CN106674195A - 一种苯并吲哚衍生物双光子荧光探针及其制备方法和用途 - Google Patents

一种苯并吲哚衍生物双光子荧光探针及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种苯并吲哚衍生物双光子荧光探针及其制备方法和用途，其中苯并吲哚衍生物双光子荧光探针的结构式如下：本发明以具有较高的反应活性和良好的生物相容性的苯并吲哚基团作为主体，与4‑吡啶甲醛反应，简洁高效地制备了具有π共轭体系的吲哚类衍生物L，并对其进行识别阴离子活性筛选，结果表明L具有单一识别HSO3 ‑的性质，且识别前后单双光子荧光有明显的变化，细胞实验表明，L作为双光子荧光探针可以穿透细胞膜，实现对细胞质外源性HSO3 ‑的检测。

Description

一种苯并吲哚衍生物双光子荧光探针及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及一种双光子荧光探针，具体地说是一种苯并吲哚衍生物双光子荧光探针及其制备方法和用途。
背景技术
随着双光子技术的发展，双光子荧光材料在生物学应用中优势引起了人们更多的关注。首先，具有生物特异性的双光子荧光材料在使用过程中，激发光源位于近红外区/红外区，具有更强的穿透能力；其次，在双光子荧光材料的激发范围内，有效的避免了生物体自发荧光对材料本身发光性质的干扰；第三，双光子荧光材料在激发时只有焦点附近的分子被激发，能够明显的减小激光对分子的损伤，降低光漂白。因此，低成本设计制备具有强双光子荧光探针具有重要的科学意义和实用价值。
HSO3 -作为常见的食品药品添加剂，有防腐抑菌等重要作用，但这仅限于合适的浓度，过量使用HSO3 -会引起哮喘、过敏、呼吸困难、荨麻疹和肠胃不适等。因此，识别和检测生物体内HSO3 -得到了科研工作者的关注。研究者们已经报道许多简便的检测分析技术，例如紫外分光光度法，色谱法和电化学法。然而，这些检测方法都存在复杂的样品预处理、耗时、复杂的操作工序等缺点。此外，这些方法的检测灵敏度低，即不能检测低浓度的HSO3 -。在HSO3 -的识别过程中，双光子荧光探针分子具有合成简易，高灵敏度，易于监测等优点，同时这类荧光探针利用近红外(NIR)波长的光作为激发源，为实时监测提供了更高的空间分辨率，更长的观测时间以及更深的组织穿透能力。
申请人对本申请的主题进行了如下的文献检索：
1、www.baidu.com网检索结果：(2016/19/12)
2、中国期刊网检索结果：
检索方式一：
篇名-具有HSO3 -识别功能的分子探针无相关文献。
篇名-吲哚化合物双光子光学材料无相关文献。
检索方式二：
全文-具有HSO3 -识别功能的分子探针无相关文献。
全文-吲哚化合物双光子光学材料无相关文献。
发明内容
本发明旨在提供一种苯并吲哚衍生物双光子荧光探针及其制备方法和用途，所要解决的技术问题是通过分子设计得到选择性好、灵敏度高的识别HSO3 -的吲哚衍生物，并可通过单双光子荧光检测识别。
本发明苯并吲哚衍生物双光子荧光探针，简称L，结构式如下：
本发明苯并吲哚衍生物双光子荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
1、中间体OT的合成
向50mL圆底烧瓶中加入2,3,3-三甲基苯并吲哚3.51g(10mmol)，室温下加入碘甲烷2.8g(20mmol)，混合均匀后于室温下搅拌反应24h，反应结束后有白色沉淀生成(若沉淀中含有少量杂质，则可用适量乙醇洗涤)，抽滤得白色固体3.3g即为中间体OT，产率94％。
2、目标产物L的合成
向100mL三口烧瓶中依次加入3.51g(10mmol)中间体OT、1.1g(10mmol)4-吡啶甲醛及30mL乙醇，搅拌下加入2滴催化剂六氢吡啶，然后升温至60℃反应6h，反应结束后溶液变为紫红色，有红色固体析出，抽滤得3.8g红色固体即为目标产物L，产率86％。
本发明制备路线如下：
本发明苯并吲哚衍生物双光子荧光探针的用途，可在定性检测生物体内HSO3 -时作为检测试剂应用。
本发明设计制备的吲哚衍生物的双光子荧光探针，是基于吡啶具有良好的平面结构，苯并吲哚与吡啶共轭桥联，使得探针分子具有较大的共轭体系，有利于分子内电荷转移(ICT)，产生强的光学效应；在吲哚衍生物中引入碘甲烷使其成盐，以增强分子的水溶性，便于生物学方面的应用。HSO3 -加入后，进攻共轭双键，破坏了探针原有的共轭结构，使得电荷重新分布，ICT效应消失，从而引起荧光光谱的变化。该类探针在温和的测试条件下表现出高选择性、高灵敏度、取样量少、可实时检测等优点。
本发明以具有较高的反应活性和良好的生物相容性的苯并吲哚基团作为主体，与4-吡啶甲醛反应，简洁高效地制备了具有π共轭体系的吲哚类衍生物L，并对其进行识别阴离子活性筛选，结果表明L具有单一识别HSO3 -的性质，且识别前后单双光子荧光有明显的变化，细胞实验表明，L作为双光子荧光探针可以穿透细胞膜，实现对细胞质外源性HSO3 -的检测。
与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：
1、L末端的吲哚和吡啶基团，选择性好、灵敏度高，可以通过单光子荧光对HSO3 -实现单一性定量识别，检测限达到168nmol/L；在乙腈：PBS＝1：1(v/v)溶液中加入HSO3 -后，L在570nm所表现出的特征发射峰逐渐降低，在470nm处有一个新峰的形成，单光子荧光发射峰强度增强(图2)。识别后出现的新峰与化合物的特征峰之间的差值是100nm，其他阴离子均没有以上现象(图3)。
2、L可以通过双光子荧光对HSO3 -实现单一性识别；
当激光波长从680-920nm范围内变化时，L的双光子荧光最大发射峰位于620nm处，在乙腈：PBS＝1：1溶液中加入HSO3 -后，同单光子荧光发射相比，双光子荧光发射峰发生了明显的红移，荧光强度降低。在840nm作为激发波长时，L的最大有效双光子吸收截面是13GM，识别后有效双光子吸收截面是2GM(图4)。
3、L具有吲哚盐型小分子结构，在水中的溶解度大，有利于在生物体内的HSO3 -检测方面的应用；
4、本发明L与HSO3 -结合后具有很好的细胞通透性，以840nm为激发波长时，当加入HSO3 -后，观察到被L着色的细胞质的双光子荧光出现明显淬灭现象(图4)，这一研究结果的发现，对于生命科学研究方向具有重大的意义；
5、本发明L的制备是以苯并吲哚作原料，原料易得，成本低，合成步骤简单，产率高达86％。
附图说明
图1是本发明目标产物L的电喷雾质谱，说明目标分子L被合成。
图2是本发明目标产物L在乙腈/PBS溶液中对HSO3 -响应的单光子荧光光谱，从图中可以看出通过单光子荧光光谱可以实现L对HSO3 -的单一识别。
图3是本发明目标产物L在乙腈/PBS溶液中对混合阴离子识别前后的对比图，从图中可以看出在混合阴离子体系，L对HSO3 -的识别效果并未受到影响。
图4是本发明目标产物L在乙腈/PBS溶液中对HSO3 -识别前后的双光子吸收截面图谱，插图为L在乙腈/PBS溶液中对HSO3 -识别前后的双光子荧光图，从图中可以看出通过双光子荧光和双光子吸收截面的变化同样可以实现L对HSO3 -的单一识别。
图5是本发明目标产物L加入HSO3 -前后的双光子荧光肝癌细胞成像研究结果，其中A、F是在使用405nm作为激发波长，450-490nm作为发射波长时的单光子显影图，B、G是在使用405nm作为激发波长，560-600nm作为发射波长时的单光子显影图，C、H是在使用820nm作为激发波长，610-650nm作为发射波长时的双光子显影图，D、I是明场图，E、J是L的比率显影图，所有图均运用Image J软件获得。从图5中可以看出L做为双光子荧光探针可以穿透细胞膜，实现对细胞质外源性HSO3 -的检测。
具体实施方式
本实施例中苯并吲哚衍生物双光子荧光探针的制备方法如下：
1、中间体OT的合成
向50mL圆底烧瓶中加入2,3,3-三甲基苯并吲哚3.51g(10mmol)，室温下加入碘甲烷2.8g(20mmol)，混合均匀后于室温下搅拌反应24h，反应结束后有白色沉淀生成(若沉淀中含有少量杂质，则可用适量乙醇洗涤)，抽滤得白色固体3.3g即为中间体OT，产率94％。
2、目标产物L的合成
向100mL三口烧瓶中依次加入3.51g(10mmol)中间体OT、1.1g(10mmol)4-吡啶甲醛及30mL乙醇，搅拌下加入2滴催化剂六氢吡啶，然后升温至60℃反应6h，反应结束后溶液变为紫红色，有红色固体析出，抽滤得3.8g红色固体即为目标产物L，产率86％。
熔点:215-217℃。1H NMR(400MHz,d6-DMSO),δ:8.84(d,J＝5.9Hz,2H),8.46(dd,J＝16.8,12.6Hz,2H),8.35(d,J＝9.0Hz,1H),8.26(d,J＝8.1Hz,1H),8.18(d,J＝9.0Hz,1H),8.13(d,J＝6.0Hz,1H),7.96(d,J＝16.7Hz,1H),7.85(dd,J＝11.3,4.1Hz,1H),7.78(t,J＝7.5Hz,1H),4.40-4.37(s,3H),2.03(s,6H).13C NMR(100MHz,d6-DMSO),δ:173.1,149.7,144.5,137.9,133.8,133.5,132.6,128.6,125.8,125.6,124.2,120.7,52.9,32.6,27.7.ESI-MS:313.17.FT-IR(KBr):3414,2996,1616,1595,1550,1465,1417,1386,1350,11319,1236,1213,975,806,763,669,524.Anal.Calcd.for C22H21N2I:C,60.01；H,4.81；N,6.36.Found:C,59.98；H,4.79；N,6.38.
3、细胞培养及染色：采用人体肝癌HepG2细胞、DMEM培养基培养24-36小时。染色前用PBS洗涤三次以除去培养基。在培养小皿中加入200μL的PBS后加入20μL的L无水DMSO溶液(1×10-3mol/L)。避光孵育15分钟后，用移液枪吸出溶液。PBS溶液洗涤三次后进行双光子荧光显微与成像。

Claims (3)

1.一种苯并吲哚衍生物双光子荧光探针，其特征在于其结构式如下：
2.一种权利要求1所述的苯并吲哚衍生物双光子荧光探针的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)中间体OT的合成
向50mL圆底烧瓶中加入2,3,3-三甲基苯并吲哚10mmol，室温下加入碘甲烷20mmol，混合均匀后于室温下搅拌反应24h，反应结束后有白色沉淀生成，抽滤得白色固体即为中间体OT；
(2)目标产物L的合成
向100mL三口烧瓶中依次加入10mmol中间体OT、10mmol 4-吡啶甲醛及30mL乙醇，搅拌下加入2滴催化剂六氢吡啶，然后升温至60℃反应6h，反应结束后溶液变为紫红色，有红色固体析出，抽滤得红色固体即为目标产物L。
3.一种权利要求1所述的苯并吲哚衍生物双光子荧光探针的用途，其特征在于：本发明苯并吲哚衍生物在定性检测生物体内HSO3 -时作为检测试剂应用。
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