CN106754511A

CN106754511A - 一种枯草芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN106754511A
Application number: CN201611196867.4A
Authority: CN
Inventors: 陈永明; 李坤; 卢祯鑫; 陈丽萍
Original assignee: Fujian Luodong Bio Technology Co ltd
Current assignee: Fujian Luodong Bio Technology Co ltd
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2016-12-22
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-12-22
Also published as: CN106754511B

Abstract

本发明涉及了一种保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌及其应用。所述枯草芽孢杆菌在微好氧环境中具有较强产酶能力，脂肪酶的活性较强。所述枯草芽孢杆菌在有机肥发酵上能降低氨气的挥发，保护肥效的作用；在养殖场除臭抑菌应用上,可减少大肠菌群的数量，强烈抑制环境中的有害微生物，调整环境生态平衡，有益养殖环境健康。在畜禽尸体无害化处理应用中，可有效分解油脂，减少臭气的排放。在生物发酵床应用上，可做到使得猪粪分解更为彻底，散发的氨气等有害气体减少。

Description

一种枯草芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物应用领域，特别涉及一种枯草芽孢杆菌及其应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌，可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。在遗传学研究中应用广泛，对此菌的嘌呤核苷酸的合成途径与其调节机制研究较清楚。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故名。

枯草芽孢杆菌是一种多功能的微生物，目前在有机肥发酵或发酵床制作中有一定的应用，但并非所有的枯草芽孢杆菌株在以上领域是有效的。

堆肥是利用含有肥料成分的动植物遗体和排泄物，加上泥土和矿物质混合堆积，在高温、多湿的条件下，经过发酵腐熟、微生物分解而制成的一种有机肥料。自然堆肥发酵过程长，而且在堆积发酵过程中，温度升高，pH升高，容易造成氨气溢出，总氮减少，以NH₃形式挥发损失的氮含量有时高达氮损失总量的92％，需要解决氨气的挥发问题，减少氮的损失，保护肥效。

我国是牲畜养殖大国，畜牧业发展的同时，由于牲畜饲料基数大，每天因自然死亡和病害死亡的牲畜数量相当庞大。根据动物死亡原因，动物尸体的来源可以分为自然淘汰或自然死亡，病害死亡两种形式。自然死亡淘汰危害较小，因疫病死亡的动物尸体不当处理不但对水源、土壤、大气污染严重，还容易造成疫病的传播和蔓延。患有口蹄疫、猪瘟、高致病性禽流感等具有强传染性的染疫动物尸体，甚至严重威胁到人类的生命与健康。传统的动物死尸处理主要有填埋法、消毒法、焚烧法、化制法、生物降解法(发酵法)。其中，利用生物降解法处理动物尸体，但处理尸体的时间过长，处理过程有恶臭产生。

发明内容

本发明人通过对枯草芽孢杆菌的研究、筛选和验证，提供了一种在微好氧环境中具有较强产酶能力的枯草芽孢杆菌，该枯草芽孢杆菌株制剂和含有其成分的组合物，可有效运用于有机肥发酵、病死畜禽尸体无害化处理、生物发酵床。

为本发明的第一个发明目的，本发明提供了保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学；分类命名为：枯草芽孢杆菌3号，Bacillus Subtilis 3号；保藏编号为：CCTCC M2016443，保藏日期为：2016年9月1日的枯草芽孢杆菌。本发明的枯草芽孢杆菌在微好氧环境中有较强的产酶能力，所产脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶的活力较强。

为达到本发明的第二个发明目的，本发明提供保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌在有机肥发酵上的应用。

所述枯草芽孢杆菌在有机肥的后熟阶段中大量繁殖，抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌等有害菌繁殖，同时可减少有机肥发酵过程中的氨气排放量，保护肥效。

为达到本发明的第三个发明目的，本发明提供一种用于有机肥发酵的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

所述枯草芽孢杆菌在有机肥的后熟阶段中大量繁殖，有效抑制大肠杆菌等致病菌繁殖。同时可减少有机肥发酵过程中的氨气排放量，保护肥效。

为达到本发明的第四个发明目的，本发明提供一种用于养殖场粪便污水处理的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌可在生物发酵床中的粪便和尿液发酵过程中快速繁殖，可抑制金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肠炎沙门氏菌等有害菌繁殖，同时可减少有机肥发酵过程中的氨气排放量，保护肥效。

为达到本发明的第五个发明目的，本发明提供一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌可快速分解尸体中的油脂，降低空气中氨气浓度，减少环境污染。同时所述枯草芽孢杆菌具有快速的繁殖能力，可极大减少致病菌的数量。

为达到本发明的第六个发明目的，本发明提供一种用于生物发酵床的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

进一步地，用于生物发酵床的组合物，包括100质量份保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌，100质量份保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌的和800质量份的沸石粉。其中保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌活菌数为1.0×10⁸CFU/g～5.0×10⁸CFU/g，保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌活菌数为5.0×10⁹CFU/g～1.0×10¹⁰CFU/g。

所述保藏编号为：CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌,保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为：湖北省武汉市，洪山区八一路，武汉大学；分类命名为：枯草芽孢杆菌1号，Bacillus Subtilis1号；保藏日期为：2016年09月1日。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌可强烈抑制环境中的有害微生物，特别是大肠杆菌的繁殖，调整环境生态平衡，有益养殖环境健康。

为达到本发明的第七个发明目的，本发明提供一种用于养殖场除臭抑菌的组合物，所述组合物中含有保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

具体实施方式

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例详予说明。

保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌为发明人在禽畜粪便污水中分离筛选出，其能耐高温(在100℃可存活10分钟以上)、耐酸(可在pH值为2.5的环境中存活)、耐胆盐(在胆盐中存活率在90％以上)。

所述枯草芽孢杆菌菌株发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和甘露醇，形成酸，不产气，不分解乳糖，不形成吲哚、硫化氢；产酶有淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、脂肪酶；形成的菌落表面粗糙，不透明，成灰白色，边缘不扩张，呈不规则略带状，菌落整体呈大致圆形；细胞杆状，有芽孢，芽孢椭圆形中生或近中生，芽孢囊不明显膨大，在7％氯化钠中生长，V-P测定阳性，硝酸盐还原阳性，能从D-甘露醇产酸，不利用丙酸盐。该枯草芽孢杆菌具有极强的污水处理能力，降低氨气排放量，从而减少环境污染。

在分离筛选中，所用的样品为禽畜粪便污水，所用培养基按1L蒸馏水、0.3％牛肉膏、1％蛋白胨、1.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5％葡萄糖的配方配置，并在121℃灭菌20分钟，pH控制在7.2～7.4。用灭菌后的NaCl溶液，稀释样品，得到样品液。将样品液涂布在以上培养基后，在37℃、培养48h后，挑选长势良好、菌落形态相似且数目最多的菌落，分离纯化直至菌落形态一致的单菌。将分离出的单菌进行淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶的检测试验，筛选出可分泌淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶的单菌；对筛选出的10个菌株再进一步进行粪便污水处理试验进行筛选，选出粪便污水处理能力最强的菌种，粪便污水的主要污染成分是粗蛋白、粗脂肪和少量淀粉等，且微生物所处的环境是微好氧环境，因此筛选菌株的目标是在微好氧环境中的产酶能力，该菌株在微好氧情况下其菌液淀粉酶活力可达10.3U/ml，蛋白酶活力可达65.5U/ml，脂肪酶活力可达739.5U/ml。筛选出的单菌为保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌。

筛选出的菌种保存在砂土管、冷冻干燥管中，将处于休眠状态。使用时需要进行活化、培养，获得一定数量的纯种菌。

枯草芽孢杆菌的培养方法，包括如下步骤：

a、菌种活化：将处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化

b、菌种扩大培养：将菌种依次经过一级种子摇床培养、二级种子罐培养、三级种子罐培养、发酵罐进行扩大培养。

所述菌种扩大培养用培养基包括如下组分：玉米淀粉、豆粕粉、玉米浆、酵母浸粉、K₂HPO₄、蛋白胨、MgSO₄.7H₂0；所述培养基的pH值为7.5。

实施例1 有机肥发酵试验

本试验设2个对照组和1个测试组。每组按85％猪粪、15％秸秆的重量比例堆制3组有机肥，对照组1不添加任何菌种；对照组2在每立方堆肥原料中添加了保藏号为CCTCCM2016441的枯草芽孢杆菌100g(活菌数为1.0×10¹⁰CFU/g)；测试组在每立方堆肥原料中添加了保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌100g(活菌数为1.0×10¹⁰CFU/g)和保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌100g(活菌数为1.0×10⁹CFU/g)；3组有机肥混匀后堆积，每隔一天翻倒一次。

对照组1发酵时间为28天，其中第3～12天为高温期，高温期温度在58～70℃。

对照组2发酵时间为20天，其中第3～8天为高温期，高温期温度在65～72℃。

测试组发酵时间为20天，其中第3～8天为高温期，高温期温度在66～70℃。

发酵堆肥结束后对3组的堆肥取样并测定养分含量，结果如下：

保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌与保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌合用，肥力得到巩固。同时，在堆积发酵过程中，添加保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌与对照组相比可显著降低翻堆时的氨臭味。堆积完成后，保藏号为CCTCCM2016443的枯草芽孢杆菌在有机肥中检测活菌含量达到1.0×10⁷CFU/g。

实施例2 草莓种植试验

选用二组大棚草莓，每组草莓种植面积为100平方米，草莓种植时施用，6个月后进行采收。对照组施用实施例1中对照组2发酵的有机肥，试验组施用实施例1中测试组发酵的有机肥。

在播种180天后，对草莓进行采收，对照组草莓亩产量为430kg，试验组草莓亩产量为508kg，试验组草莓产量高出对照组18％。试验结果表明，在有机肥料堆中添加保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌具有明显的增加堆肥和土壤肥效的作用。

实施例3 用于生物发酵床的组合物

100g保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g)、100g保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌(活菌数为5.0×10⁸cfu/g)，与800g沸石粉混合均匀，得到1000g生物发酵床组合物，生产时按照同比例扩大。

实施例4 生物发酵床试验

本试验使用生物发酵床对固液混合的猪排泄物进行发酵，生物发酵床的垫料层采用锯末、稻壳为发酵基质，并添加0.2％发酵菌组合物，调水分到50％启动发酵，发酵床基质厚度为1.5米。

其中，对照组1使用100g保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC 1.3358的市售枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g)与900g沸石粉混合均匀，制成组合物；

对照组2使用100g保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g)与900g沸石粉混合均匀，制成组合物；

测试组使用实施例3配置的组合物。

测试组和对照组每天添加30kg/m³养猪粪污水，持续添加50天，每天翻动垫料1次。到30天时对照组1发酵床温度为即降到50℃以下，而对照组2和测试组50天时仍能正常运行，发酵温度为60℃以上；与对照组2不同的是，测试组的猪粪分解更彻底，翻堆时料堆散发的氨臭味更淡。

测试结果表明在发酵床中添加保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌使得猪粪分解更为彻底，使用过程散发的氨气等有害气体减少。

实施例5 畜禽尸体无害化处理

选取30只病死鸡和15头死猪尸体，分为相同质量的3份，其中2份为对照组，1份为测试组，每份加入由锯末、稻壳基质组成的5立方米垫料中。

对照组1向垫料中添加1000g沸石粉；

对照组2向垫料中添加100g保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g)和900g的沸石粉；

测试组向垫料中添加100g保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1.0×10¹⁰cfu/g)和100g保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌(活菌数为2.0×10⁹cfu/g)和800g沸石粉；

堆肥发酵完成后取样测试，测试组和对照组2并未检出沙门氏菌，鸡瘟等病毒检测结果均为阴性反应；对照组1检测含有沙门氏菌，鸡瘟等病毒检测结果为阴性。

对照组1共需26天完成发酵，发酵过程产生恶臭味；对照组2需10天完成发酵，但垫料中存在的油脂只有少量分解，发酵过程中有氨臭味和臭气产生；测试组需10天完成发酵，发酵过程可分解垫料中存在的油脂，垫料不油腻，发酵过程有较淡的氨臭味和臭气。

结果表明组添加保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌促进了病死畜禽的分解，并能有效抑制病原微生物，促进了畜禽尸体中油脂的分解。

实施例6 育肥猪圈舍喷雾试验

在猪场选取3栋猪舍为测试对象，猪舍1为对照组1，猪舍2为对照组2，猪舍3为测试组，3栋猪舍面积和空间均相同，猪舍内各有1000头育肥猪。

对照组1用清水喷雾；

对照组2使用100g保藏号为CCTCC M2016441枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10¹⁰cfu/g)和900g蒙脱石粉混合均匀，配制成组合物1kg，溶于100L清水制备的对照溶剂2；

测试组采用100g保藏号为CCTCC M2016441的枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10¹⁰cfu/g)、100g保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌(活菌数为1×10⁹cfu/g)，与800g蒙脱石粉混合均匀，溶于100L清水制备的对照溶剂3。

用喷雾器均匀喷洒除臭溶剂在猪舍的地面、墙壁上，5天后进行臭气、氨气气体的浓度检测，结果如下：

	臭味去除率	氨气去除率
			对照组1	0	0
对照组2	80％	50％
			测试组	80％	50％

其中，臭气浓度采用三点比较式臭袋法(GB/T14675),氨气采用次氯酸钠- 水杨酸分光光度法(GB/T14679)。

试验5天后对猪舍采食区、排粪区和猪栏墙壁进行大肠菌群平板计数，取样面积25cm²。结果如下表：

检测区域	对照组1	对照组2	测试组
				采食区	1.5×10⁶CFU	3.3×10⁵CFU	1.6×10³CFU
排粪区	6.1×10⁶CFU	9.7×10⁵CFU	3.2×10⁴CFU
				猪栏墙壁	3.9×10⁵CFU	5.2×10⁴CFU	8.7×10²CFU

试验结果表明：除臭抑菌剂中添加保藏号为CCTCC M2016443的枯草芽孢杆菌，可减少大肠菌群的数量，强烈抑制环境中的有害微生物，调整环境生态平衡，有益养殖环境健康。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。

尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。

Claims

1.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌。

2.保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC M 2016443的枯草芽孢杆菌在有机肥发酵上的应用。

3.一种用于有机肥发酵的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

4.一种用于养殖场粪便污水处理的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

5.一种用于畜禽尸体无害化处理的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

6.一种用于生物发酵床的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。

7.根据权利要求6所述的用于生物发酵床的组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌和保藏号为CCTCC M 2016441的枯草芽孢杆菌。

8.一种用于养殖场除臭抑菌的组合物，其特征在于，所述组合物中含有权利要求1所述的枯草芽孢杆菌作为有效成分。