/L的PBS缓冲液和100μL浓度为1.3mmol/L的氯化钙溶液，轻轻吹打液体润洗管B内壁，吹打时应避免产生气泡；
S6，将管B放入离心机，在4000r/min下离心1min，用滴管取下层液体150μL作为待检样品；
S7，将S6中取得的待检样品滴入庆大霉素检测卡上的滴液区，观察反应结果，完成检测；
当检测卡上的质控线（C区）和检测线（T）均显示红色色带，无论颜色深浅均可判断检测样品为阴性；
当检测卡上的质控线（C区）显示为红色色带，检测线（T）不显示红色色带，初步判断检测样品为阳性；
当检测卡上的质控线（C区）不显示红色色带时，无论检测线（T）是否显示红色色带，该检测卡均判断为失效。
实施例二
本发明提供了一种技术方案，一种禽肉中庆大霉素检测方法，检测方法包括以下步骤：
S1，取需要检测的新鲜禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉组织，将取得的肌肉组织进行粉碎处理；
S2，取两只50ml的离心管，分别标记为管A和管B，使用天平称得3g S1中切碎的组织样品，放入管A中待用；
S3，向S2中的管A中加入7ml浓度为2.3mol/L的乙酸乙酯溶液，手动将管A剧烈震荡3min后，在25℃的环境中，将管A放入离心机中，转速调至4000r/min，定时5min；
S4，用滴管移取S3中管A离心得到的上清液2ml至管B中，氮气吹干或者使用65℃空气吹干；
S5，使用移液枪向管B中加入400μL浓度为1.4mol/L的PBS缓冲液和200μL浓度为1.4mmol/L的氯化钙溶液，轻轻吹打液体润洗管B内壁，吹打时应避免产生气泡；
S6，将管B放入离心机，在4000r/min下离心1min，用滴管取下层液体150μL作为待检样品；
S7，将S6中取得的待检样品滴入庆大霉素检测卡上的滴液区，观察反应结果，完成检测；
当检测卡上的质控线（C区）和检测线（T）均显示红色色带，无论颜色深浅均可判断检测样品为阴性；
当检测卡上的质控线（C区）显示为红色色带，检测线（T）不显示红色色带，初步判断检测样品为阳性；
当检测卡上的质控线（C区）不显示红色色带时，无论检测线（T）是否显示红色色带，该检测卡均判断为失效。
实施例三
本发明提供了一种技术方案，一种禽肉中庆大霉素检测方法，检测方法包括以下步骤：
S1，取需要检测的新鲜禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉组织，将取得的肌肉组织进行粉碎处理；
S2，取两只50ml的离心管，分别标记为管A和管B，使用天平称得4g S1中切碎的组织样品，放入管A中待用；
S3，向S2中的管A中加入9ml浓度为3.3mol/L的乙酸乙酯溶液，手动将管A剧烈震荡3min后，在25℃的环境中，将管A放入离心机中，转速调至4000r/min，定时5min；
S4，用滴管移取S3中管A离心得到的上清液3ml至管B中，氮气吹干或者使用65℃空气吹干：
S5，使用移液枪向管B中加入500μL浓度为1.5mol/L的PBS缓冲液和300μL浓度为1.5mmol/L的氯化钙溶液，轻轻吹打液体润洗管B内壁，吹打时应避免产生气泡；
S6，将管B放入离心机，在4000r/min下离心1min，用滴管取下层液体150μL作为待检样品；
S7，将S6中取得的待检样品滴入庆大霉素检测卡上的滴液区，观察反应结果，完成检测；
当检测卡上的质控线（C区）和检测线（T）均显示红色色带，无论颜色深浅均可判断检测样品为阴性；
当检测卡上的质控线（C区）显示为红色色带，检测线（T）不显示红色色带，初步判断检测样品为阳性；
当检测卡上的质控线（C区）不显示红色色带时，无论检测线（T）是否显示红色色带，该检测卡均判断为失效。
综上所述，该禽肉中庆大霉素检测方法及检测卡，通过在切碎的待检组织样中加入5-10ml的乙酸乙酯，手动将管A剧烈震荡3min后，在25。C的环境中使用离心机进形离心后取上清液，能够有效的对样品肌肉组织进行纤维脱脂，有效降低脂肪对检测结果的影响，结合免疫层析法和免疫胶体金技术，样本中的庆大霉素在侧向移动的过程中与胶体金结合垫9内的抗庆大霉素单克隆抗体结合，抑制了抗体和NC膜10检测线上庆大霉素-载体蛋白偶联物12的结合，利用胶体金颜色的变化体现在NC膜10上检测判断禽肉中是否含有庆大霉素，操作方便，价格低廉，适合作为庆大霉素大量筛选检测的检测方法。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下。由语句“包括一个......限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素”。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种禽肉中庆大霉素检测方法，其特征在于，所述检测方法包括以下步骤：
S1，取需要检测的新鲜禽肉，去除脂肪，只取禽肉的肌肉组织，将取得的肌肉组织进行粉碎处理；
S2，取两只50ml的离心管，分别标记为管A和管B，使用天平称得2-4g S1中切碎的组织样品，放入管A中待用；
S3，向S2中的管A中加入5-10ml浓度为2-3.3mol/L的乙酸乙酯溶液，手动将管A剧烈震荡3min后，在25℃的环境中，将管A放入离心机中，转速调至4000r/min，定时5min；
S4，用滴管移取S3中管A离心得到的上清液1-3ml至管B中，氮气吹干或者使用65℃空气吹干；
S5，使用移液枪向管B中加入300-500μL浓度为1-1.5mol/L的PBS缓冲液和100-300μL浓度为1-1.5mmol/L的氯化钙溶液，轻轻吹打液体润洗管B内壁，吹打时应避免产生气泡；
S6，将管B放入离心机，在4000r/min下离心1min，用滴管取下层液体150μL作为待检样品；
S7，将S6中取得的待检样品滴入庆大霉素检测卡上的滴液区，观察反应结果，完成检测；
当检测卡上的质控线（C区）和检测线（T）均显示红色色带，无论颜色深浅均可判断检测样品为阴性；
当检测卡上的质控线（C区）显示为红色色带，检测线（T）不显示红色色带，初步判断检测样品为阳性；
当检测卡上的质控线（C区）不显示红色色带时，无论检测线（T）是否显示红色色带，该检测卡均判断为失效。
2.一种禽肉中庆大霉素检测卡，其特征在于：所述检测卡包括上壳（1）和下壳（2），所述上壳（1）的下沿设置有插块（3），所述下壳（2）的上沿开设有插槽（4），所述插块（3）与插槽（4）插接，所述上壳（1）上分别开设有滴液孔（5）和观察窗（6），所述滴液孔（5）位于观察窗（6）的一侧，所述观察窗（6）的内部粘接有透明保护壳（7），所述下壳（2）的上表面对应滴液孔（5）的位置设置有样品垫（8），所述样品垫（8）靠近观察窗（6）的一侧设置有胶体金结合垫（9），所述胶体金结合垫（9）靠近观察窗（6）的一侧设置有NC膜（10），所述NC膜（10）远离胶体金结合垫（9）的一侧设置有吸水垫（11），所述NC膜（10）上沿着胶体金结合垫（9）至吸水垫（11）的方向依次包被有呈条状的庆大霉素-载体蛋白偶联物（12）和羊抗鼠IgG（13）。
3.根据权利要求2所述的一种禽肉中庆大霉素检测卡，其特征在于：所述胶体金结合垫（9）上包被有抗庆大霉素单克隆抗体和胶体金的结合物，所述庆大霉素-载体蛋白偶联物（12）和羊抗鼠IgG（13）分别作为检测卡上的检测线（T）和质控线（C）。
4.根据权利要求2所述的一种禽肉中庆大霉素检测卡，其特征在于：所述样品垫（8）远离观察窗（6）的一侧面与胶体金结合垫（9）的一侧面接触，所述胶体金结合垫（9）的另一侧面与NC膜（10）的一侧面接触，所述NC膜（10）的另一侧面与吸水垫（11）的一侧面接触。
5.根据权利要求2所述的一种禽肉中庆大霉素检测卡，其特征在于：所述透明保护壳（7）为无色透明有机玻璃。
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