KR101976207B1 - 정의된 합성 피브로넥틴 모방체 펩티드 및 이에 의해 변형된 표면 - Google Patents
정의된 합성 피브로넥틴 모방체 펩티드 및 이에 의해 변형된 표면 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 피브로넥틴 코팅된 표면을 모방하는 적용을 위한 구성물(composition)에 관한 것이다. 유리하게는, 이러한 구성물은 피브로넥틴의 기능성 중 하나 이상을 모방하는 동물 무함유 (이종성분-무함유(xeno-free) 및 인간-성분-무함유), 화학적으로 정의된 합성 표면을 제공한다.
Description
<관련 출원에 대한 교차 참조>
본 출원은 2010년 12월 8일에 출원된 미국 가출원 제61/420,818호를 우선권 주장하며, 이 가출원의 내용은 본원에 참고로 포함된다.
<발명의 기술분야>
본 발명은 피브로넥틴의 하나 이상의 기능적 특징을 모방하는 화합물 및 이에 의해 변형된 표면에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 인간 피브로넥틴의 코팅과 견줄만한 세포 부착을 제공하는 이종성분-무함유(xeno-free), 인간 또는 동물-성분-무함유, 화학적으로 정의된 합성 화합물 및 이에 의해 변형된 표면에 관한 것이다.
세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 코팅된 표면은 세포 배양 및 이식 장치의 코팅에서 광범위하게 사용되고 있다. 특히, 피브로넥틴은 세포 부착, 성장, 이동 및 분화를 지지하는 세포 배양에서 사용되는, 흔히 사용되는 ECM 단백질이다. 세포 배양을 위한 표면의 코팅을 위해 사용되는 ECM 단백질은 일반적으로 인간 또는 기타 동물 기원이고, 종종 불충분하게 정의된다. 이러한 ECM 단백질의 사용은 예를 들어, 인간 치료적 적용에서 문제가 될 수 있다. 이러한 표면의 코팅을 위해 단리된 인간 ECM 단백질을 사용할 수 있으나, 이에 의한 ECM 중 일부와 관련된 비용은 매우 높다. 또한, 재조합 인간 ECM 단백질에 대하여, 이에 존재하는 오염물질의 가변성으로 인해 단리된 ECM 단백질의 상이한 배치(batch)로부터 세포 배양의 가변성이 기인될 수 있다. 추가로, 세포 배양의 가변성은 단리된 피브로넥틴 및 재조합 피브로넥틴 양자 모두를 위해 일반적으로 사용되는 자가-코팅 공정 그 자체로부터 발생할 수 있다.
그러므로, 피브로넥틴 코팅된 표면을 모방하는, 이종성분-무함유, 인간 또는 동물-성분-무함유, 화학적으로 정의된 합성 표면에 대한 필요성이 존재한다.
<발명의 요약>
본 발명은 이종성분-무함유, 인간 또는 동물-성분-무함유, 화학적으로 정의된 합성 화합물 및 이에 의해 변형된 표면을 제공한다. 유리하게는, 이러한 화합물에 의해 변형된 표면은 인간 피브로넥틴 코팅된 표면을 모방한다. 추가로, 이러한 이종성분-무함유, 인간 또는 동물-성분-무함유, 화학적으로 정의된 합성 코팅은 불충분하게 정의되고 또한 치료적 적용에서 면역 반응을 유도할 수 있는 동물-유래 생성물과 관련된 문제를 회피한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 화합물에 의해 변형된 표면을 포함하는 세포 배양 용기를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 가요성 링커에 의해 결합된 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 적어도 2개의 영역을 포함하며, 적어도 1개의 영역은 아미노산 서열 GRGDSP (서열 1)를 포함하고, 또 다른 영역은 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13RX15PX17SRNX21X22TLTX26 (서열 2)을 포함하며, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S, V, A, G를 나타내거나 부재하고, X8은 G, A를 나타내거나 부재하고, X9는 R 또는 G를 나타내고, X10은 P, A, Q 또는 G를 나타내고, X11은 R 또는 K를 나타내고, X12는 E, Q, W, A 또는 G를 나타내고, X13은 D 또는 E를 나타내고, X15는 V, L 또는 I를 나타내고, X17은 H 또는 P를 나타내고, X21은 S, T 또는 G를 나타내고, X22는 I 또는 L을 나타내고, X26은 N 또는 H를 나타내는, 화합물을 제공한다.
한 실시양태에서, X7은 S를 나타낸다. 한 실시양태에서, X8은 G를 나타낸다. 한 실시양태에서, X9는 R을 나타낸다. 한 실시양태에서, X10은 G 또는 A를 나타낸다. 한 실시양태에서, X11은 R을 나타낸다. 한 실시양태에서, X12는 E, A 또는 G를 나타낸다. 한 실시양태에서, X13은 D를 나타낸다. 한 실시양태에서, X15는 V를 나타낸다. 한 실시양태에서, X17은 H를 나타낸다. 한 실시양태에서, X22는 I를 나타낸다. 한 실시양태에서, X26은 N을 나타낸다.
한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G 또는 A를 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G 또는 A를 나타내고, X11은 R을 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G 또는 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E, A 또는 G를 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G 또는 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E, A 또는 G를 나타내고, X13은 D를 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G 또는 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E, A 또는 G를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G 또는 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E, A 또는 G를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G 또는 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E, A 또는 G를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X22는 I를 나타낸다. 한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G 또는 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E, A 또는 G를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다.
한 실시양태에서, 가요성 링커는 아미노산 서열 SGSGSGSGS (서열 3), GGSGGSGGS (서열 4), SGTGSGTGS (서열 5) 또는 GGGSGGGSGG (서열 6)를 포함한다.
한 실시양태에서, X7은 S를 나타내고; X8은 G를 나타내고; X9는 R을 나타내고; X10은 G 또는 A를 나타내고; X11은 R을 나타내고; X12는 E, A 또는 G를 나타내고; X13은 D를 나타내고; X15는 V를 나타내고; X17은 H를 나타내고; X22는 I를 나타내고; X26은 N을 나타내고, 가요성 링커는 아미노산 서열 SGSGSGSGS (서열 3), GGSGGSGGS (서열 4), SGTGSGTGS (서열 5) 또는 GGGSGGGSGG (서열 6)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 표면의 적어도 일부가 가요성 링커에 의해 결합된 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 적어도 2개의 영역을 갖는 화합물의 코팅을 상부에 포함하는 표면이 제공되며, 여기서 적어도 1개의 영역은 아미노산 서열 GRGDSP (서열 1)를 포함하고, 또 다른 영역은 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13RX15PX17SRNX21X22TLTX26 (서열 2)을 포함하며, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S, V, A, G를 나타내거나 부재하고, X8은 G, A를 나타내거나 부재하고, X9는 R 또는 G를 나타내고, X10은 P, A, Q 또는 G를 나타내고, X11은 R 또는 K를 나타내고, X12는 E, Q, W, A 또는 G를 나타내고, X13은 D 또는 E를 나타내고, X15는 V, L 또는 I를 나타내고, X17은 H 또는 P를 나타내고, X21은 S, T 또는 G를 나타내고, X22는 I 또는 L을 나타내고, X26은 N 또는 H를 나타낸다. 한 실시양태에서, 표면은 피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징을 모방한다. 한 실시양태에서, 표면의 적어도 일부는 상부에 코팅을 포함하며, X7은 S를 나타내고; X8은 G를 나타내고; X9는 R을 나타내고; X10은 G 또는 A를 나타내고; X11은 R을 나타내고; X12는 E, A 또는 G를 나타내고; X13은 D를 나타내고; X15는 V를 나타내고; X17은 H를 나타내고; X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타내고, 가요성 링커는 아미노산 서열 SGSGSGSGS (서열 3), GGSGGSGGS (서열 4), SGTGSGTGS (서열 5) 또는 GGGSGGGSGG (서열 6)를 포함한다.
또 다른 측면에서, 표면의 적어도 일부가 가요성 링커에 의해 결합된 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 적어도 2개의 영역을 갖는 화합물의 코팅을 상부에 포함하는 표면을 포함하는 구성물(composition)이 제공되며, 여기서 적어도 1개의 영역은 아미노산 서열 GRGDSP (서열 1)를 포함하고, 또 다른 영역은 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13RX15PX17SRNX21X22TLTX26 (서열 2)을 포함하며, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S, V, A, G를 나타내거나 부재하고, X8은 G, A를 나타내거나 부재하고, X9는 R 또는 G를 나타내고, X10은 P, A, Q 또는 G를 나타내고, X11은 R 또는 K를 나타내고, X12는 E, Q, W, A 또는 G를 나타내고, X13은 D 또는 E를 나타내고, X15는 V, L 또는 I를 나타내고, X17은 H 또는 P를 나타내고, X21은 S, T 또는 G를 나타내고, X22는 I 또는 L을 나타내고, X26은 N 또는 H를 나타내며, 표면은 피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징을 모방한다.
본 발명의 이들 및 다른 특징은 하기 상세한 설명의 연구를 통해 보다 양호하게 이해될 것이다.
본 발명에 의해, 이종성분-무함유, 인간 또는 동물-성분-무함유, 화학적으로 정의된 합성 화합물 및 이에 의해 변형된 표면을 제공할 수 있으며, 이에 따라 이종성분-무함유, 인간 또는 동물-성분-무함유, 화학적으로 정의된 합성 코팅은 불충분하게 정의되고 또한 치료적 적용에서 면역 반응을 유도할 수 있는 동물-유래 생성물과 관련된 문제를 회피할 수 있다.
도 1A는 상부에 임의의 세포외 매트릭스 단백질 코팅이 없는 조직 배양 표면상에 존재하는 LNCaP 인간 전립선 암 세포의 이미지이다.
도 1B는 상부의 본 발명의 화합물 (즉, KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7))에 의해 변형된 표면에 부착된 LNCaP 인간 전립선 암 세포의 이미지이다.
도 1C는 상부의 인간 피브로넥틴 (즉, BD 바이오코트(BioCoat) 피브로넥틴)의 코팅을 갖는 표면에 부착된 LNCaP 인간 전립선 암 세포의 이미지이다.
도 2는 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면 (본원에서 "HFN"으로 지칭됨), 상부에 본 발명의 화합물 (즉, KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7))이 있는 표면 (본원에서 "모방체"로 지칭됨) 및 상부에 임의의 코팅이 없는 대조군 조직 배양 (본원에서 "TC"로 지칭됨) 표면에 대한 LNCaP 세포 부착의 정량을 위한 MTS 분석 후 490 nm의 흡광도 수준을 도시하는 그래프이다.
도 3은 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면 (본원에서 "HFN"으로 지칭됨), 상부에 본 발명의 화합물 (즉, KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7))이 있는 표면 (본원에서 "모방체"로 지칭됨) 및 상부에 임의의 코팅이 없는 대조군 조직 배양 (본원에서 "TC"로 지칭됨) 표면에 대한 인큐사이트(IncuCyte) (에센(Essen)) A-172 (인간 신경교아종 세포주) 및 RKO (인간 결장 암종 세포주) 세포 부착에 의한 전면생장률(confluence) 정량을 도시하는 그래프이다.
도 4a는 본원에서 "DA2"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGTGSGTGSGRGDSP (서열 8), 본원에서 "DA4"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNGGGSGGGSGGGRGDSP (서열 9), 본원에서 "DA1"로 지칭되는 KSGRARADRVPHSRNTITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 10), 본원에서 "DA3"으로 지칭되는 KSGRARADRVPHSRNTITLTNGGSGGSGGSGRGDSP (서열 11), 본원에서 "DA5"로 지칭되는 KSGRGRGDRVPHSRNGITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 12), 본원에서 "모방체 펩티드"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7)의 코팅을 상부에 갖는 표면, 본원에서 "피브로넥틴"으로 지칭되는 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면 또는 본원에서 "펩티드 없음"으로 지칭되는 펩티드 코팅이 없는 표면에 부착된 A-172 인간 신경교아종 암 세포의 이미지이다. 특히, 가요성 링커에 밑줄이 쳐져 있다.
도 4b는 본원에서 "DA2"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGTGSGTGSGRGDSP (서열 8), 본원에서 "DA4"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNGGGSGGGSGGGRGDSP (서열 9), 본원에서 "DA1"로 지칭되는 KSGRARADRVPHSRNTITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 10), 본원에서 "DA3"으로 지칭되는 KSGRARADRVPHSRNTITLTNGGSGGSGGSGRGDSP (서열 11), 본원에서 "DA5"로 지칭되는 KSGRGRGDRVPHSRNGITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 12), 본원에서 "모방체 펩티드"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7)의 코팅을 상부에 갖는 표면, 본원에서 "피브로넥틴"으로 지칭되는 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면 또는 본원에서 "펩티드 없음"으로 지칭되는 펩티드 코팅이 없는 표면에 대해 MTS 분석에 의해 A-172 인간 신경교아종 암 세포 부착의 정량 분석을 기준으로 한 그래프를 도시한다. 특히, 가요성 링커에 밑줄이 쳐져 있다.
도 1B는 상부의 본 발명의 화합물 (즉, KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7))에 의해 변형된 표면에 부착된 LNCaP 인간 전립선 암 세포의 이미지이다.
도 1C는 상부의 인간 피브로넥틴 (즉, BD 바이오코트(BioCoat) 피브로넥틴)의 코팅을 갖는 표면에 부착된 LNCaP 인간 전립선 암 세포의 이미지이다.
도 2는 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면 (본원에서 "HFN"으로 지칭됨), 상부에 본 발명의 화합물 (즉, KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7))이 있는 표면 (본원에서 "모방체"로 지칭됨) 및 상부에 임의의 코팅이 없는 대조군 조직 배양 (본원에서 "TC"로 지칭됨) 표면에 대한 LNCaP 세포 부착의 정량을 위한 MTS 분석 후 490 nm의 흡광도 수준을 도시하는 그래프이다.
도 3은 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면 (본원에서 "HFN"으로 지칭됨), 상부에 본 발명의 화합물 (즉, KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7))이 있는 표면 (본원에서 "모방체"로 지칭됨) 및 상부에 임의의 코팅이 없는 대조군 조직 배양 (본원에서 "TC"로 지칭됨) 표면에 대한 인큐사이트(IncuCyte) (에센(Essen)) A-172 (인간 신경교아종 세포주) 및 RKO (인간 결장 암종 세포주) 세포 부착에 의한 전면생장률(confluence) 정량을 도시하는 그래프이다.
도 4a는 본원에서 "DA2"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGTGSGTGSGRGDSP (서열 8), 본원에서 "DA4"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNGGGSGGGSGGGRGDSP (서열 9), 본원에서 "DA1"로 지칭되는 KSGRARADRVPHSRNTITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 10), 본원에서 "DA3"으로 지칭되는 KSGRARADRVPHSRNTITLTNGGSGGSGGSGRGDSP (서열 11), 본원에서 "DA5"로 지칭되는 KSGRGRGDRVPHSRNGITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 12), 본원에서 "모방체 펩티드"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7)의 코팅을 상부에 갖는 표면, 본원에서 "피브로넥틴"으로 지칭되는 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면 또는 본원에서 "펩티드 없음"으로 지칭되는 펩티드 코팅이 없는 표면에 부착된 A-172 인간 신경교아종 암 세포의 이미지이다. 특히, 가요성 링커에 밑줄이 쳐져 있다.
도 4b는 본원에서 "DA2"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGTGSGTGSGRGDSP (서열 8), 본원에서 "DA4"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNGGGSGGGSGGGRGDSP (서열 9), 본원에서 "DA1"로 지칭되는 KSGRARADRVPHSRNTITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 10), 본원에서 "DA3"으로 지칭되는 KSGRARADRVPHSRNTITLTNGGSGGSGGSGRGDSP (서열 11), 본원에서 "DA5"로 지칭되는 KSGRGRGDRVPHSRNGITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 12), 본원에서 "모방체 펩티드"로 지칭되는 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7)의 코팅을 상부에 갖는 표면, 본원에서 "피브로넥틴"으로 지칭되는 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면 또는 본원에서 "펩티드 없음"으로 지칭되는 펩티드 코팅이 없는 표면에 대해 MTS 분석에 의해 A-172 인간 신경교아종 암 세포 부착의 정량 분석을 기준으로 한 그래프를 도시한다. 특히, 가요성 링커에 밑줄이 쳐져 있다.
본원에서 사용되는 하기 용어는 하기 기재된 정의를 가질 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "피브로넥틴 세포-결합 도메인"은 이에 세포-결합하는 것을 특징으로 하는 인간 또는 다른 동물로부터 유래된 피브로넥틴 단백질의 영역을 지칭한다. 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 예시적인 영역에는 SGRPREDRVPHSRNSITLTN (서열 13) 및 GRGDSP (서열 1)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 어구 "피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징"에는 피브로넥틴-의존적 세포 유형의 세포 부착, 성장, 이동 및 분화가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 예시적인 피브로넥틴-의존적 세포 유형에는 LNCAP, MIA-Paca-2, A-172 및 RKO 세포가 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징은 LNCaP 세포를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징은 MIA-PaCa-2 세포를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징은 A-172 세포를 사용하는 것을 특징으로 한다. 또 다른 실시양태에서, 피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징은 RKO 세포를 사용하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 표면은 피브로넥틴 코팅된 표면의 세포 부착을 모방한다.
본 발명의 화합물로 코팅된 세포 배양 표면을 피브로넥틴으로 코팅된 세포 배양 표면과 비교하는 것과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "모방 (mimic)"은 평가되는 하나 이상의 기능적 특징에서의 상대적인 유사성을 가리킨다. 바람직하게는, 그의 정량은 하나 이상의 기능적 특성에서 적어도 90%의 유사성을 보여줄 것이다.
본원에서 사용되는 어구 "가요성 링커"는 아미노산 서열의 두 영역을 함께 연결하여 결합된 영역의 상대적인 가요성을 제공함으로써 그의 이동을 가능하게 하는 방식으로 기능하는 화학적 화합물을 가리킨다. 예를 들어, 가요성 링커에서 회선각 (torsion angle)의 변화는 여기에 결합된 영역이 회전할 수 있게 한다. 본 발명에서, 가요성 링커는 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 두 영역을 함께 결합하기 위해서 사용된다. 비록 링커가 함께 연결된 아미노산 서열의 형태 및 결과적으로 전체 화합물의 그에 따른 활성에 영향을 미칠 수 있으나, 일반적으로 링커는 본질적으로, 그리고 그 자체로 생물학적 활성을 갖는 것으로 고려되지 않는다. 그보다는, 링커는 결합되는 아미노산 서열의 기능을 지지하도록 설계된다. 링커는 재조합 기술 또는 합성 기술 (예를 들어, 고체상 합성)을 통해 생산되고, 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 및/또는 펩티드유사물 (peptidomimetic)을 포함할 수 있다. 전형적으로, 링커의 쇄 길이는 1 내지 15개의 아미노산이다. 특정 실시양태에서, 링커의 쇄 길이는 5 내지 10개의 아미노산이다. 링커는 당업계에 공지되어 있고, 문헌 [Freund et al., FEBS 320:97-100 (1993)]; [Gururaja et al., J Pept Res, 61:163-176 (2003)] (링커 GSGS (서열 14) 및 GSGSGSGSGS (서열 15)); [Prehoda et al., Science, 290:801-806 (2000)]; [Wriggers et al., Biopolymers, 80(6):736-746 (2005)]; 및 [Hu et al., J Biotechnol, 107(1):83-90 (2004)], [Mardilovich et al., Langmuir, 22:3259-3264 (2006)]; [Margeta et al., Proc Natl Acad Science, 106:1632-37 (2009)] (링커 GSGSGSGSGS)]; [van Dongen et al., J Am Chem Soc, 129:3494-3495 (2007)] (2 내지 9개의 GGSGGS (서열 16) 반복부를 함유하는 링커)을 포함하나 이에 제한되지 않는 다수의 문헌에 기술되어 있다.
본 발명에서 사용하기에 적합한 가요성 링커에는 SGSGSGSGS (서열 3), GGSGGSGGS (서열 4), SGTGSGTGS (서열 5) 및 GGGSGGGSGG (서열 6)가 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
피브로넥틴은 인테그린으로 불리는 막관통 수용체 단백질 뿐만 아니라 ECM 성분 콜라겐, 피브린 및 헤파란 술페이트 프로테오글리칸 (예를 들어, 신데칸)에 결합하는 고 분자량 (~440 kDa) ECM 당단백질이다. 피브로넥틴은 세포 부착, 성장, 이동 및 분화를 지지하고, 상처 치유, 배아 발생 및 특정 유형의 발암에서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려졌다.
구조적으로, 피브로넥틴은 1쌍의 C-말단 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 거의 동일한 폴리펩티드 쇄로 구성되는 이량체로서 존재한다. 각각의 피브로넥틴 단량체의 분자량은 230 내지 250 kDa이고, 3가지 유형의 모듈인 유형 I, II 및 III을 함유한다. 모듈은 피브로넥틴 단량체의 길이를 따라 여러 기능적 및 단백질-결합 도메인으로 배열된다. 피브로넥틴이 다른 피브로넥틴 분자와 회합하도록 하는 4개의 피브로넥틴-결합 도메인이 있다. 이러한 피브로넥틴-결합 도메인 중 하나인 I1 -5는 "어셈블리 도메인"으로서 지칭되고, 피브로넥틴 매트릭스 어셈블리의 개시를 위해서 요구된다. 모듈 III9 -10은 피브로넥틴의 "세포-결합 도메인"에 상응한다. RGD 서열 (Arg-Gly-Asp)은 III10에 위치하고, 세포 표면 상에 α5β1 및 αVβ3 인테그린을 통한 세포 부착 부위이다. "시너지 (synergy) 부위"는 III9에 있고, 피브로넥틴과 α5β1 인테그린의 회합을 조절하는 역할을 담당한다. 또한, 피브로넥틴은 피브린-결합 (I1 -5, I10 -12), 콜라겐-결합 (I6 -9), 피불린 (fibulin)-1-결합 (III13 -14), 헤파린-결합 및 신데칸-결합 (III12 -14)을 위한 도메인을 함유한다.
본 발명을 임의의 이론에 의해 제한하고자 하는 것을 아니지만, 본 발명의 화합물은 가요성 링커에 의해 결합된 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 적어도 2개의 영역을 포함한다. 이러한 영역은 피브로넥틴의 하나 이상의 기능적 특징을 모방하는 방식으로 또 다른 영역과 상호작용하는 것으로 여겨진다. 특히, 이러한 화합물로 코팅된 표면은 피브로넥틴 코팅된 표면의 세포 부착을 모방한다.
본 발명의 화합물은 통상의 재조합 기법 또는 합성 기술 (예를 들어, 고체상 합성)을 사용하여 제조할 수 있다. 유사하게, 통상의 기술을 사용하여 해당 적용분야에 적합한 정도까지 이러한 화합물을 정제할 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 화합물의 합성적 합성은 적어도 70% 또는 그 초과의 순도 수준을 제공할 수 있다. 한 실시양태에서, 화합물은 적어도 90%의 순도 수준을 갖는다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 90% 또는 그 초과의 순도 수준을 갖는다. 특정 적용분야, 예컨대 치료학 분야에서, 화합물을 합성하는 것이 특히 바람직하다
본 발명의 화합물은 가요성 링커에 의해 결합된 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 적어도 2개의 영역을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 화합물은 100개 미만의 아미노산의 길이이다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물의 쇄 길이는 약 25 내지 약 50개의 아미노산이다. 본 발명의 화합물은 천연 아미노산, 비-천연 아미노산 및/또는 펩티드유사물을 포함할 수 있다.
당업자는 피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특성을 모방하기 위해서 세포 배양을 위한 표면 상에 코팅되는 경우 생성된 화합물의 능력을 양보하지 않고, 피브로넥틴 세포-결합 도메인 및/또는 링커의 영역을 본원에 기재된 아미노산 서열의 1개 이상의 아미노산으로 치환할 수 있을 것으로 이해된다.
특히, 본 발명의 화합물은 천연 피브로넥틴 세포-결합 도메인과 비교하여 1개 이상의 아미노산의 보존적 치환을 가질 수 있다. "보존적 치환"은 유사한 화학 구조 및 극성의 측쇄에 의해 각각의 아미노산의 측쇄가 대체되는 것으로 정의되고, 측쇄는 유전적으로 코딩되거나 또는 유전적으로 코딩되지 않은 아미노산으로부터 유도된다. 유사한 측쇄를 갖는 이러한 류의 아미노산 족 (family)은 당업계에 공지되어 있다. 이는 예를 들어, 염기성 측쇄 (리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄 (아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄 (알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지 측쇄 (트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄 (티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 갖는 아미노산을 포함한다.
본 발명은 가요성 링커에 의해 결합된 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 적어도 2개의 영역을 포함하는 화합물을 제공하고, 여기서 적어도 1개의 영역은 아미노산 서열 GRGDSP (서열 1)을 포함하고, 또 다른 영역은 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13RX15PX17SRNX21X22TLTX26 (서열 2)을 포함하며, 여기서 X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S, V, A, G를 나타내거나 부재하고, X8은 G, A를 나타내거나 부재하고, X9는 R 또는 G를 나타내고, X10은 P, A, Q 또는 G를 나타내고, X11은 R 또는 K를 나타내고, X12는 E, Q, W, A 또는 G를 나타내고, X13은 D 또는 E를 나타내고, X15는 V, L 또는 I를 나타내고, X17은 H 또는 P를 나타내고, X21은 S, T 또는 G를 나타내고, X22는 I 또는 L을 나타내고, X26은 N 또는 H를 나타낸다.
특정 실시양태에서, X1은 부재하고, X2는 부재하고, X3은 부재하고, X4는 부재하고, X5는 부재하고, X6은 K를 나타낸다. 또 다른 실시양태에서, X1은 부재하고, X2는 부재하고, X3은 부재하고, X4는 부재하고, X5는 부재하고, X6은 부재한다.
한 실시양태에서, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 P를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 S를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 그 결과, X1X2X3X4X5X6SGRPREDRVPHSRNSITLTN (서열 17)이다. 한 실시양태에서, X1은 부재하고, X2는 부재하고, X3은 부재하고, X4는 부재하고, X5는 부재하고, X6은 K를 나타내고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 P를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 S를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 그 결과, KSGRPREDRVPHSRNSITLTN (서열 18)이다.
한 실시양태에서, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6 은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 S를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 그 결과, X1X2X3X4X5X6SGRAREDRVPHSRNSITLTN (서열 19)이다. 한 실시양태에서, X1은 부재하고, X2는 부재하고, X3은 부재하고, X4는 부재하고, X5는 부재하고, X6은 K를 나타내고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 E를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 S를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 그 결과, KSGRAREDRVPHSRNSITLTN (서열 20)이다.
한 실시양태에서, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 A를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 S를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 그 결과, X1X2X3X4X5X6SGRARADRVPHSRNSITLTN (서열 21)이다. 한 실시양태에서, X1은 부재하고, X2는 부재하고, X3은 부재하고, X4는 부재하고, X5는 부재하고, X6은 K를 나타내고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 A를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 S를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 그 결과, KSGRARADRVPHSRNSITLTN (서열 22)이다.
한 실시양태에서, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 A를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 T를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 따라서, X1X2X3X4X5X6SGRARADRVPHSRNTITLTN (서열 23)이다. 한 실시양태에서, X1은 부재하고, X2는 부재하고, X3은 부재하고, X4는 부재하고, X5는 부재하고, X6은 K를 나타내고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 A를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 T를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 따라서, KSGRARADRVPHSRNTITLTN (서열 24)이다.
한 실시양태에서, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 G를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 G를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 따라서, X1X2X3X4X5X6SGRGRGDRVPHSRNGITLTN (서열 25)이다. 한 실시양태에서, X1은 부재하고, X2는 부재하고, X3은 부재하고, X4는 부재하고, X5는 부재하고, X6은 K를 나타내고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 G를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 G를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 G를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 따라서, KSGRGRGDRVPHSRNGITLTN (서열 26)이다.
한 실시양태에서, X1은 K를 나타내거나 부재하고, X2는 K를 나타내거나 부재하고, X3은 K를 나타내거나 부재하고, X4는 K를 나타내거나 부재하고, X5는 K를 나타내거나 부재하고, X6은 K를 나타내거나 부재하고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 A를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 G를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 따라서, X1X2X3X4X5X6SGRARADRVPHSRNGITLTN (서열 27)이다. 한 실시양태에서, X1은 부재하고, X2는 부재하고, X3은 부재하고, X4는 부재하고, X5는 부재하고, X6은 K를 나타내고, X7은 S를 나타내고, X8은 G를 나타내고, X9는 R을 나타내고, X10은 A를 나타내고, X11은 R을 나타내고, X12는 A를 나타내고, X13은 D를 나타내고, X15는 V를 나타내고, X17은 H를 나타내고, X21은 G를 나타내고, X22는 I를 나타내고, X26은 N을 나타낸다. 따라서, KSGRARADRVPHSRNGITLTN (서열 28)이다.
본 발명의 화합물은 피브로넥틴의 하나 이상의 기능적 특성이 바람직하거나 피브로넥틴과 연관된 하나 이상의 신호전달 특성의 변형이 바람직한 적용에 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 세포 신호전달을 억제하는 치료제로서 이용될 수 있다. 피브로넥틴으로부터 유도된 펩티드의 항전이 효과는, 예를 들어 문헌 [Kato et al ., Clinical Cancer Research, 8:2455-2462 (2002)]에 기재되어 있다.
마찬가지로, 본 발명의 화합물을 사용하여 변형된 표면은 피브로넥틴의 하나 이상의 기능적 특성이 바람직하거나 피브로넥틴과 연관된 하나 이상의 신호전달 특성의 변형이 바람직한 적용에 유용하다. 이러한 적용에는 생체 내 세포 성장 촉진뿐만 아니라 시험관 내 세포 배양도 포함된다. 예를 들어, 피브로넥틴으로 코팅된 보철 장치는 새로운 상피 조직의 성장 및 이동을 촉진하는 데 바람직하다. 피브로넥틴 코팅된 보철 장치의 제조법은 당업자에게 익히 공지되어 있다 (예를 들어 미국 특허 제5,171,318호 참조).
본 발명의 화합물로 변형된 표면은 수동적 (즉, 비-공유결합) 코팅, 화합물의 공유결합적 고정화 또는 임의의 다른 화합물 침착 방법을 이용할 수 있다.
세포 배양에서 사용하기 위한 본 발명의 화합물로 변형된 표면에는 세포 배양 용기, 세포 배양 장치 및 미세담체가 포함된다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 세포 배양 용기는 당업자에게 익히 공지되어 있다. 적합한 용기의 예에는 디쉬, 플라스크, 멀티-웰 플레이트, 및 현미경 슬라이드, 세포 배양 삽입물이 포함되나, 이에 제한되지 않는다. 세포 배양에 적합한 미세담체도 당업자에게 익히 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Nie, Biotechnol . Prog ., 25(1):20-31 (2009)]을 참조한다.
유리하게도, 본 발명의 표면을 사용하여 배양된 세포는 치료적 적용 (예를 들어, 상처 치유)에 적합하고, 다른 경우라면 면역 반응을 유발하고, 심지어 이식된 세포의 거부반응을 일으킬 수도 있는 상이한 공급원으로부터 단리된 피브로넥틴의 사용에 내재된 문제점을 회피한다.
실시예
아미노산 서열 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7)을 갖는 본 발명의 화합물은 상업적으로 이용가능한 주문형 펩티드 합성 서비스를 사용하여 합성하였다. 이어서, 상기 화합물을 표면에 첨가하여 표면을 변형시켰다.
피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징을 모방하는 본 발명의 화합물에 의해 변형된 표면의 능력을 조사하기 위하여, 동일한 배양 조건 하에서 이러한 표면 둘 다에 세포를 접종하고 모니터링하였다. 요약하면, ATCC로부터의 LNCaP 세포, MIA-PaCa-2, A-172 또는 RKO 세포를 공급자의 지시에 따라 배양하였다. LNCaP는 10% 소 태아 혈청으로 보충한 RPMI-1640 배지 (ATCC 카탈로그 번호 30-2001)에서 배양하였다. MIA-PaCa-2 및 A-172 세포는 10% 소 태아 혈청으로 보충한 DMEM (인비트로젠(Invitrogen) 카탈로그 번호 11885-084)에서 성장시켰다. RKO 세포는 10% 소 태아 혈청으로 보충한 EMEM (ATCC 카탈로그 번호 30-2003)에서 배양하였다. 세포를 5% CO2를 갖는 습윤 인큐베이터 내 37℃에서 배양하였다. 접종을 위해, 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 세척하고, T-75 플라스크 내에서 3 ml의 0.25% 트립신-EDTA를 세포에 첨가하였다. 플라스크를 현미경 하에서 검사하여 세포가 표면으로부터 분리되었으면, 10 ml 배양 배지를 첨가하여 트립신을 중화시켰다. 세포를 15 ml BD 폴컨(Falcon) 튜브로 이동시키고, 200 X g에서 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하고, 세포 펠릿을 200 마이크로그램/ml BSA를 갖는 DMEM (인비트로젠 카탈로그 번호 11885-084)으로 1회 세척하였다. 세포를 200 마이크로그램/ml BSA를 갖는 DMEM에 재현탁시키고, 24 웰 플레이트의 웰당 1.0 ml 배지 중 50,000개 세포/㎠로 접종하였다. 배양 표면은 화합물 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7) 또는 양성 대조군으로 제공되는 BD 바이오코트 피브로넥틴에 의해 변형된 표면이었다. 추가로, BD 조직 배양물 처리된 표면을 음성 대조군으로 제공하였다. 세포를 24시간 동안 5% CO2를 갖는 습윤 인큐베이터 내 37℃에서 인큐베이션하였다.
접종 후 24시간 인큐베이션 뒤에, LNCaP 세포를 현미경에 의해서 시각화하고, 이미지를 포획하였다. 명백하게, 세포 부착 및 확장이 본 발명의 화합물 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7) (도 1B 참조)과 BD 바이오코트 피브로넥틴 (도 1C 참조)에 의해 변형된 표면 사이에서 견줄만하였다. 반면에, 음성 대조군으로 제공된, 상부 코팅 없이 조직 배양물 처리된 표면에서는 세포 부착 및 확장이 유의하게 감소하였다 (도 1A 참조).
상기 시각적 분석에 더하여, MTS 분석을 수행하여 세포 부착의 정도를 정량하였다. 요약하면, 플레이트를 뒤집어 배지를 제거하고, MTS를 함유하는 300 ㎕ 완전 배지 (프로메가(Promega) 카탈로그 번호 G3582)를 24 웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 세포를 1시간 동안 5% CO2를 갖는 습윤 인큐베이터 내 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 0.1 ml 배지를 BD 폴컨™ 96 웰 플레이트로 이동시키고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 2에 도시된 바와 같이, 화합물 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7) 및 BD 바이오코트 피브로넥틴 처리된 표면은 견줄만한 LNCaP 세포 부착을 지지한 반면, 미처리된 조직 배양 표면에 대한 LNCaP 부착은 유의하게 감소하였다.
유사하게, 화합물 KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7) 및 BD 바이오코트 피브로넥틴으로 처리된 표면 상의 A-172 및 RKO 세포의 인큐사이트 (에센)에 의한 전면생장률 정량은 견줄만하였다 (도 3 참조). 반면에, 미처리된 조직 배양 표면에 대한 전면생장률 정량은 유의하게 감소하였다.
추가로, KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 7), KSGRPREDRVPHSRNSITLTNSGTGSGTGSGRGDSP (서열 8), KSGRPREDRVPHSRNSITLTNGGGSGGGSGGGRGDSP (서열 9), KSGRARADRVPHSRNTITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 10), KSGRARADRVPHSRNTITLTNGGSGGSGGSGRGDSP (서열 11) 또는 KSGRGRGDRVPHSRNGITLTNSGSGSGSGSGRGDSP (서열 12)의 코팅을 상부에 갖는 표면은 BD 바이오코트 피브로넥틴 표면과 유사한 세포 부착 및 확장을 지지하였다 (도 4a 및 도 4b 참조).
당업자라면 상기 기재된 실시양태에 대해 그의 광범위한 발명의 개념에서 벗어나지 않는 한 변화가 가해질 수 있음을 인지하고 있을 것이다. 그러므로, 본 발명은 개시된 특정 실시양태에 제한되는 것이 아니라, 첨부된 특허청구범위에 의해 한정되는 바와 같은 본 발명의 취지 및 범위 내의 변형을 포함하고자 하는 것임을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Becton, Dickinson and Company
<120> Synthetic, Defined Fibronectin Mimetic Peptides and Surfaces
Modified with the Same
<130> P-9298/1 (102-823)
<150> US 61/420,818
<151> 2010-12-08
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin cell-binding domain
<400> 1
Gly Arg Gly Asp Ser Pro
1 5
<210> 2
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin cell-binding domain
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> Xaa denotes S, V, A, G or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Xaa denotes G, A or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Xaa denotes R or G
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> Xaa denotes P, A, Q or G
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Xaa denotes R or K
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> Xaa denotes E, Q, W, A or G
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Xaa denotes D or E
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Xaa denotes V, L or I
<220>
<221> misc_feature
<222> (17)..(17)
<223> Xaa denotes H or P
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> Xaa denotes S, T or G
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(22)
<223> Xaa denotes I or L
<220>
<221> misc_feature
<222> (26)..(26)
<223> Xaa denotes N or H
<400> 2
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Arg Xaa Pro
1 5 10 15
Xaa Ser Arg Asn Xaa Xaa Thr Leu Thr Xaa
20 25
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flexible linker
<400> 3
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flexible linker
<400> 4
Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flexible linker
<400> 5
Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Ser
1 5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> flexible linker
<400> 6
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> two regions of a fibronectin cell-binding domain joined by a
flexible linker
<400> 7
Lys Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser
1 5 10 15
Ile Thr Leu Thr Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg
20 25 30
Gly Asp Ser Pro
35
<210> 8
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> two regions of a fibronectin cell-binding domain joined by a
flexible linker
<400> 8
Lys Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser
1 5 10 15
Ile Thr Leu Thr Asn Ser Gly Thr Gly Ser Gly Thr Gly Ser Gly Arg
20 25 30
Gly Asp Ser Pro
35
<210> 9
<211> 37
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> two regions of a fibronectin cell-binding domain joined by a
flexible linker
<400> 9
Lys Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser
1 5 10 15
Ile Thr Leu Thr Asn Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
20 25 30
Arg Gly Asp Ser Pro
35
<210> 10
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> two regions of a fibronectin cell-binding domain joined by a
flexible linker
<400> 10
Lys Ser Gly Arg Ala Arg Ala Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Thr
1 5 10 15
Ile Thr Leu Thr Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg
20 25 30
Gly Asp Ser Pro
35
<210> 11
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> two regions of a fibronectin cell-binding domain joined by a
flexible linker
<400> 11
Lys Ser Gly Arg Ala Arg Ala Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Thr
1 5 10 15
Ile Thr Leu Thr Asn Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Arg
20 25 30
Gly Asp Ser Pro
35
<210> 12
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> two regions of a fibronectin cell-binding domain joined by a
flexible linker
<400> 12
Lys Ser Gly Arg Gly Arg Gly Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Gly
1 5 10 15
Ile Thr Leu Thr Asn Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg
20 25 30
Gly Asp Ser Pro
35
<210> 13
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> two regions of a fibronectin cell-binding domain joined by a
flexible linker
<400> 13
Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser Ile
1 5 10 15
Thr Leu Thr Asn
20
<210> 14
<211> 4
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 14
Gly Ser Gly Ser
1
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 15
Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 6
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> linker
<400> 16
Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
<210> 17
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin cell-binding domain
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (2)..(2)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (4)..(4)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Xaa denotes K or is absent
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Xaa denotes K or is absent
<400> 17
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro
1 5 10 15
His Ser Arg Asn Ser Ile Thr Leu Thr Asn
20 25
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> fibronectin cell-binding domain
<400> 18
Lys Ser Gly Arg Pro Arg Glu Asp Arg Val Pro His Ser Arg Asn Ser
1 5 10 15
Ile Thr Leu Thr Asn
20
<210> 19
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Ile Thr Leu Thr Asn
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Claims (18)
- 가요성 링커에 의해 결합된 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 적어도 2개의 영역을 포함하는 화합물로서, 적어도 1개의 영역은 아미노산 서열 GRGDSP (서열 1)를 포함하고, 또 다른 영역은 KSGRX10RX12DRVPHSRNX21ITLTN (서열 2)을 포함하며,
X10은 P, A, Q 또는 G를 나타내고,
X12는 E, Q, W, A 또는 G를 나타내고,
X21은 S, T 또는 G를 나타내며,
여기서 상기 화합물은 100개 미만의 아미노산의 길이이고, 상기 가요성 링커는 아미노산 서열 SGSGSGSGS (서열 3), GGSGGSGGS (서열 4), SGTGSGTGS (서열 5) 또는 GGGSGGGSGG (서열 6)를 포함하는 화합물. - 제1항에 있어서, X10이 G 또는 A를 나타내는 것인 화합물.
- 제1항에 있어서, X12가 E, A 또는 G를 나타내는 것인 화합물.
- 가요성 링커에 의해 결합된 피브로넥틴 세포-결합 도메인의 적어도 2개의 영역을 포함하는 화합물로서, 적어도 1개의 영역은 아미노산 서열 GRGDSP (서열 1)를 포함하고, 또 다른 영역은 KSGRAREDRVPHSRNSITLTN (서열 20)을 포함하며, 여기서 상기 가요성 링커는 아미노산 서열 SGSGSGSGS (서열 3), GGSGGSGGS (서열 4), SGTGSGTGS (서열 5) 또는 GGGSGGGSGG (서열 6)를 포함하는 화합물.
- 표면을 갖는 구성물(composition)로서, 상기 표면이 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 화합물의 코팅을 포함하는 구성물.
- 제5항에 있어서, 상기 표면은 피브로넥틴 코팅된 표면의 하나 이상의 기능적 특징을 모방하는 구성물.
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