CN106687120A - 一种用作免疫抑制剂的植物sRNA提取物 - Google Patents

Abstract

本申请涉及一种用作免疫抑制剂的植物sRNA提取物。

Description

一种用作免疫抑制剂的植物sRNA提取物

本发明涉及一种用作免疫抑制剂的植物sRNA提取物。

本发明还涉及一种用作免疫抑制剂的包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

本发明涉及一种用作抗炎剂的植物sRNA提取物。

本发明还涉及一种用作抗炎剂的包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

多种真核生物(包括植物、动物和真菌)已进化出若干RNA沉默途径以保护其细胞和基因组免受侵入性核酸(诸如，病毒或转座子)的入侵，并且在发育或对外部刺激的应答中调控基因表达(综述，参见Baulcombe(2005)Trends Biochem.Sci.30:290-293；Meins等，(2005)Annu.Rev.Cell Dev.Biol.21:297-318)。

非编码RNA(ncRNA)是由DNA转录但不翻译成蛋白的功能性RNA分子。在通常情况下，ncRNA的功能能在转录水平和转录后水平上调控基因表达。短nc RNA(<30nt)包括microRNA(miRNA)、短干扰RNA(siRNA)和piwi相互作用RNA(piRNA)(Sharma等，(2013),MolBiotechnol 55,63:77)。已知在大多数生物体中microRNA以序列特异性的方式干扰基因表达(尽管在植物和动物中是不同的)。主要通过研究miRNA与核DNA上的调控区的结合来研究miRNA在给定细胞类型中的作用以对这种调控进行研究(Gomes AQ等，(2013)Int.J.Mol.Sci,14,16010-16039)。

在过去十年中，大量的科学文献强调了sRNA类别特别是miRNA在免疫功能中所起的作用(综述，参见Bi Y.等；MicroRNAs:novel regulators during the immuneresponse.J Cell Physiol.2009Mar；218(3):467-72；O'Connell R.M.等；Physiologicaland pathological roles for microRNAs in the immune system.Nat RevImmunol.2010Feb；10(2):111-22)。已提出内源性miRNA作为在癌症和其他疾病治疗中的治疗剂或靶标(Calin G.A和Croce CM；MicroRNA signatures in human cancers.Nat RevCancer.2006Nov；6(11):857-66)。这种治疗应用的主要限制步骤是标准siRNA双链体是哺乳动物先天免疫系统的高效激活剂(Robbins等，siRNA and innate immunity,Oligonucleotides 2009；19(2):89-102)并且因此显示出不希望出现的副作用(如，诱导促炎性过程)(Judge AD等；Sequence-dependent stimulation of the mammalian innateimmune response by synthetic siRNA.Nat Biotechnol 2005；23(4):457-62；Sioud,Induction of inflammatory cytokines and interferon responses by double-stranded and single-straned siRNA is sequence-dependent and requiresendosomal localization.J Mol Biol,2005；348(5):1079-90)。这本身并不令人惊讶，因为事实上多种病毒都是由双链RNA构成的并且在进化过程中哺乳动物宿主发展了Toll样受体(TLR)介导的应答以使得病毒处于免疫控制下(Kawai和Akira；Immune recognition ofviral infection.Nature Immunology 2006；7:131-137)。特别是，双链RNA被TLR3识别(Alexopolou等；Recognition of double-stranded RNA and activation of NF-kappaBby Toll-like receptor 3.Nature 2001；413:732-738)并且单链RNA被TLR7和TLR8识别(Hornung等；RNA recognition via TLR7 and TLR8.Handb Exp Pharmacol 2008；183:71-86)。因此我们能归纳出内源性miRNA通过调控基因表达作为免疫应答的调节剂，而外源性的小RNA(sRNA)被免疫细胞识别为潜在有害的主要激发炎性应答。

最近的研究发现sRNA包含在“胞外体”(即由脂质和蛋白组成的细胞外囊泡)内，其在哺乳动物中的细胞之间和器官之间交换(综述，参见van der Grein和Nolte-‘t-Hoen；“Small Talk”in the innate immune system via RNA-containing extracellularvesicles.Front Imm2014；5:542；Robbins和Morelli；Regulation of immune responsesby extracellular vesicles.Nat Rev Immunol.2014；14(3):195-208)。胞外体由免疫和非免疫细胞产生并且通过介导免疫刺激或免疫抑制以及通过驱动炎性、自身免疫性和感染性疾病的病理在免疫调控中起重要作用。由于多种sRNA能够调控基因表达，所以其通过胞外体的细胞内转移可能导致胞外体靶向细胞功能的长期改变。

最近已通过深度测序对人免疫细胞来源胞外体的长度小于100个核苷酸的sRNA内容物进行了鉴定，并且发现其由可能具有基因调控功能的(Kapranov等，RNA maps revealnew RNA classes and a possible function for pervasive transcription.Science2007,316(5830):1484–8；Persson等；The non-coding RNA oft he multidrugresistance-linked vault partcle encodes multiple regulatory small RNAs.NatCell Biol 2009,11(10):1268–71.Haussecker等；Human tRNA-derived small RNAs inthe global regulation of RNA silencing.RNA 2010,16(4):673–95)多种小非编码RNA种类组成(Nolte-’t Hoen等；Deep sequencing of RNA from immune cell-derivedvesicles uncovers the selective incorporation of small non-coding RNAbiotypes with potential regulatory functions.Nucleic Acids Res 2012,40(18):9272–85)。

胞外体或其他RNA穿梭囊泡不仅构成了细胞内和细胞间sRNA转移机制，还提供了使其免于被RNAse降解的保护(Valadi等；Exosome-mediated transfer of mRNA andmicroRNA is a novel mechanism of genetic exchange between cells.Nat CellBiol,2007；9:654:659)。

除了细胞内或种内miRNA已知的作用外，出现了表明植物miRNA具有调节人细胞潜能的证据，从而提出了一种更深刻的模式变革(Zhang L等，Exogenous plant MIR168aspecifically targets mammalian LDLRAP1:evidence of cross-kingdom regulationby microRNA.Cell Research,2012 22:107-126)。在最近一个引起激烈争论的报道中，Zhang等(如上所述)发现特定水稻MIR168a能够特异性靶向哺乳动物低密度脂蛋白受体衔接蛋白，降低其在肝脏中的表达，从而对LDL水平产生影响。如果证实了饮食来源的microRNA在脊椎动物消费者中的吸收和功能，则将大大改变我们对于营养和生态学的理解。RNAi在治疗人类疾病中的治疗性开发是困难的，因为这些辅助过程在大多数动物中不存在或是减少的。最近的报道挑战了多种范式，表明摄入的microRNA(miRNA)转移至血液，在组织中累积并且对内源性转录本施加标准调控(参见Witwer和Hirsch(2014)的综述，Transfer and functional consequences of dietary microRNAs in vertebrates:Concepts in search of corroboration,BioAssays)。

最近发现了另一种外源的和生物体之间的ncRNA交换。线虫寄生虫使用含有miRNA的胞外体的分泌通过直接对靶基因进行调控从而操纵和调节宿主的先天应答(Buck等；Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNA to mammalian cellsand modulate innate immunity.Nat Comm 2014；5:5488)。

最近已假设靶细胞对胞外体的内吞涉及与胞外基质蛋白对接，随后与下方的细胞骨架融合以及在胞内腔中释放内容物(Tian等；Dynamics of exosome internalizationand trafficking.J Cell Physiol 2013；228:1487-1495；Morelli等；Endocytosis,intracellular sorting,and processing of exosomes by dendritic cells.Blood2004；104:3257-3266；Clayton等；Adhesion and signaling by B cell-derivedexosomes:the role of integrins.FASEB J 2004；18:977-979)。

尽管最初认为需要至少30bp的dsRNA才能通过I型IFN系统活化siRNA非序列特异性免疫抑制(Elbashir等；Duplexes of 21-nucleotides RNAs mediate RNAinterference in cultured mammalian cells.Nature 2001；411:494-8)，随后发现小于21bp的siRNA也能够通过Toll样受体信号传导诱导炎症(Tatematsu等；Beyond dsRNA:Toll-like receptor 3signalling in RNA-induced immune responses.BiochemJ.2014,1；458(2):195-201；Judge AD等；Sequence-dependent stimulation of themammalian innate immune response by synthetic siRNA.Nat Biotechnol 2005；23(4):457-62；Sioud,Induction of inflammatory cytokines and interferon responsesby double-stranded and single-stranded siRNA is sequence-dependent andrequires endosomal localization.J Mol Biol,2005；348(5):1079-90；Bridge等，Induction of an interferon response by RNAi vectors in mammalian cells.NatGenet 2003；34(3):263-4；Sledz等；Activation of the interferon system by short-interfering RNAs.Nat Cell Biol 2003；5:834)。

miRNA通过胞外体或其他囊泡的细胞间交换来控制包括肿瘤发展在内的炎症介导的过程的证据不断增加。在动物模型中诱导的肿瘤上进行的实验显示胞外体转运了与TLR7结合的<19bp的miRNA。特别地，其显示肿瘤分泌的miR-21和miR-29a能够通过非标准机制发挥功能，其通过作为配体与免疫细胞中的Toll样受体(TLR)家族(鼠源性TLR7和人TLR8)的受体结合，触发最终可能导致肿瘤生长和转移的TLR介导的促转移炎症应答(Fabbri等；MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatoryresponse.PNAS 2012,109(31):E2110–E2116)。

这是人产生的胞外体包含的miRNA直接结合至TLR的第一个证据。

一些证据表明siRNA和sRNA具有促炎性作用。已发现这些分子以非序列依赖性的方式通过TLR3通路发出信号，以与病毒dsRNA类似的机制诱导细胞活化和I型IFN应答(Karikò等；Small interfering RNAs mediate sequence-independent genesuppression and induce immune activation by signaling through toll-likereceptor 3.J Imm 2004；172:6545-6549)。

发现了长度>36bp的2’-O-甲基化修饰的双链RNA与PolyI:C竞争与TLR3的结合并且消除PolyI:C的IFN-β诱导能力(Okahira等；Interferon-beta induction throughtoll-like receptor 3depends on double stranded RNA structure.DNA and CellBiol 2005；24(10):614-23)，这进一步表明sRNA通过非标准途径干扰免疫功能的出现。

始终需要能够作为免疫抑制剂和能够用于预防或治疗炎性病症的药剂和组合物。

我们的实验令人吃惊的揭示了外源性施用含有植物sRNA提取物的DOTAP囊泡显示出免疫抑制和抗炎作用：植物sRNA提取物和植物miRNA本身抑制炎症并且还通过在炎症状况下抑制T细胞增殖来阻止炎症。

而且，我们令人吃惊的发现了在炎症状况下植物sRNA提取物通过TLR3与树突状细胞相互作用，并且负向调节含有TIR结构域的适体诱导的IFNβ(TRIF)和IFNβ基因的表达。

因此，我们令人吃惊的显示了植物sRNA提取物与树突状细胞通过TLR3相互作用，其中TLR3代表一种蛋白，因此该相互作用是以不依赖于序列的方式发生的。

因此，植物miRNA、植物sRNA提取物以及包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物代表了一种新型免疫抑制剂，可以特别地将其用于治疗和预防炎性疾病，特别是自身免疫性疾病或炎性疾病，如多发性硬化症、类风湿性关节炎、免疫介导的肾病、肝胆疾病、炎性肠病(IBD)、银屑病和哮喘。

用于对特定炎性剂刺激下T淋巴细胞功能进行评估的体外检测表明各种植物sRNA提取物的存在减少了T淋巴细胞的增殖(参见图3A和图3B)。

对于DC和T淋巴细胞的表型评估还表明了植物sRNA提取物的存在改变细胞分化途径。

我们还令人吃惊的发现了包封在脂质体中的植物sRNA提取物能够与DC接触并通过内吞作用与TLR3接触且干扰TRIF介导的信号(见图16至图20)。

而且，我们令人吃惊的证明了植物sRNA提取物以不依赖于序列的方式显示出免疫抑制和抗炎作用，而人sRNA提取物未显示出此类作用(参见例如图16至图18)。

因此，从动物肉中获得的sRNA提取物在体外检测中未显示出免疫抑制和抗炎作用(数据未显示)，其反而具有潜在的促炎作用，这与现有信息一致(Alexopolou等；Recognition of double-straned RNA and activation of NF-kappaB by Toll-likereceptor 3.Nature 2001；413:732-738，Hornung等；RNA recognition via TLR7 andTLR8.Handb Exp Pharmacol 2008；183:71-86，Fabbri等；MicroRNAs bind to Toll-likereceptors to induce prometastatic inflammatory response.PNAS 2012,109(31):E2110–E2116)。

我们还发现各种植物sRNA提取物如草莓(野草莓，Fragaria vesca)果实植物sRNA提取物(在实验中表示为：“Fv sRNA”或“FvsRNA”)和包含来自3种不同、不相关植物品种的植物sRNA提取物的组合物(包含蕨类叶子、卷心菜叶子和苹果皮的植物sRNA提取物的组合物；在实验中表示为：“混合”)显示出免疫抑制和抗炎作用(图3A、图3B)，特别是包含具有长度为10至120个核苷酸的植物样本sRNA的植物sRNA提取物(实施例1，图1、图2B)，特别是包含具有长度为10至60个或15至60个核苷酸的植物样本sRNA的植物sRNA提取物(实施例5；图13、图19)。

而且，在为本发明目的在实验性自身免疫性脑病鼠类模型(一种针对多发性硬化症的已建立的动物模型系统)(Mix等；Animal models of multiple sclerosis—potentials and limitations.Prog.Neurobiol 2010；92:386–404)上进行的体内实验也令人吃惊的证明了植物sRNA提取物和包含本发明2种或多种植物sRNA提取物的组合物减轻在多发性硬化症期间的炎症并且改善其病理状况(图21至图24)。

因此，令人吃惊的发现植物sRNA和植物sRNA提取物与人sRNA、人miRNA和双链病毒RNA不同，其减轻炎症而不是诱发炎症信号。这种机制是通过植物sRNA结合和饱和Toll样受体3(TLR3)以及通过TRIF以减少其他TLR也能感测到的炎症信号的方式影响下游信号来介导的。因而，植物sRNA提取物在动物(特别是人)中显示出的抗炎作用由其与蛋白靶标的结合所介导，而非通过与特定sRNA序列结合来直接调控基因表达(即其显示出不依赖于序列的生物活性)。

而且，我们令人吃惊的发现通过包含脂质体的制剂能够向待治疗动物有效地施用和递送植物sRNA提取物(参见图21和图22；制剂：将植物sRNA提取物溶解在磷酸盐缓冲盐水溶液中并使用DOTAP制备脂质体，其通过将植物sRNA提取物与DOTAP在37℃下孵育30分钟获得)。

在植物中，已发现RNA沉默通路控制多种发育过程，包括开花时间、叶形态、器官极性、花形态和根发育(Mallory和Vaucheret的综述(2006),Nat,Genet,38:S31-36)。所有RNA沉默系统均包括利用RNaseIII样酶(称为Dicer酶或在植物中Dicer样酶)将双链RNA(dsRNA)处理为21至25个核苷酸(nt)的小RNA(Bernstein等，(2001)Nature 409:363-366；Xie等，(2004)PLoS Biol 2,E104:0642-0652；Xie等，(2005)Proc Natl Acad Sci USA102:12984-12989；Dunoyer等，(2005)Nat Genet 37:1356-1360)。这些小RNA掺入含有Argonaute蛋白的沉默效应物复合物(综述，参见Meister和Tuschl(2004)Nature 431:343-349)。

在植物和动物miRNA之间存在多种主要差异：与在动物中相同，植物microRNA前体由RNA聚合酶II转录。但是，与动物不同的是，植物microRNA生物产生的整个过程是在植物细胞核中进行的。由Hasty将成熟microRNA从细胞核中运输出去，Hasty是在植物中发现的一种输出蛋白(exportin)5样蛋白。在植物和动物microRNA之间存在根本性的区别(Axtell,MJ.等，Vive la difference:biogenesis and evolution of microRNAs inplants and animals.Genome Biology.12(2011):p.221-234.)：

a)在动物中，由Drosha和Dicer依次对miRNA前体进行处理以产生miRNA双链体，而在植物中仅需要一种Dicer样酶(DCL1)。

b)在植物中，miRNA双链体在3’末端的2’OH基团上被甲基化。

c)植物和动物之间的靶标识别过程是不同的。在植物中miRNA指引microRNA靶标的mRNA裂解，而在动物中miRNA通常阻碍其靶标的翻译。

d)与植物miRNA与其靶标的外显子几乎完全匹配不同的是，在动物中microRNA与其靶标的杂交是不严格的，已知仅典型的7-8个核苷酸的“种子序列”对microRNA靶标的识别具有特异性。

对植物miRNA的研究集中在植物miRNA在植物中的作用；例如通过开发人工miRNA。已描述了人工microRNA(amiRNA)在拟南芥中靶向病毒mRNA序列(Niu等，(2006)NatureBiotechnology 24:1420-1428)或内源性基因(Schwab等，(2006)Plant Cell 18:1121-1133)。可以在不同启动子下表达amiRNA构建体以改变沉默的空间模式(Schwab等，(2006)Plant Cell 18:1121-1133)。人工miRNA取代miRNA前体骨架中的microRNA及其互补的star序列，并且取代靶向待沉默的mRNA的序列。

可以在多种空间、时间和发育表达模式中发现通过内源性miRNA的沉默(Parizotto等，(2007)Genes Dev 18:2237-2242；Alvarez等，(2006)Plant Cell 18:1134-51)。

已知特定植物miRNA分子靶向植物靶序列，但是植物miRNA在动物中的作用是未知的。

免疫相关疾病和炎性疾病是相当复杂、通常涉及多种生物通路的相互联系的表现和后果，所述多种生物通路在正常生理学中对于损害或损伤的应答、启动对损害或损伤的修复以及对外来生物体产生先天和获得性防御都非常关键。当这些正常生理通路引起附加损害或损伤时出现疾病或病变，这些损害或损伤是与应答强度直接相关的、作为异常调控或过度刺激的后果的、作为对自身的反应的或者上述的组合。

尽管这些疾病的发生通常涉及多步骤通路和多个不同的生物系统/通路，但是在一个或多个这些通路中的关键点进行干预可以具有改善或治疗作用。可以通过拮抗不利的过程/通路或者刺激有利的过程/通路进行治疗性干预。

已知多种免疫相关的疾病并且已对其进行了广泛的研究。此类疾病包括免疫介导的炎性疾病如类风湿性关节炎、免疫介导的肾病、肝胆疾病、炎性肠病(IBD)、银屑病和哮喘，以及非免疫介导的炎性疾病、感染性疾病、免疫缺陷病、肿瘤等。然而，对炎性疾病的治疗方法仍存在需求，这种治疗方法与已知治疗方法相比具有更高疗效和/或显示出更少副作用。其同样适用于预防此类疾病的方法。

树突状细胞是已知的外部信号的最佳整合器，其将它们的树突插入紧临回盲瓣前的集合淋巴结内的上皮细胞中以感受微生物(Swiatczak B,Rescigno M.How theinterplay between antigen presenting cells and microbiota tunes host immuneresponses in the gut.Semin Immunol.2012Feb；24(1):43-9)。如上所述，可能将dsRNA和可能的miRNA识别为病毒威胁，从而预计将激发促炎性应答而非我们报道的令人吃惊的抗炎性应答。

因此，通过特定食物摄入(即益生菌，特定饮食方案)的、靶向有益的基因调控过程的植物miRNA分子将可能由DC通过特定机制从相同受体但是以与病毒和人miRNA不同的方式传感(Croce等，2012PNAS)。而且，免疫应答的DC主调节剂通过直接或通过产生细胞因子与T细胞相互作用从而调节炎症和耐受。

人内源性产生的miRNA通常参与确立和维持免疫细胞的细胞命运(例如miR-155(O'Connell R.M.等；MicroRNA-155promotes autoimmune inflammation by enhancinginflammatory T cell development.Immunity.2010)、miR-181a(Li QJ等，2007.miR-181ais an intrinsic modulator of T cell sensitivity and selection.Cell 129:147–161)、miR-150(Xiao C等，2007.MiR-150controls B cell differentiation bytargeting the transcription factor c-Myb.Cell 131:146–159)、miR-223(JohnnidisJB等，2008.Regulation of progenitor cell proliferation and granulocytefunction by microRNA-223.Nature 451:1125–1129)和miR146(Taganov KD等，NF-kappaB-dependent induction of microRNA miR-146,an inhibitor targeted tosignaling proteins of innate immune responses.Proc Natl Acad Sci USA 2006；103:12481–6.))。

因此，在一个实施方式中，本发明涉及一种用作免疫抑制剂的植物sRNA提取物。

因此，在又一个实施方式中，本发明涉及一种用作抗炎剂的植物sRNA提取物。

令人吃惊地，我们发现植物miRNA、植物sRNA提取物和包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物显示出抗炎作用，这与在标准siRNA和外源性补充的哺乳动物miRNA中观察到的结果是相反的(Croce等2012PNAS)。令人吃惊地，可以证明将植物sRNA提取物、包含本发明2种或多种植物sRNA提取物的组合物和/或植物miRNA与不同抗炎剂联合施用抑制炎症本身并且还能够预防炎症。

特别地，可以令人吃惊地证明包含本发明植物sRNA提取物的组合物改善实验性自身免疫性脑脊髓炎，其作为多发性硬化症的小鼠模型(参见实施例8和图21至图24)。

因此，如实施例中所描述的，我们的实验令人吃惊的证明包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物和植物miRNA作为抗炎剂是有效的，其能够减少T细胞增殖以及减少在受刺激的人树突状细胞中产生炎性细胞因子和共刺激分子。

该结果显示植物miRNA与人miRNA相比具有显著的功能差异，即在免疫调节特性上具有相反作用。因此，植物sRNA提取物和植物miRNA显示出独特的、预料不到的特性。

根据本发明，将“植物sRNA提取物”理解为包含给定植物品种的植物材料的组合物，其中与在所述组合物中相同植物品种的其他RNA相比，在所述组合物中所述植物品种sRNA的量高于在所述植物品种的天然存在的植物材料中的量。

在一个优选的实施方式中，将“植物sRNA提取物”理解为包含给定植物品种的植物材料的组合物，其中与在所述组合物中相同植物品种的其他RNA相比，在所述组合物中所述植物品种sRNA的量比在所述植物品种的天然存在的植物材料中的量至少高10％，更优选地比在所述植物品种的天然存在的植物材料中的量至少高20％、50％、100％或200％。

通常地，以(w/v)或(w/w)确定量。

在更优选的实施方式中，根据本申请的“植物sRNA提取物”指可选地溶解在适宜溶剂中的纯化的植物小RNA组分。当溶解在适宜溶剂中时，植物sRNA提取物包含少于20％(w/v)、优选少于10％(w/v)、更优选少于5％(w/v)、甚至更优选少于1％(w/v)的其他植物成分，特别是其他RNA。适宜溶剂优选水溶液，其更优选缓冲水溶液，其还可以包含诸如RNAse抑制剂的物质。

在提取物未溶解的情况下，提取物可以是固体，例如其可以是干燥的、被干燥的或冻干的提取物。而且，提取物可以是液体或冷冻液体形式，如溶液、混悬液、分散体，或者提取物可以是凝胶形式。

对于植物提取，可以使用完整植物或其部分。优选地，可以从叶、花、根、果实、种子或其部分中提取植物sRNA。特别地，可以使用草莓的果实。

优选地，在提取前将植物或其部分研磨或切碎。例如，可以将植物或其部分粉碎，特别是如实施例1中所述的在液氮中粉碎。

根据本发明，术语“植物”包括根据林奈定义的植物界的任何成员，包括有导管和无导管的植物。

在本发明使用的提取物的一个优选实施方式中，sRNA的长度为200个或更少的核苷酸、优选长度为120个或更少的核苷酸、优选长度为10至120个核苷酸之间。

因此，在一个优选的实施方式中，“sRNA植物提取物”包含长度为200个或更少的核苷酸、优选长度为120个或更少的核苷酸、优选长度为10至120个核苷酸之间的植物sRNA。

在一个更优选的实施方式中，“sRNA植物提取物”指由或者基本上由长度为200个或更少的核苷酸、优选长度为120个或更少的核苷酸、优选长度为10至120个核苷酸之间的植物sRNA组成的组合物，优选前提条件是在组合物中可以存在溶剂。

将“基本上由……组成”理解为存在少于10％、5％、1％或0.1％的其他化合物，优选前提条件是在组合物中可以存在溶剂。

在一个更优选的实施方式中，sRNA的长度为10个或更多个核苷酸。

因此，在一个优选的实施方式中，“sRNA植物提取物”包含长度为10个或更多个核苷酸的植物sRNA。

因此，在本发明的一个更优选的实施方式中，植物sRNA提取物的sRNA长度为10至200个核苷酸之间，优选长度为10至160个核苷酸之间，更优选长度为10至120个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至100个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至70个、10至60个、15至60个、20至60个或者10至50个核苷酸之间，最优选长度为10至25个核苷酸之间或10至24个核苷酸之间。

因此，在又一个优选的实施方式中，“sRNA植物提取物”或“总sRNA提取物”包含植物sRNA，其长度为10至200个核苷酸之间，优选长度为10至160个核苷酸之间，更优选长度为10至120个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至100个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至70个、10至60个、15至60个、20至60个或10至50个核苷酸之间，最优选长度为10至25个核苷酸之间。因此，sRNA植物提取物优选包含植物样本的全部sRNA分子，其长度为10至200个核苷酸之间，优选长度为10至160个核苷酸之间，更优选长度为10至120个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至100个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至70个、10至60个、15至60个、20至60个或10至50个核苷酸之间，最优选长度为10至25个核苷酸之间或10至24个核苷酸之间，其前提条件是sRNA植物提取物可选地不含核糖体RNA或可选地含有少于70％、50％、10％、10％或1％的所述植物样本的核糖体RNA(rRNA)。

从含有与miRNA组分对应的长度为10至25个或10至24个核苷酸之间的植物sRNA的植物中提取的sRNA组分。因此，这种植物sRNA提取物也是特别优选的。从含有与miRNA及其前体对应的长度为10至70个核苷酸之间、优选10至60个核苷酸之间、更优选15至60个核苷酸之间的植物sRNA的植物或植物sRNA提取物中提取sRNA组分。因此，这种sRNA植物提取物也是优选的。

根据本发明的“sRNA”是小RNA，特别是长度为200个或更少核苷酸的RNA。

在又一个优选的实施方式中，sRNA(特别是植物sRNA提取物的sRNA)不含核糖体RNA或者含有少于70％、50％、10％、10％或1％相同植物品种的核糖体RNA(rRNA)。例如，核糖体RNA是5S rRNA、5.8S rRNA、18S rRNA或28S rRNA。

因此，在又一个优选的实施方式中，sRNA的长度为120个或更少的核苷酸，优选长度为10至120个、10至100个、10至70个、10至60个、15至60个、20至60个或10至50个核苷酸之间。

在本发明使用的提取物的一个优选的实施方式中，sRNA是miRNA。

因此，在一个优选的实施方式中，使用的植物sRNA提取物是植物miRNA提取物。因此，植物miRNA提取物优选包含植物样本的全部miRNA分子，更优选长度为10至200个核苷酸之间，优选长度为10至160个核苷酸之间，更优选长度为10至120个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至100个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至70个、10至60个、15至60个、20至60个或10至50个核苷酸之间，最优选长度为10至25个核苷酸之间，如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24和25个核苷酸的全部miRNA。植物miRNA提取物可选地不含核糖体RNA或可选地含有少于70％、50％、10％、10％或1％的植物样本的核糖体RNA(rRNA)。

在又一个实施方式中，本发明涉及用作免疫抑制剂的植物miRNA提取物。

在又一个实施方式中，本发明涉及用作免疫抑制剂的植物miRNA。

在又一个实施方式中，本发明涉及在用于治疗和/或预防炎性疾病的方法中的上文定义的植物sRNA提取物或植物miRNA。

如在本申请中使用的，“炎性疾病”和/或“炎症”可以互换使用，包括特征为对于有害刺激(如病原体、受损细胞或刺激物)免疫应答增强的炎症异常。炎性疾病是多种人类疾病的基础。

在一个优选的实施方式中，炎性疾病选自下组：慢性前列腺炎、肾小球肾炎、过敏、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、结节病、血管炎、间质性膀胱炎、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶抗体综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、白塞氏(Bechet’s)综合征、PAPA综合征、布洛氏(Blau’s)综合征、痛风、成人和幼年型斯蒂尔氏(Still’s)疾病、冷吡啉病、穆克勒-威尔斯(Muckle-Wells)综合征、家族性寒冷诱导自体炎性综合征、新生儿期发病的多系统炎性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经皮肤关节综合征、全身型幼年特发性关节炎、高IgD综合征、施尼茨勒(Schnitzler’s)综合征、TNF受体相关的周期性综合征(TRAPSP)、牙龈炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎和炎性皮肤病症，所述炎性皮肤病症选自下组：银屑病、特应性皮炎、湿疹、红斑痤疮、荨麻疹和痤疮。

在又一个优选的实施方式中，所述炎性疾病是自身免疫性疾病。

在一个特定的优选实施方式中，所述自身免疫性疾病选自下组：多发性硬化症、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克隆氏病；良性淋巴细胞性脉管炎(“benign lymphocytic angiitis”)、自身免疫性淋巴增生综合征、结节病、自身免疫性血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、单纯红细胞再生障碍性贫血、干燥综合征(Sjogren's syndrome)、风湿性疾病、风湿性多肌痛、混合性结缔组织病、炎性风湿病、退行性风湿病、关节外风湿病、幼年型关节炎、幼年型类风湿性关节炎、全身型幼年特发性关节炎、关节炎性尿路炎、肌肉风湿病、慢性多关节炎、反应性关节炎、赖特尔(Reiter’s)综合征、风湿热、复发性多软骨炎、雷诺氏(Raynaud’s)现象、血管炎、冷球蛋白性血管炎、ANCA相关的血管炎、颞动脉炎、巨细胞性动脉炎、高安氏(Takayasu)动脉炎、白塞氏病、抗磷脂综合征、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、格林-巴利(Guillain-Barre)综合征、慢性免疫多发性神经病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、自身免疫性甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、艾迪生氏(Addison’s)病、膜性肾小球肾病、多腺性自身免疫性综合征、古德帕斯彻(Goodpasture’s)病、自身免疫性胃炎、自身免疫性萎缩性胃炎、恶性贫血、天疱疮、寻常型天疱疮、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、特发性肺纤维化、肌炎、皮肌炎、幼年型皮肌炎、多肌炎、纤维肌炎、肌硬化、乳糜泻、乳糜泻性皮炎、免疫球蛋白A型肾病、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、埃文斯(Evans)综合征、特应性皮炎、银屑病、寻常型银屑病、银屑病性关节病、格雷夫斯氏(Graves’)病、格雷夫斯氏眼病、硬皮病、系统性硬皮病、进行性系统性硬皮病、弥漫性硬皮病、局部硬皮病、Crest综合征、哮喘、过敏性哮喘、过敏症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏(Hashimoto’s)甲状腺炎、纤维肌痛、慢性疲劳和免疫功能障碍综合征(CFIDS)、原发性粘液性水肿、交感性眼炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性慢性活动性肝炎、胶原病、强直性脊柱炎、肩周炎、结节性全动脉炎、结节性多动脉炎、软骨钙质沉着病、韦格纳氏(Wegener’s)肉芽肿、显微镜下多血管炎、慢性荨麻疹、大疱性皮肤病、类天疱疮、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、白癜风、特应性湿疹、湿疹、慢性荨麻疹、自身免疫性荨麻疹、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、低补体血症性荨麻疹性血管炎、斑秃、普秃、全秃、德维克(Devic’s)病、恶性贫血、儿童自身免疫性溶血性贫血、特发性自身免疫性溶血性贫血、难治性或慢性自身免疫性血细胞减少、防止在获得性甲型血友病中出现自身免疫性抗因子VIII抗体、冷凝集素病、视神经脊髓炎、僵硬综合征、牙龈炎、牙周炎、胰腺炎、心肌炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎、特发性心包炎、抗合成酶抗体综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、PAPA综合征、布洛氏综合征、成人和幼年型斯蒂尔氏炎性疾病、冷吡啉相关周期性综合征、穆克勒-威尔斯综合征、家族性寒冷诱导自体炎性综合征、新生儿期发病的多系统炎性疾病、慢性婴儿神经皮肤关节综合征、家族性地中海热、高IgD综合征、施尼茨勒综合征、自身免疫性视网膜病、年龄相关的黄斑变性和TNF受体相关的周期性综合征(TRAPS)。

在又一个优选的实施方式中，所述炎性疾病是过敏性疾病。

在一个特定的优选实施方式中，所述过敏性疾病选自下组：

a)过敏性呼吸系统疾病，如支气管哮喘、儿科哮喘、过敏性哮喘、特应性哮喘、阿司匹林哮喘或过敏性支气管炎，

b)过敏性鼻部疾病，如过敏性鼻炎、春季卡他、花粉热或慢性过敏性鼻炎，

c)过敏性皮肤疾病，如特应性皮炎，

d)过敏性眼部疾病，如花粉热、季节性过敏性结膜炎或慢性过敏性结膜炎，

e)过敏性肺炎，

f)接触性皮炎，和

g)食物过敏。

在又一个优选的实施方式中，所述炎性疾病是银屑病。

在又一个优选的实施方式中，所述炎性疾病是炎性肠病，更优选克隆氏病或溃疡性结肠炎。

在又一个优选的实施方式中，所述炎性疾病是溃疡性结肠炎。

如在本申请中使用的，“炎性肠病”也指相关的疾病和指各种类型和分期的炎性肠病(IBD)，包括但不限于：克隆氏病和溃疡性结肠炎(UC)。可选地，与IBD相关的病况包括例如胶原性结肠炎、淋巴细胞性结肠炎、缺血性结肠炎、转向性结肠炎、白塞氏病、未定型结肠炎。

如在本申请中使用的，“银屑病”也指相关的疾病和指各种类型和分期的银屑病，包括但不限于：非脓疱性银屑病包括寻常型银屑病和银屑病性红皮病(红皮病性银屑病)，脓疱性银屑病包括广泛性脓疱性银屑病(von Zumbusch脓疱性银屑病)、掌跖脓疱病(持续性掌跖脓疱病、巴伯型脓疱性银屑病、四肢脓疱性银屑病)、环状脓疱性银屑病、持续性肢端皮炎、疱疹性脓疱病。可选地，与银屑病相关的状态包括例如药物诱发的银屑病、反相银屑病、尿布区银屑病、脂溢性银屑病、滴状银屑病、指甲银屑病、银屑病性关节炎。

在实施例中显示了植物sRNA提取物、包含3种植物sRNA提取物的组合物和植物miRNA减少T细胞增殖和受刺激的树突状细胞I型IFN应答、IL-1β、TNFα、CD80、CD86和CD83的表达和/或产生。因此，植物sRNA提取物、包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物和植物miRNA在治疗和/或预防自身免疫性疾病或炎性疾病中是特别有用的，在所述疾病中I型IFN应答、TNFα、CD80、CD86和/或CD83起重要作用和/或其中树突状细胞失调。例如在克隆氏病患者中，促炎性Th17和Th1细胞因子的作用超过了由调节T细胞(Treg)分泌的抗炎性细胞因子的作用。这导致促炎性细胞因子和抗炎性细胞因子的失衡。因此，可以使用植物miRNA、植物sRNA提取物和包含根据本发明的2种或多种植物sRNA提取物的组合物治疗和/或预防克隆氏病。

因此，在又一个优选的实施方式中，炎性疾病的特征为CD4⁺T细胞的增殖增加。

因此，在又一个优选的实施方式中，炎性疾病的特征为至少一种炎性标记物的表达或生成的增加，特别是选自IL-1β和TNFα的标记物，和/或其中炎性疾病的特征为至少是细胞因子或共受体失调，和/或其特征为可以通过DC活性改变检测的免疫功能的失调(即表达共刺激分子)。

因此，在又一个优选的实施方式中，炎性疾病的特征为IL-10表达或生成的增加，如淋巴瘤，特别是非霍奇金氏淋巴瘤和伯基特氏淋巴瘤、黑色素瘤和非小细胞肺癌。

将“患者”理解为需要治疗和/或预防的动物(特别是人)。因此，用于预防和/或治疗的植物sRNA提取物、包含本发明2种或多种植物sRNA提取物的组合物或植物miRNA适于预防和/或治疗需要治疗和/或预防的动物(特别是人)。

如实施例中所示，来自单子叶和双子叶植物的植物sRNA提取物有效减少T细胞增殖。如图3A所示，显示多种植物sRNA提取物是有效的。

因此，在一个优选的实施方式中，植物sRNA提取物选自苹果sRNA提取物、蓝莓sRNA提取物、树莓sRNA提取物、卷心菜sRNA提取物、拟南芥sRNA提取物、葡萄sRNA提取物、水稻sRNA提取物，特别是野生稻sRNA提取物、玉米sRNA提取物、松树sRNA提取物、蕨类sRNA提取物和鼠尾草sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，拟南芥sRNA提取物是拟南芥叶子的sRNA提取物。

在一个特定的优选实施方式中，苹果sRNA提取物是苹果皮的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，卷心菜sRNA提取物是卷心菜叶子或卷心菜花的sRNA提取物，最优选卷心菜叶子。

在又一个特定的优选实施方式中，蕨类sRNA提取物是蕨类叶子的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，蓝莓sRNA提取物是蓝莓果实的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，树莓sRNA提取物是树莓果实的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，葡萄sRNA提取物是葡萄的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，水稻sRNA提取物是水稻谷粒的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，玉米sRNA提取物是玉米谷粒的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，鼠尾草sRNA提取物是鼠尾草叶子的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，松树sRNA提取物是松针的sRNA提取物。

令人吃惊的是，草莓(即，野草莓)的总sRNA提取物甚至更有效。在一个特定的优选实施方式中，草莓(即，野草莓)的植物sRNA提取物来自草莓(即野草莓)的果实。因此，在此类优选的实施方式中，植物sRNA提取物是草莓sRNA提取物，更优选的是草莓果实sRNA提取物。

而且，如图3B)所示，确定了草莓(即，野草莓)、卷心菜叶子、蕨类叶子和苹果皮的总sRNA提取物是特别有效的。

因此，在一个更优选的实施方式中，植物sRNA提取物选自苹果sRNA提取物、卷心菜sRNA提取物、草莓sRNA提取物和蕨类sRNA提取物。

在一个特别优选的实施方式中，苹果sRNA提取物是苹果皮的sRNA提取物。

在又一个特定的优选实施方式中，卷心菜sRNA提取物是卷心菜叶子或卷心菜花的sRNA提取物，最优选卷心菜叶子。

在又一个特定的优选实施方式中，蕨类sRNA提取物是蕨类叶子的sRNA提取物。

因此，本发明的sRNA提取物可以来自任意植物，特别是单子叶植物或双子叶植物。例如，可以使用卷心菜、苹果皮、蕨类、大豆、玉米或草莓的植物sRNA提取物。

在一个特定的优选实施方式中，本发明的sRNA提取物来自选自草莓(即，野草莓)、卷心菜、蕨类和苹果的植物。

在又一个特定的优选实施方式中，本发明的sRNA提取物来自选自草莓果实(即，野草莓果实)、卷心菜叶子、蕨类叶子和苹果皮的植物部分。

在又一个实施方式中，本发明涉及包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及由2种或多种植物sRNA提取物组成的组合物。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及包含、优选地由2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种植物sRNA提取物组成的组合物。

在一个优选的实施方式中，2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种植物sRNA提取物获自不同植物科或植物品种和/或获自相同植物科或植物品种。在sRNA提取物来自相同植物品种的情况下，可以使用植物的不同部分，如卷心菜花和卷心菜叶子。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物，如2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种植物sRNA提取物，所述植物sRNA提取物选自苹果sRNA提取物、蓝莓sRNA提取物、树莓sRNA提取物、卷心菜sRNA提取物、拟南芥sRNA提取物、葡萄sRNA提取物、水稻sRNA提取物(特别是野生稻sRNA提取物)，玉米sRNA提取物、松树sRNA提取物、蕨类sRNA提取物和鼠尾草sRNA提取物。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及包含2种或多种sRNA提取物的组合物，所述sRNA提取物选自草莓sRNA提取物(即，野草莓sRNA提取物)、卷心菜sRNA提取物、蕨类sRNA提取物和苹果sRNA提取物。

在又一个实施方式中，本发明涉及包含、优选地由2、3或4种sRNA提取物组成的组合物，所述sRNA提取物选自草莓sRNA提取物(即，野草莓提取物)、卷心菜提取物、蕨类提取物和苹果提取物，更优选地所述组合物包含、优选地由2、3或4种sRNA提取物组成，所述sRNA提取物选自草莓果实sRNA提取物(即，野草莓果实提取物)、卷心菜叶子提取物、蕨类叶子提取物和苹果皮提取物。

因此，在又一个实施方式中，本发明涉及包含、优选地由2、3或4种sRNA提取物组成的组合物，所述sRNA提取物选自草莓sRNA提取物(即，野草莓提取物)、卷心菜提取物、蕨类提取物和苹果提取物，更优选地所述组合物包含、优选地由2、3或4种sRNA提取物组成，所述sRNA提取物选自草莓果实sRNA提取物(即，野草莓果实提取物)、卷心菜叶子提取物、蕨类叶子提取物和苹果皮提取物。

本发明的组合物可以采用本领域技术人员公知的方法获得，例如通过制备如上文所述的各植物sRNA提取物并将各植物sRNA提取物混合。例如，在实施例1中制备了包含3种不同植物sRNA提取物的组合物，即蕨类叶子、卷心菜叶子和苹果皮的sRNA植物提取物的组合，在该实施例中称为“混合”。

令人吃惊的是，“混合”组合物成功地用于多发性硬化症的EAE小鼠模型中。

可以将本发明的组合物用于本申请所述的医学适应症(例如，作为免疫抑制剂)和用于治疗和/或预防本申请所述的炎性疾病，特别是其中炎性疾病是自身免疫性疾病，更优选其中炎性疾病是多发性硬化症。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及包含、优选地由2种或多种sRNA提取物组成的组合物，所述sRNA提取物选自草莓sRNA提取物(即，野草莓sRNA提取物)、卷心菜sRNA提取物、蕨类sRNA提取物和苹果sRNA提取物，更优选地所述组合物包含、优选由2、3或4种sRNA提取物组成，所述sRNA提取物选自草莓果实sRNA提取物(即，野草莓果实提取物)、卷心菜叶子提取物、蕨类叶子提取物和苹果皮提取物。

在一个优选的实施方式中，本发明涉及一种组合物，所述组合物包含、优选地由卷心菜sRNA提取物、蕨类sRNA提取物和苹果sRNA提取物以及可选地草莓sRNA提取物(即,野草莓sRNA提取物)组成，更优选地所述组合物包含、优选地由卷心菜叶子sRNA提取物、蕨类叶子sRNA提取物和苹果皮sRNA提取物以及可选地草莓果实sRNA提取物(即,野草莓果实sRNA提取物)组成。

在一个优选的实施方式中，本发明每个组合物的sRNA提取物均包含各植物样本全部的具有如下长度的sRNA分子，其长度为10至200个核苷酸之间，优选长度为10至160个核苷酸之间，更优选长度为10至120个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至100个核苷酸之间，甚至更优选长度为10至70个、10至60个、15至60个、20至60个或10至50个核苷酸之间，最优选长度为10至25个核苷酸之间或10至24个核苷酸之间，其前提条件是sRNA植物提取物可选地不含核糖体RNA或可选地含有少于70％、50％、10％、10％或1％的植物样本核糖体RNA(rRNA)。

在又一个优选的实施方式中，本发明的组合物不含有其他植物sRNA提取物，特别是不含来自其他植物的其他植物sRNA提取物。

在又一个优选的实施方式中，本发明涉及一种组合物，所述组合物由卷心菜叶子sRNA提取物、蕨类叶子sRNA提取物和苹果皮sRNA提取物组成，优选地，其中所述组合物含有(1)5至90％卷心菜叶子sRNA提取物(w/w)，(2)5至90％蕨类叶子sRNA提取物(w/w)和(3)5至90％苹果皮sRNA提取物(w/w)，优选地(1)20至40％卷心菜叶子sRNA提取物(w/w)，(2)20至40％蕨类叶子sRNA提取物(w/w)和(3)20至40％苹果皮sRNA提取物(w/w)。

应理解(1)+(2)+(3)之和为100％。

在本发明的一个优选实施方式中，组合物是溶液，特别是缓冲溶液，如缓冲盐水溶液，和/或其中所述组合物可选地还包含药学上可接受的载体和/或可食用的助剂。

在一个优选的实施方式中，组合物是药学上可接受的溶液，特别是适于静脉注射的溶液。

在另一个优选的实施方式中，组合物是可食用的组合物，特别是适于人食用的组合物。

应理解，针对根据本发明的植物sRNA提取物的优选实施方式还应用于本发明中包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物以及用于本发明用途的包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物及相关方法。

在又一个实施方式中，本发明涉及用作药物的如本申请所公开的植物sRNA提取物或根据本发明的包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

本申请所公开的针对植物sRNA提取物和包含本发明2种或多种植物sRNA提取物的组合物的优选实施方式还应用于用作药物的植物sRNA提取物和包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

本发明的又一个实施方式涉及用作免疫抑制剂的包含本发明2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

在又一个实施方式中，本发明涉及在用于治疗和/或预防炎性疾病的方法中的包含本发明2种或多种植物sRNA提取物。

例如，在实施例中令人吃惊地显示了使用包含蕨类sRNA提取物、苹果sRNA提取物和卷心菜sRNA提取物的组合物在针对多发性硬化症的EAE小鼠模型中能够实现病情的改善。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或植物miRNA提取物的一个优选实施方式中，植物是陆生植物(Embriophytae)，如开花植物、蕨类或松树。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或植物miRNA提取物的一个更优选的实施方式中，植物是导管植物(Tracheophytes)，如蕨类。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或植物miRNA提取物的一个更优选的实施方式中，植物是蕨类(Pteridophyta)。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或植物miRNA提取物的一个更优选的实施方式中，植物是种子植物(Spermatophytes)，如开花植物或松树。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或植物miRNA提取物的一个优选的实施方式中，所述植物选自苹果、蓝莓、树莓、草莓、卷心菜、拟南芥、葡萄(或酿酒葡萄，Vitis vinifera)、水稻(如，亚洲栽培稻(Oryza sativa)或野生稻)、玉米(如，Zea mays)、松树、蕨类和鼠尾草。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或植物miRNA提取物的一个优选的实施方式中，植物是开花植物(Magnoliophyta)。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或植物miRNA提取物的一个更优选的实施方式中，植物是蔷薇科植物(Rosacea spp.)。

本领域技术人员公知蔷薇科植物包括蔷薇(Rosoideae)亚科，特别是玫瑰、黑莓、树莓、草莓、金腊梅属和水杨梅属；梅(Amygdaloideae)亚科，特别是仁果类水果，传统上称为苹果(Maloideae)亚科或Pyroideae亚科，如苹果、栒子属和山楂属；绣线菊(Spiraeoideae)亚科；和Dryadoideae亚科，特别是Dryas、腊果属(Cercocarpus)、蕨叶属(Chamaebatia)、Cowania和单花木属(Purshia)。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA的一个更优选的实施方式中，植物是草莓，最优选野草莓。因此，在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA的一个更优选的实施方式中，植物sRNA提取物来自草莓，最优选来自野草莓。

在又一个优选的实施方式中，本发明的组合物包含草莓sRNA提取物。

在本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或植物miRNA提取物的另一个优选的实施方式中，植物是针叶树(松柏门，Pinophyta)，如松树。

在又一个优选的实施方式中，施用一种或多种不同的植物sRNA提取物和/或植物miRNA。例如，可以施用2、3、4、5、6、7、8、9或10种不同的植物sRNA提取物。例如，可以施用草莓和大豆的sRNA提取物。

可以将一种或多种不同的植物sRNA提取物一起或单独施用，或者可以同时或在不同时间点施用。在一起施用不同植物sRNA提取物的情况下，可以施用包含本发明2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

而且，可以证明合成的特定植物miRNA有效减少T细胞的增殖和促炎性细胞因子IL-1β、TNFα的表达和/或生成，并且减少通过CD80、CD86和CD83正确表达的方式刺激的树突状细胞的免疫反应性。将合成的miRNA理解为通过化学合成获得的在植物中天然存在的miRNA。或者，特定植物miRNA可以从植物中纯化。miRNA的合成是本领域公知的，并且例如在实施例1中进行了描述。

在又一个实施方式中，本发明使用的植物miRNA优选是纯化的miRNA。

纯化的植物miRNA通常含有少于10％、1％、0.01％或0.001％的其他成分，特别是植物成分。

可以将一种或多种不同的植物miRNA一起或单独施用，或者可以同时或在不同时间点施用。

优选地，施用至少一种植物sRNA提取物和/或两种或多种纯化的miRNA。

令人吃惊的是，如在实施例中所示的，来自野草莓的miR168就其免疫抑制作用而言是非常有效的。因此，在又一个优选的实施方式中，根据本发明使用的植物miRNA是野草莓miR168。

特别地，可以施用一种植物或一种以上植物的植物sRNA提取物。例如，可以施用两个不同植物品种或不同植物科的植物sRNA提取物。例如，可以施用包含本发明的来自两个不同植物品种或不同植物科的2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

将“一种以上”理解为包含例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、14、20、40种或更多种。

可以如上文和在实施例中所描述的获得植物sRNA提取物。

在又一个优选的实施方式中，可以以植物sRNA提取物混合物的形式施用两种或多种植物sRNA提取物。特别地，可以将来自两个不同植物品种或不同植物科的植物sRNA提取物混合并且可以在随后施用。从而，得到如上文所述的包含两种或多种植物sRNA提取物的本发明的组合物。

植物sRNA提取物优选含有甲基化的植物miRNA或者将提取的植物miRNA甲基化。在又一个优选的实施方式中，所使用的植物miRNA是甲基化的植物miRNA。本发明使用的甲基化的植物miRNA优选在3’末端的2’OH基团处被甲基化。

因此，在一个特定的优选实施方式中，植物sRNA提取物的植物sRNA(特别是植物miRNA)或其混合物是甲基化的sRNA，优选是甲基化的miRNA，更优选是在3’末端的2’OH基团处被甲基化的sRNA或miRNA。

根据本发明使用的植物sRNA提取物或包含2种或多种植物sRNA提取物的本发明组合物的一个优选的实施方式，提取物的sRNA分子和/或组合物的sRNA分子包含、或由甲基化的sRNA组成，优选3’末端的2’OH基团处被甲基化的sRNA或miRNA。

植物sRNA提取物或包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物可以既含有成熟sRNA分子又含有其前体RNA分子。

可以采用本领域公知的方法(Schwab,R.,Ossowski,S.,Riester,M.,Warthmann,N.和Weigel,D.(2006).Highly specific gene silencing by artificial microRNAs inArabidopsis.The Plant Cell 18,1121-1133)使用miRNA表达构建体重组生产，或者可以从植物中分离用于本发明用途的miRNA。

优选地，施用成熟miRNA分子。

在现有技术中描述了很多miRNA，可以根据本发明对其进行使用。如下表1所示，在大量植物物种中描述了这些miRNA(Kozomara,A.,and Griffiths-Jones,S.(2011).miRBase:integrating microRNA annotation and deep-sequencing data.NucleicAcids Research 39,D152-D157)。在草莓(Fragaria ananassa)中也描述了这些miRNA(Ge,A.,Shangguan,L.,Zhang,X.,Dong,Q.,Han,J.,Liu,H.,Wang,X.和Fang,J.(2012).Deepsequencing discovery of novel and conserved microRNAs in strawberry(Fragaria×ananassa).Physiologia Plantarum)。

表1：

优选地，使用miR156、miR168、osamiR168或其混合物。

特别优选的miRNA是miR168，特别是草莓的miR168。

将用于根据本发明目的的“miRNA”或“microRNA”理解为寡核糖核酸，其长度为约19至24个核苷酸(nt)，其调控包含靶序列的多核苷酸的表达。miRNA是非蛋白编码RNA并且在动物和植物中均已鉴定得到。在植物中通过对较大的前体多核苷酸的Dicer样1处理获得miRNA。术语“miRNA”也包括“人工的miRNA”，其包含经合成设计用作沉默靶序列的miRNA序列。特别地，此类人工miRNA显示出与未经修饰的miRNA或miRNA前体骨架具有80％或更高，优选90％或更高，甚至更优选91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列一致性。在一个优选的实施方式中，植物miRNA在3’末端的2’OH基团处被甲基化。

在一个优选的实施方式中，使用内源性miRNA，因为其机制可能不依赖于靶标。

“miRNA前体骨架”是提供形成发夹RNA结构所必需的骨架结构的多核苷酸，所述发夹RNA结构允许加工和最终形成miRNA。优选地，所述骨架来自草莓、水稻、玉米或大豆。此前已对microRNA前体骨架进行了描述。例如，US20090155910A1(WO 2009/079532)公开了下述大豆miRNA前体骨架：156c、159、166b、168c、396b和398b，以及US 20090155909A1(WO 2009/079548)公开了下述玉米miRNA前体骨架：159c、164h、168a、169r和396h。miRNA前体骨架的示例包括miRNA GM-396b前体骨架或其活性变体和miRNA GM-159前体骨架或其活性变体，如WO 2012/154824中所描述的。

将“miRNA表达构建体”理解为DNA构建体，其包含具有编码miRNA的多核苷酸序列和star序列的miRNA前体骨架。此类miRNA表达构建体可以在适宜载体中，以使得其在适宜宿主中表达，随后分离miRNA。此类表达系统是本领域技术人员公知的并且例如在(Schwab,R.,Ossowski,S.,Riester,M.,Warthmann,N.和Weigel,D.(2006).Highly specific genesilencing by artificial microRNAs in Arabidopsis.The Plant Cell 18,1121-1133)中进行了描述。

供使用的植物miRNA和植物sRNA提取物以及包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物令人吃惊地显示出了抗炎活性。可以通过将植物miRNA、植物sRNA提取物或包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物与其他已知的抗炎剂联用以增强此类作用。

因此，在又一个优选的实施方式中，本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA或包含本发明2种或多种植物sRNA提取物的组合物与至少一种其他抗炎剂联合施用。

在一个更优选的实施方式中，所述其他抗炎剂选自下组：皮质类固醇、他汀类、干扰素β、非甾体抗炎药(NSAID)、甲氨蝶呤，环孢素A和缓解疾病的抗风湿药(DMARD)。

在另一个实施方式中，根据本发明使用的植物sRNA提取物或植物miRNA，或者包含本发明2种或多种植物sRNA提取物的组合物包含在药物组合物中。

因此，在又一个实施方式中，如上文所定义的，本发明涉及用于治疗和/或预防炎性疾病的方法中的药物组合物，所述药物组合物包含至少一种植物miRNA或植物sRNA提取物或包含如本申请所定义的2种或多种植物sRNA提取物的组合物。

在一个优选的实施方式中，药物组合物包含至少一种植物miRNA或植物sRNA提取物或含有2种或多种植物sRNA提取物的组合物和至少一种载体。载体通常是本领域技术人员公知的并且包括盐水、糖、多肽、聚合物、脂质、乳膏、凝胶、胶束材料和金属纳米粒子。在一个更优选的实施方式中，载体包含下述中的至少一种：水、葡萄糖溶液、聚阳离子粘合剂、阳离子脂质、阳离子胶束、阳离子多肽、亲水性聚合物接枝聚合物、非天然阳离子聚合物、阳离子聚缩醛、亲水性聚合物接枝聚缩醛、脂质体、配体功能化阳离子聚合物、配体功能化亲水性聚合物接枝聚合物和配体功能化脂质体。在另一个更优选的实施方案中，聚合物包含可生物降解的组氨酸-赖氨酸聚合物、可生物降解的聚酯如聚乳酸(PLA)、聚(乙醇酸)(PGA)和聚(乳酸-羟基乙酸共聚物)(PLGA)、聚酰胺-胺(PAMAM)树枝状大分子、阳离子脂质或PEG化的PEL。

在又一个实施方式中，本发明涉及一种药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂，其包含含有2种或多种本发明植物sRNA提取物的组合物或者用于本发明目的的植物sRNA提取物，优选地其中所述药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂包含a)脂质，更优选至少一种脂质体，或b)胞外体。

在一个优选的实施方式中，所述药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂包含脂质，特别是至少一种脂质、至少两种脂质、至少三种脂质或至少四种脂质，如1、2、3、4或5种脂质。在又一个优选的实施方式中，所述药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂包含阳离子脂质，特别是1、2、3、4或5种阳离子脂质。

在一个优选的实施方式中，脂质能够形成脂质体。特别地，阳离子脂质适于这一目的。

阳离子脂质优选包括DOTAP、DOPE、DC-Chol/DOPE、DOTMA和DOTMA/DOPE。

在某些实施方式中，本发明的药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂包含阳离子脂质、中性脂质、固醇和/或解聚脂质。

在某些实施方式中，固醇是胆固醇。

在某些实施方式中，解聚脂质是聚乙二醇修饰的脂质(PEG-修饰的脂质)。在某些实施方式中，PEG-修饰的脂质是PEG-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)。在某些实施方式中，PEG-修饰的脂质是PEG-二苯乙烯基甘油(PEG-DSG)。在某些实施方式中，PEG-修饰的脂质是PEG-氨甲酰基-1,2-二肉豆蔻酰基丙胺(PEG-cDMA)。

在某些实施方式中，中性脂质是磷脂。在某些实施方式中，磷脂选自磷脂酰胆碱(PC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)。

在某些实施方式中，所述药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂由阳离子脂质和植物sRNA提取物或包含2种或多种本发明植物sRNA提取物的组合物或本发明使用的植物miRNA组成。

在某些实施方式中，总脂质与sRNA之比为从5至35(即从5比1至35比1，以脂质重量比sRNA重量计)。在某些实施方式中，总脂质与sRNA之比为从5至15(即从5比1至15比1，以脂质重量比sRNA重量计)。

在某些实施方式中，本发明的药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂包含、或由脂质和水性成分组成；所述水性成分包含在水性介质中的植物sRNA提取物或包含2种或多种根据本发明的植物sRNA提取物的组合物。水性介质优选药学上可接受的水溶液，如药学上可接受的水性缓冲溶液。水性成分可以是溶液、分散体、混悬液或水凝胶。

解聚脂质：减少形成过程中粒子聚集的脂质的示例包括聚乙二醇(PEG)修饰的脂质、单唾液酸神经节苷脂Gml和聚酰胺寡聚物(“PAO”)，如在美国专利号6,320,017中描述的。也可以将在制剂过程中阻止聚集的具有不带电荷、亲水性、空间位阻部分的其他化合(如PEG、Gml或ATTA)与用于本发明的方法和组合物中的脂质偶联。在例如美国专利号6,320,017中描述了ATTA-脂质，并且例如在美国专利号5,820,873、5,534,499和5,885,613中描述了PEG-脂质偶联物。通常地，选择以减少聚集的脂质成分的浓度为以脂质摩尔百分数计约1至15％。

有用的PEG修饰脂质(或脂质-聚乙二醇偶联物)的具体示例可以具有各种“锚定”脂质部分以便将PEG部分固定在脂质囊泡表面。适宜的PEG修饰脂质的示例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、在美国专利申请序列号08/486,214中描述的PEG-神经酰胺偶联物(例如PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙烷-3-胺。特别适宜的是PEG修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。

在空间上较大部分(如，PEG或ATTA)与脂质锚偶联的实施方式中，对脂质锚的选择取决于偶联物与脂质颗粒具有何种类型的结合。众所周知，mPEG(mw2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)将保持与脂质体结合直到颗粒从循环中清除，这可能需要几天时间。其他偶联物如PEG-CerC20具有类似的停留能力。然而，PEG-CerC14在暴露于血清后迅速交换出制剂，在一些测定中其T1/2小于60分钟。如美国专利申请序列号08/486,214中所示，至少三个特征影响交换速率：酰基链长度、酰基链饱和度和空间-位阻头部基团的大小。具有这些特性的适当变化的化合物对于本发明可能是有用的。对于一些治疗性应用而言，在体内迅速从核酸-脂质颗粒中脱离的PEG修饰的脂质可能是适宜的，因此PEG修饰的脂质将具有相对较短的脂质锚定。在其他治疗性应用中，显示出较长血浆循环寿命的核酸-脂质颗粒可能是适宜的，因此PEG修饰的脂质将具有相对较长的脂质锚定。

应注意的是，防止聚集的化合物不一定需要与脂质偶联才能正常发挥功能。在溶液中游离的PEG或游离的ATTA可能足以阻止聚集。如果粒子在制剂后是稳定的，则在向对象施用前可以透析除去PEG或ATTA。

中性脂质：当存在于脂质体中时，中性脂质可以是在生理pH下以不带电的或中性两性离子形式存在的多种脂质类型中的任意一种。此类脂质包括例如二酰基磷脂酰胆碱、二酰基磷脂酰乙醇胺、神经酰胺、鞘磷脂、二氢鞘磷脂、脑磷脂和脑苷脂。用于本申请所述粒子中的中性脂质的选择通常考虑例如脂质体尺寸和血流中脂质体的稳定性。合宜地，中性脂质成分是具有两个酰基的脂质(即，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。可以获得或者可以采用本领域公知的技术分离或合成具有多种酰基链基团、不同链长度和饱和度的脂质。在一组实施方式中，含有碳链长度范围为C10至C20的饱和脂肪酸的脂质是适宜的。在另一组实施方式中，使用具有碳链长度范围为C10至C20的单或双不饱和脂肪酸的脂质。此外，可以使用具有饱和与不饱和脂肪酸链混合物的脂质。

在某些实施方式中，本发明中使用的中性脂质包括但不限于磷脂酰胆碱(PC)、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DOPC)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺(PE)、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂(SM)、心磷脂、磷脂酸、1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DPPE)、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(POPC)、二月桂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DLPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DMPC)、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DMPE)、1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、二棕榈酰油基(dipalmitoloeoyl)-PE、二植烷基(diphytanoyl)-PE、二硬脂酸磷脂酞乙醇胺(DSPE)、二反油酰基(dielaidoyl)-PE、二亚油酰基(dilinoleoyl)-SM和二亚油酰基-PE。在本发明中使用的中性脂质也可以由鞘磷脂、二氢鞘磷脂或具有其他头部基团(如，丝氨酸和肌醇)的磷脂的组成。在某些实施方式中，中性脂质是DOPE、DSPC、POPC、DPPC或任何相关的磷脂酰胆碱。

固醇成分当存在时可以是脂质体、液体囊泡或液体粒子制备领域中常规使用的那些固醇中的任意一种。在某些实施方式中，固醇是胆固醇。

阳离子脂质：阳离子脂质在约生理pH下携带净正电荷。适宜的阳离子脂质包括但不限于：N,N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(“DODAC”)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基-N,N-N-三乙基氯化铵(“DOTMA”)；N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(“DDAB”)；N-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N,N,N-三甲基氯化铵(“DOTAP”)；1,2-二油酰氧基-3-三甲基氨基丙基氯盐(“DOTAP.Cl”)；3β-(N-(N′,N′-二甲基氨基乙烷)-氨甲酰基)胆固醇(“DC-Chol”)、N-(1-(2,3-二油酰氧基)丙基)-N-2-(精胺甲酰胺)乙基)-N,N-二甲基铵三氟乙酸(“DOSPA”)、双十八烷基酰胺基甘氨酰羧基精胺(“DOGS”)、1,2-二油酰基-sn-3-磷脂酰乙醇胺(“DOPE”)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(“DODAP”)、N,N-二甲基-2,3-二油酰氧基)丙胺(“DODMA”)和N-(1,2-二肉豆蔻基氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(“DMRIE”)。此外，可以使用多种市售阳离子脂质制备物，如LIPOFECTIN(包含DOTMA和DOPE，来自GIBCO/BRL)和LIPOFECTAMINE(包含DOSPA和DOPE，来自GIBCO/BRL)。在特定实施方式中，阳离子脂质是氨基脂质。

其他阳离子脂质包括1,2-二亚油氧基(dilinoleyl)-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油酰基(dilinoleoyl)-3-二甲基氨基丙烷(DLinDAP)、1-亚油酰基-2-亚油酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-2-DMAP)、1,2-二亚油基氨基甲酰氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-C-DAP)、1,2-二亚油基巯基-3-二甲基氨基丙烷(DLin-S-DMA)、2,2-二亚油基-4-二甲基氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)。

适于在本发明组合物中使用的阴离子脂质包括但不限于磷脂酰甘油、心磷脂、二酰基磷脂酰丝氨酸、二酰基磷脂酸、N-十二酰基磷脂酰乙醇胺、N-琥珀酰基磷脂酰乙醇胺、N-戊二酰基磷脂酰乙醇胺、赖氨酰基磷脂酰甘油和连接至中性脂质的其他阴离子修饰基团。

在某些实施方式中，本发明的药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂包含两亲性脂质。“两亲性脂质”指其中脂质材料的疏水性部分取向至疏水相而亲水性部分取向至水相的任意适宜材料。此类化合物包括但不限于磷脂、氨基脂和鞘脂。代表性磷脂包括鞘磷脂、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酸、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰胆碱或二亚油酰磷脂酰胆碱。也可以使用其他不含磷的化合物如鞘酯、糖鞘脂家族、二酰基甘油和α-酰氧基酸。此外，能够容易地将此类两亲性脂质与其他脂质(如，甘油三酯和固醇)混合。

在又一个优选实施方式中，可以使用胞外体。例如在Montecalvo等(2012,Blood,119:756-766和Stoorvogel,2012,Blood,119:646-648)中描述了此类胞外体及其制备。

例如，可以使用负载了植物sRNA提取物的sRNA或包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物的胞外体。例如可以使用负载植物miRNA的胞外体。

例如在雷明顿制药科学(本领域的标准参考文本)中描述了其他适宜的药物载体。药物组合物还可以包含常规药物添加剂和助剂、赋形剂或稀释剂，包括但不限于：水、任意来源的明胶、植物胶、木质素磺酸盐、滑石粉、糖、淀粉、阿拉伯胶、植物油，聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂、润滑剂、着色剂、润湿剂、填充剂等。

如在实施例中使用的，特别优选的载体或脂质是DOTAP。

使用DOTAP，形成了能够保护本申请所述的植物sRNA提取物和包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物递送的脂质体。

例如，在实施例中令人吃惊的显示了使用包含蕨类sRNA提取物、苹果sRNA提取物和卷心菜sRNA提取物以及作为载体的DOTAP的组合物能够在针对多发性硬化症的EAE小鼠模型中实现疾病的改善。

优选地，药物组合物包含至少一种药学上可接受的RNAse抑制剂。

在又一个实施方式中，载体是聚合物，例如与miRNA分子形成纳米粒子的组氨酸-赖氨酸共聚物。纳米粒子的直径通常为约100nm至约1000nm。

因此，本发明还提供了一种纳米粒子，所述纳米粒子包含一种或多种本发明使用的植物miRNA或植物sRNA提取物或者包含2种或多种本发明植物sRNA提取物的组合物。在一个实施方式中，纳米粒子还包含载体，如一种或多种本申请所述的那些，和可选地靶向配体。

在本发明的又一个实施方式中，所述植物miRNA或植物sRNA提取物或者包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物包含在食品添加剂或膳食补充剂中。优选地，膳食补充剂、食品添加剂、食品或食料包含至少一种RNAse抑制剂，其对于此类组合物是可接受的。特别地，此类RNAse抑制剂是无毒的。

用于确定sRNA或特定miRNA的量的方法是本领域公知的，例如，可以使用基于芯片的检测测定如Agilent小RNA测定或Millipore SmartRNAplex^TMmiRNA分析测定，或者可以使用基于PCR的检测测定如Qiagen miScript^TMPCR系统、MicroRNA测定或ExiqonmiRCURY LNA^TM检测。

可以将此类食品添加剂加入食品、食料、膳食补充剂、营养补充剂或用于食品或食料的补充组合物，例如饮料(例如但不限于运动饮料、功能水、果汁、冰沙；速溶饮料)、汤、乳制品(例如但不限于单次冲泡酸奶饮料)、营养棒和涂抹酱，特别是饮料和营养棒。

例如，可以将植物sRNA提取物(如，野草莓sRNA提取物)或者包含2种或多种植物sRNA提取物(如，蕨类sRNA提取物、卷心菜sRNA提取物或苹果sRNA提取物)的组合物(见实施例1)制成液体形式，例如可选地含有至少一种RNAse抑制剂的水溶液。可以将此类溶液作为食品添加剂，例如用于饮料或乳制品的。如在本申请中使用的，术语食品指适于人或动物消费的任意食品或饲料。食品可以是制备和包装的食品(例如，蛋黄酱、沙拉酱、面包或奶酪食品)或动物饲料(例如，挤出和粒状动物饲料、粗混合饲料或宠物食品组合物)。如在本申请中使用的，术语食料指适于人或动物消费的任意物质。术语膳食补充剂指在单剂量或多剂量单元中包装的用于补充人或动物饮食的少量化合物。膳食补充剂通常不提供显著量的热量但是可以含有其他微量营养素(例如，维生素或矿物质)。术语营养补充剂指包含膳食补充剂结合能量来源的组合物。

食品或食料是例如饮料(如，无酒精和酒精饮料)以及加入饮用水和液体食物中的液体制备物，无酒精饮料是例如软饮料、运动饮料、果汁(如，橙汁、苹果汁和葡萄柚汁)；柠檬汽水、茶、近水饮料和牛奶以及其他乳制品饮料(如，酸奶饮料和饮食饮料)。在另一个实施方式中，食品或食料指包含根据本发明的组合物的固体或半固体食物。这些形式可以包括但不限于烘焙食品如蛋糕和饼干、布丁、乳制品、甜食、快餐食品或冷冻甜食或新鲜食品(例如，冰淇淋、奶昔)、制备的冷冻食品、糖果、零食产品(例如，薯条)、液体食品如汤、涂抹酱、调味汁、色拉调味品、制备的肉制品、奶酪、酸奶和任何其他含脂肪或油的食品以及食品成分(例如，小麦粉)。术语食品和食料还包括功能食品和制备的食品，后者指经批准用于人类消费的任何预包装食品。

在加入含有根据本发明使用的植物miRNA或植物sRNA提取物或包含本发明的2种或多种植物sRNA提取物的组合物的食品添加剂以前，食品或食料可能已经含有RNA。这可能是因为食品或食料含有或来源于植物或其部分(如，果实或果汁)。

在这种实施方式中，所得到的食品或食料与未加入这种食品添加剂的食品或食料相比含有量和/或浓度增加的植物miRNA或植物sRNA提取物。

在一个优选的实施方式中，此类食品或食料含有植物sRNA的量与未加入含有植物sRNA提取物的此类食品添加剂的食品或食料的量相比高至少10％，更优选地与未加入含有植物sRNA提取物的此类食品添加剂的食品或食料中的量相比高至少20％、50％、100％或200％。

在又一个优选的实施方式中，此类食品或食料含有植物sRNA的量与未加入含有包含2种或多种本发明植物sRNA提取物的组合物的此类食品添加剂的食品或食料的量相比高至少10％，更优选地与未加入含有包含2种或多种本发明植物sRNA提取物的组合物的此类食品添加剂的食品或食料中的量相比高至少20％、50％、100％或200％。在又一个优选的实施方式中，此类食品或食料含有2种或多种植物sRNA提取物的量与未加入含有2种或多种本发明植物sRNA提取物的组合物的此类食品添加剂的食品或食料中的量相比均高至少10％，更优选地与未加入含有2种或多种本发明植物sRNA提取物的组合物的此类食品添加剂的食品或食料中的量相比均高至少20％、50％、100％或200％。

在又一个优选的实施方式中，此类食品或食料含有总植物miRNA的量与未加入含有包含一种或多种特定miRNA的此类食品添加剂的食品或食料的量相比高至少10％，更优选地与未加入含有包含一种或多种特定miRNA的此类食品添加剂的食品或食料的量相比高至少20％、50％、100％或200％。

在又一个优选的实施方式中，此类食品或食料含有特定植物miRNA的量与未加入含有一种或多种特定miRNA的此类食品添加剂的食品或食料中的特定植物miRNA的量相比高至少10％，更优选地与未加入含有一种或多种特定miRNA的此类食品添加剂的食品或食料的量相比高20％、50％、100％或200％。

动物饲料包括宠物食品组合物，其有利地包括旨在提供必要饮食需求以及零食(例如狗饼干)或其他食物补充的食品。包含根据本发明的组合物的动物饲料可以是干组合物(例如，粗磨食物)、半湿组合物、湿组合物或其任意混合物。或者或附加地，动物饲料是补充剂，例如肉汤、饮用水、酸奶、粉末、混悬液、咀嚼物、零食(例如饼干)或任何其他递送形式。

食品组合物优选口服施用。膳食补充剂优选口服施用。

因此，在又一个实施方式中，本发明涉及一种食品，所述食品包含如上文所定义的植物sRNA提取物、包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物或植物miRNA。

因此，在又一个实施方式中，本发明涉及一种膳食补充剂，所述膳食补充剂包含如上文所定义的植物sRNA提取物、包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物或植物miRNA。

在又一个实施方式中，本发明涉及一种生产第二种食品的方法，所述方法包括向第一种食品中加入如本申请定义的植物sRNA提取物、包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物或植物miRNA。

例如，可以将如上文所定义的植物sRNA提取物或包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物加入饮料中并进行混合，以获得含有或富含植物sRNA提取物的饮料。在第一种食品不含植物sRNA的情况下，第二种食品含有植物sRNA。

因此，在一个优选的实施方式中，第一种食品是不含植物sRNA和/或植物miRNA和/或植物sRNA提取物的食品。

在另一个优选的实施方式中，第一种食品含有植物sRNA和/或植物miRNA。在一个优选的实施方式中，此类第二种食品含有的植物sRNA的量与第一种食品中的量相比高至少10％，更优选地与第一种食品中的量相比高至少20％、50％、100％或200％。

在又一个优选的实施方式中，此类第二种食品含有的总植物miRNA的量与第一种食品中的量相比高至少10％，更优选地与第一种食品中的量相比高至少20％、50％、100％或200％。

在又一个优选的实施方式中，此类第二种食品含有的特定植物miRNA的量与第一种食品中的量相比高至少10％，更优选地与第一种食品中的量相比高至少20％、50％、100％或200％。

膳食补充剂可以以任意适宜形式递送。在优选的实施方式中，将膳食补充剂制剂成供口服递送。本发明膳食补充剂的成分包含在食用消费可接受的赋形剂和/或载体中。载体以及因此膳食补充剂本身的实际形式并不关键。载体可以是液体、凝胶、胶丸、胶囊、粉末、固体片剂(包衣或未包衣)、茶等。

在其他实施方式中，膳食补充剂以适于由消费者加入食品或饮料中的粉末或液体形式提供。例如，在一些实施方式中，可以以粉末形式给予个体膳食补充剂，例如通过混入饮料使用，或通过拌入半固体食品(如，布丁、顶盖、酱汁、酱泥、烹调谷物或沙拉酱)使用，或者通过以其他方式加入食物使用，例如密封在食品或饮料容器的封盖中以便在食用前即时打开。

当然，根据本发明使用的植物miRNA、植物sRNA提取物或包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物作为食品添加剂的用量可以根据已知因素而改变，如施用方式和途径；接受者的年龄、健康状况和体重；症状的性质和程度；同时进行的治疗的种类；治疗的频率；以及期望的效果，这些能够由本领域的专家通过正常试验或者通过对miRNA或植物sRNA提取物或包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物的制剂的通常考虑所确定。通常地，根据施用途径不同，植物miRNA或植物sRNA提取物或者包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物的剂量可以从0.1mg/kg体重剂量至500mg/kg体重剂量变化。优选地，剂量是1至500、10至500、10-450、10-400、10-300、10-200、10-100、50-400、50-400、50-350、50-300、50-200、100-400、100-300或100-200mg/kg体重剂量。通常地，所示剂量是日剂量。

可以由本领域的专家通过正常的临床前和临床试验或通过对药物组合物制剂的通常考虑来确定根据本发明使用的植物miRNA或植物sRNA提取物的剂量或药物组合物中包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物的剂量。通常地，根据施用途径不同，植物miRNA或植物sRNA提取物或者包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物的剂量可以在0.1mg/kg体重剂量至500mg/kg体重剂量之间变化。优选地，剂量是1至500、10至500、10-450、10-400、10-300、10-200、10-100、50-400、50-400、50-350、50-300、50-200、100-400、100-300或100-200mg/kg体重剂量。通常地，所示剂量是日剂量。

药物组合物可以以单剂量或多剂量施用。

根据本发明的组合物可以是适于向动物机体(包括人体)施用的任意盖伦制剂形式，更特别地可以是以常规用于口服施用的任意形式，例如固体形式例如片剂、丸剂、颗粒剂、糖丸、胶囊剂和泡腾制剂如粉剂和片剂，或液体形式例如溶液、乳剂或混悬剂形式，例如糊剂和油性混悬液。可以将糊剂灌入硬壳或软壳胶囊，由此胶囊具有例如(鱼、猪、家禽、牛)明胶基质、植物蛋白或木质素磺酸盐的特征。其他应用形式的示例是用于透皮、胃肠外、局部或注射施用的形式。药物组合物可以是控制(延迟)释放剂型。

例如，在实施例中成功使用了用于静脉注射的包含3种植物sRNA提取物的组合物的DOTAP制剂。

在一个优选的实施方式中，根据本发明的组合物是用于静脉注射的制剂形式。

在又一个优选的实施方式中，根据本发明的组合物是片剂、丸剂、颗粒剂、糖丸、胶囊或泡腾制剂形式。

在又一个优选的实施方式中，本发明涉及一种治疗或预防炎性疾病的方法，所述方法包括向需要其的患者施用药学有效量的植物sRNA提取物、包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物或植物miRNA。

在又一个优选的实施方式中，本发明涉及一种预防炎性疾病的方法，所述方法包括向人施用植物sRNA提取物、包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物或植物miRNA，其优选地包含在膳食补充剂、食品或食品添加剂中。在一个优选的实施方式中，所述人是需要其的患者。在另一个实施方式中，所述人是健康人，特别是未患有炎性疾病的人。

膳食补充剂可以以单剂量或多剂量施用。

在本发明的食品或用于生产第二种食品的方法的又一个实施方式中，miRNA是野草莓miR168。

附图说明

图1：根据实施例1获得的sRNA图谱的示例。A、显示以核苷酸(nt)表示的6种RNA标记物的分子梯图谱；B、通过检测总RNA样品获得的图谱，其包含可通过28S和18S峰识别的高分子量部分和在电泳图左侧的低分子量sRNA部分。C-G、在本申请提供的实验中使用的sRNA部分的示例。H、在分析后由于存在高分子量RNA(18S和28S)污染已被排除样品的电泳图。

图2：A：显示了野草莓FvmiR156(A)FvmiR168(B)、水稻OsamiR168(C)和sGFP(D)双链结构的序列。me：甲基。B：显示了根据实施例1获得的sRNA图谱尺寸测定的示例。

图3：A：不同植物sRNA提取物对T细胞增殖的影响。显示了MLR结果。与对照(DC+Tw/o sRNA处理)相比任何处理均具有显著的统计学意义。B：在小鼠细胞系中不同植物sRNA提取物对T细胞增殖的影响。显示了MLR结果。增殖以刺激指数表示，通过与未刺激样品的结果进行比较确定已刺激的各样品相对于背景的刺激百分率。

图4：显示了获得用于miRNA处理的树突状细胞以及评估植物miRNA对已刺激的DC的作用的实验设计。

图5：植物miRNA处理对DC免疫功能的影响。miRNA处理对IL-1β、TNFα、IL-10和IL-6生成的影响。平均值+SD，N＝5，*p<0.05，**p<0.01T检验，$p<0.05，Kruskal Wallis检验，处理与未进行预处理比较

图6：植物miRNA处理对DC免疫功能的影响。miRNA处理对共刺激分子的表达的影响。平均值+SD，N＝3，*p<0.05，**p<0.01T检验，$p<0.05，Kruskal Wallis检验，处理与未进行预处理比较

图7：内源性人miRNA处理对DC免疫功能的影响。miRNA处理对IL-1β、TNFα、、IL-10的生成的影响。平均值+SD，N＝5，*p<0.05，**p<0.01T检验，$p<0.05，Kruskal Wallis检验，处理与未进行预处理比较

图8：内源性人miRNA处理对DC免疫功能的影响。miRNA处理对共刺激分子的表达的影响。平均值+SD，N＝5，*p<0.05，**p<0.01T检验，$p<0.05，Kruskal Wallis检验，处理与未进行预处理比较

图9：在暴露于不同植物和人miRNA以及总FvsRNA部分后，T细胞针对负载LPS的DC应答并产生INFγ的能力。平均值+SD，N＝5，*p<0.05，**p<0.01T检验，§p<0.05，KruskalWallis检验，处理与未进行预处理比较

图10：miRNA处理对T细胞增殖的影响。显示了使用不同植物和人miRNA以及总FvRNA部分处理后的MLR结果。平均值+SD，N＝4，*p<0.05，**p<0.01T检验，处理与未进行预处理的MLR测定比较表明FvmiR168和FvsRNA调节T细胞增殖。

图11：在暴露于总sRNA提取物后，T细胞产生INFγ的能力响应于负载LPS的DC。平均值+SD，N＝5，*p<0.05，**p<0.01T检验，处理与未进行预处理比较

图12：T细胞亚群鉴定。在存在或不存在10ng/ml野草莓和卷心菜叶子sRNA提取物的条件下使用LPS处理PBMC。5天后，通过流式细胞术分析CD4⁺细胞以获得Th1(Tbet)、Th2(Gata3)、Th17(Rorγ)或Treg(CD45⁺CD25^highFoxp3⁺)细胞的存在情况。数据以平均值±sd(N＝3)表示。*p<0.05，**p<0.01T检验，处理与未进行预处理比较。

图13：sRNA部分对T细胞增殖的影响。显示了使用不同植物sRNA部分以及总sRNA样品处理后的MLR结果。增殖以刺激指数表示，通过与未刺激样品的结果进行比较确定已刺激的各样品相对于背景的刺激百分率。平均值+SD，N＝6，直方：p<0.05，T检验，处理与未进行预处理比较。

图14：sRNA与免疫细胞的结合。将细胞与绿色标记的sRNA(10ng/ml)共培养2小时，然后使用流式细胞术分析。数据以平均值±sd表示(N＝3)。

图15：阻断实验。使用不同阻断剂预处理细胞1小时，然后将其暴露于荧光素标记的野草莓sRNA 2小时。然后洗涤细胞，利用流式细胞术分析FITC的阳性情况。数据以配体百分率表示，其中将FITC-核酸之间的无阻断结合设定为100％结合。平均值±sd(N＝3)。*p-值<0.05，T-检验，阻断与未阻断的细胞(无)比较。

图16：人上皮sRNA提取物对T细胞增殖的影响。显示了使用不同植物sRNA部分以及总sRNA样品处理后的MLR结果。增殖以刺激指数表示，通过与未刺激样品的结果进行比较确定已刺激的各样品相对于背景的刺激百分率。平均值+SD，N＝4，**p<0.01，T检验，处理与未进行预处理比较。

图17：阻断实验。使用不同阻断剂(PolyI:C(TLR3配体)、ssRNA40(TLR8配体)、FvsRNA、混合sRNA、人上皮sRNA提取物)预处理DC细胞1小时，然后将其暴露于荧光素标记的sRNA或TLR配体2小时。然后洗涤细胞，利用流式细胞术分析FITC的阳性情况。数据以结合百分率表示，其中将FITC-核酸的无阻断结合设定为100％结合。平均值±sd(N＝7)，*p-值<0.05，T-检验，阻断与未阻断的细胞(无)比较。

图18：共定位实验。使用荧光素标记的sRNA或PolyI:C或ssRNA40处理细胞1小时。然后洗涤细胞，使用TLR3抗体标记细胞并利用流式细胞术对细胞的FITC和APC(TLR3)以及FITC和PE(TLR8)双阳性进行分析。数据以阳性细胞百分率表示，其中将总FITC细胞设定为100％。平均值±sd(N＝6)，*p-值<0.05，**p-值<0.01，T-检验，TLR3+与TLR8+细胞比较。

图19：阻断实验。使用PolyI:C(TLR3配体)或ssRNA40(TLR8配体)预处理DC细胞1小时，然后将其暴露于荧光素标记的sRNA部分2小时。然后洗涤细胞，利用流式细胞术分析FITC的阳性情况。数据以结合百分率表示，其中将FITC-核酸的无阻断结合设定为100％结合。平均值±sd(N＝6)，直方，p-值<0.01，灰色直方p-值<0.05，T-检验，阻断与未阻断的细胞(无)比较。

图20：使用实时PCR进行基因表达分析以评估TRIF(TICAM1)(A)和IFNβ(B)表达。将来源于DC的单核细胞暴露于不同sRNA 1小时，然后使用LPS刺激。刺激4小时后，在所提取的总RNA中检测基因表达。

图21：植物提取物对EAE的作用。混合sRNA显著改善EAE的临床指征和疾病进程。利用单因素ANOVA检验进行分析，表明曲线具有统计学差异(*p<0.05)。特别是在免疫后第8天和第15天时混合sRNA组与未给药组小鼠相比以及混合sRNA组与给予运载体的小鼠相比临床评分具有显著的统计学意义。结果以两次独立实验的平均值±SD表示。

图22：使用植物提取物的治疗对EAE小鼠脊髓炎症和脱髓鞘的作用。上面的照片)：H&E染色显示了与未给药的或给予运载体的小鼠相比给予混合sRNA的小鼠脊髓白质中的浸润(箭头)数量减少。下面的照片)：混合sRNA治疗后的LFB染色显示了相似的情形(箭头)。

图23：通过对直接调控IL-10产生的T细胞群的Th1(Tbet)、Th2(GATA3)、Th17(RORc)、Treg(FoxP3)和cMAF因子对EAE细胞群进行表征。

图24：EAE淋巴结匀浆中细胞因子表达的表征。

序列

实施例

实施例1：植物sRNA提取物的制备以及miRNAs miR156、miR168、osamiR168和小双 链sGFP的合成(图1和图2)

根据生产商的方案使用mirPremier microRNA分离试剂盒(Sigma-Aldrich)提取植物sRNA。我们收集了若干植物材料，包括植物界的：来自野草莓(cv.Hawaii 4)的草莓果实、蓝莓、树莓果实、苹果皮、卷心菜叶子和花；塔米娜葡萄；蕨类叶子；拟南芥叶子；野生稻和玉米。所有这些都在液氮中粉碎。取100克与试剂盒中提供的缓冲液混合。使用试剂盒中提供的柱子将小RNA组分与高分子量RNA分离。最后使用无RNAse水洗脱小RNA。

在各次提取后，使用Agilent RNA 6000Nano试剂盒通过BioAnalyzer仪器对样品进行分析。本专利中使用的sRNA图谱的示例如图1中所示。图1A显示以核苷酸(nt)表示的6种RNA标记物；图1B显示了通过检测总RNA样品获得的图谱，其包含可通过28S和18S峰识别的高分子量部分和在电泳图左侧的低分子量sRNA部分。图1C-1G显示了在本申请提供的实验中使用的sRNA部分的示例。图1H显示了在分析后由于高分子量RNA(18S和28S)污染已被排除的样品。而且，我们使用Agilent小RNA试剂盒对各sRNA制备物进行了分析。通过BioAnalyzer分析我们表征了我们在接下来的实验中使用的各组分中存在的sRNA的尺寸。根据相对于分子梯的峰的已知尺寸和出现时间的保留时间对尺寸进行评估。所有植物sRNA提取物的目标部分均为10至120个核苷酸(nt)之间(图2B)。

合成的植物小RNA双链(图2A)由Sigma Genosys合成并使用HPLC纯化。根据Sigma寡核苷酸合成服务(http://www.sigmaaldrich.com/life-science/custom-oligos/sirna-oligos.html)的描述对小RNA链退火并在3’端甲基化。完成后，将小RNA双链在无RNAse水中重悬为适宜浓度。

实施例2：sRNA对T细胞增殖影响的评估(图3)

在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，在存在或不存在(阳性对照)不同植物sRNA提取物的条件下将人CD4+T细胞与同种异体人单核细胞来源的DC共培养。MLR是一项功能测定，其检测来自一个个体(应答者)的淋巴细胞对来自另一个个体(刺激者)的淋巴细胞的增殖应答。详细地说，通过聚蔗糖(Ficoll)梯度离心从健康供体白细胞层收集外周血单核细胞。然后，通过阳性磁性选择分离CD14⁺单核细胞并在含有IL-4和GM-CSF的培养基中将其分化成未成熟的DC。5天后，收集此类单核细胞来源的DC并用于随后的刺激实验。对于MLR而言，在存在或不存在sRNA提取物的条件下，将DC与CD4+T细胞共培养。在各项(这项或下述)实验中，将sRNA或miRNA与DOTAP复合，DOTAP是一种脂质体转染剂，其促进核酸进入细胞(Carvalho等，TLR3essentially promotes protective class I-restricted memory CD8⁺T-cell responses to Aspergillus fumigatus in hematopoietic transplantedpatients.Blood.2012Jan 26；119(4):967-77；Bourquin C等，Immunostimulatory RNAoligonucleotides induce an effective antitumoral NK cell response through theTLR7.J Immunol.2009Nov 15；183(10):6078-86)。将DOTAP也加入对照细胞中以排除交叉反应性。

在以从宿主体液中获取的更接近于生理浓度的浓度(10ng/ml)使用时，所有被检测的植物sRNA提取物均能够减少T细胞增殖(图3A)。

而且，我们使用小鼠细胞系对相同植物sRNA提取物限制小鼠T细胞增殖的能力进行了检测。所检测的植物sRNA提取物能够限制T细胞增殖，其中卷心菜叶子、蕨类、苹果皮的sRNA提取物是最有效的(图3B)。

实施例3：miRNA对免疫细胞性质及其对炎性刺激应答能力影响的评估

在体外实验中，将人单核细胞来源的DC暴露于纯化的miRNA(或野草莓纯sRNA提取物)，然后使用纯化的LPS(细菌细胞壁的脂多糖层)刺激经预处理的DC。这项实验能够通过利用流式细胞术对共刺激因子的分析以及检测培养基中DC分泌的可溶性因子(如，细胞因子)来确定sRNA对DC活化过程和成熟的影响。DC细胞表面表达的共刺激分子是免疫细胞正常活化和成熟的标记物。这些分子表达水平的增加促进DC-T细胞接触和抗原提呈，从而活化T细胞及其存活，激发正常的适应性免疫应答。细胞因子能够增强细胞应答(即，促炎性细胞因子，如IL-6、TNFα、IL-1β、IL-12p70、IL-23、INFγ、IL-17)、促进2型应答，从而有助于抗体产生(IL-4、IL-13、IL-5)或下调炎症过程(IL-10、TGFβ)。

特别地，通过对预先暴露于miRNA或仅使用LPS处理过的DC的CD80、CD86、CD83和II类免疫组织相容性复合物(MHCII或HLA-DR)的水平进行比较，证实了特定miRNA可能具有减弱作用。平行地，通过评估所释放的细胞因子的性质，评估了DC对刺激产生正常应答的能力。检测促炎性(IL-6、TNFα、IL-1β、IL-12p70)和抗炎性(IL-10)细胞因子的水平能够评价特定miRNA的免疫调节能力。对所有经处理的DC，分析24小时的IL-1β、TNFα、IL-10产生情况以及48小时的CD80、CD86、CD83和MHCII表达情况。然后将细胞用于混合淋巴细胞反应，其中将经处理的DC在CD4⁺T细胞存在的情况下共培养。5天后，对培养基上清液中INFγ的产生情况进行评估。

总体实验设计如图4中所示。

在第一组实验中分别使用下述试剂处理树突状细胞(DC)：

·野草莓特定小双链miR156(FvmiR156)(SEQ ID No：1和2；图2A)

·野草莓小双链miR168(FvmiR168)(SEQ ID No：3和4；图2B)

·水稻小双链osamiR168(SEQ ID No：5和6；图2C)

·野草莓总sRNA部分(FvsRNA)

·小双链化学修饰的绿色荧光蛋白序列(sGFP；SEQ ID No：7和8；图2D)(已将其作为多组的阴性对照(参见Robbins M,2008,Hum Gen Ther))；

·野草莓总高分子量RNA组分(FvRNA)

·大肠杆菌LPS(阳性对照)

·预先暴露于上述所有核酸2小时的大肠杆菌LPS

对若干miRNA浓度进行了实验，其范围从其生理浓度(10ng/ml)至核酸的常规实验浓度(10μg/ml,Liu X1等，(2010)MicroRNA-148/152impair innate response andantigen presentation of TLR-triggered dendritic cells by targeting CaMKIIα.JImmunol.15；185(12):7244-51；Carvalho等，TLR3essentially promotes protectiveclass I-restricted memory CD8⁺T-cell responses to Aspergillus fumigatus inhematopoietic transplanted patients.Blood.2012Jan 26；119(4):967-77；Bourquin C等，Immunostimulatory RNA oligonucleotides induce an effective antitumoral NKcell response through the TLR7.J Immunol.2009Nov 15；183(10):6078-86)。即便在最高浓度下观察到了最强的抑制作用，为了避免系统可能的饱和效应，显示结果的实施例使用了由宿主体液中获得的更接近于miRNA生理浓度的浓度(图5和图6)。而高分子量RNA组分不影响LPS对DC的活化，但是植物miRNA和植物sRNA组分既调节细胞因子又调节共刺激物的表达。

特别地，如图5中所示，植物sRNA显著减少了由LPS引起的IL-1β、TNFα和IL-10的生成。而且，FvmiR68显示出了最强的作用。

此外，我们发现植物sRNA限制了CD80、CD86和CD83表达的增加(图6)。

在又一组实验中(图7和图8)，为了研究在植物miRNA序列中存在的甲基基团(其在内源性DC人miRNA中不存在)可能产生的影响，使用了两种人miRNA(miR148、miR155及其星号形式miR155*)，已知其影响DC对LPS的应答(综述，Zhan和Wu,Functional regulation ofmonocyte-derived dendritic cells by microRNAs.Protein Cell.2012Jul；3(7):497-50)。分别使用下述试剂对DC进行处理：

·人miR155

·甲基化的人miR155

·人miR148

·甲基化的人miR148

通过在3’末端的2’OH基团加入甲基基团合成甲基化的miRNA。

甲基基团未改变人miRNA调节DC对LPS产生应答的能力。

进行了进一步的实验以评估是否不仅仅是sRNA组分，合成的植物miRNA也能够调节T细胞增殖，使用LPS处理DC之前，将其暴露于下述试剂中2小时：

·野草莓小双链miR168(FvmiR168)(SEQ ID No：3和4；图2B)

·水稻小双链osamiR168(SEQ ID No：5和6；图2C)

·野草莓总sRNA部分(FvsRNA)

·hsamiR155

·hsamiR148

然后与CD4⁺T细胞共培养。sRNA处理的DC和miRNA处理的DC似乎具有降低的免疫刺激能力，因为T细胞产生的LPS诱导的IFN-γ减少(图9)。MLR检测显示了FvmiR168和FvsRNA调节T细胞增殖(图10)。

实施例4：sRNA对免疫细胞性质及其对炎性刺激应答能力影响的评估(图4；图11- 12)

为了确证植物sRNA提取物的作用，将人单核细胞来源的DC暴露于野草莓和卷心菜叶子sRNA提取物中，然后使用纯化的LPS刺激经预处理的DC，随后将其暴露于T细胞以评估对于LPS诱导的IFN-γ产生情况的调节。植物sRNA处理的DC似乎具有降低的免疫刺激能力，因为T细胞产生的LPS诱导的IFN-γ减少了(图11)。我们还评估了经处理后T细胞亚群的存在。利用流式细胞术，我们通过检测其特定转录因子的表达情况揭示了T细胞群。尽管Tbet减少确证了Th1对LPS应答的减少，但是结果显示Treg(表达Foxp3的细胞)略有增加(图12)。

实施例5：植物sRNA部分对T细胞增殖的影响：具有<60个或70个核苷酸尺寸的sRNA 减少响应炎性刺激的T细胞增殖(图13)

使用12％聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，我们对植物sRNA样品进行了分级。在各次凝胶电泳中，使用两种不同尺寸的标记物对尺寸进行评估：低范围sRNA梯和microRNA梯(均来自New Englands BioLabs)。使用来自Life Technologies的MEGAclear试剂盒对条带进行纯化和提取。使用Agilent小RNA试剂盒确认各sRNA组分的尺寸和纯度。

如前所述，将sRNA组分与DOTAP复合，DOTAP是一种脂质体转染剂，其促进核酸进入细胞。使用那些制备物，在混合淋巴细胞反应(MLR)测定中，在存在或不存在(阳性对照)不同植物sRNA组分(10ng/ml)的条件下将人CD4+T细胞与经LPS刺激的同种异体人单核细胞来源的DC共培养。

在图13中，我们以刺激指数(相对于背景的增殖情况)表示了T细胞的增殖能力。范围为10-60个或15-60个核苷酸的sRNA组分负向调节应答LPS刺激的T细胞增殖。

实施例6：植物sRNA与免疫细胞结合的评估(图14-图19)

在这项实验中，我们评估了植物sRNA与在前面实施例中使用的DC和T细胞的结合能力。因此，我们根据生产厂商的说明书使用5’End-Tag试剂盒(Vendor Laboratories)用荧光素对植物sRNA样品进行标记。首先，我们将纯化的DC和T细胞或者这两者的共培养物暴露于FvsRNA，我们通过流式细胞术分析绿色细胞阳性率。植物sRNA与树突状细胞接触，但不与T细胞接触(图14)。

然后，我们进行了阻断实验以评估在这种结合中是否涉及特定受体。我们通过使用特定配体或针对受体的抗体特异性阻断了若干DC抗原的受体。

特别地，我们使用了10μg/ml：

-LPS(Sigma-Aldrich)，针对TLR4的抗原

-雷西莫特(R848)(InvivoGen)，RNA的合成类似物，针对TLR7/8的抗原

-低分子量(LMW)聚肌苷酸：聚胞苷酸(polyI:C)(InvivoGen)，dsRNA(病毒)的合成类似物，针对TLR3的抗原。

-来自酿酒酵母的甘露聚糖(Sigma-Aldrich)

-针对TLR4的阻断抗体

-针对TLR8的阻断抗体

-针对DC-SIGN的阻断抗体

-针对ALCAM/CD166抗原的阻断抗体，阴性对照。其在活化的T细胞、活化的单核细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经元、黑色素瘤细胞上表达，以及在汗腺和脂肪腺中表达，但是不参与免疫应答。

使用不同阻断剂预处理DC 1小时，然后将其暴露于荧光素标记的野草莓sRNA 2小时。随后洗涤细胞并通过流式细胞术分析针对FITC的阳性情况。

PolyI:C(TLR3，病毒dsRNA)和R848(TLR8)部分阻断结合(图15)。

由于使用野草莓sRNA的首次实验表明了TLR3和部分TLR8可能的作用，因此我们将检测扩大至所有活性sRNA样品，并且使用如非植物sRNA，例如从Caco-2细胞系中提取的sRNA。我们首先检测了人上皮sRNA是否像植物sRNA一样具有减少LPS诱导的T细胞增殖的能力(见图3)。如图中所示，人上皮sRNA提取物不能像植物sRNA一样限制T细胞增殖(图16)。

近期的实验集中在肿瘤环境来源的miRNA与免疫细胞的结合上，实验中使用了合成的单链小RNA(19nu)ssRNA40作为TLR7/8配体(参见Muller Fabbri等，(2012)PNAS,109(31):E2110–E2116)。因此，我们使用ssRNA40代替R848作为受体激动剂。在开始前，为了确认我们的实验设置，我们通过使用针对TLR8的抗体阻断了受体以检测ssRNA40与TLR8的结合(未显示)。

在所示的实施例中，使用不同的阻断剂预处理DC 1小时

-PolyI:C(TLR3配体)，

-ssRNA40(TLR8配体)，

-草莓FvsRNA，

-sRNA混合物，包含1/3卷心菜叶子的sRNA提取物、1/3蕨类叶子的sRNA提取物和1/3苹果皮的sRNA提取物，

-作为对照的人上皮sRNA。

并且随后暴露于荧光素标记的sRNA(上文提及的)或TLR配体两小时。随后洗涤细胞并通过流式细胞术分析针对FITC的阳性情况。数据以结合百分率表示，其中将FITC-核酸的无阻断结合设定为100％结合。

PolyI:C和ssRNA40两者对植物sRNA的接触均产生了抑制，表明TLR3和TLR8均参与了结合(图17)。

我们通过进行共定位实验证实了我们的结果。使用荧光素标记的sRNA处理2小时后，我们使用FIX和PERM试剂盒(Life Technologies)以及与APC偶联的抗TLR3抗体和与PE偶联的抗TLR8抗体针对TLR3和TLR8的表达对DC进行了细胞内标记。然后针对FITC和APC(TLR3)或FITC和PE(TLR8)的双阳性情况对细胞进行分析。数据以阳性细胞百分率表示，其中将FITC细胞总数设定为100％。

植物和非植物sRNA似乎均与TLR3和TLR8结合，但是植物sRNA的接触似乎主要由 TLR3介导并且部分由TLR8介导(图18)。

为了评估植物sRNA提取物样品的哪部分与DC结合，我们使用了在如上文所述的实施例4的阻断实验中纯化的sRNA部分。使用PolyI:C(TLR3配体)或ssRNA40(TLR8配体)预处理DC 1小时，然后将其暴露于荧光素标记的sRNA部分(在该实施例中，显示了苹果皮和FvsRNA部分，图19)2小时。然后洗涤细胞并通过流式细胞术分析针对FITC的阳性情况。PolyI:C阻断了与10-60个核苷酸的sRNA的结合，但是不阻断与更大尺寸的sRNA的结合。

实施例7：评估TLR3信号下游TRIF(TICAM1)和IFNβ表达的基因表达分析(图20)

将单核细胞来源的DC暴露于不同sRNA 1小时，然后使用LPS刺激。使用LPS刺激4小时后，检测所提取的总RNA的基因表达。数据以增加的倍数表示。使用小RNA预处理诱导衔接蛋白TRIF编码基因和IFNβ转录的下调(图20)。

实施例8：外源性植物提取物改善实验性自身免疫性脑脊髓炎(图21-24)

我们研究了植物sRNA在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)病理过程中的参与情况，在C57BL/6小鼠中通过免疫接种髓鞘少突胶质细胞糖蛋白肽35-55(MOG肽)诱导实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)，该模型是多发性硬化症的模型(E.Mix等，2010,Neurobiol.；92:386–404)。特别地，我们通过评估神经临床评分、测定T细胞增殖、DC表型以及组织病理性评分考察了静脉注射植物提取物对EAE病理过程的影响。

如此前所示将从卷心菜叶子、蕨类和苹果皮分离的sRNA(即卷心菜叶子、蕨类和苹果皮的植物sRNA提取物)组合在一起，然后溶解在磷酸盐缓冲液和DOTAP脂质体转染试剂(运载体)中，使其最终剂量为10μg/ml，每只小鼠150μl。在免疫接种(dpi)后第3天疾病的早期阶段和疾病的整个持续期(可达免疫接种后25天)每4天静脉注射给予sRNA混合物或运载体。进行了两次独立的实验。每次实验使用12只小鼠并将其随机分配至3个不同的实验组：

-给予混合sRNA的小鼠

-给予运载体的小鼠

-未给药的小鼠。

每日检查植物提取物对EAE严重程度的影响。在实验期间三组之间的体重不存在显著差异。出现疾病的两组小鼠具有典型的临床体征。

然而，如图21中所示，当与未给药的和给予运载体的小鼠比较时，混合sRNA治疗显著减轻了EAE的临床表现。与对照组相比，混合sRNA组的疾病发病(p.i.第8天)和最高(p.i.第15天)EAE评分的平均值显著降低(p<0.05)。这些结果表明施用植物sRNA提取物产生了对EAE的保护作用，使疾病的严重程度降低。

EAE由自身反应性免疫细胞浸润到中枢神经系统(CNS)中所介导，其导致运动神经元的炎症和脱髓鞘，从而导致麻痹。苏木素和伊红(H&E)染色的结果表明，诱导EAE后，未经处理和仅sRNA或运载体处理的小鼠在脊髓中具有不同面积的免疫细胞浸润(图22，上面的照片)。然而，与未处理或给予溶剂处理的小鼠相比，经sRNA处理的小鼠目测具有较少浸润。利用牢固蓝(LFB)甲酚紫染色对脱髓鞘程度进行评估，结果表明与给予混合sRNA的小鼠相比在未处理和经运载体处理的小鼠的脊髓中炎性细胞浸润部位具有更多和更大的脱髓鞘斑块(图22，下面的照片)。

这些结果表明经植物提取物处理的小鼠出现的疾病严重程度降低与脊髓组织学后果改善相关。总之，我们的结果表明植物sRNA提取物减轻了由免疫接种MOG诱导的EAE的病理学进展。通过EAE病理学的若干检测结果证实了这种改善，包括：神经缺陷评分降低；脊髓中的炎性细胞浸润和脱髓鞘减轻。而且，就直接调控IL-10产生的Th1(Tbet)、Th2(GATA3)、Th17(RORc)、Treg(FoxP3)和cMAF因子对T细胞群进行了细胞群表征。分析显示“混合”植物sRNA提取物处理抑制导致EAE和缺乏IL-10增加的细胞的Th1和Th17的分化(图23、图24)，cMAF的水平不变证实了这一点。

Claims (26)

1.一种用作免疫抑制剂的植物sRNA提取物。

2.根据权利要求1所述的使用的植物sRNA提取物，其中所述sRNA的长度为200个核苷酸或更少，优选长度为120个核苷酸或更少，优选长度为10至120个核苷酸之间。

3.根据权利要求1或2所述的使用的植物sRNA提取物，其中所述sRNA的长度为10至70、10至60、15至60、20至60或者10至50个核苷酸之间。

4.根据权利要求1、2或3的任意一项所述的使用的植物sRNA提取物，其中所述sRNA是miRNA。

5.根据权利要求1至4中任意一项所述的使用的植物sRNA提取物，其中所述植物sRNA提取物选自苹果sRNA提取物、蓝莓sRNA提取物、树莓sRNA提取物、卷心菜sRNA提取物、拟南芥sRNA提取物、葡萄sRNA提取物、水稻sRNA提取物，特别是野生稻sRNA提取物，玉米sRNA提取物、松树sRNA提取物、蕨类sRNA提取物和鼠尾草sRNA提取物。

6.根据权利要求1至5中任意一项所述的使用的植物sRNA提取物，其中所述植物sRNA提取物选自苹果sRNA提取物、卷心菜sRNA提取物、草莓sRNA提取物和蕨类sRNA提取物，

优选地其中

所述苹果sRNA提取物是苹果皮的sRNA提取物，或者

所述卷心菜sRNA提取物是卷心菜叶子或卷心菜花的，更优选地卷心菜叶子的，sRNA提取物，或者

所述蕨类sRNA提取物是蕨类叶子的sRNA提取物，或者

所述草莓sRNA提取物是草莓果实的sRNA提取物。

7.一种组合物，所述组合物包含2种或多种植物sRNA提取物，优选地其中所述组合物包含2种或多种选自下组的植物sRNA提取物：苹果sRNA提取物、蓝莓sRNA提取物、树莓sRNA提取物、卷心菜sRNA提取物、拟南芥sRNA提取物、葡萄sRNA提取物、水稻sRNA提取物，特别是野生稻sRNA提取物，玉米sRNA提取物、松树sRNA提取物、蕨类sRNA提取物和鼠尾草sRNA提取物，

更优选地

其中所述组合物包含，优选地由选自下组的两种或多种sRNA提取物组成：草莓sRNA提取物，即野草莓sRNA提取物，卷心菜sRNA提取物、蕨类sRNA提取物和苹果sRNA提取物。

8.根据权利要求7所述的组合物，其包含卷心菜叶sRNA提取物、蕨类叶子sRNA提取物和苹果皮sRNA提取物以及可选地草莓果实sRNA提取物，优选地由其组成。

9.根据权利要求1至6中任意一项所述的使用的植物sRNA提取物或者根据权利要求8所述的组合物，其中所述sRNA包括甲基化的sRNA，更优选地在3’末端的2’OH基团处被甲基化的sRNA或miRNA。

10.根据权利要求8或9所述的组合物，所述组合物用作免疫抑制剂。

11.一种用于治疗和/或预防炎性疾病的方法中的，优选地根据权利要求2至6和9中的任意一项所定义的植物sRNA提取物或根据权利要求7、8或9所述的组合物，特别地其中所述炎性疾病选自下组：慢性前列腺炎、肾小球肾炎、过敏、盆腔炎性疾病、再灌注损伤、结节病、血管炎、间质性膀胱炎、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、心包炎、肌炎、抗合成酶抗体综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、白塞氏综合征、PAPA综合征、布洛氏综合征、痛风、成人和幼年型斯蒂尔氏炎性疾病、冷吡啉病、穆克勒-威尔斯综合征、家族性寒冷诱导自体炎性综合征、新生儿期发病的多系统炎性疾病、家族性地中海热、慢性婴儿神经皮肤关节综合征、全身型幼年特发性关节炎、高IgD综合征、施尼茨勒综合征、TNF受体相关的周期性综合征(TRAPSP)、牙龈炎、牙周炎、肝炎、肝硬化、胰腺炎、心肌炎、血管炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎和炎性皮肤病症，所述炎性皮肤病症选自下组：银屑病、特应性皮炎、湿疹、红斑痤疮、荨麻疹和痤疮。

12.根据权利要求11所述的使用的植物sRNA提取物或组合物，其中所述炎性疾病是自身免疫性疾病。

13.根据权利要求12所述的使用的植物sRNA提取物或组合物，其中所述自身免疫性疾病选自下组：多发性硬化症、类风湿性关节炎、银屑病性关节炎、盘状红斑狼疮、系统性红斑狼疮(SLE)；溃疡性结肠炎；克隆氏病；良性淋巴细胞性血管炎、自身免疫性淋巴增生综合征、结节病、自身免疫性血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、单纯红细胞再生障碍性贫血、干燥综合征、风湿性疾病、风湿性多肌痛、混合性结缔组织病、炎性风湿病、退行性风湿病、关节外风湿病、幼年型关节炎、幼年型类风湿性关节炎、全身型幼年特发性关节炎、关节炎性尿路炎、肌肉风湿病、慢性多关节炎、反应性关节炎、赖特尔综合征、风湿热、复发性多软骨炎、雷诺氏现象、血管炎、冷球蛋白性血管炎、ANCA相关的血管炎、颞动脉炎、巨细胞性动脉炎、高安氏动脉炎、白塞氏病、抗磷脂综合征、重症肌无力、自身免疫性溶血性贫血、格林-巴利综合征、慢性免疫多发性神经病、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、自身免疫性甲状腺炎、胰岛素依赖性糖尿病、I型糖尿病、艾迪生氏病、膜性肾小球肾病、多腺性自身免疫性综合征、古德帕斯彻病、自身免疫性胃炎、自身免疫性萎缩性胃炎、恶性贫血、天疱疮、寻常型天疱疮、肝硬化、原发性胆汁性肝硬化、特发性肺纤维化、肌炎、皮肌炎、幼年型皮肌炎、多肌炎、纤维肌炎、肌硬化、乳糜泻、乳糜泻性皮炎、免疫球蛋白A型肾病、过敏性紫癜、埃文斯综合征、特应性皮炎、银屑病、寻常型银屑病、银屑病性关节病、格雷夫斯氏病、格雷夫斯氏眼病、硬皮病、系统性硬皮病、进行性系统性硬皮病、弥漫性硬皮病、局部硬皮病、Crest综合征、哮喘、过敏性哮喘、过敏症、原发性胆汁性肝硬化、桥本氏甲状腺炎、纤维肌痛、慢性疲劳和免疫功能障碍综合征(CFIDS)、原发性粘液性水肿、交感性眼炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性慢性活动性肝炎、胶原病、强直性脊柱炎、肩周炎、结节性全动脉炎、结节性多动脉炎、软骨钙质沉着病、韦格纳氏肉芽肿、显微镜下多血管炎、慢性荨麻疹、大疱性皮肤病、类天疱疮、大疱性类天疱疮、瘢痕性类天疱疮、白癜风、特应性湿疹、湿疹、慢性荨麻疹、自身免疫性荨麻疹、正常补体血症性荨麻疹性血管炎、低补体血症性荨麻疹性血管炎、斑秃、普秃、全秃、德维克病、恶性贫血、儿童自身免疫性溶血性贫血、特发性自身免疫性溶血性贫血、难治性或慢性自身免疫性血细胞减少、防止在获得性甲型血友病中出现自身免疫性抗因子VIII抗体、冷凝集素病、视神经脊髓炎、僵硬综合征、牙龈炎、牙周炎、胰腺炎、心肌炎、胃炎、痛风、痛风性关节炎、特发性心包炎、抗合成酶抗体综合征、巩膜炎、巨噬细胞活化综合征、PAPA综合征、布洛氏综合征、成人和幼年型斯蒂尔氏炎性疾病、冷吡啉相关周期性综合征、穆克勒-威尔斯综合征、家族性寒冷诱导自体炎性综合征、新生儿期发病的多系统炎性疾病、慢性婴儿神经皮肤关节综合征、家族性地中海热、高IgD综合征、施尼茨勒综合征、自身免疫性视网膜病、年龄相关的黄斑变性和TNF受体相关的周期性综合征(TRAPS)，

优选地其中所述自身免疫性疾病是多发性硬化症。

14.根据权利要求11所述的使用的植物sRNA提取物或组合物，其中所述炎性疾病是过敏性疾病。

15.根据权利要求14所述的使用的植物sRNA提取物或组合物，其中所述过敏性疾病选自下组：过敏性呼吸系统疾病如支气管哮喘、小儿哮喘、过敏性哮喘、特应性哮喘、阿司匹林哮喘或过敏性支气管炎，过敏性鼻部疾病如过敏性鼻炎、春季卡他、花粉热或慢性过敏性鼻炎，过敏性皮肤病如特应性皮炎，过敏性眼病如花粉热、季节性过敏性结膜炎或慢性过敏性结膜炎，过敏性肺炎，接触性皮炎和食物过敏。

16.根据权利要求11所述的使用的植物sRNA提取物或组合物，其中所述炎性疾病是银屑病。

17.根据权利要求11至16中任意一项所述的使用的植物sRNA提取物或组合物，其中所述炎性疾病的特征为至少一种炎性标记物的表达或产生增加，所述炎性标记物特别地选自IL-1β和TNFα，和/或其中所述炎性疾病的特征为在患者的至少一种细胞和/或组织中的细胞因子或共受体调节异常，特别地其中所述至少一种细胞是树突状细胞。

18.根据权利要求1至6、9或11至17中任意一项所述的使用的植物sRNA提取物，其中所述sRNA提取物来自草莓，或根据权利要求7至9中任意一项所述的组合物，或根据权利要求11至17中任意一项所述的使用的组合物，其中所述组合物包含草莓sRNA提取物。

19.根据权利要求1至6、9或11至18中任意一项所述的使用的植物sRNA提取物或根据权利要求11至18中任意一项所述的使用的组合物，其中所述植物sRNA提取物或组合物与至少一种其他抗炎剂联合施用。

20.根据权利要求19所述的使用的植物sRNA提取物或组合物，其中所述其他抗炎剂选自下组：皮质类固醇、他汀类药物、干扰素β、非甾体抗炎药(NSAID)、甲氨蝶呤、环孢素A和改善病情的抗风湿药(DMARD)。

21.根据权利要求1至6、9或11至20中任意一项所述的使用的植物sRNA提取物，或根据权利要求11至20中任意一项所述的使用的组合物，或根据权利要求7至9中任意一项所述的组合物，其中所述植物sRNA提取物或组合物包含在食品添加剂或膳食补充剂中。

22.根据权利要求1至6、9或11至19中任意一项所述的使用的植物sRNA提取物或根据权利要求11至19中任意一项所述的使用的组合物，其中所述植物sRNA提取物包含在药物组合物中。

23.一种药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂，所述药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂包含根据权利要求7至9中任意一项所述的组合物，或根据权利要求1至6和9中的任意一项所定义的植物sRNA提取物，

优选地

其中所述药物组合物、食品添加剂或膳食补充剂包含a)脂质，更优选地至少一种脂质体，或b)胞外体。

24.一种食品产品，所述食品产品包含植物sRNA提取物，优选地包括根据权利要求1至6和9中任意一项所定义的植物sRNA提取物，或根据权利要求7至9中任意一项所述的组合物。

25.一种生产第二种食品产品的方法，所述方法包括向第一种食品产品中加入植物sRNA提取物，优选地加入根据权利要求1至6和9中任意一项所定义的植物sRNA提取物，或根据权利要求7至9中任意一项所述的组合物。

26.一种作为药物的植物sRNA提取物，优选地根据权利要求2至6和9中任意一项所定义的，或根据权利要求7至9中任意一项所述的包含2种或多种植物sRNA提取物的组合物。