CN106715675B - 包被固体支持物的方法 - Google Patents
包被固体支持物的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN106715675B CN106715675B CN201580044481.9A CN201580044481A CN106715675B CN 106715675 B CN106715675 B CN 106715675B CN 201580044481 A CN201580044481 A CN 201580044481A CN 106715675 B CN106715675 B CN 106715675B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glu
- leu
- ala
- lys
- val
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/20—Material Coatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种用于包被固体支持物的方法，所述固体支持物适合用在细胞培养应用中。所述方法包括以下步骤：将载体蛋白的溶液加热到至少50℃，并在引起含2个至1000个蛋白分子的可溶性载体蛋白聚集体形成的条件下孵育所述载体蛋白的溶液，其中所述载体蛋白包括附着在其上或作为其氨基酸序列一部分的至少一种细胞功能调节肽序列。随后，在蛋白聚集体能非共价吸附至固体支持物的条件下，将蛋白聚集体与固体支持物接触。本发明还涉及经包被的固体支持物，所述经包被的固体支持物具有非共价吸附在其表面上的上述载体蛋白聚集体的至少一种聚集体。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于包被固体支持物的方法，所述固体支持物适合用在细胞培养应用中。该方法包括以下步骤：将载体蛋白(该载体蛋白包括附着在其上或作为其氨基酸序列一部分的至少一种细胞功能调节肽序列)溶液加热到至少50℃，并在引起含2个至1000个蛋白分子的可溶性载体蛋白聚集体形成的条件下进行孵育。随后，在蛋白聚集体能非共价吸附至固体支持物的条件下，将蛋白聚集体与固体支持物接触。本发明还涉及一种经包被的固体支持物，所述经包被的固体支持物具有在其表面上非共价吸附的至少一种上述载体蛋白聚集体。
背景技术
体外细胞培养通常在塑料细胞培养容器(例如，聚苯乙烯培养瓶或培养皿)中进行。这种培养瓶或培养皿在通常使用的37℃或更高的温度下非常稳定，同时它们还是透明的且易于制造。然而，目前可用于细胞培养的大多数细胞或细胞系未显示出足够的与疏水塑料表面的附着能力。因此，通过在未改性塑料表面上生长细胞所获得的结果通常较差。
为了克服细胞在塑料细胞培养瓶或培养皿上附着能力不足的问题，现有技术中提出了若干使这些物品表面更亲水的方法。例如，进行在表面上提供反应性亲水基团的等离子体处理。然而，已证明通过这些技术获得的表面改性产物不适用于某些应用，例如干细胞或高度分化的细胞的培养。此外，通过等离子体处理进行表面改性是昂贵且费力的。因此，开发了用于提供表面改性的培养容器的替代方法。
在细胞培养领域早已认识到，使用细胞外基质(ECM)的组分能极大地影响表面结合活细胞的能力。在体内，细胞主要通过形成部分ECM的结构蛋白的结合来彼此相互作用并且与它们的环境相互作用。发现了细胞与ECM的粘附相互作用影响许多重要的细胞活性，包括细胞生长、细胞分化、细胞迁移和组织形成。事实上，ECM参与许多复杂的生理过程，如形态发生、血管生成、伤口愈合和肿瘤转移。
ECM是组成上有差异的三维分子复合体，其包括生物活性蛋白(例如，层粘连蛋白和纤连蛋白)、糖蛋白、透明质酸、弹性蛋白、蛋白聚糖和胶原。细胞通过在其表面上表达的特异性表面受体的结合而与ECM相互作用。已知与ECM的组分相互作用的最著名的细胞表面受体是整联蛋白。在脊椎动物中，发现了24种整联蛋白亚型，每种亚型表现出不同的配体特异性。这些整联蛋白亚型总结于Barczyk et al.2010(Cell Tissue Res 339,269-280)和Yurchenco&Patton2009(Curr Pharma Des.15,1277-1294)中。一些整联蛋白与其ECM靶组分的结合受ECM分子中的特异性结合序列的影响。在许多基质蛋白，例如纤连蛋白、层粘连蛋白和骨桥蛋白中已经鉴定出的一著名结合序列是肽序列Arg-Gly-Asp(RGD)，该肽序列描述于Pierschbacher and Ruoslahti,J.Biol Chem 1987,262,17294-17298中。为了提高培养的细胞在支持物品如培养瓶或微量滴定板上的附着，现有技术中考虑将源自ECM的材料枝接到这些物品的表面。
在第一种方式中，提出提供具有完整ECM材料的培养容器的表面。来自小肠、胃或膀胱组织的黏膜下层用作ECM的来源。参见，例如US5281422、US5554389、US6099567和US6206931。凝胶状蛋白混合物MatrigelTM是另一种完整ECM材料的适当来源，其广泛用于细胞培养领域并且可用于如Corning Life Sciences的制造商的细胞培养应用中。MatrigelTM由鼠Engelbreth-Holm-Swarm(EHS)肉瘤分泌，并且含有形成培养细胞的天然的、生物相容性环境的过量的生长因子和其他生物活性分子。然而，经完整ECM材料(例如，MatrigelTM)包被的物品缺乏确定的特征，因为仍然不知道不同ECM组分中的哪一组分是混合物的一部分并且在包被后是可接近的。此外，在含有全部ECM提取物的表面上培养细胞是有问题的，因为不可能严格控制由细胞与不同ECM组分结合所引发的细胞信号级联放大。
鉴于这些问题，考虑提供已用单一ECM蛋白或ECM蛋白片段包被的更加定制化的表面。然而，全长ECM蛋白的生产是昂贵的且在技术上是麻烦的。为了克服这些问题，建议将带有细胞结合序列基序(例如RGD基序)的较短的肽枝接到支持物表面上，以改善细胞的附着。可以容易地大量合成肽，并且它们在枝接条件下相对稳定。而经全长蛋白和肽包被的产品都不够稳定。用于在支持物品表面上固定蛋白或肽的常规技术依赖于蛋白或肽在表面上的非共价吸附。然而，不幸的是，已发现蛋白或肽在细胞培养条件下(特别是在37℃温育期间)的解吸附导致培养的细胞从其支持物上脱离下来，这可能最终诱导这些细胞发生程序性细胞死亡(凋亡)。
防止蛋白解吸附问题的一种方法是使用蛋白或肽与支持物材料表面上的羟基、胺或其它反应性基团进行共价化学固定。可以使用能产生诸如胺、羟基、羧基或醛基等官能团的化学物质(如三氟代乙烷磺酰氯(tresyl chloride)、戊二醛或氰基硼氢化物)，通过表面活化来实现直接共价偶联。随后，这些基团与蛋白或肽中的官能团反应，从而得到共价偶联。这样的偶联方法详细描述于例如，US5278063、US2005/0059140和US7399630中。然而，培养的细胞对化合物的存在非常敏感。即使非常低量的反应性化学物质也能显著抑制或甚至完全破坏细胞的生长或附着。因此，蛋白或肽在细胞培养物表面上的化学固定是不理想的。
从上文可以看出，需要提供将蛋白或肽稳定固定在细胞培养物品(例如容器、培养瓶、平板和平皿)表面上的新方法。对于应用于细胞培养表面的蛋白或肽包被的需求相当高。包被应当是稳定的，并且在37℃孵育1至10天期间，不释放或释放非常少量的固定的蛋白或肽。此外，为了用于细胞培养，表面通常需要是无菌的。本发明提供了一种满足这些需求并还提供了额外优点的新方法。
发明内容
本发明提供了用载体蛋白包被固体支持物的方法。该方法快速、可重复性高且易于在细胞培养消耗品的现有生产过程中实施。通过将细胞功能调节肽序列引入载体蛋白中，可以定制能够例如通过促进粘附、生长、迁移和/或分化来调节细胞某些功能的合成表面，其中细胞培养在该表面上。本文公开的方法提供了非常适合用在细胞培养应用中的产品，因为其能产生稳定和均匀的包被。此外，所述方法能生产包被，其特征在于可针对某些应用特别定制的细胞功能调节肽序列的多样性。最后，本发明的方法不使用可能干扰包被表面下游应用的任何反应性化学物质。
在第一方面，本发明涉及一种用于包被固体支持物的方法，所述固体支持物适合用在细胞培养应用中。本发明的所述方法包括以下步骤：
(a)制备至少一种载体蛋白的溶液，所述载体蛋白包括附着于其上或作为其氨基酸序列一部分的至少一种细胞功能调节肽序列；
(b)将所述溶液加热到至少50℃，并在引起含2个至1000个蛋白分子的可溶性载体蛋白聚集体形成的条件下孵育所述溶液；
(c)在所述载体蛋白聚集体能非共价吸附至所述固体支持物的条件下，将所述载体蛋白聚集体与所述固体支持物接触；
(d)可选地，洗涤所述固体支持物以去除未结合的载体蛋白和载体蛋白聚集体；
由此提供在其表面上包括多种细胞功能调节肽序列的固体支持物。本发明的方法优选不包括使用反应性化学物质将载体蛋白偶联到支持物上。
因此，本发明的方法涉及在适合用在细胞培养应用中的固体支持物品上提供含有蛋白或肽材料的包被。支持物品可以是任何材料，其中，在此尤其优选包被玻璃或塑料表面。通过应用本发明的方法包被的固体支持物可以是通常用于细胞培养应用中的产品的表面，尤其是细胞培养容器，例如细胞培养瓶、滚瓶、培养板、管、微量滴定板、膜或培养皿。在本发明的一个优选实施方式中，所述固体支持物是具有6、12、24或48个孔的细胞培养板。这些平板可获自许多不同的制造商，例如，可以是由Fisher Scientific以商品名CorningTM销售的平板。在另一个优选的实施方式中，所述固体支持物可以是小塑料盘或小塑料珠，该小塑料盘或小塑料珠通常用作在培养贴壁生长的细胞系的生物发酵器中的基底。这种由聚丙烯制成的盘可以例如自Eppendorf AG以商品名
购得。在又一个实施方式中，所述固体支持物可以是较大的载体板，所述较大的载体板用作培养贴壁生长的细胞系的生物发酵器中的基底。可以使用本发明的包被方法的另一固体物体是医疗植入物，所述医疗植入物在植入患者体内之前接种了细胞。待用蛋白材料包被的固体支持物的表面可以是亲水性的或疏水性的，这意味着大量的物品可以使用本发明的方法来产生能接种细胞的表面。该方法避免了对表面进行任何种类的侵蚀性化学处理，这些处理可能对随后细胞生长带来影响。
本发明在一定程度上基于这样的认识，即通过使细胞功能调节肽序列(例如，提供细胞附着的肽序列)偶联到载体蛋白上，或者通过重组方法将它们包括在所述载体蛋白的氨基酸序列中，可将这些细胞功能调节肽序列吸附到固体支持物(例如，细胞培养容器)上。然后加热载体蛋白，以诱导部分变性，并且形成可以吸附到载体表面的可溶性蛋白聚集体。在加热时，聚集体内的载体蛋白部分变性，但仍保持可溶，这使蛋白聚集体均匀地分布在待包被的表面上。相反，完全变性的蛋白会形成沉淀的蛋白斑块，从而使蛋白发生不期望的局部堆积，而非均匀分布。根据本发明，载体蛋白在支持物品上的包被相应地使随后在支持物表面上培养的细胞进行均匀分布。细胞的均匀分布是在许多细胞培养应用中要实现的重要目标。用于评价细胞在表面上均匀分布的方法已描述于，例如，Amenta et al.(1998),Proceedings of the 25th Annual Conference on Computer Graphics and InteractiveTechniques,415-421中。
用于本发明方法的载体蛋白可以具有任何尺寸，但优选载体蛋白具有至少20000或更大的分子量。在本发明的甚至更优选的实施方式中，载体蛋白具有至少30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000或更大的尺寸。在本发明的方法中使用时，载体蛋白的尺寸尤其优选为至少50000。可用于本发明方法的合适的载体蛋白包括白蛋白，例如人血清白蛋白或牛血清白蛋白，和卵白蛋白。在优选的实施方式中，用于本发明方法的载体蛋白是不在ECM中天然存在的蛋白，例如白蛋白，更优选牛血清白蛋或人血清白蛋白或其片段。
在本发明的方法中使用的载体蛋白经修饰以包括一种或多种细胞功能调节肽序列。根据本发明，所述载体蛋白用于为细胞功能调节肽提供适当的环境。细胞功能调节肽序列可以利用化学偶联或通过重组技术与载体蛋白相关联。根据优选的实施方式，所述载体蛋白是重组蛋白，所述重组蛋白包括作为其氨基酸序列一部分的一种或多种细胞功能调节肽。根据甚至更优选的实施方式，所述载体蛋白是重组白蛋白，例如其中插入了一种或多种细胞功能调节肽的牛血清白蛋白或人血清白蛋白。
根据另一个实施方式，所述载体蛋白包括1种或更多种、2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种或甚至10种或更多种的细胞功能调节肽。在又一实施方式中，所述载体蛋白包括1种细胞功能调节肽。
所述细胞功能调节肽与所述载体蛋白偶联或整合至所述载体蛋白的一级结构中，使得在形成热诱导的聚集体时，存在于不同载体蛋白上的细胞功能调节肽形成细胞功能调节序列的分子嵌合体。由不同或相同的肽组成的这种阵列提供与细胞表面上的大量受体或结合分子的强相互作用。因此，在本发明的优选实施方式中，所述细胞功能调节肽被包括在载体蛋白中，以便形成细胞功能调节肽的分子嵌合体，所述细胞功能调节肽存在于聚集体的不同载体蛋白上或不同载体蛋白中。
根据本发明，尤其优选每个载体蛋白存在2、3、4、5、6或更多个相同或不同的细胞功能调节肽。
在同一聚集体内的大量相同或不同的细胞功能调节肽序列对于细胞培养应用是特别令人感兴趣的，该同一聚集体是可用于细胞结合的肽的分子嵌合体形式。待培养的细胞在其表面上具有许多受体分子，这些受体分子与它们在增殖期间所附着的表面相互作用。通过本发明的方法包被的物品表面上的聚集体所提供的细胞功能调节肽的分子嵌合体确保这些细胞功能调节肽以足够高的密度存在，以调节附着到聚集体的细胞的功能。
通过将天然载体蛋白的氨基酸替换成在细胞功能调节肽所起源的天然蛋白内，细胞功能调节肽的位于三级结构相同或相似位置中的氨基酸，可将细胞功能调节肽序列引入载体蛋白中。可以通过诸如Swiss-PdbViewer、ICM-Browser、Phyre、Modeller、HHpred、Robetta或BioInfoBank服务器的计算机程序计算和可视化包含一种或多种细胞功能调节肽的载体蛋白的构象。
如在本发明的上下文中使用的，术语“细胞功能调节肽”是指在与细胞结合时能够调节一种或多种细胞功能(例如，细胞增殖、细胞分化、细胞迁移、细胞活化、细胞衰老或细胞凋亡)的任何肽序列。该术语还包含一种肽，该肽用于将细胞附着到经这种肽包被的表面。能够调节某些细胞功能的许多肽序列是本领域已知的。待包被在支持物上的细胞功能调节肽或细胞功能调节肽的组合的选择将决定经包被的支持物品促进培养细胞在基质上的粘附、生长、移动或分化的能力。术语“肽”的含义中还包括肽模拟物，例如含有一个或多个非天然存在的氨基酸的肽模拟物。
根据本发明的优选实施方式，所述支持物被包被有含一种或多种肽序列的载体蛋白，所述肽序列提供细胞锚定，即通过肽序列的结合使细胞附着到经包被的表面上。优选地，经包被的支持物包括至少一种载体蛋白，所述载体蛋白包括一个或多个如SEQ ID NO：1～26所示的肽序列。这些序列含有源自ECM组分(例如，层粘连蛋白、纤连蛋白和胶原)的细胞结合基序。根据本发明的尤其优选的实施方式，所述固体支持物包被有至少一种载体蛋白，所述载体蛋白包括提供细胞锚定且含RGD序列基序的一个或多个肽序列。RGD序列优选是载体蛋白的环状结构的一部分。在另一个实施方式中，提供细胞锚定的肽序列是环状肽。根据本发明的尤其优选的实施方式，所述固体支持物包被有不同的载体蛋白，每个载体蛋白都包括提供细胞锚定且含RGD序列基序的不同的肽序列。
在另一个优选的实施方式中，上述支持物包被有至少一种载体蛋白，所述载体蛋白包括调节细胞生长和分化的一种或多种肽序列。SEQ ID NO：27～56中示出已报道具有生长因子活性的肽序列。SEQ ID NO：27～56中的序列含有已知来自不同生长因子分子的基序，除其他之外，所述生长因子分子包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子α(TGF-α)、神经生长因子(NGF)、骨桥蛋白、表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)。
根据本发明，NO：1～56中公开的所有肽可以以线性形式或以环状形式使用(即，环状肽可用于基于肽与它们的载体蛋白化学偶联的实施方式)。因此，当序列表提到环状肽时，这应理解为还指该肽的线性形式，反之亦然。
在另一个优选的实施方式中，所述支持物包被有至少一种载体蛋白，所述载体蛋白包括已发现对促进成骨细胞生长和分化有效的一种或多种肽序列。这些肽包括SEQ IDNO：1、13、15、22和49所示的序列。在另一个优选的实施方式中，所述支持物包被有至少一种载体蛋白，所述载体蛋白包括已发现对促进神经元细胞生长和分化有效的一种或多种肽序列。这些肽包括SEQ ID NO：1、5～7、17、24～25、27～29和55～56所示的序列。在另一个优选的实施方式中，所述支持物包被有至少一种载体蛋白，所述载体蛋白包括已发现对促进肝细胞生长和分化有效的一种或多种肽序列。这些肽包括SEQ ID NO：1、6、16～19、27～32和34所示的序列。
根据本发明，所述支持物品可以仅包被有单一种类的细胞功能调节肽或包被有不同调节肽的混合物。然而，在优选的实施方式中，在同一或不同的载体蛋白中使用2、3、4、5或更多种不同的细胞功能调节肽序列。因此，所述支持物的表面优选包被有含至少2种不同的细胞功能调节肽的载体蛋白聚集体，其中，至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的肽同样是可能的。本发明的方法还可以提供含10、20或30种不同的细胞功能调节肽的包被。例如，可以将提供细胞锚定的第一细胞功能调节肽与促进细胞分化的第二肽的组合使用。第一和第二细胞功能调节肽可包含在相同或不同的载体蛋白分子的一级结构中。例如，如果BSA用作载体蛋白，则可以产生重组BSA分子，所述重组BSA分子在其一级结构中包括(a)SEQ ID NO：1～26中的任意种的肽以及(b)SEQ IDNO：27～56中的任意种的肽。
或者，对于某些应用可能期望产生不同的重组BSA分子，每一个重组BSA分子在其一级结构中仅包括一种细胞功能调节肽。然后，在制备本文所述方法的步骤(a)中的载体蛋白溶液时，可混合不同的BSA载体蛋白，所述不同的BSA载体蛋白的特征为拥有特定的细胞功能调节肽。
可以定制附着或包括在载体蛋白序列中的细胞功能调节肽的组合，以实现或抑制某些细胞功能。在一个实施方式中，包被在固体支持物表面上的不同的细胞功能调节肽序列的特定组成促进细胞生长。在另一个实施方式中，细胞功能调节肽序列的组成诱导或促进细胞活化，包括一种或多种激酶的活化。激酶活化可以涉及，例如，酪氨酸激酶、Src酪氨酸激酶和Ras-MAPK通路的活化。在又一个实施方式中，所包含的不同肽序列的组成抑制细胞分裂和/或细胞分化。在又一个实施方式中，支持物品的表面已包被有防止细胞从包被表面剥离的肽或肽的组合。
在一个替代的实施方式中，所述细胞功能调节肽可以化学偶联至各自的载体蛋白。将小肽偶联至较大蛋白的方法是本领域已知的。例如，如下面实施例中更详细描述的，可以通过使用胺-巯基交联剂将细胞功能调节肽偶联至载体蛋白(例如，白蛋白)，其中胺-巯基交联剂用于产生可用于与细胞功能调节肽偶联的巯基反应性、马来酰亚胺活化的载体蛋白。也可以使用将肽偶联到蛋白的其它方法。这样的方法描述于例如，G.T.Hermanson"Bioconjugate techniques",3rded.(2013)Academic Press；ISBN-13:978-0123822390中。
在本发明的包被方法的第一步骤中，制备载体蛋白的溶液，这意味着蛋白溶解在如水或水性缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)的水性介质中。载体蛋白的量应适于避免溶液中的蛋白出现任何沉淀。当使用不同的载体蛋白进行包被时，优选在加热之前将这些载体蛋白混合成单一溶液。或者，对于每种载体蛋白可制备单独的溶液，并且分别对每种载体蛋白溶液单独进行后续的加热步骤。根据载体蛋白的大小和性质，包含在溶液中的载体蛋白的量可有差异。通常，在本发明方法的步骤(a)的溶液中所使用的载体蛋白的量在1～50mg/ml的范围内，例如5～40mg/ml、10～30mg/ml或20-25mg/ml的范围内。
可选地，在步骤(a)之后对含有载体蛋白的溶液进行灭菌。由于大多数细胞培养应用需要在无菌条件下进行培养，因此必须避免步骤(a)中使用的蛋白溶液中存在污染。用于提供无菌蛋白溶液的技术是本领域公知的且包括，例如，通过孔径在0.1μm至0.5μm，优选0.2μm至0.3μm，更优选0.22μm的过滤膜来过滤蛋白溶液。合适的过滤膜可从许多不同的制造商处购得，例如从Sartorius、Millipore、Pall等购得。本发明的方法避免使用影响肽和蛋白完整性的杀菌的化学物质或物理过程(如UV或γ辐射)。
在本发明方法的后续步骤中，将含有载体蛋白的溶液加热至诱导形成可溶性蛋白聚集体的温度，所述蛋白聚集体平均包括2～1000个蛋白分子/聚集体。优选地，由所述方法的步骤(b)所得到的聚集体中，每个聚集体包括2至1000个蛋白分子，最优选每个聚集体包括5个至100个蛋白分子。如本文所使用的，形成含2个至1000个蛋白分子的聚集体意指溶液中的至少50％，优选至少80％、至少90％、甚至更优选至少95％的载体蛋白存在于含2个至1000个蛋白分子的聚集体中。在加热步骤期间使用的温度为至少50℃，其中，更高的温度是更优选的，例如，至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃。换句话说，在步骤(b)中将蛋白溶液加热至50℃至75℃，优选65℃至73℃，更优选68℃至72℃的温度。加热步骤进行10分钟至48小时，其中，在大多数情况下，高温施加1小时～24小时，例如，2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、18h、20或22h。在所述方法的步骤(b)中使用的最佳温度随着载体蛋白的大小和性质以及溶液的组成(例如，加入的盐或缓冲液的浓度)的不同而不同。对于给定的载体蛋白溶液，本领域技术人员能容易地确定形成含所述数目的蛋白分子的可溶性聚集体所需的温度和孵育时间。
用于监测聚集体溶解度的相当简单的方法是，测量蛋白溶液在335nm波长下的光密度(OD)。OD将随着溶液中蛋白聚集体的形成而增加。如图2所示，用于聚集体形成的最合适的温度是容易确定的。如该图所示，将BSA加热至不同温度(65℃、70℃和75℃)并持续不同的时间段，通过测量335nm处的OD来监测BSA聚集体的形成。65℃的温度明显太低而不能诱导BSA聚集体的形成(参见图2中的A、A')，而75℃的温度太高，因为75℃的温度诱导了大部分聚集体从溶液中沉淀出来，通过离心去除沉淀蛋白后OD值下降证明了这一点(参见图2中的C')。对于BSA，发现70℃的温度是尤其有利的，因为加热约18小时形成的聚集体中只有一小部分在离心时从溶液中沉淀出来(参见图2中的B')。因此，可以使用本领域技术人员已知的常规方法来确定导致可溶性载体蛋白聚集体形成的条件。优选地，通过测量355nm处的OD来监测聚集体的形成。在离心后保持335nm处的高OD表明强蛋白聚集和低水平的沉淀(或没有沉淀)。一旦确定了最佳条件，它们就可以常规地用于生产相应载体蛋白的可溶性聚集体。
同样，也可以容易地确定聚集体所含的蛋白分子的平均数量。为此，将经加热以诱导聚集体形成的蛋白溶液的一部分，在非还原条件下进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。这种电泳将提供关于加热时形成的蛋白聚集体的分子量的信息。一旦知道了载体蛋白的分子量，就可以计算聚集体中的蛋白的数量。
优选地，对本发明方法的步骤(b)中的条件进行选择，使得至少50％，优选至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或至少95％的蛋白聚集体保持为可溶形式。
加热步骤(b)可以在标准热混合器装置中进行。在温度升高的孵育期间可以使用100rpm～500rpm的搅拌速率。
在溶液加热完成后，将蛋白聚集体在能非共价吸附至固体支持物的条件下与固体支持物接触。为此，可以将含有蛋白聚集体的溶液进行离心，例如，在1000rpm至5000rpm下离心5分钟以除去任何不溶和沉淀的蛋白材料。然后将由离心步骤获得的上清液施加到待包被的支持物上。在一个实施方式中，将一部分溶液直接吸取到支持物品的表面上，随后支持物品在25℃～37℃的温度下进行干燥，直到液体从支持物品表面完全蒸发掉。干燥也可以在标准蒸发器中进行。在一个替代的实施方式中，将步骤(b)中获得的蛋白聚集体冻干，然后溶解在水性介质中，随后将水性介质施加到支持物上。步骤(c)中的孵育时间为1小时至48小时，优选2小时至24小时，例如4小时、6小时、8小时、10小时、12小时、14小时、16小时、18小时或20小时。
可选地，在步骤(c)之后洗涤进行了包被的支持物品，以除去任何未结合的载体蛋白和载体蛋白聚集体。可以通过用水或合适的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)冲洗支持物品的表面来进行洗涤。洗涤缓冲液应优选不含任何变性化合物或洗涤剂(如SDS)，以避免从支持物品的表面上除去吸附的聚集体。在洗涤和干燥后，可以将支持物品储存起来，直到进一步用于细胞培养。
当进行上述方法时，提供在其表面上包括多个细胞功能调节肽序列的固体支持物，所述细胞功能调节肽序列存在于非共价吸附的载体蛋白聚集体中。优选地，经包被的固体支持物的表面平均每mm2表面积包括1000个至1000000个，优选100000个至400000个细胞功能调节肽序列。
在又一方面，本发明涉及可通过上述方法获得的经包被的固体支持物。
在又一方面，本发明涉及经包被的固体支持物，所述经包被的固体支持物具有非共价吸附在其表面上的至少一种载体蛋白聚集体，其中，所述载体蛋白包括附着于其上或作为其氨基酸序列一部分的至少一种细胞功能调节肽序列，并且所述聚集体包括2个至1000个蛋白分子，优选5个至100个，更优选50个至100个蛋白分子。
如本文其他处所述，所述固体支持物可以是任何材料，其中，特别优选具有玻璃或塑料表面的支持物品。所述固体支持物可以是细胞培养物品的表面，例如，细胞培养容器(例如，细胞培养瓶、滚瓶、培养板，培养管、微量滴定板、膜、盘、珠、载玻片、用于生物发酵器的载板或培养皿)。在本发明的优选实施方式中，本发明的固体支持物是具有6个、12个、24个或48个孔的细胞培养板。
本发明的固体支持物包括在其表面上的至少一种本文其他处所述的载体蛋白的聚集体。聚集的载体蛋白提供细胞功能调节肽序列的分子嵌合体。因此，在优选实施方式中，所述支持物的表面包括细胞功能调节肽序列的分子嵌合体，所述细胞功能调节肽序列存在于聚集体的不同载体蛋白上或不同载体蛋白中。所述载体蛋白优选是在细胞外基质中非天然存在的蛋白。
本发明的经包被的支持物表面可仅包括如上描述的细胞功能调节肽序列之一，但优选在一种或多种载体蛋白中包括两种或更多种不同的细胞功能调节肽序列。例如，所述支持物品的表面可包括至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种不同的细胞功能调节肽序列。在具体实施方式中，所述支持物的表面包括载体蛋白聚集体，所述载体蛋白聚集体包括可用于细胞结合的细胞功能调节肽序列的分子嵌合体。形成的嵌合体可以包括相同或不同的细胞功能调节肽序列。考虑到存在于待培养的细胞表面上的大量受体并且它们可能在促进或抑制细胞功能中相互作用的事实，这是尤其令人感兴趣的。在尤其优选的方面，经包被的固体支持物包括至少一种具有细胞结合肽基序(优选RGD基序)的细胞功能调节肽序列。例如，所述支持物可包括选自SEQ ID NO：1～26中的一种或多种细胞结合肽和/或选自SEQID NO：27～56中的具有生长因子活性的一种或多种肽。
通过非共价吸附，将载体蛋白固定在固体支持物的表面上，所述载体蛋白包含附着在其上或包含于其中的细胞功能调节肽序列。尽管细胞功能调节肽序列非共价吸附至本发明的支持物品的表面，但是通过本发明的方法提供的包被是高度稳定的。优选地，在37℃孵育24小时后，在PBS或细胞培养基中，从经包被的表面去除小于30％的载体蛋白，更优选去除小于25％、小于20％、小于15％、小于10％或小于5％的载体蛋白。甚至更优选地，在这些条件下小于4％、3％、2％、1％或小于0.5％或0.1％的载体蛋白从表面脱离下来。当然，非共价吸附的蛋白的脱离可以通过研磨性化学物质如有机溶剂或洗涤剂来实现。
根据本发明，也可以在载体蛋白聚集后再附着细胞功能调节肽。在细胞培养中用RGD肽对HEK293细胞测试15分钟时，发现仅在聚集后提供细胞功能调节肽的载体蛋白显示与聚集前这些肽已附着的蛋白类似的结果。
在一个优选的实施方式中，固体支持物的表面平均每mm2表面积包括1000个至1000000个，优选100000个至400000个细胞功能调节肽序列。
本发明的支持物品的表面可包括至少5个或更多个，优选至少10个或更多个已经被不同载体蛋白，例如因各自的细胞功能调节肽序列而彼此不同的BSA蛋白包被的位置或点。
附图说明
图1示出了本发明的方法的原理。说明了固体表面包被的不同制备方法和所得产物。
图2示出了孵育时间和温度对BSA聚集的影响。经不同时间段将白蛋白溶液加热至不同温度(65℃、70℃和75℃)，并通过测量335nm处的光密度OD来监测BSA聚集体的形成。然后将溶液离心，再次测量335nm处的OD。65℃离心前(A)和离心后(A')，70℃离心前(B)和离心后(B')，75℃离心前(C)和离心后(C')。
图3示出了将聚集的BSA包被到聚苯乙烯板上的效率。该图显示了与在70℃聚集的BSA溶液孵育不同时间段(1h、4h、18h)后，包被到聚苯乙烯孔中的BSA的量。BSA CTL表示未受热的加热的BSA。
图4示出了在疏水和亲水表面上的包被效率的对比。提供为细胞培养进行了预先处理(组织培养处理(TCT)，
Corning#3524)或未经处理(
Corning#3738)的24个平板。这些平板的孔经1mg/ml聚集的BSA包被4小时，其中如实施例2所述，该聚集的BSA已偶联至线性或环状RGD。在洗涤后，将平板在37℃干燥。将150000个HEK293细胞加入到每个孔中并在含有10％FCS的培养基中孵育15分钟。孵育15分钟后，通过使用WST-1试剂的比色测定法估算附着的细胞数。使用690nm处的吸光度作为参考，测量在450nm处的吸光度。白柱＝TCT；灰柱＝未经处理的表面。A：仅BSA，B：BSA+SMCC，C：BSA+SMCC+RGD线性，D：BSA+SMCC+RGD环状，E:无包被。
具体实施方式
实施例
实施例1：在其序列中插入细胞功能调节肽序列的BSA载体蛋白的构建体
构建了不同的重组人血清白蛋白(HAS)，这些不同的重组人血清白蛋白(HAS)包括作为其一级结构一部分的源自ECM蛋白的细胞功能调节肽序列。为此目的，使用Vector NTI软件(Invitrogen)的组件3D Molecule Viewer软件，测定天然ECM蛋白内的细胞功能调节肽序列的构象。在随后的步骤中，将天然ECM蛋白的构象与HAS蛋白的构象进行比较，以鉴定出具有相似构象的区域。当鉴定出相似区域时，BSA的位于所选区域中的氨基酸被替换成细胞功能调节肽的氨基酸，并且使用程序“SWISS-MODEL”重新计算所得重组蛋白的结构。以这种方式，在天然HAS蛋白中鉴定出适于被替换成SEQ ID NO：2(GRGDS)的细胞功能调节肽序列的三个环。
第一个环(环-1)含有天然HAS(SEQ ID NO：57)的氨基酸80至84(DESAE)。第二个环(环-2)含有天然HAS的氨基酸116至120(AKQEP)，而第三个环(环-3)含有氨基酸194至198(QAADK)。这些环的氨基酸被替换成SEQ ID NO：2(GRGDS)的序列。所得构建体分别示于SEQID NO：58～60中，其中所得构建体具有在HAS环区1、2或3中的SEQ ID NO：2的细胞功能调节肽序列。在SEQ ID NO：61中，描述了在HAS的所有三个环区中都包括SEQ ID NO：2的细胞功能调节肽序列的构建体。
在另一构建体中，将序列REDV引入BSA蛋白的位于氨基酸137至140(PRLV)的线性段中。所得构建体如SEQ ID NO：62所示。在另一个构建体中，将肽RYVVLPR引入BSA蛋白的位于氨基酸129至135(HKDDNPN)的反向环中。所得构建体如SEQ ID NO：63所示。包括引入到环3中的RGD，引入到线性段中的REDV以及引入到反向环中的RYVVLPR的构建体如SEQ ID NO：64所示。在其序列中具有1、2或3种细胞功能调节肽序列的不同构建体按下文进一步的描述来使用。将VSV-G标签或His标签添加到C末端序列用于进行亲和纯化。在毕赤酵母Pichiapastoris中进行表达。表达后进行SDS-PAGE电泳，与未转染的细胞相比，68kD处的条带鉴定为表达的HAS。
实施例2：通过细胞功能调节肽序列附着到BSA表面来构建BSA载体蛋白
在1ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的10mg HAS(Sigma#021M7353V)的溶液与3mg Sulfo-SMCC(#MF158668,Thermo Scientific,Rockford,Il,USA)在21℃孵育1.5小时。将溶液在相同的缓冲液中透析过夜。通过在21℃，将1mg活化的HAS与1mg肽孵育过夜进行肽的偶联。RGD环状或间隔肽由Eurogentec(Liège,比利时)或Bachem AG(Bubendorf,瑞士)综合性合成。将肽悬浮在含10mM EDTA的PBS溶液中。使用相同的方法将肽偶联在聚集的蛋白上。
实施例3：蛋白聚集
在70℃，含在1ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的10mg BSA(Sigma#A3059)的溶液在低结合管(Eppendorf AG,汉堡,德国)中，在
(Eppendorf AG,汉堡,德国)上以500rpm混合速率孵育4小时。孵育后，测定溶液在335nm处的光密度(OD)以确定蛋白聚集体的存在。
实施例4：确定用于获得可溶性蛋白聚集体的实验条件
制备含有在1ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的10mg BSA(Sigma#A3059,圣路易斯,USA)和1μg生物素化的BSA(Sigma#A8549,圣路易斯,USA)。将溶液分成在
Protein LoBindTubes(Eppendorf,汉堡,德国)中的等份，并在
(Eppendorf,汉堡,德国)上以500rpm混合速率在不同的温度下加热不同的时间。孵育后，测定335nm处的OD以监测蛋白聚集体的形成。天然可溶性BSA的OD在该波长处为0。更高的OD值表明蛋白聚集体的形成。然后将溶液在5000rpm离心5分钟，并再次测量OD。离心将不可溶的聚集体从溶液中去除。
结果示于图2中。溶液在70℃加热4小时后的OD为0.04，离心后是相同的。溶液在75℃加热18小时后在335nm处的OD为0.407，但在离心后OD仅0.07。这表明部分蛋白通过加热而变性并从溶液中沉淀出来。
将加热的蛋白溶液在非变性的电泳蓝色非变性丙烯酰胺凝胶(梯度从4.5％至16％)上进行分离。电泳条件如下：在4mA下，于50mM两性离子缓冲剂Tricine、15mM Bis-Tris pH 7、0.02％考马斯蓝的负极缓冲液和50mM Bis-Tris pH7的正极缓冲液之间移动18h。在70℃孵育4小时的聚集的BSA溶液显示出大部分聚集体的分子量在600000和1百万之间，只有少量聚集体具有较低的分子量。在65℃孵育4小时的蛋白溶液显示出低分子量的BSA聚集体(主要是二聚体至八聚体)。在75℃孵育的溶液不显示任何条带，这是因为蛋白聚集体和/或沉淀物太大而不能进入凝胶。以上显示了如何确定在没有蛋白材料的实质性损失的情况下，实现聚集体形成的温度和时间的最佳参数。
实施例5：聚集的BSA在聚苯乙烯孔中的包被
制备含有在1ml 100mM磷酸盐缓冲液(pH 7.4)中的10mg BSA(Sigma#A3059,圣路易斯,USA)和1μg生物素化的BSA(Sigma#A8549,圣路易斯,USA)。将溶液分成在
Protein LoBindTubes(Eppendorf,汉堡,德国)中的等份，并在
(Eppendorf,汉堡,德国)上以500rpm混合速率在70℃加热0h、1h、4h和18h。在加热步骤之后，使不同的聚集的BSA溶液与“组织培养处理(TCT)”多孔板(Corning#3595,NY,USA)的聚苯乙烯孔接触。使用50μl/孔(500μg BSA+50ng生物素化的BSA/孔)进行包被。
用塑料膜密封孔并在室温下孵育18小时。孵育后，清空孔，用200μl PBS洗涤1×5分钟，随后洗涤2×1分钟，然后在室温下与50μl链霉亲和素-过氧化物酶缀合物溶液(0.5％脱脂牛奶+在100mM磷酸盐缓冲液中的1μg/mlSTAV-HRP)孵育30分钟。
在孵育缀合物后，孔在室温下用200μl PBS洗涤3×1分钟，并在室温下用50μl TMB溶液精确孵育5分钟。通过在每个孔中加入50μl 1N HCl溶液来终止反应，在MultiskanTM读板器(LabSystems,ThermoScientific)中在450nm波长下进行读板。不同BSA溶液的光密度的图示于图3中。可以看出，包被的聚集体的量随着聚集时间而增加。
然后将经包被的平板在37℃的PBS溶液中孵育24小时，以测量从平板中释放的蛋白的量。发现在这些条件下，在PBS溶液中未检测到生物素化的BSA，这意味着没有蛋白从包被中释放出来。
进行直接链霉亲和素-过氧化物酶测定，用于在PBS水溶液在37℃洗涤24小时之前和之后，检测在经包被的孔的表面上生物素化的BSA的存在。通过三种不同的聚集条件(70℃下1小时、4小时、18小时)来包被孔。如上所述，通过测定光密度来测量生物素化的BSA。结果示于下表1中。可以看出，对于所有三种聚集条件，生物素化的BSA的量在洗涤前后基本相同。在37℃洗涤24小时后，生物素化的BSA没有损失。这些结果显示聚集的BSA的包被是稳定的且不溶于水性介质中。使用未聚集的BSA作为对照(CTL)。
表1：洗涤包被的BSA聚集体的效果
| 未洗涤 | 经洗涤(24h) | |
| CTL | 0.17 | 0.16 |
| 在70°聚集1h | 0.25 | 0.33 |
| 在70°聚集4h | 0.56 | 0.60 |
| 在70°聚集18h | 1.54 | 1.64 |
实施例6：在疏水或亲水表面上培养细胞
在经处理用于细胞培养(TCT,
Corning#3524)或未经处理的(
Corning#3738)24个平板中培养HEK293细胞。将150000个细胞加入到每个孔中并在含有10％FCS的培养基中孵育15分钟。孔的包被如实施例3那样用1mg/ml聚集的BSA进行4小时，并且如实施例5那样包被在孔上。包被后，洗涤平板并在37℃下干燥。使用SMCC(如实施例2中所述)将含有线性或环状RGD的肽偶联至BSA。孵育15分钟后，通过使用WST-1试剂(N°10008883,Cayman Chemical,密歇根,US)的比色测定法估算附着的细胞数，并使用690nm处吸光度作为参考，读取450nm处的吸光度。
结果示于图4中。在对照实验中可以看出，与未处理的表面(E)相比，TCT增加附着到表面的细胞数。当使用已包被了聚集的BSA的平板时，TCT和非TCT平板之间实现了相同的细胞附着效率，其中聚集的BSA包括含线性RGD的肽(C)或含环状RGD的肽(D)。不包括任何细胞功能调节肽的包被对细胞附着具有负面效果(A)。
实施例7：干细胞分化
将若干肽或肽的组合偶联至BSA以提供载体蛋白。如实施例3所述的，加热蛋白溶液以获得聚集体。随后，如实施例5所述的，将蛋白聚集体包被到培养瓶的表面。人间充质干细胞(hMSC)获自Lonza(#PT-2501,Vervier,比利时)。在诱导分化前，细胞首先在干细胞生长培养基(BulletKitTM,Lonza PT-3001)中生长1天～2天。
用于成骨分化的细胞培养：细胞在第0天以3.7×103个细胞/cm的密度接种到经包被的平板的孔中。使用hMSC成骨分化BulletKitTM(Lonza,PT-3002)在第1天开始诱导分化。在第3、6和10天更新诱导培养基。在第14天进行试验。成骨细胞的分化引起基质成熟和矿化。成骨细胞含有由羟基磷灰石和含1型胶原的有机组分构成的矿化结节；通过OsteolmageTM骨矿化试验(Lonza,PA-1503)测定羟基磷灰石。OsteolmageTM与羟基磷灰石的结合引起可观察和测量的荧光信号。分化的其他标记物是前胶原1、TGF-β和纤连蛋白的合成。在分化14和21天后测试细胞培养物。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：13的肽的组合或SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：15的肽的组合对于细胞生长和细胞分化都特别有效。在预分化步骤中和在较高分化时，与TCT相比，含RGD的、聚集的BSA使细胞生长好得多。分化程度与用BioCoatTM纤连蛋白包被的平板(BD,比利时)观察到的程度相似。
用于成脂分化的细胞培养：hMSC细胞在第0天以2.1×104个细胞/cm的密度接种到孔中。培养基是hMSC成脂分化BulletKitTM(Lonza,PT-3004)，并且根据制造商的说明书进行培养。在第4天更新培养基。使用hMSC成脂分化BulletKitTM(Lonza,PT3004)在第5天开始诱导分化。在第8天，用维持培养基替换诱导培养基，培养3天。在第11天开始另一个诱导周期，在第15天开始第三个诱导周期。在第18、20、22、25天添加维持培养基，在第26天进行测定。包括SEQ ID NO：1的肽的、聚集的BSA使细胞生长良好并分化为脂肪细胞。
实施例8：干细胞的神经分化
将SEQ ID NO：1的含环状RGD的肽偶联至BSA以提供载体蛋白，经加热以获得如实施例3所述的聚集体。然后，如实施例5中所述，将聚集体包被在培养容器表面上。
干细胞是获自
(#N7800-200)(Life Technologies,比利时)的人神经干细胞(H-9hNSC)。它们源自NIH批准的H9(WA09)胚胎干细胞。培养基和分化培养基来自
根据制造商推荐的方案，在诱导分化前，细胞首先在干细胞生长培养基(
NSC SFM,Life Technolgies)中生长2天。
若干培养表面用于分化步骤：标准组织培养处理(TCT)表面、
(Corning,比利时)、PureCoatTM ECM模拟培养皿纤连蛋白(PureCoatTM ECM MimeticCultureware Fibronectin Protein)(Becton Dickinson,BD,比利时)、BioCoatTM聚L-鸟氨酸/层粘蛋白(BD,比利时)，和用根据本发明制备的含RGD的BSA聚集体包被的表面。
实施例9：在无血清培养基中的培养
将SEQ ID NO：1的含环状RGD的肽偶联至HSA以提供载体蛋白，经加热以获得如实施例3所述的聚集体。然后，如实施例5中所述，将聚集体包被在培养容器表面上。
人间充质干细胞(hMSC)获自Lonza(#PT-2501,Vervier,比利时)。根据制造商的要求，将细胞在补充有谷氨酰胺的CTSTM 
MSC SFM培养基(A10332-01,LifeTechnologies)中生长。
将细胞培养10天，在此期间对细胞进行检查：在显微镜下检查培养物，在细胞从支持物上分离后对细胞进行计数。观察到，细胞在这段期间在肽处理的表面上增殖良好，而它们在TCT表面上不增殖并最终退化。
序列表
<110> 艾本德股份公司
<120> 包被固体支持物的方法
<130> P 98350
<160> 64
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 环状
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 第1位和第5位连接形成环状肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (5)..(5)
<223> 第1位和第5位连接形成环状肽
<400> 1
Arg Gly Asp Pro Cys
1 5
<210> 2
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 2
Gly Arg Gly Asp Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 3
Gly Ser Gly Arg Gly Asp Ser Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 4
Val Thr Gly Arg Gly Asp Ser Pro Ala Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 5
Cys Gly Gly Asn Gly Glu Pro Arg Gly Asp Thr Tyr Arg Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 包括C末端的NH2基团
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 6
Gly Pro Arg Gly Asn Arg Gly Asp Ser Ile Asp Gln
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 包括C末端的NH2基团
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 7
Gly Ser Pro Gly Glu Arg Gly Asp Gln Gly Ala Arg
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 包括C末端的NH2基团
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 8
Asp Gly Arg Gly Asp Ser Val Ala Tyr Gly
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 包括C末端的NH2基团
<220>
<221> MOD_RES
<222> (11)..(11)
<223> 酰胺化
<400> 9
Pro Arg Gly Asp Ser Gly Tyr Arg Gly Asp Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 10
Cys Gly Gly Glu Pro Arg Gly Asp Thr Tyr Arg Ala
1 5 10
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 11
Cys Gly Pro Arg Gly Asp Thr Tyr Gly
1 5
<210> 12
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 包括N末端的乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<400> 12
Lys Gly Gly Pro Gln Val Thr Arg Gly Asp Val Phe Thr Met Pro
1 5 10 15
<210> 13
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 13
Glu Glu Ile Gln Ile Gly His Ile Pro Arg Glu Asp Val Asp Tyr His
1 5 10 15
Leu Tyr Pro
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 14
Glu Ile Leu Asp Val
1 5
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 15
Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg Pro Val Cys Phe Glu Lys Gly Met Asn
1 5 10 15
Tyr Thr Val Arg
20
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 16
Cys Ser Arg Ala Arg Lys Gln Ala Ala Ser Ile Lys Val Ala Val Ser
1 5 10 15
Ala Asp Arg
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 17
Gly Cys Gly Tyr Ile Gly Ser Arg Ser Pro Gly
1 5 10
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<220>
<221> MOD_RES
<222> (3)..(3)
<223> Xaa是羟脯氨酸(Hyp)
<400> 18
Gly Phe Xaa Gly Glu Arg Gly Val Gln
1 5
<210> 19
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 19
Ala Asp Gly Glu Ala Asp Pro
1 5
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 20
Pro His Ser Arg Asn
1 5
<210> 21
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 21
Leu His Ser Arg Asn
1 5
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 22
Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Pro His Ser Arg Asn
20
<210> 23
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 23
Arg Gly Asp Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Leu His Ser Arg Asn
20
<210> 24
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 24
Gly Thr Pro Gly Pro Gln Gly Ile Ala Gly Gln Arg Gly Val Val
1 5 10 15
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 25
Met Asn Tyr Tyr Ser Asn Ser
1 5
<210> 26
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 包括C末端的NH2基团和N末端的乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (10)..(10)
<223> 酰胺化
<400> 26
Cys Gly Gly Phe His Arg Arg Ile Lys Ala
1 5 10
<210> 27
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 27
Thr Gly Gln Tyr Leu Ala Met Asp Thr Asp Gly Leu Leu Tyr Gly Ser
1 5 10 15
<210> 28
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 28
Ala Asn Arg Tyr Leu Ala Met Lys Glu Asp Gly Arg Leu Leu Ala Ser
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 29
Glu Val Tyr Val Val Ala Glu Asn Gln Gln Gly Lys Ser Lys Ala
1 5 10 15
<210> 30
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 30
Val Val Asn Gly Ile Pro Thr Arg Asn
1 5
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 31
Lys Gln Leu Arg Ala Met Cys
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 32
Pro Ala Ser Asp Ala Phe Gln Arg Lys Leu Glu
1 5 10
<210> 33
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 33
Leu Ala Arg Leu Leu Thr
1 5
<210> 34
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 34
Ser Phe Leu Leu Arg Asn Pro Asn Asp Lys Tyr Glu Pro Phe
1 5 10
<210> 35
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 35
Leu Leu Gly Asp Phe Phe Arg Lys Ser Lys Glu Lys Ile Gly Lys Glu
1 5 10 15
Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg Asn Leu Val
20 25 30
Pro Arg Thr Glu Ser
35
<210> 36
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 36
Cys Gly Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Cys
1 5 10
<210> 37
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 37
Ser Leu Glu Glu Glu Trp Ala Gln Val Glu Cys Glu Val Tyr Gly Arg
1 5 10 15
Gly Cys Pro Ser Gly Ser Leu Asp Glu Ser Phe Tyr Asp Trp Phe Glu
20 25 30
Arg Gln Leu Gly
35
<210> 38
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 38
Gly Ser Leu Asp Glu Ser Phe Tyr Asp Trp Phe Glu Arg Gln Leu Gly
1 5 10 15
Lys Lys
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 39
Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg Lys Lys Cys
1 5 10
<210> 40
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 40
Ile Val Arg Lys Lys Cys Arg Lys Ile Glu
1 5 10
<210> 41
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 包括C末端的NH2基团
<220>
<221> MOD_RES
<222> (12)..(12)
<223> 酰胺化
<400> 41
Ala Leu Lys Arg Gln Gly Arg Thr Leu Tyr Gly Phe
1 5 10
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 42
Gly Gln Gly Phe Ser Tyr Pro Tyr Lys Ala Val Phe Ser Thr Gln
1 5 10 15
<210> 43
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 43
Ala Pro Ser Gly His Tyr Lys Gly
1 5
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 44
Met Gln Leu Pro Leu Ala Thr
1 5
<210> 45
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 45
Ala Pro Ser Gly His Tyr Lys Gly
1 5
<210> 46
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 46
Cys Val Arg Ala Cys
1 5
<210> 47
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 47
Asn Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu Asp Thr Gln
1 5 10 15
Tyr Ser Lys Val Leu Ala Leu Tyr
20
<210> 48
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 48
Glu Cys Gly Leu Leu Pro Val Gly Arg Pro Asp Arg Asn Val Trp Arg
1 5 10 15
Trp Leu Cys
<210> 49
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 49
Lys Pro Ser Ser Ala Pro Thr Gln Leu Asn
1 5 10
<210> 50
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 50
Lys Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser
1 5 10
<210> 51
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 51
Ser Asn Val Ile Leu Lys Lys Tyr Arg Asn
1 5 10
<210> 52
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 52
Gly Trp Gln Asp Trp Ile Ile Ala Pro Glu Gly Tyr Ala Ala Tyr Tyr
1 5 10 15
Cys Glu Gly Glu
20
<210> 53
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 53
Ala Ile Ser Val Leu Tyr Phe Asp Asp Ser Ser Asn Val Ile Leu Lys
1 5 10 15
Lys Tyr Arg Asn
20
<210> 54
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽
<400> 54
Ile Val Arg Lys Lys Cys Arg Lys Ile Glu
1 5 10
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 环状，具有在第1位的NAc和第16位的NH2基团
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> MOD_RES
<222> (16)..(16)
<223> 酰胺化
<400> 55
Cys Ser Arg Arg Gly Glu Leu Ala Ala Ser Arg Arg Gly Glu Leu Cys
1 5 10 15
<210> 56
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> 细胞功能调节肽, 具有C末端的NH2基团
<220>
<221> MOD_RES
<222> (9)..(9)
<223> 酰胺化
<400> 56
Phe Pro Gln Ser Phe Leu Pro Arg Gly
1 5
<210> 57
<211> 609
<212> PRT
<213> 智人
<400> 57
Met Lys Trp Val Thr Phe Ile Ser Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ser Ala
1 5 10 15
Tyr Ser Arg Gly Val Phe Arg Arg Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala
20 25 30
His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu
35 40 45
Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val
50 55 60
Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp
65 70 75 80
Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp
85 90 95
Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala
100 105 110
Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln
115 120 125
His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val
130 135 140
Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys
145 150 155 160
Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro
165 170 175
Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys
180 185 190
Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu
195 200 205
Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys
210 215 220
Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val
225 230 235 240
Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser
245 250 255
Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys Val His Thr Glu Cys Cys His Gly
260 265 270
Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile
275 280 285
Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu
290 295 300
Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp
305 310 315 320
Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser
325 330 335
Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly
340 345 350
Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val
355 360 365
Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys
370 375 380
Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu
385 390 395 400
Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys
405 410 415
Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu
420 425 430
Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val
435 440 445
Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His
450 455 460
Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val
465 470 475 480
Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg
485 490 495
Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe
500 505 510
Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala
515 520 525
Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu
530 535 540
Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys
545 550 555 560
Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala
565 570 575
Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe
580 585 590
Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly
595 600 605
Leu
<210> 58
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有修饰的环1的HSA
<400> 58
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Gly Arg Gly Asp Ser Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 59
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有修饰的环2的HSA
<400> 59
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Gly Arg Gly Asp Ser
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 60
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有修饰的环3的HSA
<400> 60
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gly Arg Gly Asp Ser Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 61
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有修饰的环1-3的HSA
<400> 61
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Gly Arg Gly Asp Ser Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Gly Arg Gly Asp Ser
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gly Arg Gly Asp Ser Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 62
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有修饰的线性段的HSA
<400> 62
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln His Lys Asp Asp Asn Pro Asn Leu
100 105 110
Arg Glu Asp Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 63
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有修饰的反向环的HSA
<400> 63
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg Leu
100 105 110
Pro Arg Leu Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gln Ala Ala Asp Lys Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
<210> 64
<211> 585
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有修饰的反向环、线性段和环3的HSA
<400> 64
Asp Ala His Lys Ser Glu Val Ala His Arg Phe Lys Asp Leu Gly Glu
1 5 10 15
Glu Asn Phe Lys Ala Leu Val Leu Ile Ala Phe Ala Gln Tyr Leu Gln
20 25 30
Gln Cys Pro Phe Glu Asp His Val Lys Leu Val Asn Glu Val Thr Glu
35 40 45
Phe Ala Lys Thr Cys Val Ala Asp Glu Ser Ala Glu Asn Cys Asp Lys
50 55 60
Ser Leu His Thr Leu Phe Gly Asp Lys Leu Cys Thr Val Ala Thr Leu
65 70 75 80
Arg Glu Thr Tyr Gly Glu Met Ala Asp Cys Cys Ala Lys Gln Glu Pro
85 90 95
Glu Arg Asn Glu Cys Phe Leu Gln Arg Tyr Val Val Leu Pro Arg Leu
100 105 110
Arg Glu Asp Val Arg Pro Glu Val Asp Val Met Cys Thr Ala Phe His
115 120 125
Asp Asn Glu Glu Thr Phe Leu Lys Lys Tyr Leu Tyr Glu Ile Ala Arg
130 135 140
Arg His Pro Tyr Phe Tyr Ala Pro Glu Leu Leu Phe Phe Ala Lys Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Ala Ala Phe Thr Glu Cys Cys Gly Arg Gly Asp Ser Ala Ala
165 170 175
Cys Leu Leu Pro Lys Leu Asp Glu Leu Arg Asp Glu Gly Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Ala Lys Gln Arg Leu Lys Cys Ala Ser Leu Gln Lys Phe Gly Glu
195 200 205
Arg Ala Phe Lys Ala Trp Ala Val Ala Arg Leu Ser Gln Arg Phe Pro
210 215 220
Lys Ala Glu Phe Ala Glu Val Ser Lys Leu Val Thr Asp Leu Thr Lys
225 230 235 240
Val His Thr Glu Cys Cys His Gly Asp Leu Leu Glu Cys Ala Asp Asp
245 250 255
Arg Ala Asp Leu Ala Lys Tyr Ile Cys Glu Asn Gln Asp Ser Ile Ser
260 265 270
Ser Lys Leu Lys Glu Cys Cys Glu Lys Pro Leu Leu Glu Lys Ser His
275 280 285
Cys Ile Ala Glu Val Glu Asn Asp Glu Met Pro Ala Asp Leu Pro Ser
290 295 300
Leu Ala Ala Asp Phe Val Glu Ser Lys Asp Val Cys Lys Asn Tyr Ala
305 310 315 320
Glu Ala Lys Asp Val Phe Leu Gly Met Phe Leu Tyr Glu Tyr Ala Arg
325 330 335
Arg His Pro Asp Tyr Ser Val Val Leu Leu Leu Arg Leu Ala Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Thr Thr Leu Glu Lys Cys Cys Ala Ala Ala Asp Pro His Glu
355 360 365
Cys Tyr Ala Lys Val Phe Asp Glu Phe Lys Pro Leu Val Glu Glu Pro
370 375 380
Gln Asn Leu Ile Lys Gln Asn Cys Glu Leu Phe Glu Gln Leu Gly Glu
385 390 395 400
Tyr Lys Phe Gln Asn Ala Leu Leu Val Arg Tyr Thr Lys Lys Val Pro
405 410 415
Gln Val Ser Thr Pro Thr Leu Val Glu Val Ser Arg Asn Leu Gly Lys
420 425 430
Val Gly Ser Lys Cys Cys Lys His Pro Glu Ala Lys Arg Met Pro Cys
435 440 445
Ala Glu Asp Tyr Leu Ser Val Val Leu Asn Gln Leu Cys Val Leu His
450 455 460
Glu Lys Thr Pro Val Ser Asp Arg Val Thr Lys Cys Cys Thr Glu Ser
465 470 475 480
Leu Val Asn Arg Arg Pro Cys Phe Ser Ala Leu Glu Val Asp Glu Thr
485 490 495
Tyr Val Pro Lys Glu Phe Asn Ala Glu Thr Phe Thr Phe His Ala Asp
500 505 510
Ile Cys Thr Leu Ser Glu Lys Glu Arg Gln Ile Lys Lys Gln Thr Ala
515 520 525
Leu Val Glu Leu Val Lys His Lys Pro Lys Ala Thr Lys Glu Gln Leu
530 535 540
Lys Ala Val Met Asp Asp Phe Ala Ala Phe Val Glu Lys Cys Cys Lys
545 550 555 560
Ala Asp Asp Lys Glu Thr Cys Phe Ala Glu Glu Gly Lys Lys Leu Val
565 570 575
Ala Ala Ser Gln Ala Ala Leu Gly Leu
580 585
Claims (20)
1.一种用于包被固体支持物的方法，所述固体支持物适合用在细胞培养应用中，所述方法包括：
(a)制备至少一种载体蛋白的溶液，所述载体蛋白包括附着于其上或作为其氨基酸序列一部分的至少一种细胞功能调节肽序列，其中所述细胞功能调节肽序列包括细胞结合肽基序，并且其中，所述载体蛋白是白蛋白或源自白蛋白的蛋白；
(b)将所述溶液加热到至少50℃，并在引起含2个至1000个蛋白分子的可溶性载体蛋白聚集体形成的条件下，孵育所述溶液；
(c)在使所述载体蛋白聚集体非共价吸附至所述固体支持物的条件下，将所述载体蛋白聚集体与所述固体支持物接触；
从而提供了在固体支持物表面上包括多种细胞功能调节肽序列的固体支持物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述固体支持物的表面是疏水的或亲水的。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在同一载体蛋白中或不同的载体蛋白中，使用2种、3种、4种、5种或更多种不同的细胞功能调节肽序列。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述蛋白聚集体包括5个至100个蛋白分子。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(b)中，将所述溶液加热到50℃至75℃。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(b)中，选择条件以获得至少50％的可溶形式的蛋白聚集体。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述细胞结合肽基序是RGD基序和/或选自SEQID NO：1～26所示序列中的细胞结合肽基序。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，至少一种所述细胞功能调节肽序列进一步包括选自SEQ ID NO：27～56中的具有生长因子活性的肽序列。
9.根据权利要求1、2或8所述的方法，其中，细胞功能调节肽被包括在所述载体蛋白中，以便形成细胞功能调节肽的分子嵌合体，所述细胞功能调节肽存在于聚集体的不同载体蛋白上或不同载体蛋白中。
10.根据权利要求5所述的方法，其中，在步骤(b)中，将所述溶液加热到65℃至73℃。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，在步骤(b)中，将所述溶液加热到68℃至72℃。
12.根据权利要求6所述的方法，其中，在步骤(b)中，选择条件以获得至少90％的可溶形式的蛋白聚集体。
13.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法在步骤(c)后还包括：(d)洗涤所述固体支持物以去除未结合的载体蛋白和载体蛋白聚集体。
14.一种通过权利要求1～13中任一项的方法得到的经包被的固体支持物。
15.一种经包被的固体支持物，所述固体支持物具有非共价吸附在其表面上的至少一种载体蛋白聚集体，其中，所述载体蛋白是白蛋白或源自白蛋白的蛋白并包括附着于其上或作为其氨基酸序列一部分的至少一种细胞功能调节肽序列，所述细胞功能调节肽序列包括细胞结合肽基序；并且，所述聚集体包括2个至1000个蛋白分子。
16.根据权利要求15所述的经包被的固体支持物，其中，所述固体支持物的表面包括2种或更多种不同的细胞功能调节肽序列。
17.根据权利要求15或16所述的经包被的固体支持物，其中，在37℃孵育24小时后，从包被的表面去除少于30％的所述载体蛋白。
18.根据权利要求15或16所述的经包被的固体支持物，其中，所述细胞结合肽基序是RGD基序和/或选自SEQ ID NO：1～26所示序列中的细胞结合肽基序。
19.根据权利要求18所述的经包被的固体支持物，其中，至少一种所述细胞功能调节肽序列进一步包括选自SEQ ID NO：27～56中的具有生长因子活性的肽序列。
20.根据权利要求15、16和19中任一项所述的经包被的固体支持物，其中，所述固体支持物的表面包括细胞功能调节肽序列的分子嵌合体，所述细胞功能调节肽序列存在于聚集体的不同载体蛋白上或不同载体蛋白中。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP14181625.6 | 2014-08-20 | ||
| EP14181625.6A EP2988130A1 (en) | 2014-08-20 | 2014-08-20 | Method for coating a solid support |
| PCT/EP2015/069150 WO2016026932A1 (en) | 2014-08-20 | 2015-08-20 | Method for coating a solid support |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN106715675A CN106715675A (zh) | 2017-05-24 |
| CN106715675B true CN106715675B (zh) | 2020-12-01 |
Family
ID=51357864
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201580044481.9A Expired - Fee Related CN106715675B (zh) | 2014-08-20 | 2015-08-20 | 包被固体支持物的方法 |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US20170175068A1 (zh) |
| EP (2) | EP2988130A1 (zh) |
| JP (1) | JP6481023B2 (zh) |
| CN (1) | CN106715675B (zh) |
| WO (1) | WO2016026932A1 (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP6840219B2 (ja) | 2016-03-14 | 2021-03-10 | パテル ラビンドラカマー ディラブハイＰＡＴＥＬ，Ｒａｖｉｎｄｒａｋｕｍａｒ Ｄｈｉｒｕｂｈａｉ | バイオリアクタシステム及びその方法 |
| WO2021015123A1 (ja) * | 2019-07-25 | 2021-01-28 | 東レ株式会社 | アレルゲン固定化担体の製造方法及びアレルゲン特異的抗体の検出方法 |
| CN110903381B (zh) * | 2019-12-04 | 2022-08-16 | 广州领晟医疗科技有限公司 | 一种促进软骨再生的肽kai 11及其应用 |
| CN114456231A (zh) * | 2022-01-12 | 2022-05-10 | 广州领晟医疗科技有限公司 | 一种软骨再生肽kps10及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5278063A (en) * | 1989-09-28 | 1994-01-11 | Board Of Regents The University Of Texas System | Chemical modification of promote animal cell adhesion on surfaces |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5330911A (en) * | 1989-09-28 | 1994-07-19 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Surfaces having desirable cell adhesive effects |
| US5281422A (en) | 1991-09-24 | 1994-01-25 | Purdue Research Foundation | Graft for promoting autogenous tissue growth |
| CA2151742C (en) * | 1993-02-22 | 1999-05-25 | Alfred A. Amkraut | Compositions for oral delivery of active agents |
| US5554389A (en) | 1995-04-07 | 1996-09-10 | Purdue Research Foundation | Urinary bladder submucosa derived tissue graft |
| BR9711166A (pt) | 1996-08-23 | 1999-08-17 | Cook Biotech Inc | PrÄtese de enxerto materiais para sua prepara-Æo e m-todos para seu uso |
| JP4302188B2 (ja) | 1996-12-10 | 2009-07-22 | パーデュー・リサーチ・ファウンデーション | 胃粘膜下組織由来組織移植片 |
| US6544750B1 (en) * | 1999-08-17 | 2003-04-08 | Thromgen, Inc. | Peptide analogs as selective inhibitors of thrombin activation of protease activated receptor 1 |
| US7157275B2 (en) | 2003-08-15 | 2007-01-02 | Becton, Dickinson And Company | Peptides for enhanced cell attachment and growth |
| US20050059140A1 (en) | 2003-09-12 | 2005-03-17 | Andrea Liebmann-Vinson | Methods of surface modification to enhance cell adhesion |
| US20120171769A1 (en) * | 2010-12-30 | 2012-07-05 | Mcgonigle Joseph S | Cell attachment coatings and methods |
-
2014
- 2014-08-20 EP EP14181625.6A patent/EP2988130A1/en not_active Withdrawn
-
2015
- 2015-08-20 EP EP15754181.4A patent/EP3183576B1/en active Active
- 2015-08-20 JP JP2017510312A patent/JP6481023B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-08-20 US US15/502,285 patent/US20170175068A1/en not_active Abandoned
- 2015-08-20 CN CN201580044481.9A patent/CN106715675B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2015-08-20 WO PCT/EP2015/069150 patent/WO2016026932A1/en active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5278063A (en) * | 1989-09-28 | 1994-01-11 | Board Of Regents The University Of Texas System | Chemical modification of promote animal cell adhesion on surfaces |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Dynamic rearrangement of disulfide bridges influences solubility of whey protein coatings;Floris et al;《International dairy journal,Elsevier applied science barking,GB》;20071208;第18卷(第5期);摘要及第2.3-2.5部分 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2988130A1 (en) | 2016-02-24 |
| JP2017527555A (ja) | 2017-09-21 |
| WO2016026932A1 (en) | 2016-02-25 |
| EP3183576B1 (en) | 2019-11-13 |
| JP6481023B2 (ja) | 2019-03-13 |
| EP3183576A1 (en) | 2017-06-28 |
| US20170175068A1 (en) | 2017-06-22 |
| CN106715675A (zh) | 2017-05-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| SAKIYAMA et al. | Incorporation of heparin‐binding peptides into fibrin gels enhances neurite extension: an example of designer matrices in tissue engineering | |
| Widhe et al. | A fibronectin mimetic motif improves integrin mediated cell biding to recombinant spider silk matrices | |
| KR101976207B1 (ko) | 정의된 합성 피브로넥틴 모방체 펩티드 및 이에 의해 변형된 표면 | |
| Ravi et al. | Maleimide–thiol coupling of a bioactive peptide to an elastin-like protein polymer | |
| Cutler et al. | Engineering cell adhesive surfaces that direct integrin α5β1 binding using a recombinant fragment of fibronectin | |
| CN106715675B (zh) | 包被固体支持物的方法 | |
| Sawyer et al. | The effect of adsorbed serum proteins, RGD and proteoglycan-binding peptides on the adhesion of mesenchymal stem cells to hydroxyapatite | |
| Chen et al. | Surface biofunctionalization by covalent co-immobilization of oligopeptides | |
| Fraioli et al. | Surface guidance of stem cell behavior: chemically tailored co-presentation of integrin-binding peptides stimulates osteogenic differentiation in vitro and bone formation in vivo | |
| JP5858411B2 (ja) | コラーゲン結合性分子を付加した改変ラミニンおよびその利用 | |
| US20110200560A1 (en) | Non-ionic self-assembling peptides and uses thereof | |
| Zhang et al. | Compatibility of neural stem cells with functionalized self-assembling peptide scaffold in vitro | |
| Jeon et al. | Functional enhancement of neuronal cell behaviors and differentiation by elastin-mimetic recombinant protein presenting Arg-Gly-Asp peptides | |
| US10662230B2 (en) | Cyclic RGD cell-binding motif and uses thereof | |
| Silva et al. | Fibrin functionalization with synthetic adhesive ligands interacting with α6β1 integrin receptor enhance neurite outgrowth of embryonic stem cell-derived neural stem/progenitors | |
| Imen et al. | Construction of multifunctional proteins for tissue engineering: Epidermal growth factor with collagen binding and cell adhesive activities | |
| US20230313126A1 (en) | Peptide Conjugated Hydrogel Substrate for the Maintenance and Expansion of Human Pluripotent Stem Cells | |
| KR101865451B1 (ko) | 무기물 표면 접착 또는 코팅용 단백질 접착제 | |
| WO2013002311A1 (ja) | 幹細胞培養用基材及びそれを用いた培養方法 | |
| US20230203131A1 (en) | Chimeric protein comprising a fibrinogen fragment and a laminin fragment and use thereof | |
| Karuri et al. | A surface derivatization strategy for combinatorial analysis of cell response to mixtures of protein domains | |
| Maheshwari | Biophysical regulation of cell motility by adhesion ligands and growth factors: effect of spatial presentation of the ligand |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20201201 Termination date: 20210820 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |