CN106674333B - 一种环肽类抗真菌化合物及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种环肽类抗真菌化合物及其制备方法。具体的，本发明提供的环肽类抗真菌化合物结构新颖，体内抗菌活性显著优于阿尼芬净，并且，体内半衰期与阿尼芬净相比显著延长。另一方面，本发明提供的该环肽类抗真菌化合物制备方法简单，适合工业化生产。本发明还提供了所述环肽类化合物的一种新晶型。

Description

一种环肽类抗真菌化合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及环肽领域，具体涉及一种环肽类抗真菌化合物及其制备方法。

背景技术

棘白菌素(echinocandin)为宽范围的一组抗真菌剂，其典型的包括环状六肽和亲脂性尾端，后者通过酰胺键附接于六肽核心。尽管天然存在的棘白菌素具有某种程度的抗真菌活性，但它们并不适合作为治疗剂，这主要是由于差的水溶性、不充分的功效，和/或溶血作用。通过全合成或者通过对天然存在或天然产生的前体进行合成修饰或酶法改性获得的棘白菌素化合物被称为半合成棘白菌素化合物。

已批准上市的半合成类棘白菌素化合物，包括：阿尼芬净(anidulafungin)、卡泊芬净(caspofungin)和米卡芬净(micafungin)，它们可用于治疗真菌感染，特别是由曲霉菌(Aspergillus)、芽生菌(Blastomyces)、假丝酵母(Candida)、球孢子菌(Coccidioides)和组织胞浆菌(Histoplasma)引起的真菌感染。其维持或改善对葡聚糖合酶的抑制作用，但不引起溶血作用。

阿尼芬净、米卡芬净和卡泊芬净都是由天然存在的棘白菌素(例如棘白菌素B、纽莫康定A0或纽莫康定B0)通过半合成得到。作为治疗剂，它们在其全身的半衰期、大的治疗窗口、安全特性，及与其它药物的相互作用的相对缺乏的方面是有吸引力的化合物。但由于这些化合物水溶性差，肠道吸收率低，只能通过静脉内给药。并且临床上关于这类产品种类相对较少。开发半衰期长、抗菌谱广的新的棘白菌素类药物，提高患者用药依从性，扩大临床用药品种，具有显著的意义。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种新的环六肽类抗真菌药物，其具有增加的水溶性，并且在体内半衰期长，治疗指数高，具有对抗一种或多种真菌种类或属的活性，具有静脉内给药适应性。

具体的，本发明提供了一种式1化合物：

或其药学上可接受的盐。

另一方面，本发明还提供了一种药用组合物，其包含本发明所提供的化合物，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的赋形剂。

在具体的实施方案中，药用组合物包含本发明的化合物的乙酸盐或盐酸盐。本发明的药用组合物可被配制为单位剂量形式或本文描述的任何其它剂型，供静脉内、局部或口服给药。

本领域熟知的用于制备制剂的方法例如在“Remington:药物科学或实践(TheScience and Practice of Pharmacy)”(第20版,ed.A.R.Gennaro,2000,LippincottWilliams&Wilkins)中发现。胃肠外给药的制剂，例如含有赋形剂、无菌水或盐水，聚亚烷基二醇如聚乙二醇、植物来源的油，或氢化萘。供吸入的制剂可包含赋形剂，例如，乳糖，或可以是包含例如，聚氧乙烯-9-十二烷基醚、羟乙酸盐和去氧胆酸盐的水性溶液，或可以是以滴鼻剂形式给药的油性溶液，或作为凝胶剂。

用于口服利用的制剂包括片剂，本发明提供的化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂。这些赋形剂可以是，例如惰性稀释剂或填充剂(如，蔗糖和山梨醇)、润滑剂、助流剂和抗结合剂(如，硬脂酸镁、硬脂酸锌、硬脂酸、二氧化硅、氢化植物油或滑石粉)。用于口服利用的制剂也是咀嚼片、片剂、糖衣片，或胶囊(即，作为硬明胶胶囊，其中的活性成分与惰性固体稀释剂混合，或作为软明胶胶囊)。

制剂中的本发明提供的化合物的浓度将根据多种因素，包括要给予的药物剂量，以及给药途径而变化。

本发明所述化合物药学上可接受的盐，包括但不限于，酸加成盐；通过用金属，如碱金属或碱土金属盐(如，钠、锂、钾、镁或钙盐)；或常用于制药工业的金属复合物替代酸性质子而形成的金属盐。酸加成盐的实例包括有机酸如乙酸、乳酸、扑酸、马来酸、柠檬酸、苹果酸、抗坏血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕榈酸、辛二酸、水杨酸、酒石酸、甲烷磺酸、甲苯磺酸或三氟乙酸；聚合酸如丹宁酸，和羧甲基纤维素；和无机酸如盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸。金属复合物包括锌，和铁，及其它等。

另一方面，本发明还提供了包含本发明的化合物的药物组合物在治疗哺乳动物真菌感染中的用途。进一步的，所述真菌感染选自头皮癣、体癣、脚癣、甲癣、甲周癣、变色性皮癣、阴道念珠菌病、呼吸道念珠菌病、胆道念珠菌病、食道念珠菌病、尿道念珠菌病、全身性念珠菌病、粘膜与皮肤念珠菌病、曲霉病、毛霉病、副球孢子菌病、北美芽生菌病、组织胞浆菌病、球孢子菌病、真菌性鼻窦炎或慢性副鼻炎。

本发明的化合物I，如在实施例中所述，通过在标准反应条件下，使棘白菌素类化合物与合适的酰基、烷基、羟基和/或氨基基团的偶合官能化或非官能化来合成。例如，棘白菌素B(Echinocandin B，简称ECB)可由构巢曲霉(Aspergilus nidulans)代谢产生，其结构如下：

棘白菌素B经脱酰酶作用，得到环肽母核(Echinocandin B Nucleus，ECBN)，环肽母核再经过化学修饰可制备得到阿尼芬净。美国专利US7785826B2详细介绍了ECB转化ECBN的工艺。此工艺主要流程包括：将ECB发酵完成以后，离心获得菌丝体，把菌丝体重新悬浮于水中然后加入纯化的脱酰酶。CN102618606B、EP0561639B1等文献也公开了ECB转化ECBN的方法。

ZL95196643.X说明书部分实施例156公开了化合物1侧链MFE的制备方法；US7199248B2也公开了化合物I侧链MFE及其活化形式的制备方法，

化合物1母核(ANL)的制备可采用ECBN与MFE或其活化物反应制备获得，反应式如下：

其中，ECBN与MFE活化物反应条件类似US7199248B2中公开的FR179642与MFE活化物反应的条件进行操作(在本发明具体实施例中也有举例说明)。

对于本发明的化合物的半合成途径，化合物的立体化学通过起始原料确定。因此，半合成的棘白菌素衍生物的立体化学具有与其从中衍生的天然存在的棘白菌素构型相同的立体化学。

因此，本发明的棘白菌素类化合物可衍生自环状肽抗真菌剂，如棘白菌素B、棘白菌素B母核(ECBN)、阿尼芬净。

另一方面，本发明还提供了化合物ANM的无定型，其具有基本如图3所示的X-射线粉末衍射(XRPD)谱图。

其中XRPD测试使用Panalytical(帕纳科)公司的XPERT-3型X射线衍射仪。测试方法是，将约10毫克样品均匀平铺在单晶硅样品盘上，用以下描述参数进行XRPD测试：

本发明提供的带有独特两亲性基团的环六肽化合物，特别能增强抗真菌效力，尤其是体内抗菌活性。

本发明的化合物在水中与阿尼芬净相比较具有增加的溶解性；本发明化合物最低抑菌浓度优于阿尼芬净，并且体内半衰期显著长于阿尼芬净，另外，与阿尼芬净相比，本发明化合物体内分布体积较大。

附图说明

图1显示的是化合物1对系统性念珠菌感染小鼠肾脏载菌量的影响。

图2显示的是化合物ANM的红外谱图。

图3显示的是化合物ANM的X-射线粉末衍射谱图。

具体实施例：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例、或份数按重量计，除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：化合物ANL的制备

将化合物ANA(5g)，化合物MFE1(3.1g)，磷酸氢二钾(1.8g)加入至丙酮和纯化水(4:1，v/v)的混合溶液(50ml)，反应液升温至55℃±5℃反应2h后，趁热过滤，滤液旋干，真空干燥得7.0g目标化合物ANL。

实施例2：化合物ANP的制备

(1)化合物(ANL苯硼酸脂)制备

室温氮气保护下，将化合物ANL(7.0g)加入至无水四氢呋喃(35ml)中，然后加入苯硼酸(0.98g)，搅拌1h，室温脱溶至干，加入无水四氢呋喃(42ml)搅拌0.5h后，脱溶，除水，反复两次。加入无水四氢呋喃(21ml)和无水乙腈(42ml)溶解搅拌0.5h，脱溶，除水，固体真空干燥过夜。

(2)氯化胆碱的反应前处理

室温氮气保护下，将氯化胆碱(25.97g)加入至无水乙腈(210ml)中，超声溶解，然后室温脱溶，重复加入无水乙腈(210ml)，超声，脱溶。固体真空干燥过夜。

(3)化合物ANP的制备

室温氮气保护下，将步骤(2)制备的干燥的氯化胆碱加入至无水乙腈(70ml)中，加入三氟乙酸(17.5ml)，搅拌至溶清，快速加入步骤(1)制备的干燥的ANL苯硼酸脂，室温氮气保护下搅拌2.5h。反应液滴加纯化水(175ml)，得到含化合物ANP的无色澄清溶液。

实施例3：化合物ANM的制备

将实施例2制备的含化合物ANP的无色澄清溶液通过0.45μm有机膜过滤，滤液通过C18，10μm填料制备柱制备纯化，制备方法如下表1所述：流动相分别为乙腈、1‰醋酸/水，表1：制备方法

分段收集洗脱液，得到化合物ANM，冻干得目标产物1.5g，收率：30％，HPLC：97.3％。化合物ANM的红外谱图如图2所示，其X-射线粉末衍射谱图如图3。

实施例4：化合物1的制备

用胆碱氯化物(13mg，0.093mmol)和HCl(4M在1,4-二氧六环中，1.0μL，0.004mmol)处理溶于无水DMSO(0.2mL)中的化合物ANL(4.5mg；0.004mmol)。将生成的溶液于室温下搅拌2天并于40℃加热约8小时，然后用水和乙腈稀释并经制备型RP HPLC纯化，用水(0.1％TFA)/CH₃CN(0.1％TFA)洗脱。产物经冻干分离，得到2.4mg化合物1。ESI⁺m/z：1216.58[M]⁺。

实施例5化合物X的制备

用胆碱氯化物(13mg；0.093mmol)和HCl(4M在1,4-二氧六环中；1.0μL；0.004mmol)处理溶于无水DMSO(0.2mL)中的阿尼芬净(5mg；0.004mmol)。将生成的溶液于室温下搅拌2天并于40℃加热约8小时，然后用水和乙腈稀释并经制备型RP HPLC纯化，用水(0.1％TFA)/CH3CN(0.1％TFA)洗脱。产物经冻干分离，得到2.0mg化合物X，为白色固体。HPLC T_R10.84min(90％)。LC/MS，ESI⁺m/z 1225.60[M]⁺。

实施例6体外对念珠菌属的最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)的测定

按照临床和实验室标准品研究所(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)M27-A3文件所述的程序进行。取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640培养液200μl作空白对照；96孔板每排3～12号孔各加RPMI 1640培养液100μl；2号孔分别加RPMI1640培养液180μl和640μg/ml抗真菌化合物溶液20μl，充分混匀；每排为1个待筛选化合物；最后一排为质控氟康唑；2～11号孔10级倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％；12号孔不含药物，作阳性对照；将受试菌株于SDA平皿上活化2次，以保证其活力；将活化菌株划线接种于SDA平皿，35℃培养24小时；挑取直径>1mm的菌落5个，将其溶解于灭菌三蒸水中，于振荡器上震荡15秒制备成菌悬液；用血细胞计数板将菌悬液浓度用RPMI 1640培养液调整至1×10⁶～5×10⁶(相当于麦氏浊度0.5)CFU/ml将上述已经配置好的菌悬液用RPMI 1640培养液稀释1000倍(首先稀释50倍，然后稀释20倍)，使其浓度介于1×10³～5×10³CFU/ml之间。菌悬液稀释至1×10³～5×10³CFU/ml之间后，用多道移液器将菌液接终至96孔板第2～12号孔，最终接种浓度为0.5×10³～2.5×10³CFU/ml；96孔板最后一排为质控菌株近平滑念珠菌ATCC22019。新型隐球菌孵箱中孵箱中35℃培养72小时后观察结果，其他念珠菌35℃培养24小时后观察结果。

实验结果如下表1和2所示。

表1：对念珠菌(国际标准株)的MIC值

由上述结果可看成，本发明化合物1对国际标准株念珠菌和临床分离株的念珠菌具有较好的抑菌效果，其与阿尼芬净相比体外具有类似的抗念珠菌谱和较优的抗念珠菌活性。

表2：对念珠菌(临床分离株)的MIC值

实施例7体外对丝状菌的最低抑菌浓度(MIC)/最低有效浓度(MEC)的测定

按照临床和实验室标准品研究所(Clinical and Laboratory StandardsInstitute)M38-A2文件所述的程序进行。取无菌96孔板，于每排1号孔加RPMI 1640培养液200μl作空白对照；96孔板每排3～12号孔各加RPMI 1640培养液100μl；96孔板每排2号孔分别加RPMI 1640培养液180μl和640μg/ml抗真菌化合物溶液20μl，充分混匀；每排为1个待筛选化合物；最后一排为质控伏立康唑；2～11号孔10级倍比稀释，使各孔的最终药物浓度分别为64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25和0.125μg/ml，各孔中DMSO含量均低于1％；12号孔不含药物，作阳性对照；将受试菌株于PDA平皿上活化7天，以诱导分生孢子以及孢囊孢子的形成；在孵育7天的菌落上加入含有0.01ml吐温20(1滴)的0.85％盐水1ml，制备菌悬液；菌悬液静置3～5min后,大颗粒沉于底部,取上层均质液体(含孢囊孢子或分生孢子以及菌丝片段)；用血细胞计数板将菌悬液浓度用RPMI 1640培养液调整至1×10⁶～5×10⁶CFU/ml将上述已经配置好的菌悬液用RPMI 1640培养液稀释250倍(首先稀释25倍，然后稀释10倍)，使其浓度介于0.4×10⁴～2×10⁴CFU/ml之间。菌悬液稀释至0.4×10⁴～2×10⁴CFU/ml之间后，用多道移液器将菌液接终至96孔板第2～12号孔，最终接种菌悬液浓度为0.2×10⁴～1×10⁴CFU/ml。孵箱中35℃培养48小时后观察结果(皮肤癣菌7天后观察结果)。

实验结果见表3。

表3：对丝状菌(国际标准株)的MIC和MEC值

由上述结果可以看出化合物1对丝状真菌也具有较好的抑菌效果，其与阿尼芬净体外具有相似的抗菌谱和较优的抗丝状真菌活性

实施例8化合物1在比格犬体内药代动力学研究

选取17～20月龄雄性比格犬9条(北京玛斯生物技术有限公司)，动物饲养在普通动物房内。动物房通风良好，装备空调，温度保持在18～26℃，湿度保持在40％～70％。明暗照明各12小时，每只犬独立饲养，可自由进食和饮水。经兽医检验合格后，入选本实验。比格犬每只犬均用耳部纹身标记，并在笼具上标注试药编号、剂量。实验前一天，比格犬禁食过夜，给药4h后可恢复进食，实验过程中可自由饮水。阿尼芬净组比格犬分别进行10min静脉推注1mg·kg^-1阿尼芬净溶液，于给药前及推注完成后5、15、30min、1、2、4、8、12、24、48和72h，由颈静脉采血0.5mL，置于含K₂-EDTA抗凝剂试管中。化合物X组比格犬分别进行10min静脉推注1mg·kg^-1化合物X溶液，于给药前及推注完成后5、15、30min、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168h，由颈静脉采血0.5mL，置于含K₂-EDTA抗凝剂试管中。化合物1组比格犬分别进行10min静脉推注1mg·kg^-1BG-10048溶液，于给药前及推注完成后5、15、30min、1、2、4、8、12、24、48、72、96、120、144和168h，由颈静脉采血0.5mL，置于含K₂-EDTA抗凝剂试管中。采集的全血样品在离心前都置于冰上，同一时间点采集的全血样品需在采集完成半小时内离心完，低温离心(5500rpm)10min后分离血浆，保存在-70℃冰箱。建立测定比格犬血浆中阿尼芬净、化合物X和化合物1浓度的LC-MS/MS分析方法，用于本实验获得的生物样品的浓度测定。采用Pharsight Phoenix 6.3中的非房室模型计算药代动力学参数，并计算绝对生物利用度。实验结果见表4。

表4：

PK参数	单位	阿尼芬净	化合物X	化合物1
					T<sub>1/2</sub>	h	17	65	71
AUC<sub>0-t</sub>	ng·h·mL-1	21121	67351	77731
					AUC<sub>0-inf</sub>	ng·h·mL-1	22396	82573	87932
CL	mL·kg-1·min-1	0.748	0.202	0.19
					Vd<sub>ss</sub>	L·kg-1	0.835	1.52	1.48

从上表可看出，比格犬静脉注射给予阿尼芬净、化合物X和化合物1后半衰期分别为17、65和71h。化合物X和化合物1具有较大的分布体积和较长的半衰期。这些药代动力学特性可提供诸如降低的给药量、减少的给药频率，和/或在治疗/预防某些真菌感染中的改进的功效的优点。

实施例9化合物1对系统性念珠菌感染小鼠肾脏载菌量的影响

选取6～8周龄雄性C57小鼠20只，随机分为5组。实验动物饲养在SPF动物房内。动物房通风良好，装备空调，温度保持在20～25℃，湿度保持在40％～70％，明暗照明各12小时，实验动物能自由进食和饮水。正常喂养7天后，经兽医检验，体征状况良好小鼠可入选本实验。每只小鼠均用尾标号标记。动物分别于接菌前4天和1天腹腔注射150mg/kg环磷酰胺。将受试白念珠菌SC5314于SDA平皿上活化2次，以保证其活力。将活化菌株划线接种于SDA平皿，35℃培养24小时；挑取直径>1mm克隆，将其接种于YPD培养基中，过夜培养。将上述菌液调整至1×10⁴CFU/ml用于系统性真菌感染动物模型复制。实验动物尾静脉注射1×10⁴CFU/ml复制系统性真菌感染模型。模型复制后2小时，四组动物分别腹腔注射给予溶剂对照、4.5mg/kg的阿尼芬净、1.5mg/kg的化合物X和4.5mg/kg的化合物1。给药12小时后，处死所有动物，取双侧肾脏，加入2ml PBS缓冲液进行匀浆，将匀浆液涂布于SDA平皿上，35℃培养48小时，计算单位重量肾脏组织内的菌落数。实验结果见下表5和图1。

表5：化合物1对系统性念珠菌感染小鼠肾脏载菌量的影响

由表5可看出，模型对照组、阿尼芬净组、化合物X组和化合物1组给药12小时后肾脏载菌量分别为4.69、3.86、3.87和2.89Log 10CFU/g。给药后阿尼芬净与化合物X肾脏载菌量显著低于模型组，表明阿尼芬净和化合物X具有良好的体内抗真菌活性。化合物1肾脏载菌量显著低于阿尼芬净组和化合物X组，表明化合物1比阿尼芬净和化合物X具有更好的体内抗真菌活性。

实施例10化合物ANM的溶解性测试

在各种不同pH条件下测定化合物ANM和阿尼芬净的溶解性，以评价该化合物在含水载体中的经注射给药(如静脉内或肌内注射)的制剂的适应性。实验结果发现化合物ANM与阿尼芬净相比，在较大pH范围内(pH 1～8)均具有更优的溶解性。

Claims (7)

1.一种式1化合物：

或其药学上可接受的盐。

2.一种药用组合物，其特征在于，包含权利要求1所述化合物，或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的赋形剂。

3.根据权利要求2所述药用组合物，其特征在于，包含权利要求1所述化合物的乙酸盐或盐酸盐。

4.根据权利要求2所述药用组合物，其特征在于，所述药用组合物经静脉内给予。

5.一种权利要求2所述药用组合物在制备治疗哺乳动物真菌感染的药物中的用途。

6.根据权利要求5所述用途，其特征在于，所述真菌感染选自头皮癣、体癣、脚癣、甲癣、甲周癣、变色性皮癣、全身性念珠菌病、粘膜与皮肤念珠菌病、曲霉病、毛霉病、副球孢子菌病、北美芽生菌病、组织胞浆菌病、球孢子菌病、真菌性鼻窦炎或慢性副鼻炎。

7.一种化合物ANM的无定型，其具有基本如图3所示的X-射线粉末衍射谱图，

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