CN106706797B - 磁性分散萃取材料富集检测尿液中可卡因及其代谢物的方法 - Google Patents

Abstract

一种磁性分散萃取材料富集检测尿液中可卡因及其代谢物的方法，采用聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒与PSA磁珠混合后用于尿液中可卡因及其代谢物富集，经洗脱后通过LS‑MS法检测分析可卡因及其代谢物的含量。本发明能够快速分离和富集可卡因，利用功能化磁性颗粒与可卡因有效结合、磁性富集和分离结合运用，由于前处理后的样品无损伤、无污染，浓度高，所以可以明显提高前处理效率，减少人为因素的影响，很大程度上提高检测的准确性，为微量可卡因的准确检验提供更可靠的保障。

Description

磁性分散萃取材料富集检测尿液中可卡因及其代谢物的方法

技术领域

本发明涉及的是一种毒品检测领域的技术，具体是一种磁性分散萃取材料富集检测尿液中可卡因及其代谢物的方法。

背景技术

可卡因(古柯碱，cocaine)是国家严控的一类精神药品(中国食品药品监督管理局，国食药监安[2005]481号文件)。可卡因在我国是一种非常普遍的毒品，吸食的人反应包括兴奋、自信、活力增加、心跳加速、瞳孔扩大、发烧、发抖和出汗。持续吸食可卡因会形成精神和生理依赖，严重危害人体健康，影响社会安定。所以建立可快速、准确的分析可卡因类毒品的检测方法可以提供科学准确的犯罪证据。因为可卡因可以通过吸烟、静脉注射、口服、鼻腔摄取，所以可以在吸食者的尿样中检测到可卡因及其代谢物。目前已报到的尿样中可卡因的分析方法主要包括气相色谱(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱连用法(GC-MS)、液相色谱-质谱连用法(LC-MS)、高效薄层色谱法(HPTLC)和免疫分析法(IA)。

无论上述哪种涉及仪器的检测方法，都要对疑似含可卡因及其代谢物的尿液等检材进行分析检测中的关键环节——色谱分析样品的前处理。因为样品前处理可以去除基质干扰，提高分析精度和检测灵敏度，增加选择性，减少停机概率。以高效液相色谱分析为例，样品的前处理包括：取样、试样的调制、提取、纯化、浓缩等步骤。虽然样品前处理的方法很多，本质上可分为两大类：一类是对检测器相应弱的样品，可以通过衍生技术改变其物理和化学性质，使之成为可被检测的化合物。另一类是通过对复杂基质样品低含量组分进行分离、纯化和富集以获得同样效果。

目前尿液检材中可卡因及其代谢物的前处理方法主要是第二类前处理方法，包括液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微萃取(SPME)和微波萃取(MWE)。其中液液萃取体液中的可卡因是目前司法鉴定的常规和标准化的方法；固相萃取技术处理可卡因体液时需要使用固相萃取柱，然后活化、缓冲活化、淋洗、干燥、洗脱、氮吹和定容后才能进入色谱分析；固相微萃取和微波萃取技术是目前尚未完全成熟的技术，其实际的可靠性和重复性有待于进一步实验分析。

发明内容

本发明针对现有可卡因前处理方法普遍存在步骤繁琐耗时，试剂消耗量大，受操作人员影响大，或者可靠性不佳的缺陷，且如果前处理不当，会使全过程的回收率降低，会发生定性定量错误和色谱柱寿命缩短的等问题，提出一种磁性分散萃取材料富集检测尿液中可卡因及其代谢物的方法，能够快速分离和富集可卡因，利用功能化磁性颗粒与可卡因磁性富集和分离结合运用，由于前处理后的样品无损伤、无污染，浓度高，所以可以明显提高前处理效率，减少人为因素的影响，很大程度上提高检测的准确性，为微量可卡因的准确检验提供更可靠的保障。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明涉及一种用于检测尿液中可卡因及其代谢物的磁性分散萃取材料，由聚乙烯吡咯烷酮修饰的磁性颗粒和乙二胺基-N-丙基修饰的二氧化硅磁珠(PSA磁珠)构成。

所述的聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒和PSA磁珠的质量比为(1～8)：(2～1)。

所述的聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒，其内部核心为PSA磁珠，外部包覆有聚乙烯吡咯烷酮层，该聚乙烯吡咯烷酮层的厚度为1～50nm。

所述的可卡因及其代谢物包括但不限于：苯甲酰爱康宁、爱康宁、甲基爱康宁等。

本发明涉及上述PSA磁珠的应用，将其用于检测可卡因及其代谢物，具体为：对含有可卡因及其代谢物的尿液进行前处理，通过其表面基团的吸附和解吸特性实现对可卡因的富集和分离。

本发明涉及上述聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒的应用，将其用于检测可卡因及其代谢物，具体为：对含有可卡因及其代谢物的尿液进行前处理，通过其表面基团的吸附和解吸特性实现对可卡因的富集和分离。

本发明涉及一种磁性分散萃取材料富集检测尿液中可卡因及其代谢物的方法，采用三乙胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯对PSA磁珠进行双键修饰后，然后通过偶氮二异丁腈和乙烯基吡咯烷酮对其修饰得到聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒；再将聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒与PSA磁珠混合后用于尿液中可卡因及其代谢物富集，经洗脱后通过LS-MS方法检测分析可卡因及其代谢物的含量。

所述的双键修饰，具体是指：取0.5～1g平均粒径为500nm的PSA磁珠分散在100～500mL二甲亚砜中，在20～50Hz下超声10～20min，加入0.2～0.5mL的三乙胺溶液，100～400rpm下机械搅拌10min，加入4～9.5mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，40℃下反应10～24小时；通过磁性分离得到的纳米粒子用二甲亚砜和甲醇一次清洗3～5次，然后在50～70℃下真空干燥过夜，得到双键修饰的磁性纳米粒子。

所述的聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒，通过向100～200mL的异丙醇溶液中加入0.3～0.5g双键修饰的磁性纳米粒子，在20～50Hz下超声10～20min，加入0.05～0.1g偶氮二异丁腈和0.3～0.6g乙烯基吡咯烷酮，100～400rpm下机械搅拌，氮气保护，65～80℃下反应10～16小时，得到聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒。

所述的混合，具体是指：取1mL尿液检材于2mL的离心管中，加入0.002～0.01g的PSA磁珠以及0.001～0.008g聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒，均匀混合20～30min，磁性分离，去除尿液，在真空干燥箱中，60℃处理2小时，即完成对尿液中可卡因及其代谢物富集和分离。

所述的洗脱，具体是指：向富集后的磁性固相萃取材料中加入100μL～500μL的洗脱溶液，均匀混合5～10min，磁性分离，收集洗脱液，完成对可卡因及其代谢物的洗脱。

优选的，上述的洗脱溶剂为乙腈、甲醇、异丙醇、乙酸乙酯和水或者是几种的混合。

更为优选的，上述的洗脱溶剂为乙腈：甲醇(v/v)＝1:4，乙腈：异丙醇醇(v/v)＝1:3，乙腈：异丙醇醇(v/v)＝1:5，甲醇，甲醇：水(v/v)＝4:1。

进一步优选的，上述的洗脱溶剂为乙腈：甲醇(v/v)＝1:4和甲醇：水(v/v)＝4:1。

所述的LS-MS方法，即液相色谱-质谱分析法检测得到的结果与标准曲线进行对比，即可得到所检测尿液样本中可卡因及其代谢物的浓度。

所述的液相色谱中有机相为20％v/v，无机相为80％v/v，其中：有机相为98％v/v的乙腈和2％v/v的乙醇，无机相为2mM甲酸铵以及0.05％v/v甲酸。

所述的液相色谱中的流速设置为0.2mL/min，流量斜率为2min，进样量为25μL。

所述的质谱分析中的参数设置如表1所示。

表1：MS参数设置

技术效果

与现有技术相比，本发明通过功能化磁性纳米颗粒进行选择性分离、富集尿液检材中的可卡因及其代谢物，并建立磁性分散萃取的方法，利用功能化磁性纳米颗粒对复杂的尿液样本中选择性富集分离实现可卡因体液检材的前处理技术，减少前处理的步骤，提高前处理的效率，同时不牺牲过程的回收率，完善检测过程的重要环节。

本发明能够通过快速简便的前处理对体液中的可卡因完成高效提取和富集，避免了以往提取和检测过程中的前处理复杂和重复性低的缺点，可使用仪器进行高通量的尿液检材中可卡因。

附图说明

图1为尿液样本中加标100ppb的可卡因、甲基爱康宁、苯甲酰爱康宁的LC-MS的色谱图。

具体实施方式

实施例1

聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒合成：

1)取1g平均粒径为500nm的PSA磁珠分散在500mL二甲亚砜中，在35Hz下超声10min，加入0.5mL的三乙胺溶液，250rpm下机械搅拌10min，加入8.2mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，

40℃下反应16小时。

2)通过磁性分离得到的纳米粒子用二甲亚砜和甲醇一次清洗3次，然后在60℃下真空干燥过夜，得到双键修饰的磁性纳米粒子；

3)向180mL的异丙醇溶液中加入0.4g双键修饰的磁性纳米粒子，在35Hz下超声12min，

加入0.1g偶氮二异丁腈和0.55g乙烯基吡咯烷酮，250rpm下机械搅拌，氮气保护，75度下反应12小时，得到聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒。

实施例2

取8份正常人的尿液样本每份分成1mL，尿液样本1不做任何处理，按下述方法处理后直接进行分析检测：

1)向尿液样本2～8中分别加入一定量的可卡因及其代谢物，加入0.004g的PSA磁珠和

上述实施例1制备的0.005g聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒的混合物，均匀混合20min，磁性分离，去除尿液，在真空干燥箱中，60℃处理2小时。

2)加入400μL的洗脱溶液，洗脱溶剂为乙腈：甲醇(v/v)＝1:4，均匀混合5min，磁性分离，收集洗脱液，完成对可卡因及其代谢物的洗脱，将洗脱液用LC-MS进行检测即可得到分析结果。

表2为尿液样本及可卡因加标尿液样本的检测实验

由表2中的检测结果可以得知，尿液样本中不含有可卡因，在1mL中加标可卡因添加

浓度范围在10～200ng/mL，加标回收样品的检测回收率在72-90.2％，回收率良好。

表3为尿液样本及苯甲酰爱康宁加标尿液样本的检测实验

由表3中的检测结果可以得知，尿液样本中不含有苯甲酰爱康宁，在1mL中加标苯甲酰爱康宁添加浓度范围在10～200ng/mL，加标回收样品的检测回收率在70.5-85.1％，回收率良好。

表4为尿液样本及甲基爱康宁加标尿液样本的检测实验

由表4中的检测结果可以得知，尿液样本中不含有甲基爱康宁，在1mL中加标甲基爱康宁添加浓度范围在10～200ng/mL，加标回收样品的检测回收率在86-90.6％，回收率良好。实施例3

本实施例包括以下步骤：

1)取1mL尿液检材(标记为样本A)于2mL的离心管中，加入0.005g的PSA磁珠或者0.002g聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒的两者混合，均匀混合30min，磁性分离，去除尿液，在真空干燥箱中，60℃处理2小时。

2)加入400μL的洗脱溶液，洗脱溶剂为甲醇：水(v/v)＝4:1，均匀混合5min，磁性分离，收集洗脱液，完成对可卡因及其代谢物的洗脱，将洗脱液用LC-MS进行检测，分析得到样本A中检测到可卡因：0ng/mL，苯甲酰爱康宁：0ng/mL，甲基爱康宁：0ng/mL。

实施例4

本实施例包括以下步骤：

1)取1mL尿液检材(标记为样本B)于2mL的离心管中，加入0.004g的PSA磁珠和上述实施例1制备的0.005g聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒的混合物，均匀混合20min，磁性分离，去除尿液，在真空干燥箱中，60℃处理2小时。

2)加入400μL的洗脱溶液，洗脱溶剂为乙腈：甲醇(v/v)＝1:4，均匀混合5min，磁性分离，收集洗脱液，完成对可卡因及其代谢物的洗脱，将洗脱液用LC-MS进行检测，分析得到的A中检测到可卡因：6ng/mL，苯甲酰爱康宁：0ng/mL，甲基爱康宁：0ng/mL。

上述具体实施可由本领域技术人员在不背离本发明原理和宗旨的前提下以不同的方式对其进行局部调整，本发明的保护范围以权利要求书为准且不由上述具体实施所限，在其范围内的各个实现方案均受本发明之约束。

Claims (11)

1.一种用于检测尿液中可卡因及其代谢物的磁性分散萃取材料，其特征在于，由聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒和二氧化硅磁珠构成，其内部核心为乙二胺基-N-丙基修饰的二氧化硅磁珠，外部包覆有聚乙烯吡咯烷酮层；所述的代谢物是指：苯甲酰爱康宁和甲基爱康宁。

2.根据权利要求1所述的磁性分散萃取材料，其特征是，所述的聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒和二氧化硅磁珠的质量比为(1~8)：(2~1)。

3.根据权利要求1所述的磁性分散萃取材料，其特征是，所述的聚乙烯吡咯烷酮层的厚度为1~50nm。

4.一种根据上述任一权利要求中所述的磁性分散萃取材料的应用，其特征在于，将其用于检测可卡因及其代谢物，具体为：对含有可卡因及其代谢物的尿液进行前处理，通过其吸附特性实现对可卡因的富集和分离。

5.一种根据权利要求1~3中任一所述的磁性分散萃取材料的应用，其特征在于，将其用于检测可卡因及其代谢物，具体为：对含有可卡因及其代谢物的尿液进行前处理，通过其表面基团的吸附和解吸特性实现对可卡因的富集和分离。

6.一种磁性固相萃取材料富集检测尿液中可卡因及其代谢物的方法，其特征在于，采用三乙胺和甲基丙烯酸缩水甘油酯对二氧化硅磁珠进行双键修饰后，然后通过偶氮二异丁腈和乙烯基吡咯烷酮对其修饰得到聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒；再将聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒与二氧化硅磁珠混合后用于尿液中可卡因及其代谢物富集，经洗脱后通过LS-MS方法检测分析可卡因及其代谢物的含量；所述的代谢物是指：苯甲酰爱康宁和甲基爱康宁。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的双键修饰，具体是指：取0.5~1g平均粒径为500nm的二氧化硅磁珠分散在100~500mL二甲亚砜中，在20~50Hz下超声10~20min，加入0.2~0.5mL的三乙胺溶液，100~400rpm下机械搅拌10min，加入4~9.5mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯，40℃下反应10~24小时；通过磁性分离得到的纳米粒子用二甲亚砜和甲醇一次清洗3~5次，然后在50~70℃下真空干燥过夜，得到双键修饰的磁性纳米粒子。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒，通过向100~200mL的异丙醇溶液中加入0.3~0.5g双键修饰的磁性纳米粒子，在20~50Hz下超声10~20min，加入0.05~0.1g偶氮二异丁腈和0.3~0.6g乙烯基吡咯烷酮，100~400rpm下机械搅拌，氮气保护，65~80℃下反应10~16小时，得到聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的混合，具体是指：取1mL尿液检材于2mL的离心管中，加入0.002~0.01g的二氧化硅磁珠以及0.001~0.008g聚乙烯吡咯烷酮修饰磁性颗粒，均匀混合20~30min，磁性分离，去除尿液，在真空干燥箱中，60℃处理2小时，即完成对尿液中可卡因及其代谢物富集和分离。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的洗脱，具体是指：向富集后的磁性分散萃取材料中加入100μL~500μL的洗脱溶液，均匀混合5~10min，磁性分离，收集洗脱液，完成对可卡因及其代谢物的洗脱。

11.根据权利要求6所述的方法，其特征是，所述的LS-MS连用法，即液相色谱-质谱分析法检测得到的结果与标准曲线进行对比，即可得到所检测尿液样本中可卡因及其代谢物的浓度；

所述的液相色谱中有机相为20%v/v，无机相为80%v/v，其中：有机相为98%的乙腈和2%的乙醇，无机相为2mM甲酸铵以及0.05%甲酸。