CN106726032A - 一种时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

一种时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架。管状组织工程支架的管壁包括层叠的五层，即第一材料层、第二材料层、第三材料层、第四材料层和第五材料层。本发明在同一个组织工程管状支架中实现了两种功能分子的负载。并且，通过控制支架材料的化学组成与分子量，从而调控支架的降解速率，达到支架外静电纺丝层首先释放功能分子，而支架管壁内部的微球随着管壁的降解滞后释放功能分子，实现多功能分子的时序性释放。

Description

一种时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架及其制 备方法
技术领域：
本发明属于生物组织工程领域，具体涉及一种时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架及其制备方法。
背景技术：
在组织工程策略中，支架可以支持细胞在三维空间中构建新生组织，是组织再生的重要影响因素。许多人体器官是管状的，如血管、食道、肠、胆管、输尿管等等，当这些器官组织受到损伤时，多数情况下，需要使用管状支架作为假体，进行组织重建。另外，对于自体管状器官狭窄病变而引起的疾病，如血管狭窄等，可以使用管状支架作为支撑物，拓宽狭窄区域，保持血流通畅；对于外周神经的缺损修复，也可以使用管状支架作为导管，桥连受损神经，达到神经修复再生的目的。然而，制备管状支架的材料，如天然类的脱细胞组织、聚多糖、聚氨基酸或者合成类的聚酯、聚醚、聚多醇、聚烃等材料本身不具有生物活性，只是简单的为组织再生提供空间上的支持，在一定程度上，导致组织修复的能力与效果不佳。比如，选择商品化的脱细胞小肠粘膜(SIS)材料进行尿道重建，成功率在80％左右，并可能伴有尿道狭窄的并发症。因此，将管状支架与功能分子相结合，制备可以控制释放一种或者多种功能分子的管状支架，具有重要意义。功能分子可以是诸如蛋白质、多肽、氨基酸、生长因子、激素、抗生素、抗肿瘤药物、抗增殖药物等等可以促进或者抑制细胞生长、引导细胞迁移分化的天然分子或者合成药物。在组织修复的不同时间段，需要不同的功能分子，多种功能分子共同作用，可以有效调控组织的再生过程。所以，制备负载多种功能分子的管状支架，实现支架中功能分子的时序性缓释，尤为重要。
发明内容：
本发明的目的是提供一种时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架及其制备方法。
本发明的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
管状组织工程支架的管壁包括层叠的五层，即第一材料层、第二材料层、第三材料层、第四材料层和第五材料层；
所述的第一材料层为生物可吸收材料制成的纳米纤维层，在纳米纤维层中负载有功能分子；
所述的第二材料层为基底膜层，选自生物可吸收材料制成的基底膜层；
所述的第三材料层为生物可吸收材料制成的微球层，微球层中负载有与第一材料层不同的功能分子；
所述的第四材料层为基底膜层，选自生物可吸收材料制成的基底膜层；
所述的第五层为生物可吸收材料制成的纳米纤维层，在纳米纤维层中负载有功能分子。
所述的生物可吸收材料可以为可降解聚酯材料，如乙交酯、丙交酯、己内酯、三亚甲基碳酸内酯、对二氧六环己烷酮为原料通过均聚或共聚制备得到的系列合成材料，或者可以为脱细胞基质、明胶、胶原、丝蛋白、多糖等天然材料。
基底膜层的厚度优选为0.5mm～1.0mm。
所述的纳米纤维层优选是在基底膜层进行静电纺丝，使得在基底膜层的一侧复合负载功能分子的纳米纤维层，纳米纤维层厚度小于1μm。
所述的生物可吸收材料制成的微球层，微球直径为0.1μm～100μm，微球层复合于基底膜层的另一侧。
所述的功能分子可以为层连粘蛋白、纤连蛋白、钙黏蛋白等蛋白质；RGD、IKVAV、YIGSR等多肽；表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子等生长因子；生长激素、甲状腺素等调控细胞生长行为的激素；青霉素、链霉素、庆大霉素等抗生素；阿霉素、紫杉醇、丝裂霉素C、氟尿嘧啶等抑制细胞生长抗肿瘤药物；咪康唑、阿莫罗芬、环吡酮等抗菌剂；曲马多、哌替啶、卡马西平等止痛剂；水杨酸、布洛芬等消炎剂；依那西普、地西泮、三唑仑等拮抗剂等等。
本发明相比于现有技术，其有益效果如下：
1.本发明在同一个组织工程管状支架中实现了两种功能分子的负载。并且，通过控制支架材料的化学组成与分子量，从而调控支架的降解速率，达到支架外静电纺丝层首先释放功能分子，而支架管壁内部的微球随着管壁的降解滞后释放功能分子，实现多功能分子的时序性释放。
2.管壁表面的纳米纤维层，具有模仿细胞外基质的纳米纤维结构，有利于细胞的生长与组织的再生。
附图说明：
图1是基底膜层为由可降解聚酯材料制成的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架外貌图；
图2是基底膜层为由体内可吸收的天然材料制成的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架外貌图；
图3是时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架内部的负载有功能分子的微球电镜图片
图4是时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架表面的纳米纤维层；
图5是时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架的表面纳米纤维层负载生长因子的累计释放曲线
图6是时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架的管壁内部微球层负载的药物的累计释放曲线。
图7是时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架的管壁截面图；
其中1、第五材料层；2、第四材料层；3、第三材料层；4、第二材料层；5、第一材料层。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
将1.0g的PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)溶解于20mL的氯仿中，溶剂挥发后制备得到PLGA基底膜层。将100μg表皮生长因子(EGF)与1.0g牛血清蛋白(BSA)溶解于质量分数为5％的明胶/六氟异丙醇溶液中，装入注射泵，流速为0.5mL/h，以PLGA基底膜层作为接收物，设置针头与接收装置距离为15cm，电位差为15kV，进行静电纺丝，在基底膜层的一侧制备纳米纤维层，纳米纤维层负载有表皮生长因子(EGF)与牛血清蛋白(BSA)。纳米纤维层微观结构如图4所示。
采用单乳液挥发法制备聚乳酸(PLA)载药微球，称取200mg的PLA和1.0mg的丝裂霉素C溶于10mL二氯甲烷溶液后，搅拌缓慢注入100mL的聚乙烯醇水溶液(2％，w/v g/ml)，超声分散后，溶剂减压挥发，清洗干燥，得到负载药物丝裂霉素C的PLA微球。微球的微观形貌如图3所示。
将负载药物丝裂霉素C的PLA微球分散于PLGA基底膜层另一侧，然后将两张基底膜层复合(微球层在内，纳米纤维层在外)，将复合后的基底膜卷曲黏合成管状，得到时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，外形如图1所示。
时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架的结构如图7所示，其从外到内包括层叠的五层，即第一材料层(纳米纤维层)5、第二材料层(基底膜层)4、第三材料层(微球层)3、第四材料层(基底膜层)2和第五材料层(纳米纤维层)1。
纳米纤维层的厚度小于1μm，基底膜层的厚度为0.5mm～1.0mm，微球直径为0.1μm～100μm。
实施例2：
将500g的聚己内酯(PCL)粒料加入吹膜机制备PCL基底膜层。将100μg的短肽(IKVAV)与1.0g牛血清蛋白(BSA)溶解于质量分数为3％的聚乳酸PLA溶液中，装入注射泵，流速为0.5mL/h，以PCL基底膜层作为接收物，设置针头与接收装置距离为15cm，电位差为15kV，进行静电纺丝，在基底膜层的一侧制备纳米纤维层，纳米纤维层负载有短肽(IKVAV)和牛血清蛋白(BSA)。
采用喷雾干燥法制备PLA载药微球。称取500mg的PLA和3.0mg的五氟尿嘧啶溶于30mL二氯甲烷溶液后，搅拌缓慢注入300mL的聚乙烯醇水溶液(2％，w/v g/ml)，超声分散乳化后，选择口径为0.5mm的喷嘴，加料速率2mL/min，进风量为500NL/h，入口温度为45℃，在基底膜层的另一侧制备负载五氟尿嘧啶的微球层。
将两张基底膜层(一层复合有纳米纤维层，另外一层复合有微球层的基底膜层)复合(微球层在内，纳米纤维层在外)，将复合后的基底膜层卷曲黏合成管状，得到时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，外形如图1所示。
纳米纤维层的厚度小于1μm，基底膜层的厚度为0.5mm～1.0mm，微球直径为0.1μm～100μm。
实施例3：
采用冷冻干燥法制备明胶基底膜层。5.0g明胶溶解于40mL水溶液中，加入交联剂后，将溶液旋涂成膜。所得明胶膜迅速至于-40℃环境中冷冻4h，-20℃冷冻干燥12h，得到明胶基底膜层。将200μg表皮生长因子(EGF)与2.0g牛血清蛋白(BSA)溶解于质量分数为5％的明胶/六氟异丙醇溶液中，装入注射泵，流速为0.5mL/h，以明胶基底膜层作为接收物，设置针头与接收装置距离为15cm，电位差为15kV，进行静电纺丝，在基底膜层的一侧制备纳米纤维层，纳米纤维层负载有表皮生长因子(EGF)与牛血清蛋白(BSA)。
采用单乳液挥发法制备聚己内酯(PCL)载药微球，称取500mg的PCL和2.5mg的丝裂霉素C溶于20mL二氯甲烷溶液后，搅拌缓慢注入100mL的聚乙烯醇水溶液(2％，w/v g/ml)，超声分散后，溶剂减压挥发，清洗干燥，得到负载药物丝裂霉素C的PCL微球。
将负载药物丝裂霉素C的PCL微球分散于明胶基底膜层另一侧，然后将两张基底膜层复合(微球层在内，纳米纤维层在外)，将复合后的基底膜卷曲黏合成管状，得到时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，外形如图2所示。
实施例4：
将实施例3制备得到的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架置于1mL塑料试管中，加入500μL的PBS缓冲液，37℃，摇床40rpm条件下模拟体内环境进行功能分子释放实验；每隔一段时间取样，取样时将500μL的PBS缓冲液全部取出，更换500μL新鲜PBS缓冲液。时间点为1d、3d、6d、9d、12d、15d、18d、21d。用Elisa试剂盒检测样品中EGF的释放含量；于358nm处测定紫外吸收，并结合MMC(丝裂霉素C)标准曲线计算MMC的释放含量。
对于纳米纤维层中EGF的释放，结果如图5所示，在三周内，时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架皆可缓释一定量的活性EGF，且在释放初期，并未出现明显暴释现象，三周累积释放量约为24.2ng。
对于时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架中MMC的释放，如图6所示，体现为药物的延迟释放，即在释放初期，药物缓释速率较小，而达到某一时间点时，药物释放的速率明显增加。对于低度交联(25％)的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架主体部分9天左右即基本降解，这使得时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架中药物释放的延迟效应并不明显；对于中度交联(50％)的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其降解时间延长至21天，此时，时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架中载药微球的释放行为表现出明显的延迟，即在释放的前6天，药物缓释速率较低，累积释放量仅有7％左右，而在接下来的时间内，药物缓释速率明显提高，第21天时，累积释放量达到45％左右；对于高度交联(65％左右)的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架的降解时间延长至21天以上，此时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架中药物释放行为与前组相似，也表现出明显的延迟，但与前组不同的是，药物缓释速率的增加约发生在释放的第9天。
管状支架中两种功能分子的释放表现为，负载于管壁纳米纤维表层的EGF首先释放，而负载于管壁内部的药物随着支架的降解可控延迟释放，整体实现时序性控制释放两种功能分子。

Claims (9)

1.一种时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
管状组织工程支架的管壁包括层叠的五层，即第一材料层、第二材料层、第三材料层、第四材料层和第五材料层；
所述的第一材料层为生物可吸收材料制成的纳米纤维层，在纳米纤维层中负载有功能分子；
所述的第二材料层为基底膜层，选自生物可吸收材料制成的基底膜层；
所述的第三材料层为生物可吸收材料制成的微球层，微球层中负载有与第一材料层不同的功能分子；
所述的第四材料层为基底膜层，选自生物可吸收材料制成的基底膜层；
所述的第五层为生物可吸收材料制成的纳米纤维层，在纳米纤维层中负载有功能分子。
2.根据权利要求1所述的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
所述的生物可吸收材料为可降解聚酯材料或天然材料。
3.根据权利要求2所述的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
所述的可降解聚酯材料为乙交酯、丙交酯、己内酯、三亚甲基碳酸内酯、对二氧六环己烷酮为原料通过均聚或共聚制备得到的合成材料。
4.根据权利要求2所述的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
所述的天然材料为脱细胞基质、明胶、胶原、丝蛋白和/或多糖。
5.根据权利要求1所述的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
所述的基底膜层的厚度为0.5mm～1.0mm。
6.根据权利要求1所述的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
所述的纳米纤维层选是在基底膜层进行静电纺丝，使得在基底膜层的一侧复合负载功能分子的纳米纤维层，纳米纤维层厚度小于1μm。
7.根据权利要求1所述的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
所述的生物可吸收材料制成的微球层，微球直径为0.1μm～100μm，微球层复合于基底膜层的另一侧。
8.根据权利要求1所述的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
所述的功能分子为调控机体组织细胞生长的蛋白、酶、生长因子、激素、药物。
9.根据权利要求8所述的时序性控制释放多功能分子的管状组织工程支架，其特征在于，
所述的功能分子为层连粘蛋白、纤连蛋白、钙黏蛋白、RGD、IKVAV、YIGSR、表皮生长因子、血管内皮生长因子、神经生长因子、生长激素、甲状腺素、青霉素、链霉素、庆大霉素、阿霉素、紫杉醇、丝裂霉素C、氟尿嘧啶、咪康唑、阿莫罗芬、环吡酮、曲马多、哌替啶、卡马西平、水杨酸、布洛芬、依那西普、地西泮和/或三唑仑。
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