CN106769983A - 一种冬虫夏草的鉴别方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种冬虫夏草的鉴别方法，针对一种冬虫夏草部位，对m种冬虫夏草样本进行n个波数的红外光谱测定，样本的吸光度值称样本序列，m≥2，n≥10；对于每个波数，将不同冬虫夏草样本的吸光度值最大值定义为参考序列；计算每个波数下样本序列和参考序列的关联系数；计算样本序列和参考序列的关联度，关联度为各个波数下上述关联系数的算术平均数。所用各个冬虫夏草样品的品质鉴定方法如下：关联度为第一、第二、第三数值范围时，该冬虫夏草样本分别为优质冬虫夏草、劣质冬虫夏草和假冬虫夏草。本方法鉴别冬虫夏草克服了现有技术中标准品曲线方法中不能定量鉴定的缺点以及用代表性点光吸收度的片面性。

Description

一种冬虫夏草的鉴别方法

技术领域

本发明属中药材鉴别领域，涉及一种冬虫夏草的鉴别方法，具体涉及一种红外光谱技术鉴别冬虫夏草的品质或真伪的方法。

背景技术

冬虫夏草为麦角菌科虫草属真菌冬虫夏草菌Cordyceps sinensis Sacc.的子座及其寄主蝙蝠蛾科昆虫虫草蝙蝠蛾Hepialus armoricanus Oberthuk的幼虫尸体的复合物,为我国名贵中药材。主产于西藏、青海、四川、云南等海拔4000～5000m的高山草甸土中，系我国特产名贵中药。冬虫夏草中含有的化学成分有甾醇类、核苷类、多糖类、甘露醇、氨基酸等^[1-2]，其中的核苷类具有明显的药理活性，具有改善心脑血液循环^[3]、防止心律失常^[4]、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等作用。

目前市售的亚香棒虫草、凉山虫草、新疆虫草、地蚕、霍克斯虫草、白僵蚕、压模“虫草”冬虫夏草的质量并没有得到保证，甚至出现了“假虫草”，压模“虫草”，对人民群众的健康造成了严重威胁。寻找一种简便快速的鉴别手段显得非常重要。

化学研究表明冬虫夏草和虫草代用品中含核苷类、多醇类、多糖,另外还含有机酸、维生素、无机元素及其它化合物,其中核苷类和醇类合物被认为是冬虫夏草及虫草代用品中的活性化合物,被用来作用评价其质量优劣的指标。

测定冬虫夏草中虫草素等核苷类物质的含量,主要采用紫外分光光度法、薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)和毛细管电泳法。这些方法只能测定虫草中的某一成份，测定速度慢。

红外光谱分析技术近年来已成功应用于食品、烟草、药品及化工等诸多行业产品的分析测定，特别在农副产品的定性分析上，因其快速、无需前处理、非破坏性及多组分同时定量分析等优势而得到广泛的应用。日本早在70年代就已将红外光谱分析技术应用于茶叶多种组分的定量分析，如茶多酚、咖啡碱、全氮量、粗纤维等的定量分析，并取得了良好的效果。

傅里叶变换红外光谱技术在鉴别虫草的真伪、评判虫草品质方面，具有综合、客观、科学的特点。首先这种技术在分析鉴定时，无需对样品进行特别的处理，直接取样测定，做到了不失样品的原本性，也不破坏其组分；其次，测定的光谱图中的峰位、峰形、峰强代表着体系中所含相应各种基团的谱峰，它反映的是一个混合物中各种成分的叠加谱图，是测试样品本质的特征。混合物中的组成、含量等因素的变化都会引起光谱整体谱图的变化，根据这些宏观特征，可以实现虫草的快速鉴定与质量控制。

D1公开了一种鉴别冬虫夏草的方法，其核心思路是用多批次的冬虫夏草建立红外光谱模型，然后比较其他其他冬虫夏草或混有不同杂质的冬虫夏草的红外光谱，根据连续区间的红外光谱的区别进行鉴别冬虫夏草。该发明能够区分其所用各个测试样本与标准曲线之间的差别，但是还不能够进行定量研究与定量判定。

D2公开了冬虫夏草子座的红外光谱分析鉴定方法，其核心思路是以过个产地各多份虫草样品的平均光谱绘制冬虫夏草子座标准红外光谱，然后比较其他样品与标准曲线中若干个峰值的差别，用以鉴别冬虫夏草子座。该发明至少有如下不足之处：

(1)标准曲线是混合样品制备的，就必然会淹没地区间与地区内虫草红外光谱的差别。

(2)比较的是若干个点，就必然会忽略了更大波长范围内的吸光度。

(3)两个样品在不同波长下的光吸收差别往往是不一样的，不同波长的光吸收差别用同一个比较标准也不客观，样本间离散程度最大的波长与样本间离散程度最小的波长下均用平均值，则大大掩盖了真实的差异程度。特别是，“在选取若干个峰位置中，通过判断被测样品光谱与冬虫夏草子座标准光谱之间的显著性水平为0.01时它们的相关系数在下限阈值0.95以上，则该被测样品是真品冬虫夏草子座”这样的标准很不客观。

D3与D4的核心与D2相同，技术构思的主要差别在于测试的虫草部位不同，也具有与D2相同的不足之处。

D5公开了一种快速鉴别虫草菌丝体真伪的方法，其核心构思路是比较待测样品与空白的溴化钾压片的光谱差别，不能够良好地比较不同的虫草菌丝体，更不能良好地鉴定虫草菌丝体真伪。

本部分引用现有技术中的期刊：

[1]李进，张文生，杜树山，等.RP-HPLC法测定青海不同产地冬虫夏草中核苷类成分的含量.中国药房，2010年第21卷第3期,234-236

[2]金道山，江朝光，梅世昌，等.比色法测定冬虫夏草中甘露醇的含量.药物分析杂志，1998,18:120-122

[3]石岩，王钢力，秦文杰，等.冬虫夏草的化学成分综述.中医研究，2006,19(7):54-56

[4]周惠燕，陈钰，等.冬虫夏草中核苷类化学成分的含量测定研究进展.中成药，2011，11(33):1955-1958

本部分引用现有技术中的专利文献：

D1：中国专利文献，公开号：103499553公开日：2014.01.08；

D2：中国专利文献，公开号：103698296公开日：2014.04.02；

D3：中国专利文献，公开号：103760126公开日：2014.04.30；

D4：中国专利文献，公开号：103674887公开日：2014.03.26；

D5：中国专利文献，公开号：103105374公开日：2013.05.15；

总之，现有技术中标准品曲线方法中不能定量鉴定，用代表性点光吸收度进行鉴定具有片面性。

发明内容

为解决至少上述技术问题，为了能够定量鉴定多个冬虫夏草样品，获知不同测试样品与优质品之间通过关联度来衡量的差别大小，本发明提供一种冬虫夏草的鉴别方法，包括：

针对一种冬虫夏草部位进行如下步骤的处理：

步骤1)：对m种冬虫夏草样本进行红外光谱测定，测定的波数数量为n，记录每个波数下的吸光度值，样本的吸光度值称样本序列，其中m≥2，n≥10；

步骤2)：对于每个波数，比较不同冬虫夏草样本的吸光度值，将吸光度值的最大值定义为参考序列；

步骤3)：计算每个波数下，所述样本序列和所述参考序列的关联系数；

步骤4)：计算所述样本序列和所述参考序列的关联度，所述关联度为每个波数下所述样本序列和所述参考序列的关联系数的算术平均数。

通过该方法，将多个波数下的吸光值进行定量分析，就能够克服基于光谱曲线分析方法中不能定量比较的缺点。

由于两种冬虫夏草样品在不同波长下，其吸光度值的差别有明显的不同，通过关联度的计算，就能够反映出两个样本的整体区别，而不是现有技术中片面地分析几个典型波长下的吸光度值，这更有利于全面比较吸光度值的差别进而更准确地判断所测试样品的品质。

在一些实施方案中，所用各个冬虫夏草样品的品质鉴定方法如下：

所述关联度为第一数值范围r1，该冬虫夏草样本为优质冬虫夏草；

所述关联度为第二数值范围r2，该冬虫夏草样本为劣质冬虫夏草；

所述关联度为第三数值范围r3，该冬虫夏草样本为假冬虫夏草。

由于关联度可以客观地全面地反应冬虫夏草质量与参考序列的差别，因此，根据冬虫夏草的差别以及假冬虫夏草的特性，可以通过不同关联度范围来判定优质冬虫夏草、劣质冬虫夏草、假冬虫夏草。

在一些实施方案中：

所述第一数值范围为：0.7＜r1≤1；

所述第二数值范围为：0.35＜r2≤0.7；

所述第三数值范围为：r3≤0.35。

根据所用冬虫夏草的部位不同，治疗或保健等目的不同，上述数值范围时可以调整的。

在一些实施方案中：

所述步骤2)中参考序列{M_ir}的计算方法为：其中：

样本序列矩阵为{M_ij}，其中i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m；

参考序列为{M_ir}，其中i＝1,2,…,n；

所述步骤3)中样本序列{M_ij}和参考序列{M_ir}的关联系数s(M_ir,M_ij)按下式计算：

其中，i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m；α为分辨系数，取0.5；

所述步骤4)中样本序列{M_ij}和参考序列{M_ir}的关联度计算式为：

在一些实施方案中：

所述冬虫夏草部位为冬虫夏草子座。

根据需要可以选用冬虫夏草的其他部位或整株。

在一些实施方案中：

m＝3；n＝341。

根据需要，可以测定更多种冬虫夏草，也可选择其他波数范围来测量。

在一些实施方案中：

选用果洛冬虫夏草子座、刚察冬虫夏草子座、祁连冬虫夏草子座进行红外光测定。

根据需要，可以选用前提地区冬虫夏草，也可选用假虫草来测定。

在一些实施方案中：

所述步骤1)中：

待测品与KBr的比例为1∶100混合，研磨充分均匀，压片测定；

采用Spectrum BXⅡ红外光谱仪，扫描的波数范围为4000～400cm^-1，中红外DGTS检测器，扫描次数累加16次，分辨率4cm^-1。

在一些实施方案中：

选取波数范围850cm^-1～1190cm^-1进行计算。

根据具体条件和测定目的，可以选用其他红外光谱仪，采用其他测定条件。

在一些实施方案中：

针对第m+1种待测冬虫夏草样本，按照前m种冬虫夏草样本相同的处理方法，将所述第m+1种待测冬虫夏草样本的测试数据与所述前m种冬虫夏草样本的测试数据合并进行计算与鉴别判断。

本方法鉴别冬虫夏草克服了现有技术中标准品曲线方法中不能定量鉴定的缺点以及用代表性点光吸收度的片面性。

具体实施方式

为了更好的解释本发明的技术方案，下面详细介绍本发明的各个实施例。以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的固定或限制。若未特别指明，实施例中所用的技术特征可以替换为具有在不背离发明构思前提下等同或相似功能或效果的其他本领域已知的技术特征，本发明的不同模块的任意组合均落入本发明的保护范围。

实验材料

冬虫夏草，采集自青海省果洛、刚察，祁连等不同地区。

实验仪器

Spectrum BXⅡ红外光谱仪，PerkinElmer公司；

YP－2压片机，上海山岳科学仪器有限公司。

试验方法

(1)压片的制备

KBr压片法制样，待测品与KBr的比例为1∶100混合(1mg待测品和100mgKBr混合)研磨充分均匀，压片测定。

(2)测试条件

光谱范围(扫描的波数范围)4000～400cm^-1，中红外DGTS检测器，扫描次数累加16次，分辨率4cm^-1。

(3)数据分析

分析软件:采用Perkin－Elmer公司的定性分析软件。

对比实施例与模型建立

1.吸光度值数据的测量

选用果洛虫草子座、刚察虫草子座、祁连虫草子座，分别制作KBr压片，测定波数范围是400cm^-1-4000cm^-1,选取建模的波数范围为850cm^-1-1190cm^-1，记录该范围内每整数波数下的吸光度值。具体数值如表1所示。

2参考序列的选择

为了使计算出的关联度能够评价不同地区冬虫夏草的质量，必须先选择参考序列。假设有样本序列矩阵{M_ij}(i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m)。i代表某种虫草样品的波数数值的序列号，一共比较n个波数数值，j代表样品的序列号，一共使用m种虫草样品。

其中参考序列的选择是根据理论制高点的原理确定的，对于每个波数，比较不同虫草样品的吸光度值，吸光度值的最大值定义为参考序列，设参考序列为{M_ir}，(i＝1,2,…,n)，其中

所以样本和参考序列的关联度越大，质量越好。

其中：m＝3；n＝341。

3计算关联系数

样本序列{M_ij}和参考序列{M_ir}的关联系数s(M_ir,M_ij)按下式计算：

其中(i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m)；α为分辨系数，取0.5。

4计算关联度

样本序列{M_ij}和参考序列{M_ir}的关联度计算式为三种冬虫夏草样本和参考序列的关联度参见表2。

5.样本品质的鉴定

所用各个冬虫夏草样品的品质鉴定方法如下：所述关联度为第一数值范围r1，该冬虫夏草样本为优质冬虫夏草；所述关联度为第二数值范围r2，该冬虫夏草样本为劣质冬虫夏草；所述关联度为第三数值范围r3，该冬虫夏草样本为假冬虫夏草。

所述第一数值范围为：0.7＜r1≤1；所述第二数值范围为：0.35＜r2≤0.7；所述第三数值范围为：r3≤0.35。

通过表1的2-4列的数据可以看出，在所列波数范围内，每种样本的光吸收度值呈中间大两端小的特点。7-8列的数据可以看出，在所列波数范围内，非参考序列与参考序列的关联系数呈中间小两端大的特点，将上述五列数据中的端点和极值的典型数据摘抄出来，形成表3，更方便地看出所有数据的宏观趋势。

特定样本在该波数范围内的吸光度值的最大值与最小值差别可以达到约零点五倍到一倍。非参考序列与参考序列的关联系数中最大值与最小值的差别也高达约零点五倍。

这可以说明，不同波长(或用波数来表示)下冬虫夏草样本的吸光度值差别很大，关联系数也差别较大，所以不同波长下的吸光值用相同的判断标准来区分标准品与待测品是不够客观的，有必要用定量的方法研究与检测虫草。计算每个波数下的关联系数可以定量研究。

为了更方便地表征测试的样本与参考序列的差异，用关联度可以综合评价差异，进而对测量样本进行品质鉴定。

而本发明所用关联度的概念可以从总体上对所测波长范围内的吸光度差别进行衡量，克服了不同波长下一个样本的吸光值的差别以及不同波长下样本间吸光值的差别所带来的比较的标准不统一。可以克服用若干个点吸光度差值判断冬虫夏草质量的片面性。另外，也能够克服曲线法肉眼观察的误差和不能定量研究与测试的缺点。

表1样本的吸光度值以及样本和参考序列的关联系数

表2样本和参考序列的关联度

表3样本的吸光度值以及样本和参考序列的关联系数的典型数值

以上各个实施例只是用于进一步说明本发明，并不是用来限制本发明的保护范围，凡是基于本发明的构思所作出的等同变换及对本发明的各个技术方案显而易见的改进，均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，包括：

针对一种冬虫夏草部位进行如下步骤的处理：

步骤1)：对m种冬虫夏草样本进行红外光谱测定，测定的波数数量为n，记录每个波数下的吸光度值，样本的吸光度值称样本序列，其中m≥2，n≥10；

步骤2)：对于每个波数，比较不同冬虫夏草样本的吸光度值，将吸光度值的最大值定义为参考序列；

步骤3)：计算每个波数下，所述样本序列和所述参考序列的关联系数；

步骤4)：计算所述样本序列和所述参考序列的关联度，所述关联度为每个波数下所述样本序列和所述参考序列的关联系数的算术平均数。

2.如权利要求1所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

所用各个冬虫夏草样品的品质鉴定方法如下：

所述关联度为第一数值范围r1，该冬虫夏草样本为优质冬虫夏草；

所述关联度为第二数值范围r2，该冬虫夏草样本为劣质冬虫夏草；

所述关联度为第三数值范围r3，该冬虫夏草样本为假冬虫夏草。

3.如权利要求2所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

所述第一数值范围为：0.7＜r1≤1；

所述第二数值范围为：0.35＜r2≤0.7；

所述第三数值范围为：r3≤0.35。

4.如权利要求1所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

所述步骤2)中参考序列{M_ir}的计算方法为：其中：

样本序列矩阵为{M_ij}，其中i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m；

参考序列为{M_ir}，其中i＝1,2,…,n；

所述步骤3)中样本序列{M_ij}和参考序列{M_ir}的关联系数s(M_ir,M_ij)按下式计算：

$s\left(M_{ir},M_{ij}\right)=\frac{\underset{i}{\min }\underset{j}{\min }|M_{ij}-M_{ir}|+\mathrm{\α}\underset{i}{\max }\underset{j}{\max }|M_{ij}-M_{ir}|}{|M_{ij}-M_{ir}|+\mathrm{\α}\underset{i}{\max }\underset{j}{\max }|M_{ij}-M_{ir}|};$

其中，i＝1,2,…,n；j＝1,2,…,m；α为分辨系数，取0.5；

所述步骤4)中样本序列{M_ij}和参考序列{M_ir}的关联度计算式为：

5.如权利要求1所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

其中，所述冬虫夏草部位为冬虫夏草子座。

6.如权利要求1所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

其中：m＝3；n＝341。

7.如权利要求1所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

选用果洛冬虫夏草子座、刚察冬虫夏草子座、祁连冬虫夏草子座进行红外光测定。

8.如权利要求1所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

所述步骤1)中：

待测品与KBr的比例为1∶100混合，研磨充分均匀，压片测定；

采用Spectrum BXⅡ红外光谱仪，扫描的波数范围为4000～400cm^-1，中红外DGTS检测器，扫描次数累加16次，分辨率4cm^-1。

9.如权利要求8所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

选取波数范围850cm^-1～1190cm^-1进行计算。

10.如权利要求1-9中任一项所述的冬虫夏草的鉴别方法，其特征在于，

针对第m+1种待测冬虫夏草样本，按照前m种冬虫夏草样本相同的处理方法，将所述第m+1种待测冬虫夏草样本的测试数据与所述前m种冬虫夏草样本的测试数据合并进行计算与鉴别判断。