CN106692108A - 一种电荷转换型纳米药物组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明适用于医药技术领域，提供了一种电荷转换型纳米药物组合物及其制备方法。所述电荷转换型纳米药物组合物包括载药内核和外核，所述外核为对所述载药内核进行电荷转换的载体锁，所述载药内核与所述外核通过正负电荷作用结合；所述载药内核的载体为带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇‑疏水改性壳聚糖，所述药物为疏水性药物，负载在所述载体之中；所述载体锁为侧链修饰2,3‑二甲基马来酸的聚赖氨酸。本发明提供的电荷转换型纳米药物组合物，实现了多种药物与多种诊断和治疗方法的联合，从而为一些肿瘤疾病开辟了新途径。

Description

一种电荷转换型纳米药物组合物及其制备方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，尤其涉及一种电荷转换型纳米药物组合物及其制备方法。
背景技术
纳米药物载体是一种具有纳米尺寸级别的包覆治疗性药物的输送系统，其可经过血液循环进入毛细血管，延长在血流中循环时间，还可透过内皮细胞间隙进入病灶，被细胞以胞饮的方式吸收，实现靶向用药，这有助于减少用药剂量，降低其副作用。纳米药物载体粒径较小，拥有较高的比表面，可以包埋疏水性药物，提高其溶解性，减少常规用药中助溶剂的副作用；能在机体中便利地运输，能实现多种药物与多种诊断和治疗方法的联合。纳米药物载体的这些优点为一些肿瘤疾病的治疗开辟了新的途径。
一般药物载体在血液中循环过程中，若其带正电荷有利于在血液中循环；进入病灶后，带正电荷也有利于攻击病变细胞；并且对脑皮层有特异性识别。然而，现有的药物载体都未同时满足上述三个要点，所以目前的药物载体很难克服血脑屏障(BBB)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种电荷转换型纳米药物载体及其制备方法，旨在利用电荷转换型纳米药物载体使药物可以在机体中便利地运输，便于攻击病变细胞，且对脑皮层特异性识别。
本发明是这样实现的，一种电荷转换型纳米药物载体，所述电荷转换型纳米药物载体包括内核和外核，所述内核为载体主体，所述外核为对所述载体主体进行电荷转换的载体锁，所述内核与所述外核通过正负电荷作用结合；
所述载体主体为带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖；所述载体锁为侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸。
本发明还提供了一种上述所述的电荷转换型纳米药物载体的制备方法，包括：
载体主体制备步骤：将壳聚糖酰基化生成疏水壳聚糖，再接枝末端为炔基的聚乙二醇(PEG)，然后与末端为叠氮的靶向肽通过点击反应(Click反应)连接，获得带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖；
载体锁制备步骤：将聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)脱苄氧基露出氨基(-NH2)，再与2,3-二甲基马来酸酐反应，获得侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸；
纳米药物颗粒载体制备步骤：使用透析法、逆向蒸发法或乳化溶剂蒸发法将所述靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖制备成纳米内核，再通过正负电荷作用将侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸溶液与所述纳米内核包裹在一起，获得电荷转换型纳米药物载体。
本发明还提供了一种电荷转换型纳米药物组合物，所述电荷转换型纳米药物组合物包括载药内核和外核，所述外核为对所述载药内核进行电荷转换的载体锁，所述载药内核与所述外核通过正负电荷作用结合；
所述载药内核的载体为带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖，所述药物为疏水性药物，负载在所述载体之中；所述载体锁为侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸。
本发明还提供了一种上述所述的电荷转换型纳米药物组合物的制备方法，包括：
载体主体制备步骤：将壳聚糖酰基化生成疏水壳聚糖，再接枝末端为炔基的聚乙二醇，然后与末端为叠氮的靶向肽通过Click反应连接，获得带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖；
载体锁制备步骤：将聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)脱苄氧基露出-NH2与2,3-二甲基马来酸酐反应，获得侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸；
纳米药物组合物制备步骤：将所述靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖和疏水性药物溶于有机溶剂中，通过透析法、逆向蒸发法或乳化溶剂蒸发法制备成载药纳米内核，再通过正负电荷作用将侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸溶液与所述纳米内核包裹在一起，获得电荷转换型纳米药物组合物。
本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明实施例提供的电荷转换型纳米药物载体，包括由载体主体构成的内核和由载体锁构成的外核两层结构，并且通过所述载体锁对所述载体进行锁定。本发明实施例提供电荷转换型纳米药物载体具有双重电荷转换作用，这种电荷转换型纳米药物载体表面带负电荷，在弱酸环境下，载体锁被打开，载体电荷发生反转，由负电荷转换成正电荷，靶向肽泄露在胶束表面，开始起到靶向作用，克服血脑屏障。此外，载体带正电荷也有利于在血液中循环，进入病灶后，带正电荷也有利于攻击病变细胞，并且对脑皮层有特异性识别。
本发明实施例提供的电荷转换型纳米药物载体，使药物可以在机体中便利地运输，实现了多种药物与多种诊断和治疗方法的联合，从而为一些肿瘤疾病开辟了新途径。
本发明实施例提供的电荷转换型纳米药物组合物，由所述电荷转换型纳米药物载体和药物组成，所述药物包裹于所述电荷转换型纳米药物载体的内核之中，载体携带药物进行组织，在弱酸环境下，载体锁被打开，载体电荷发生反转，由负电荷转换成正电荷，靶向肽暴露在胶束表面，开始起到靶向作用。载体带正电荷也有利于在血液中循环，进入病灶后，带正电荷也有利于攻击病变细胞，并且对脑皮层有特异性识别。此外，进入病变细胞后，由于溶酶体的作用，pH变的更小，药物开始释放，从而开始发挥药效。
附图说明
图1为本发明第二实施例提供的peptide14-PEG-g-HC的合成路线图；
图2为本发明第二实施例提供的D-PLL-DMMA的合成路线图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明第一实施例提供了一种电荷转换型纳米药物载体，所述电荷转换型纳米药物载体包括内核和外核，所述内核为载体主体，所述外核为对所述载体主体进行电荷转换的载体锁，所述内核与所述外核通过正负电荷作用结合；
所述载体主体为带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖；所述载体锁为侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸。
本发明第一实施例提供的一种电荷转换型纳米药物载体，包括由载体主体构成的内核和由载体锁构成的外核两层结构，并且通过所述载体锁对所述载体进行锁定。本发明实施例提供电荷转换型纳米药物载体具有双重电荷转换作用，这种电荷转换型纳米药物载体表面带负电荷，在弱酸环境下，载体锁被打开，载体电荷发生反转，由负电荷转换成正电荷，靶向肽泄露在胶束表面，开始起到靶向作用，克服血脑屏障。此外，载体带正电荷也有利于在血液中循环，进入病灶后，带正电荷也有利于攻击病变细胞，并且对脑皮层有特异性识别。
具体地，所述载体主体由疏水改性壳聚糖、聚乙二醇及靶向肽连接形成；所述载体锁由引发剂引发L-赖氨酸酸酐(lys-NCA)进行活性开环聚合(ROP聚合)和接上2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)而形成。
所述改性壳聚糖为酰基壳聚糖，所述酰基包括己酰基、十二酰基或十八酰基，优选己酰基；所述酰基壳聚糖的酰化度是0.3～1，优选0.5，0.8或1。所述壳聚糖的分子量为5000～100000。
具体地，所述聚乙二醇的分子量为2000～20000，优选2000，5000，10000，20000，更优选2000，5000。
具体地，所述带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖中改性壳聚糖、聚乙二醇及靶向肽的质量比为1:(0.02～0.2):(0.05～0.2)，优选1:0.1:0.05，1:0.05:0.05或1:0.2:0.1。具体地，所述载体主体与所述载体锁的质量比为0.1～1.4:1，优选0.1:1，0.5:1或1:1。所述载体主体与所述载体锁的质量比不同，所得的纳米药物载体的粒径、电位的大小会不一样。
具体地，所述靶向肽14为H-THAPMTSPVTP-NH2，H-pwvpswmpprht-NH2，H-thrppmwp-NH2或H-T(NMe)H(NMe)RPPM(NMe)WSPVWP-NH2。
本发明第一实施例提供的电荷转换型纳米药物载体，使药物可以在机体中便利地运输，实现了多种药物与多种诊断和治疗方法的联合，从而为一些肿瘤疾病开辟了新途径。
本发明第二实施例提供了一种上述所述的电荷转换型纳米药物载体的制备方法，包括：
载体主体制备步骤：将壳聚糖酰基化生成疏水壳聚糖，再接枝末端为炔基的聚乙二醇，然后与末端为叠氮的靶向肽通过Click反应连接，获得带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖；
载体锁制备步骤：将聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)脱苄氧基露出-NH2，再与2,3-二甲基马来酸酐反应，获得侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸；
纳米药物颗粒载体制备步骤：使用透析法、逆向蒸发法或乳化溶剂蒸发法将所述靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖制备成纳米内核，再通过正负电荷作用将侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸溶液与所述纳米内核包裹在一起，获得电荷转换型纳米药物载体。
具体地，所述载体主体制备步骤包括：将壳聚糖酰基化生成酰基壳聚糖(HC)；将炔基-聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯(Propyne-PEG-NHS)与所述HC反应，生成炔基-聚乙二醇-接枝已酰壳聚糖(Propyne-PEG-g-HC)；将反应生成的Propyne-PEG-g-HC与靶向肽14通过Click反应连接，获得靶向肽14-聚乙二醇-接枝酰基壳聚糖(肽14-PEG-g-HC)；
所述载体锁制备步骤包括：将二(三氯甲基)碳酸酯与Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸反应，使Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸形成环状的Lys-NCA；使用引发剂引发上述所形成的环发生开环反应；进行脱苄氧基反应(去保护基反应)，露出-NH2；将露出的-NH2接上2,3-二甲基马来酸酐(DMMA)，获得二乙胺-聚赖氨酸-2,3-二甲基马来酸酐(D-PLL-DMMA)；所述引发剂、lys-NCA及2,3-二甲基马来酸酐的摩尔比为1:15～30:3～30，优选1:15:10，1:20:10，1:30:10，1:15:20或1:15:30。所述引发剂包括二乙胺、三乙胺和聚乙二醇氨基(PEG-NH2)中的至少一种。
所述纳米药物颗粒载体制备步骤包括：使用透析法、逆向蒸发法或乳化溶剂蒸发法将肽14-PEG-g-HC制成纳米颗粒，通过正负电荷作用将D-PLL-DMMA溶液与肽14-PEG-g-HC纳米颗粒包裹在一起，获得电荷转换型纳米药物载体。
在载体主体制备步骤中，通过将壳聚糖酰基化生成HC来将所述壳聚糖进行疏水改性；Propyne-PEG-NHS与所述HC反应生成Propyne-PEG-g-HC的过程中是将HC连接PEG，此过程中PEG是作为亲水端，目的是为后面自组装成胶束。Propyne-PEG-g-HC与靶向肽14连接，是Propyne-PEG-g-HC跟肽上的叠氮反应。
具体地，peptide14-PEG-g-HC的合成路线图参见图1，D-PLL-DMMA的合成路线参见图2。
具体地，所述聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)与2,3-二甲基马来酸酐的摩尔比为(0.05～2):1。
本发明第二实施例提供的电荷转换型纳米药物载体的制备方法，根据所述电荷转换型纳米药物载体的结构组成，制备其具有的独特的双层结构，所述制备方法操作简单，易于工业化生产。
本发明第三实施例提供了一种电荷转换型纳米药物组合物，所述电荷转换型纳米药物组合物包括载药内核和外核，所述外核为对所述载药内核进行电荷转换的载体锁，所述载药内核与所述外核通过正负电荷作用结合；
所述载药内核的载体为带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖，所述药物为疏水性药物，负载在所述载体之中；所述载体锁为侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸。
本发明第三实施例提供的电荷转换型纳米药物组合物，由所述电荷转换型纳米药物载体和药物组成，所述药物包裹于所述电荷转换型纳米药物载体的内核之中，载体携带药物进行组织，在弱酸环境下，载体锁被打开，载体电荷发生反转，由负电荷转换成正电荷，靶向肽暴露在胶束表面，开始起到靶向作用。载体带正电荷也有利于在血液中循环，进入病灶后，带正电荷也有利于攻击病变细胞，并且对脑皮层有特异性识别。此外，进入病变细胞后，由于溶酶体的作用，pH变的更小，药物开始释放，从而开始发挥药效。
具体地，所述电荷转换型纳米药物组合物为纳米颗粒，在pH为7.1～7.9时，所述电荷转换型纳米药物组合物的粒径大小为50-150nm；在pH为6.1～6.9时，所述外核脱落。
具体地，在pH为7.1～7.9时，所述电荷转换型纳米药物组合物的表面电荷为弱负电或不带电，在pH为6.1～6.9时，所述电荷转换型纳米药物组合物的表面电荷为正电荷。
具体地，，所述疏水性药物包括紫杉醇、伊利替康、疏水阿霉素、美法仑、替莫唑胺中的至少一种。所述靶向肽14为H-THAPMTSPVTP-NH2，H-pwvpswmpprht-NH2，H-T(NMe)H(NMe)RPPM(NMe)WSPVWP-NH2或H-thrppmwp-NH2。所述疏水性药物与所述电荷转换型纳米药物载体的质量比为0.1～1:1，优选0.4:1或0.5:1。
本发明第四实施例提供了一种上述所述的电荷转换型纳米药物组合物的制备方法，包括：
载体主体制备步骤：将壳聚糖酰基化生成疏水壳聚糖，再接枝末端为炔基的聚乙二醇，然后与末端为叠氮的靶向肽通过Click反应连接，获得带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖；
载体锁制备步骤：将聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)脱苄氧基露出-NH2与2,3-二甲基马来酸酐反应，获得侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸；
纳米药物组合物制备步骤：将所述靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖和疏水性药物溶于有机溶剂中，通过透析法、逆向蒸发法或乳化溶剂蒸发法制备成载药纳米内核，再通过正负电荷作用将侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸溶液与所述纳米内核包裹在一起，获得电荷转换型纳米药物组合物。
具体地，所述聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)与2,3-二甲基马来酸酐的摩尔比为(0.05～2):1。
本发明第五实施例提供了一种电荷转换型纳米药物颗粒制剂，所述电荷转换型纳米药物颗粒制剂包括超纯水及分散于所述超纯水中的如上所述的电荷转换型纳米药物组合物。
具体地，所述电荷转换型纳米药物颗粒的浓度为0.5-4mg/mL，优选1mg/mL，2mg/mL或3mg/mL。
将本发明第三实施例提供的电荷转换型纳米药物组合物制成药物颗粒制剂，方便使用者使用，使所述药物组合物的疗效获得最大程度地发挥。
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例1
1、制备电荷转换型药物载体：
a、D-PLL-DMMA的合成
称取11.2g Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸固体溶解在于180mL无水四氢呋喃中；称取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固体溶于40mL无水四氢呋喃中，倒入等压漏斗中。在油浴反应中，反应温度保持在50℃左右。将已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反应0.5h。将反应产物旋蒸蒸发浓缩至20～30mL。用200mL无水正丁烷沉淀产物，-4℃重结晶6h抽滤，除去滤液。将抽滤所得固体在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下储存；
在冰水浴中，将20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常温下，反应24h，反应结束后在二甲基亚砜(DMSO)中透析12h，然后在去离子水中透析24h(分子截留量为3500)，冻干；
先用CF3COOH将P(Lys-苄氧基)溶解，再将33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反应2h。冻干；
将脱苄氧基后的聚赖氨酸P(Lys)溶于3mL去离子水中，用0.1N(克当量浓度)的NaOH溶液缓慢滴加调节pH，使其pH平衡在8～10之间；再分批加入DMMA，每次加入DMMA后测试pH，缓慢滴加0.2N的NaOH，确保其pH平衡在8～10之间。
b、肽14-PEG-g-HC的合成
称取2g壳聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解。滴加8mL己酰氯。己酰氯全部滴完后，将气球充入适量氮气，插在瓶塞上。室温下磁力搅拌5h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。离心，离心转速为2500rpm(转/分钟)，弃去上清液。然后将固体产物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱温度设定为35℃；
称取200mg己酰化壳聚糖固体溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(分子量2000)，密封瓶口。在磁力搅拌器上搅拌反应24h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。将所得产物在去离子水中透析2天(分子截留量为3500)，期间每隔0.5～1h更换一次水；
N3-肽14与PEG-g-HC是通过Click反应连接，300mg PEG-g-HC与100mg N3-肽14溶于20mL去离子水中，通入连续的氮气，加入60mg CuBr与80mg三(3-羟基丙基三唑基甲基)胺(THPTA)，在常温下反应24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，冻干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。
2.电荷转换型纳米药物组合物的制备
肽14-PEG-g-HC胶束通过透析法制备。其具体方法如下：将50mg聚合物溶于5mL甲醇中；用0.45μm的过滤器把不溶灰尘过滤；放在截流分子量3500的透析袋中，在50mM(毫摩尔每升)pH为7.4的磷酸缓冲盐溶液(PBS)中，在室温下，透析3天，最后溶度为1mg/mL；
D-PLL-DMMA溶于pH为7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的过滤器过滤。将此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS胶束中(1mg/mL，pH为7.4，50mM PBS)，并加入药物，其两滴的间隔时间为5min。由此制得电荷转换型纳米药物组合物。
实施例2
1、制备电荷转换型药物载体：
a、D-PLL-DMMA的合成
称取11.2g Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸固体溶解在于180mL无水四氢呋喃中；称取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固体溶于40mL无水四氢呋喃中，倒入等压漏斗中。在油浴反应中，反应温度保持在50℃左右。将已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反应0.5h。将反应产物旋蒸蒸发浓缩至20～30mL。用200mL无水正丁烷沉淀产物，-4℃重结晶6h抽滤，除去滤液。将抽滤所得固体在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下储存；
在冰水浴中，将20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常温下，反应48h，反应结束后在DMSO中透析12h，然后在去离子水中透析24h(分子截留量为5000)，冻干；
先用CF3COOH将P(Lys-苄氧基)溶解，再将33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反应2h。冻干；
将脱苄氧基后的聚赖氨酸P(Lys)溶于3mL去离子水中，用0.1N的NaOH溶液缓慢滴加调节pH，使其pH平衡在8～10之间。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后测试pH，缓慢滴加0.2N的NaOH，确保其pH平衡在8～10之间。
b、肽14-PEG-g-HC的合成
称取2g壳聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解。滴加8g十八酰氯。十八酰氯全部滴完后，将气球充入适量氮气，插在瓶塞上。室温下磁力搅拌5h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。离心，离心转速为2500rpm，弃去上清液。然后将固体产物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱温度设定为35℃；
称取200mg酰基化壳聚糖固体溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(分子量2000)，密封瓶口。在磁力搅拌器上搅拌反应24h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。将所得产物在去离子水中透析2天(分子截留量为5000)，期间每隔0.5～1h更换一次水；
N3-肽14与PEG-g-HC是通过Click反应连接，300mg PEG-g-HC与100mg N3-肽14溶于20mL去离子水中，通入连续的氮气，加入60mg CuBr与80mg THPTA，在常温下反应24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，冻干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。
2.电荷转换型纳米药物组合物的制备
肽14-PEG-g-HC胶束通过透析法制备。其具体方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的过滤器把不溶灰尘过滤。放在截流分子量3500的透析袋中，在50mM pH7.4的PBS中，在室温下，透析3天。最后溶度为1mg/mL；
D-PLL-DMMA溶于pH为7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的过滤器过滤。将此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS胶束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入药物，其两滴的间隔时间为5min。由此制得电荷转换型纳米药物组合物。
实施例3
1、制备电荷转换型药物载体：
a、D-PLL-DMMA的合成
称取11.2g Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸固体溶解在于180mL无水四氢呋喃中；称取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固体溶于40mL无水四氢呋喃中，倒入等压漏斗中。在油浴反应中，反应温度保持在50℃左右。将已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反应0.5h。将反应产物旋蒸蒸发浓缩至20～30mL。用200mL无水正丁烷沉淀产物，-4℃重结晶6h抽滤，除去滤液。将抽滤所得固体在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下储存；
在冰水浴中，将20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常温下，反应72h，反应结束后在DMSO中透析12h，然后在去离子水中透析24h(分子截留量为10000)，冻干；
先用CF3COOH将P(Lys-苄氧基)溶解，再将33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反应2h。冻干；
将脱苄氧基后的聚赖氨酸P(Lys)溶于3mL去离子水中，用0.1N的NaOH溶液缓慢滴加调节pH，使其pH平衡在8～10之间。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后测试pH，缓慢滴加0.2N的NaOH，确保其pH平衡在8～10之间。
b、肽14-PEG-g-HC的合成
称取2g壳聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，将气球充入适量氮气，插在瓶塞上。室温下磁力搅拌5h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。离心，离心转速为2500rpm，弃去上清液。然后将固体产物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱温度设定为35℃；
称取200mg酰基化壳聚糖固体溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(分子量2000)，密封瓶口。在磁力搅拌器上搅拌反应24h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。将所得产物在去离子水中透析2天(分子截留量为10000)，期间每隔0.5～1h更换一次水；
N3-肽14与PEG-g-HC是通过Click反应连接，300mg PEG-g-HC与100mg N3-肽14溶于20mL去离子水中，通入连续的氮气，加入60mg CuBr与80mg THPTA，在常温下反应24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，冻干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。
2.电荷转换型纳米纳米药物组合物的制备
肽14-PEG-g-HC胶束通过透析法制备。其具体方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的过滤器把不溶灰尘过滤。放在截流分子量3500的透析袋中，在50mM pH为7.4的PBS中，在室温下，透析3天。最后溶度为1mg/mL；
D-PLL-DMMA溶于pH为7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的过滤器过滤。将此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS胶束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入药物，其两滴的间隔时间为5min。由此制得电荷转换型纳米药物组合物。
实施例4
1、制备电荷转换型药物载体：
a、D-PLL-DMMA的合成
称取11.2g Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸固体溶解在于180mL无水四氢呋喃中；称取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固体溶于40mL无水四氢呋喃中，倒入等压漏斗中。在油浴反应中，反应温度保持在50℃左右。将已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反应0.5h。将反应产物旋蒸蒸发浓缩至20～30mL。用200mL无水正丁烷沉淀产物，-4℃重结晶6h抽滤，除去滤液。将抽滤所得固体在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下储存；
在冰水浴中，将20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常温下，反应24h，反应结束后在DMSO中透析12h，然后在去离子水中透析24h(分子截留量为3500)，冻干；
先用CF3COOH将P(Lys-苄氧基)溶解，再将33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反应2h。冻干；
将脱苄氧基后的聚赖氨酸P(Lys)溶于3mL去离子水中，用0.1N的NaOH溶液缓慢滴加调节pH，使其pH平衡在8～10之间。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后测试pH，缓慢滴加0.2N的NaOH，确保其pH平衡在8～10之间。
b、肽14-PEG-g-HC的合成
称取2g壳聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，将气球充入适量氮气，插在瓶塞上。室温下磁力搅拌5h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。离心，离心转速为2500rpm，弃去上清液。然后将固体产物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱温度设定为35℃；
称取200mg酰基化壳聚糖固体溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力搅拌器上搅拌反应24h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。将所得产物在去离子水中透析2天(分子截留量为1000)，期间每隔0.5～1h更换一次水；
N3-肽14与PEG-g-HC是通过Click反应连接，300mgPEG-g-HC与100mg N3-肽14溶于20mL去离子水中，通入连续的氮气，加入60mg CuBr与80mg THPTA，在常温下反应24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，冻干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。
2.电荷转换型纳米纳米药物组合物的制备
肽14-PEG-g-HC胶束通过透析法制备。其具体方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的过滤器把不溶灰尘过滤。放在截流分子量3500的透析袋中，在50mM pH7.4的PBS中，在室温下，透析3天。最后溶度为1mg/mL；
D-PLL-DMMA溶于pH为7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的过滤器过滤。将此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS胶束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入药物，其两滴的间隔时间为5min。由此制得电荷转换型纳米药物组合物。
实施例5
1、制备电荷转换型药物载体：
a、D-PLL-DMMA的合成
称取11.2g Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸固体溶解在于180mL无水四氢呋喃中；称取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固体溶于40mL无水四氢呋喃中，倒入等压漏斗中。在油浴反应中，反应温度保持在50℃左右。将已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反应0.5h。将反应产物旋蒸蒸发浓缩至20～30mL。用200mL无水正丁烷沉淀产物，-4℃重结晶6h抽滤，除去滤液。将抽滤所得固体在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下储存；
在冰水浴中，将20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常温下，反应24h，反应结束后在DMSO中透析12h，然后在去离子水中透析24h(分子截留量为3500)，冻干；
先用CF3COOH将P(Lys-苄氧基)溶解，再将33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反应2h。冻干；
将脱苄氧基后的聚赖氨酸P(Lys)溶于3mL去离子水中，用0.1N的NaOH溶液缓慢滴加调节pH，使其pH平衡在8～10之间。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后测试pH，缓慢滴加0.2N的NaOH，确保其pH平衡在8～10之间。
b、肽14-PEG-g-HC的合成
称取2g壳聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，将气球充入适量氮气，插在瓶塞上。室温下磁力搅拌5h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。离心，离心转速为2500rpm，弃去上清液。然后将固体产物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱温度设定为35℃；
称取200mg酰基化壳聚糖固体溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力搅拌器上搅拌反应24h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。将所得产物在去离子水中透析2天(分子截留量为1000)，期间每隔0.5～1h更换一次水；
N3-肽14与PEG-g-HC是通过Click反应连接，300mgPEG-g-HC与100mg N3-肽14溶于20mL去离子水中，通入连续的氮气，加入60mg CuBr与80mg THPTA，在常温下反应24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，冻干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。
2.电荷转换型纳米纳米药物组合物的制备
肽14-PEG-g-HC胶束通过透析法制备。其具体方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的过滤器把不溶灰尘过滤。用以上溶液用注射器吸取，将药物放在50mM的PBS中搅拌，将以上注射器的夜里慢慢注入含有药物的PBS中。最后溶度为1mg/mL；
D-PLL-DMMA溶于pH为7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的过滤器过滤。将此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS胶束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入药物，其两滴的间隔时间为5min。由此制得电荷转换型纳米药物组合物。
实施例6
1、制备电荷转换型药物载体：
a、D-PLL-DMMA的合成
称取11.2g Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸固体溶解在于180mL无水四氢呋喃中；称取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固体溶于40mL无水四氢呋喃中，倒入等压漏斗中。在油浴反应中，反应温度保持在50℃左右。将已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反应0.5h。将反应产物旋蒸蒸发浓缩至20～30mL。用200mL无水正丁烷沉淀产物，-4℃重结晶6h抽滤，除去滤液。将抽滤所得固体在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下储存；
在冰水浴中，将20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常温下，反应24h，反应结束后在DMSO中透析12h，然后在去离子水中透析24h(分子截留量为3500)，冻干；
先用CF3COOH将P(Lys-苄氧基)溶解，再将33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反应2h。冻干；
将脱苄氧基后的聚赖氨酸P(Lys)溶于3mL去离子水中，用0.1N的NaOH溶液缓慢滴加调节pH，使其pH平衡在8～10之间。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后测试pH，缓慢滴加0.2N的NaOH，确保其pH平衡在8～10之间。
b、肽14-PEG-g-HC的合成
称取2g壳聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，将气球充入适量氮气，插在瓶塞上。室温下磁力搅拌5h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。离心，离心转速为2500rpm，弃去上清液。然后将固体产物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱温度设定为35℃；
称取200mg酰基化壳聚糖固体溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力搅拌器上搅拌反应24h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。将所得产物在去离子水中透析2天(分子截留量为1000)，期间每隔0.5～1h更换一次水；
N3-肽14与PEG-g-HC是通过Click反应连接，300mg PEG-g-HC与100mg N3-肽14溶于20mL去离子水中，通入连续的氮气，加入60mg CuBr与80mg THPTA，在常温下反应24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，冻干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。
2.电荷转换型纳米纳米药物组合物的制备
肽14-PEG-g-HC胶束通过透析法制备。其具体方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的过滤器把不溶灰尘过滤。放入烧瓶内，将甲醇蒸发后，加入在50mM的PBS中超声，最后溶度为1mg/mL；
D-PLL-DMMA溶于pH为7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的过滤器过滤。将此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS胶束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入药物，其两滴的间隔时间为5min。由此制得电荷转换型纳米药物组合物。
实施例7
1、制备电荷转换型药物载体：
a、D-PLL-DMMA的合成
称取11.2g Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸固体溶解在于180mL无水四氢呋喃中；称取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固体溶于40mL无水四氢呋喃中，倒入等压漏斗中。在油浴反应中，反应温度保持在50℃左右。将已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反应0.5h。将反应产物旋蒸蒸发浓缩至20～30mL。用200mL无水正丁烷沉淀产物，-4℃重结晶6h抽滤，除去滤液。将抽滤所得固体在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下储存；
在冰水浴中，将20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常温下，反应24h，反应结束后在DMSO中透析12h，然后在去离子水中透析24h(分子截留量为3500)，冻干；
先用CF3COOH将P(Lys-苄氧基)溶解，再将33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反应2h。冻干；
将脱苄氧基后的聚赖氨酸P(Lys)溶于3mL去离子水中，用0.1N的NaOH溶液缓慢滴加调节pH，使其pH平衡在8～10之间。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后测试pH，缓慢滴加0.2N的NaOH，确保其pH平衡在8～10之间。
b、肽14-PEG-g-HC的合成
称取2g壳聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，将气球充入适量氮气，插在瓶塞上。室温下磁力搅拌5h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。离心，离心转速为2500rpm，弃去上清液。然后将固体产物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱温度设定为35℃；
称取200mg酰基化壳聚糖固体溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力搅拌器上搅拌反应24h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。将所得产物在去离子水中透析2天(分子截留量为1000)，期间每隔0.5～1h更换一次水；
N3-肽14与PEG-g-HC是通过Click反应连接，300mg PEG-g-HC与100mg N3-肽14溶于20mL去离子水中，通入连续的氮气，加入60mgCuBr与80mg THPTA，在常温下反应24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，冻干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。
2.电荷转换型纳米纳米药物组合物的制备
肽14-PEG-g-HC胶束通过乳化溶剂蒸发法制备。其具体方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的过滤器把不溶灰尘过滤。再加入0.1ml的水，搅拌形成W/O型乳状液，再加较大量水进行第二次乳化得W/O/W型复乳，再蒸发除去有机溶剂，最后溶度为1mg/mL；
D-PLL-DMMA溶于pH为7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的过滤器过滤。将此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS胶束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入药物，其两滴的间隔时间为5min。由此制得电荷转换型纳米药物组合物。
实施例8
1、制备电荷转换型药物载体：
a、D-PLL-DMMA的合成
称取11.2g Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸固体溶解在于180mL无水四氢呋喃中；称取5.2g二(三氯甲基)碳酸酯固体溶于40mL无水四氢呋喃中，倒入等压漏斗中。在油浴反应中，反应温度保持在50℃左右。将已溶解的二(三氯甲基)碳酸酯溶液一滴一滴地滴入Nε-苄氧羧基-L-赖氨酸中，1～2h滴完，完全滴完后再反应0.5h。将反应产物旋蒸蒸发浓缩至20～30mL。用200mL无水正丁烷沉淀产物，-4℃重结晶6h抽滤，除去滤液。将抽滤所得固体在真空干燥箱中干燥12h，-20℃下储存；
在冰水浴中，将20mg/mL的二乙胺DMF溶液慢慢的滴入Lys-NCA的DMF溶液中(30min滴完)，再在常温下，反应24h，反应结束后在DMSO中透析12h，然后在去离子水中透析24h(分子截留量为3500)，冻干；
先用CF3COOH将P(Lys-苄氧基)溶解，再将33％的HBr/CHCOOH滴入，在冰水浴中，反应2h。冻干；
将脱苄氧基后的聚赖氨酸P(Lys)溶于3mL去离子水中，用0.1N的NaOH溶液缓慢滴加调节pH，使其pH平衡在8～10之间。再分批加入DMMA，每次加入DMMA后测试pH，缓慢滴加0.2N的NaOH，确保其pH平衡在8～10之间。
b、肽14-PEG-g-HC的合成
称取2g壳聚糖，加入20mL甲基磺酸溶液中，搅拌至壳聚糖完全溶解。滴加8g十二酰氯。十二酰氯全部滴完后，将气球充入适量氮气，插在瓶塞上。室温下磁力搅拌5h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。离心，离心转速为2500rpm，弃去上清液。然后将固体产物放在真空干燥箱中干燥24h，干燥箱温度设定为35℃；
称取200mg酰基化壳聚糖固体溶于4mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，加入124mg聚乙二醇-琥珀酰亚胺乙酸酯(分子量5000)，密封瓶口。在磁力搅拌器上搅拌反应24h；将反应产物一滴一滴地滴入20mL无水乙醚中，沉淀出来，重复操作3～5次。将所得产物在去离子水中透析2天(分子截留量为1000)，期间每隔0.5～1h更换一次水；
N3-肽14与PEG-g-HC是通过Click反应连接，300mg PEG-g-HC与100mg N3-肽14溶于20mL去离子水中，通入连续的氮气，加入60mg CuBr与80mg THPTA，在常温下反应24h。在截流分子量3500的透析袋中透析3d后，冻干，得到肽14-PEG-g-HC粉末。
2.电荷转换型纳米纳米药物组合物的制备
肽14-PEG-g-HC胶束通过逆向蒸发法制备。其具体方法如下，50mg聚合物溶于5mL甲醇中。用0.45μm的过滤器把不溶灰尘过滤。再加入0.5ml的水，搅拌形成W/O型乳状液，再蒸发除去有机溶剂，逆向蒸发法获得的囊泡体积相对较大，最后溶度为1mg/mL；
D-PLL-DMMA溶于pH为7.4，50mM的PBS中(10mg/mL)，用0.45μm的过滤器过滤。将此溶液慢慢滴入到肽14-PEG-g-CS胶束中(1mg/mL，pH 7.4，50mM PBS)，并加入药物，其两滴的间隔时间为5min。由此制得电荷转换型纳米药物组合物。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种电荷转换型纳米药物组合物，其特征在于，所述电荷转换型纳米药物组合物包括载药内核和外核，所述外核为对所述载药内核进行电荷转换的载体锁，所述载药内核与所述外核通过正负电荷作用结合；
所述载药内核的载体为带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖，所述药物为疏水性药物，负载在所述载体之中；所述载体锁为侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸。
2.如权利要求1所述的电荷转换型纳米药物组合物，其特征在于，所述电荷转换型纳米药物组合物为纳米颗粒，在pH为7.1～7.9时，所述电荷转换型纳米药物组合物的粒径大小为50-150nm；在pH为6.1～6.9时，所述外核脱落。
3.如权利要求1所述的电荷转换型纳米药物组合物，其特征在于，所述疏水性药物包括紫杉醇、伊利替康、疏水阿霉素、美法仑、替莫唑胺中的至少一种。
4.如权利要求1所述的电荷转换型纳米药物组合物，其特征在于，所述靶向肽14为H-THAPMTSPVTP-NH2，H-pwvpswmpprht-NH2，H-thrppmwp-NH2或H-T(NMe)H(NMe)RPPM(NMe)WSPVWP-NH2。
5.如权利要求1所述的电荷转换型纳米药物组合物，其特征在于，所述疏水性药物与所述电荷转换型纳米药物载体的质量比为0.1～1:1。
6.一种如权利要求1至5任意一项所述的电荷转换型纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，包括：
载体主体制备步骤：将壳聚糖酰基化生成疏水壳聚糖，再接枝末端为炔基的聚乙二醇，然后与末端为叠氮的靶向肽通过Click反应连接，获得带正电的靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖；
载体锁制备步骤：将聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)脱苄氧基露出-NH2与2,3-二甲基马来酸酐反应，获得侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸；
纳米药物组合物制备步骤：将所述靶向肽修饰的聚乙二醇-疏水改性壳聚糖和疏水性药物溶于有机溶剂中，通过透析法、逆向蒸发法或乳化溶剂蒸发法制备成载药纳米内核，再通过正负电荷作用将侧链修饰2,3-二甲基马来酸的聚赖氨酸溶液与所述纳米内核包裹在一起，获得电荷转换型纳米药物组合物。
7.如权利要求6所述的电荷转换型纳米药物组合物的制备方法，其特征在于，所述聚(Nε-苄氧羰基赖氨酸)与2,3-二甲基马来酸酐的摩尔比为(0.05～2):1。
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