CN106755238A - 一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab’)2和Fc片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法，其包括蛋白酶解步骤和蛋白A磁珠纯化步骤。本发明的方法操作简便、纯化效率高、精确可靠。

Description

一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab’)2和Fc片段的方法
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法。
背景技术
在生物制药领域，单克隆抗体药物包含同源单克隆抗体及重组单克隆抗体,在重组单克隆抗体中,其F(ab')2和Fc片段来源于不同的两个种属之间，通过基因工程将两个片段重组后进行细胞培养以生产抗体蛋白.在蛋白抗体结构分析中，由于F(ab')2和Fc片段其来源、功能及结构的差异,各片段的结构功能分析对整体蛋白的结构功能判断分析有重要指导意义。例如，由于蛋白质翻译后修饰作用可引起F(ab')2和Fc片段上的寡糖种类的差异，而抗体蛋白寡糖的种类对抗体结合活性，生物活性，药物半衰期，电荷异构性等有重要影响，是抗体蛋白质量检验中不可或缺的部分，因此需要对F(ab')2和Fc片段进行分离纯化以便后续质检实验分析。由于F(ab')2片段上寡糖种类复杂，寡糖末端链接的唾液酸对抗体电荷异构有重要影响，且受到培养基基质，培养条件等因素影响较多，F(ab')2片段的分离纯化对其后的分析尤为重要。
目前一般完整蛋白从酶解到分离纯化为各片段的实验室流程分为蛋白酶解、蛋白A亲和层析纯化分离、样品脱盐浓缩及更换保存缓冲液。流程如下：(1)蛋白抗体经过特异性酶解后，抗体分离为F(ab')2和Fc片段。(2)酶解后抗体片段经过蛋白A亲和层析进行分离纯化。如图1所示，各片段收集过程根据UV 280nm值信号变化开始和结束收集。图中实线为UV280nm信号值变化曲线，虚线为缓冲液pH值变化曲线。使用平衡流动相(20mM Tris，100mMNaCl，pH 7.4±01)平衡蛋白A亲和层析柱后开始进样，由于F(ab')2不能被吸附在蛋白A层析柱上，这部分片段将首先被冲洗出系统。信号上升时开始收集，信号降落到基线附近停止收集。更换流动相为50mM柠檬酸缓冲液(pH 3.8±0.1)将Fc片段从层析柱中洗脱，信号上升时开始收集，信号降落到基线附近停止收集。(3)抗体片段缓冲液置换及浓缩：经过蛋白A亲和层析分离纯化的抗体片段使用超滤管或溶液置换装置更换溶液缓冲液及样品浓缩。使用10kDa超滤管在14000g高速离心去除分离纯化缓冲液并浓缩至一定浓度以备后续实验分析使用。
现有技术中的方法存在以下缺点：(1)耗时长。酶解后样品需要经过纯化系统进行纯化，并且纯化分离后样品体积大大增加，需要使用超滤装置或溶液置换装置进行溶液更换及浓缩。并且，不同蛋白抗体分离纯化不能同时进行分离纯化，纯化时间随样品数量的增加而增加。纯化后处理的超滤或者溶液置换随样品体积的增加而增加。根据样品数量的不同,一般超滤或溶液置换的时间可由数十分钟到数小时，甚至十数小时。(2)实验成本高。实验室需要配备纯化系统，超高速离心机，超滤装置或溶液置换装置等实验仪器，实验使用流动相，超滤管，蛋白A亲和层析填料等试剂耗材较多，均大大增加实验成本。(3)样品及试剂消耗量大。为增加回收率，单次需至少使用2mg样品进行蛋白A亲和层析，需使用较多量的酶进行酶解分离。同时,纯化分离及最后溶液置换步骤中要配制大量缓冲液进行实验。(4)对实验人员要求高。实验人员需要具备操作纯化系统，超滤装置或溶液置换装置能力；实验人员需要具备有蛋白样品处理，纯化，超滤及溶液置换等经验。人员数量及实验各综合能力要求较高。(5)回收率及终样品浓度难以控制。经过纯化分离及后续超滤浓缩后，由于样品转移次数较多，极容易造成样品在处理过程中回收率降低，直接导致最后样品浓度难以确认，可对后续实验分析造成影响。
发明内容
本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种操作简便、纯化效率高、能够快速、高效纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法，其包括蛋白酶解步骤和蛋白A磁珠纯化步骤。
优选地，所述蛋白酶解步骤的操作如下：
在66μg浓度为1mg/mL的抗体蛋白溶液中加入2μL浓度为67μg/μL的酶，混匀，37℃恒温孵育2小时。待孵育结束后，室温冷却，加入32μL 0.02M PBS，混匀，得到抗体酶解样品。如抗体蛋白量较多，为充分酶解可相应延长孵育时间。
优选地，所述蛋白A磁珠纯化步骤的操作包括：
步骤1.取100-150μL蛋白A磁珠，去除磁珠保存液；使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，剧烈振荡10秒，然后进行磁珠吸附，移除第一上清液。
步骤2.添加100μL所述抗体酶解样品与磁珠涡旋混匀，室温振荡孵育30-50分钟。期间可涡旋或手动混匀以防止磁珠聚集沉淀。
步骤3.孵育结束，离心，待磁珠吸附。溶液澄清后移出第二上清液，由所述第二上清液中得到纯化的F(ab')2片段。
步骤4.使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，涡旋后离心，待磁珠吸附后移除第三上清液。此步骤优选重复3次以上，更优选重复3-5次。
步骤5.添加50μL 0.2M Glycine-HCl缓冲液，充分涡旋混匀，室温静置5-8分钟。
步骤6.离心，待磁珠吸附，溶液澄清后移出第四上清液，由所述第四上清液中得到纯化的Fc片段。
更优选地，该方法还包括在获得纯化的Fc片段后，添加5μL 1M Tris于第四上清液中，中和Fc片段溶液pH以保存抗体片段。
本发明的方法利用抗体Fc片段可与蛋白A特异性吸附及磁场力的原理将抗体片段分离。首先使用包被有蛋白A的磁珠在碱性条件下特异性吸附已经分离的Fc片段，然后将样品置于磁力架上，磁珠将在磁场力聚集沉淀，而未被吸附的F(ab')2片段将留在溶液中，使用移液枪移出含有F(ab')2溶液并保存，最后在酸性条件下将吸附于磁珠上的Fc片段分离，使用磁力架将磁珠聚集沉淀，移出Fc片段溶液并保存。
该方案从完整蛋白到酶解分离纯化最快可于3小时内完成。利用F(ab')2，Fc特异性剪切酶将抗体片段分离，再使用商业化蛋白A/G包被磁珠(例如PureProteomeTM Magnetic beads，Millipore)对酶解溶液进行分离纯化。
与现有技术相比，本发明的方法可大大减少实验使用时间及实验费用；样品无需经过纯化系统进行分离纯化，并且可同步进行多品种蛋白抗体片段的分离纯化；同时，抗体片段纯化分离后无需再进行超滤或溶液置换以更换保存溶液和样品浓缩,包括酶解分离在内，可使所有实验流程缩短至3小时.由于无需使用纯化系统、亲和层析填料、层析柱、超滤系统或溶液置换系统、高速离心机、超滤管等昂贵的实验仪器及耗材，大大降低了实验成本及仪器维护成本；蛋白A包被磁珠可重复利用至少三次，并且实验过程所有使用溶液体积均为微升级别，消耗极少量的蛋白样品及缓冲溶液，同时无需配制纯化流动相或保存缓冲液，进一步简化实验操作并降低成本。
由于样品体积小且无需多次转移，本发明中实验过程中可对样品的浓度进行良好的控制，最后纯化分离后的样品浓度明确，可直接保存在洗出溶液中或进行后续分析实验。
此外，此实验操作流程简易，实验人员无需经过大量专业培训即可完成操作，可以很好的规避操作人员在复杂实验中产生的失误。
附图说明
图1是现有技术中蛋白A亲和层析分离F(ab')2和Fc片段实验各监视信号值变化标准图谱。
图2是抗体片段的SDS-PAGE结果。
图3是纯化系统样品分离纯化时间信号图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。
本发明中磁珠分离步骤需要使用的试剂耗材如下:PBS溶液,pH 7.0-7.5；0.2MGlycine-HCl,pH 2.5-3.0；1M Tris,pH 8.5；蛋白A包被磁珠；磁力架；微孔板振荡器。
本发明方法的具体实验操作流程见下(从完整蛋白到片段分离纯化)：
一、蛋白酶解
1、在66μg抗体蛋白溶液(1mg/mL)中加入2μL(67μg/μL)酶，混匀，37℃恒温孵育2小时(如抗体蛋白量较多，为充分酶解可相应延长孵育时间)。
2、孵育结束，室温冷却。添加32μL 0.02M PBS至上述溶液中，混匀，得到抗体酶解样品。
二、蛋白A磁珠纯化
1、取出100-150μL商业化蛋白A磁珠(PureProteomeTM Magnetic beads，Millipore)放入新1.5mL离心管，根据说明去除磁珠保存液。使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，涡旋振荡器剧烈振荡10秒后将离心管置于磁力架，待磁珠吸附后，移液枪移出上清液。
2、添加抗体酶解样品共100μL入磁珠离心管中，涡旋混匀，室温振荡孵育30-50分钟。期间可涡旋或手动混匀以防止磁珠聚集沉淀。
3、孵育结束，离心，放置离心管于磁力架上待磁珠吸附。溶液澄清后使用移液枪移出上清液并保存在新1.5mL离心管①中。注意吸取样品是不要碰触磁珠。新离心管①中为纯化F(ab')2片段，浓度约为0.44mg/mL。
4、使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，涡旋后离心，放置于磁力架上，待磁珠吸附后移除上清液。此步骤重复3次或以上，优选3-5次。
5、添加50μL 0.2M Glycine-HCl缓冲液，充分涡旋混匀，室温静置5-8分钟。
6、离心，放于磁力架上，待磁珠吸附，移出上清液至新1.5mL离心管②中。此管样品为纯化Fc片段，浓度约为0.44mg/mL。
7、添加5μL 1M Tris于Fc片段溶液中，以中和溶液pH。
若重复使用磁珠，可向磁珠中添加100μL 0.2M Glycine-HCl缓冲液，充分涡旋混匀，室温静置3-5分钟。离心后放于磁力架上，待磁珠吸附，移出上清液。添加500μL 0.02MPBS清洗三次磁珠后即可重复利用磁珠。
实施例
此实验方案可在3小时内取得样品并且可立即进行后续实验分析，根据方案制备抗体片段。使用12％分离胶对酶解后样品及三次重复磁珠分离样品进行分析验证。图2为抗体片段的SDS-PAGE结果。图中,Lane1为分子量Marker(Thermo)，Lane2为抗体内切酶，Lane3为完整IgG，Lane4为酶切IgG，Lane5、7、9为F(ab')2片段，Lane6、8、10为Fc片段。对比Lane5和6可见该方案分离效果确实可靠，F(ab')2片段可与Fc片段完全分离。同时，重复利用磁珠可见F(ab')2分离效果依旧理想(Lane5、7、9)，而Fc片段被磁珠全部捕获(Lane6、8、10)。
可见，本方法能将Fc片段完全从酶解混合样品中分离出来，纯化效率高，分离出的F(ab')2片段样品可以直接进行后续检测，为相关分析质检实验提供可靠有效的数据。
与现有的分离方法相比，该方法可减少大部分实验成本，无需纯化系统，超滤装置，超高速离心机等昂贵实验仪器，仅需购置蛋白A/G包被磁珠及磁力架即可完成实验，且磁珠可重复利用三次以上而未见分离效果降低。此外，该方法还可大幅度减少实验时间，可在3小时内完成抗体酶解及纯化分离，而现有技术中使用纯化系统分离2mg样品通常需要耗时约2小时(见图3，为纯化系统样品分离纯化时间信号图)。分离后收集抗体样品液体体积分别可达到10-40mL，根据超滤管体积大小，使用超滤离心进行浓缩及溶液置换需要耗时5-6小时或更多。
此外，本方法操作简便，步骤清晰明了。无需复杂的处理步骤，同时减少样品转移的次数，实验中酶解后样品只需转移一次，磁珠纯化分离后即可收获样品，减少实验步骤繁复所增加的实验操作及实验人员失误，减少样品在实验过程中的损失。样品收获后即可进行后续实验或保存于缓冲液中，无需更换样品保存缓冲液。如需增加样品量可根据方案等比例调整磁珠使用量，精确可靠。

Claims (4)

1.一种快速纯化分离蛋白抗体F(ab')2和Fc片段的方法，其特征在于包括蛋白酶解步骤和蛋白A磁珠纯化步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶解步骤的操作如下：在66μg浓度为1mg/mL的抗体蛋白溶液中加入2μL浓度为67μg/μL的酶，混匀，37℃恒温孵育2小时；待孵育结束后，室温冷却，加入32μL 0.02M PBS，混匀，得到抗体酶解样品。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述蛋白A磁珠纯化步骤的操作包括：
步骤1.取100-150μL蛋白A磁珠，去除磁珠保存液；使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，剧烈振荡10秒，然后进行磁珠吸附，移除第一上清液；
步骤2.添加100μL所述抗体酶解样品与磁珠涡旋混匀，室温振荡孵育30-50分钟；
步骤3.孵育结束，离心，待磁珠吸附，溶液澄清后移出第二上清液，由所述第二上清液中得到纯化的F(ab')2片段；
步骤4.使用500μL 0.02M PBS清洗磁珠，涡旋后离心，待磁珠吸附后移除第三上清液,该步骤重复3-5次；
步骤5.添加50μL 0.2M Glycine-HCl缓冲液，充分涡旋混匀，室温静置5-8分钟；
步骤6.离心，待磁珠吸附，溶液澄清后移出第四上清液，由所述第四上清液中得到纯化的Fc片段。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括在获得纯化的Fc片段后，添加5μL 1M Tris于第四上清液中，中和Fc片段溶液pH以保存抗体片段。
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