CN106667906A - 一种黄连碱注射液及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种黄连碱注射液及其制备方法和应用，所述黄连碱注射液的原料包括增溶剂、稳定剂、等渗调节剂；所述增溶剂采用HP‑β‑CD。本发明的提供一种黄连碱注射液，能够提高疗效且降低不良反应，运用羟丙基‑β‑环糊精（HP‑β‑CD）作为包合材料，以增加难溶性药物黄连碱的溶解度。本发明中还提供所述的黄连碱注射液在抗肺癌中的应用。

Description

一种黄连碱注射液及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域，主要涉及一种黄连碱注射液及其制备方法和应用。

背景技术

黄连碱是一类从中草药黄连、延胡索等植物中提取分离的季胺型异喹啉类生物碱，具有选择性抑制血管平滑肌细胞增殖、抗病毒和抗肿瘤等多种生物学功能。虽然近年来人们对黄连碱的药理作用尤其抗肿瘤活性进行了广泛研究，例如对乳腺癌、肝癌、骨肉瘤等均有显著抑制作用，但有关黄连碱对肺癌的影响尚未见报道。另外，由于黄连碱药物本身极略微溶于水，其给药方式受限、体内吸收且真正发挥作用的较少，便大大阻碍了其原本应有的较为广阔的应用前景，因此设计一种黄连碱的注射剂型应用于皮下注射、静脉注射、腹腔注射显得尤为重要。

因此，现有技术还有待于改进和发展。

发明内容

鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种黄连碱注射液及其制备方法和应用，旨在提供一种能够提高疗效且降低不良反应黄连碱注射液，可用于皮下注射、静脉注射、腹腔注射等，解决黄连碱因水溶性问题导致给药方式受限、体内吸收且真正发挥作用的较少的问题。

本发明的技术方案如下：

一种黄连碱注射液，其中，所述黄连碱注射液的原料包括增溶剂、稳定剂、等渗调节剂；所述增溶剂采用HP-β-CD。

所述的黄连碱注射液，其中，所述HP-β-CD与黄连碱的摩尔比为1：1。

所述的黄连碱注射液，其中，所述稳定剂采用烟酰胺，所述烟酰胺的浓度为1.25~2.5%。

所述的黄连碱注射液，其中，所述等渗调节剂采用葡萄糖，葡萄糖的浓度为5%。

所述的黄连碱注射液，其中，所述黄连碱注射液的原料还包括pH调节剂，用于调节pH值至4~6。

所述的黄连碱注射液，其中，每1000mL所述黄连碱注射液可以包括以下组分：

黄连碱 5~8g；

HP-β-CD 30~35g；

稳定剂 12.5~25g；

等渗调节剂 50g；

注射用水 加至1000mL。

所述的黄连碱注射液，其中，每1000mL所述黄连碱注射液可以包括以下组分：

黄连碱 6.5g；

HP-β-CD 31.3g；

稳定剂 12.5g；

等渗调节剂 50g；

注射用水 加至1000mL。

一种如上所述的黄连碱注射液的制备方法，其中，包括以下步骤：

在50℃条件下，将HP-β-CD溶解于注射用水中，加入黄连碱、稳定剂、等渗调节剂；再通过pH调节剂调节pH值至4~6。

所述的黄连碱注射液的制备方法，其中，包括以下步骤：

将HP-β-CD加入到处方量80%的注射用水中，放于水浴上加热至50℃，待其溶解；再将黄连碱缓慢加入到HP-β-CD水溶液中，充分搅拌；再加入稳定剂和等渗调节剂，继续于50℃环境下搅拌；加入剩余20%处方量的注射用水，完全溶解后冷却至室温，用1mol/L的盐酸调节pH至4~6，调整体积至1000mL，过滤、灌封，灭菌。

一种如上所述的黄连碱注射液的应用，其中，将所述黄连碱注射液用作抗肺癌药物。

有益效果：本发明提供一种黄连碱注射液，能够提高疗效且降低不良反应，运用羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）作为包合材料，以增加难溶性药物黄连碱的溶解度，使黄连碱的溶解度得到100%。而且，HP-β-CD的使用能够提高药物生物利用度，降低药物刺激性及毒副作用，掩盖药物不良气味等。本发明中还提供所述的黄连碱注射液在抗肺癌中的应用。

附图说明

图1为本发明中黄连碱原料药、PM、包合物三者之间的溶出曲线示意图。

图2为本发明中黄连碱与HP-β-CD的相溶解曲线示意图。

图3A为本发明中黄连碱对照品的HPLC色谱图。

图3 B为黄连碱完全配方注射液于第一天的HPLC色谱图。

图3 C为黄连碱完全配方注射液于第50天的HPLC色谱图。

图4为实施例1中不同浓度黄连碱对人肺癌A549细胞存活情况的影响。

图5为实施例1100μM黄连碱在不同作用时间对A549细胞存活情况的影响。

图6为实施例2中不同浓度黄连碱对人肺癌A549细胞凋亡情况的影响。

图7为实施例2中100μM黄连碱在不同作用时间对A549细胞凋亡情况的影响。

图8为实施例2中不同浓度黄连碱对凋亡相关蛋白C-PARP、C-Caspase-3表达的影响。

图9为实施例3中不同浓度黄连碱对人肺癌A549细胞、人正常胚肺细胞WI38以及人正常肝细胞LO2细胞的存活率比较图。

图10为实施例4中用本发明药物注射液作用于肺癌细胞A549裸鼠移植模型的体重比较图。

图11为实施例4中给药（生理盐水组、黄连碱注射液组）5周过程中肿瘤体积大小变化图。

图12为实施例4中给药（生理盐水组、黄连碱注射液组）5周后肿瘤实物比较图。

具体实施方式

本发明提供一种黄连碱注射液及其制备方法和应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中提供一种黄连碱的注射剂型，并将其应用于肺癌细胞，通过阻止肺癌细胞增殖及促进肺癌细胞凋亡，最终达到杀灭肺癌细胞的目的。本发明方案中运用羟丙基-β-环糊精（HP-β-CD）作为包合材料，以增加难溶性药物黄连碱的溶解度。HP-β-CD是β-环糊精（β-CD）的衍生物，相比较β-CD而言，HP-β-CD具有更高的水溶性、安全性和更低的肾毒性，且HP-β-CD有较大的空穴结构，可使其依据范德华力将疏水性药物容纳在内，从而形成分子囊，大大增加难溶性药物的溶解度。另外HP-β-CD的使用能够提高药物生物利用度，降低药物刺激性及毒副作用，掩盖药物不良气味等。故本发明的第一目是，提供一种能够提高疗效且降低不良反应的黄连碱注射溶液，第二目的是提供该黄连碱注射液在有效抗肺癌中的应用。本发明中运用HP-β-CD作为包合材料制备黄连碱-HP-β-CD包合物，以提高其溶解度。其中，黄连碱结构式如式1所示。

式1

具体地，所述黄连碱注射液由主药和辅料组合制成，主药是黄连碱，辅料包括增溶剂、稳定剂、等渗调节剂。所述增溶剂采用HP-β-CD，所述稳定剂采用烟酰胺，所述等渗调节剂采用葡萄糖。进一步地，所述黄连碱注射液，包括黄连碱、HP-β-CD、烟酰胺和葡萄糖；所述HP-β-CD与黄连碱的摩尔比为1：1，所述烟酰胺的浓度为1.25~2.5%，葡萄糖的浓度为5%。

对HP-β-CD作为增溶剂的选择原因请参见上文所述。另外，本发明中采用HP-β-CD与黄连碱按摩尔比值为1:1情况下进行包合，因此种比例下的包合率及溶解度均较高。

本发明所选择的烟酰胺是一种水溶性维生素，对组织无刺激性、过敏性，被公认为是安全的药物助溶剂或稳定剂，浓度在1.25~2.5%为宜，烟酰胺能够显著提高黄连碱注射液的稳定性；本注射剂中5%的葡萄糖溶液与血浆具有相同渗透压，为等渗溶液。

具体地，每1000mL所述黄连碱注射液可以包括以下组分：

黄连碱 5~8g；

HP-β-CD 30~35g；

烟酰胺 12.5~25g；

葡萄糖 50g；

注射用水 加至1000mL。

其中，黄连碱的剂量是基于药典及其他季胺型异喹啉类生物碱注射液的可用临床剂量进而进行的估算剂量。

本发明中还提供较优选的实施例方案，每1000mL所述黄连碱注射液可以包括以下组分：

黄连碱 6.5g；

HP-β-CD 31.3g；

烟酰胺 12.5g；

葡萄糖 50g；

注射用水 加至1000mL。

本发明中还提供所述黄连碱注射液的制备方法，是在50℃条件下，将HP-β-CD溶解于注射用水中，后加入黄连碱、烟酰胺、葡萄糖；再通过pH调节剂调节pH值至4~6。具体地，包括以下步骤：

在配置容器中，将HP-β-CD加入到处方量80%的注射用水中，放于水浴上加热至50℃，待其溶解；再将黄连碱缓慢加入到HP-β-CD水溶液中，充分搅拌；再加入烟酰胺和葡萄糖，继续于50℃环境下搅拌；加入剩余20%处方量的注射用水，完全溶解后冷却至室温，用1mol/L的盐酸调节pH至4~6，调整体积至1000mL，过滤、灌封，100℃流通蒸汽灭菌15min即得。

关于50℃的选择，是在发明人结合并对比30℃、40℃、50℃、60℃情况下HP-β-CD对黄连碱的包合率、以及相应溶解度值情况下进行的最优选择。

以下通过相关检测数据用于证明该黄连碱注射液中黄连碱与HP-β-CD是否形成包合、以及包合情况怎样，现有技术中有多重检测方法，例如热分析法、圆二色谱法、溶出速度法、紫外分光光度法、红外光谱法等，在本发明中，选择了溶出速度法和紫外分光光度法进行检测。

(1)溶出度考察：精密称取黄连碱原料药、黄连碱与HP-β-CD的物理混合物(简称为PM)及黄连碱-HP-β-CD包合物，按照溶出度测定法第二法(中国药典，二部)，以1000mL水为溶出介质，依法操作。分别在5、10、20、40、60min时取样，每次5mL(需即时补充溶出介质5mL)，过滤、定容、摇匀。以水为空白，在350nm波长处测定吸光度，根据回归方程计算黄连碱含量和累积溶出度，溶出曲线如图1所示。从图1可以看出，采用本发明方法制备得到的黄连碱-HP-β-CD包合物（将HP-β-CD加入到处方量80%的注射用水中，放于水浴上加热至50℃，待其溶解；再将黄连碱缓慢加入到HP-β-CD水溶液中，HP-β-CD与黄连碱按摩尔比值为1:1，充分搅拌），其溶出度最好。

(2)紫外分光光度法考察包合率：黄连碱包合率的测定采用紫外分光光度法，称取包合物质量的1/10和20mL水置于烧瓶中，分别于30、40、50、60℃下搅拌包合1h，抽滤，进行紫外分光光度法检测。

包合率/%=包合物中黄连碱的含量/原料黄连碱的质量×100%

从表1的数据可以看出，在50℃下HP-β-CD对黄连碱的包合率最佳，可达到88%。

表1

编号	包合温度/℃	包合时间/h	包合物中黄连碱含量/mg	包合率/%
					1	30	1h	25.04	69.23
2	40	1h	28.95	80.04
					3	50	1h	32.06	88.64
4	60	1h	21.02	58.12

相溶解度实验证实黄连碱与HP-β-CD的包合物能够显著增加黄连碱本身的溶解性，且随着HP-β-CD浓度的增加，黄连碱溶解增加：

称取适量HP-β-CD按照0,2,4,6,8,10,12mmol/L配制不同浓度溶液，加入过量黄连碱于上述溶液中，置25℃恒温水浴振荡24h后使溶解达到平衡，经0.45μm微孔滤膜滤过后，稀释至一定浓度，在λmax350nm波长下测吸光度，计算黄连碱含量。以HP-β-CD浓度为横坐标，黄连碱为纵坐标绘制相溶解度图（如图2所示）。由于黄连碱溶解度随HP-β-CD浓度的增加而呈线性增加，线性回归方程为y=1.0393x-0.1929，R2=0.9906，根据相溶解曲线的不同可以分为多种不同的包合类型，本发明中相溶解度曲线为典型的AL型，说明二者可形成1:1的包合物从而增加黄连碱溶解度。

稳定性实验：

取本发明中的黄连碱完全配方注射液（较优选的实施例方案）适量于室温自然放置，分别在第1天和第50天HPLC法检测黄连碱含量的变化。运用Luna C18色谱柱（250mm×4.6mm，5μm），流动相为已腈-水（1:1,1000mL含磷酸二氢钾3.4g，十二烷基硫酸钠1.7g），流速1.0mL/min，检测波长为350nm，柱温为室温。检测结果如图3A~3C所示，图3A为黄连碱对照品的HPLC色谱图，图3B为黄连碱完全配方注射液于第一天的HPLC色谱图，图3C图为黄连碱完全配方注射液于第50天的HPLC色谱图，结果显示本发明的黄连碱注射液性质稳定。

本发明中还提供所述黄连碱注射液的应用，将所述黄连碱注射液用作抗肺癌的药物。该黄连碱注射液的应用是实现本发明第二发明目的。

以下通过具体实施例用于证明该黄连碱注射液能有效用于抗肺癌，具体包括以下几个部分：

① 培养非小细胞肺癌细胞A549，用CCK-8实验检测不同浓度黄连碱对A549细胞存活情况的影响，流式细胞术检测黄连碱对肺癌细胞凋亡情况的影响。

②培养人肺癌细胞A549、PC9细胞，人正常胚肺细胞WI38以及正常肝细胞LO2细胞，用CCK-8实验检测不同浓度黄连碱对A549细胞存活情况的影响。

③ 建立裸鼠移植瘤模型，通过腹腔注射给予黄连碱注射液，按照每只裸鼠50mg/kg/day的剂量给药。6周后测量肿瘤体积。

实施例1：黄连碱可抑制肿瘤细胞的生长

1．细胞培养

人肺癌A549细胞培养在DMEM＋10％胎牛血清（FBS）完全培养基中进行。细胞培养在温度37℃、5％浓度的CO₂及饱和湿度的细胞培养箱中。

2．实验方法及结果

将A549肿瘤细胞系状态稳定后，将细胞铺于96孔板中，每孔5000个细胞，每孔含完全培养基90μL。人肺癌A549细胞按以下方式分组并处理：

（1）对照组：完全培养基溶液10μL处理；

（2）黄连碱组：用DMSO溶解配制成不同的浓度，每孔中加10μL，使培养基的终浓度为100、50、25、12.5、0μM（μmol/L）的黄连碱溶液，处理不同时间（0、6、9、12、24h）后，每孔中加入10μL Cell Counting Kit-8（CCK-8）试剂继续放于37℃孵箱培养2小时。振荡器上溶解10分钟后，用酶标仪在A450处检测吸光度值，细胞存活率根据以下公式计算：

细胞存活百分率＝（处理组吸光度－空白孔吸光度）÷（对照组吸光度－空白孔吸光度）×100%。

实验结果见图4、5。图4中，纵坐标表示细胞存活率，即处理组相对于对照组的细胞存活率。图4横坐标为不同浓度的黄连碱，图5横坐标为黄连碱50μM处理作用不同时间。从图4中可见，随着黄连碱药物浓度的增加，肺癌细胞的生存率降低；同时随着作用时间的增加，肺癌细胞的生存率也降低(图5)。表明黄连碱对肺癌A549细胞的作用成浓度和时间梯度依赖性。

实施例2：黄连碱可通过促进肿瘤细胞凋亡作用从而抑制肿瘤细胞存活

1.细胞培养（见实施例1的步骤1）

2．实验方法及结果

将A549肿瘤细胞系状态稳定后，将细胞铺于6孔板中，每孔100000个细胞，每孔含完全培养基2mL。按以下方式分组并处理：

（1）对照组：完全培养基溶液10μL处理；

（2）黄连碱组：用DMSO溶解配制成不同的浓度，每孔中加10μL，使培养基的终浓度为100、50、25、12.5、0μM（μmol/L）的黄连碱溶液，处理不同时间（0、6、9、12、24h）后，根据需要进行不同操作：采用流式细胞技术检测不同浓度及不同作用时间后细胞的凋亡情况，收集细胞、PBS漂洗、加入Annexin V-FITC及碘化丙啶避光孵育15min，流式细胞仪检测；同时采用蛋白免疫印迹技术检测不同浓度黄连碱作用后对细胞凋亡蛋白的影响，细胞刮收集细胞、裂解细胞、测蛋白浓度，将得到的已知蛋白浓度的样品进行电泳、转膜、封闭、一抗孵育、洗膜、二抗孵育、显影、定影拍照。

从图6、图7、图8我们可以清楚的观察到，随着黄连碱作用浓度和作用时间的增加，细胞的凋亡数量增加，凋亡蛋白C-PARP、C-Caspase-3的表达量也显著增加。这就从不同的手段进一步验证黄连碱可随浓度和时间依懒性增加凋亡蛋白的表达，促进细胞凋亡，从而降低肺癌细胞A549的生存率。

实施例3：黄连碱可选择性抑制肺癌细胞的生长，对正常肝细胞及肺细胞作用小

1.细胞培养

见实施例1的步骤1，还包括肝正常细胞LO2及人胚肺细胞WI38的培养。

2．实验方法及结果

待A549肿瘤细胞、LO2人正常肝细胞、WI38人胚肺细胞系状态稳定后，将细胞铺于6孔板中，每孔100000个细胞，每孔含完全培养基2mL。按以下方式分组并处理：

（1）对照组：完全培养基溶液10μL处理；

（2）黄连碱组：DMSO溶解，每孔中加10μL，使培养基的终浓度为100μM的黄连碱溶液，流式细胞处理技术检测细胞的凋亡，结果见图9。

图9结果可见，黄连碱能选择性的促进肿瘤细胞的凋亡，对正常肝细胞及胚肺细胞的影响较小，提示我们黄连碱的毒副作用小。

为证明这一验证结论是准确而可靠的，验证时同时还对样本进行了统计学的计算与分析。图中“**”表示p＜0.01，“*”表示p≤0.05。其中“p”为统计学上可接受错误的边界符号，其值为p≤0.05。在计算出p＜0.01的情况下，即可认定不同浓度组和不同时间组之间的差异出现错误概率小，同时说明了这一验证结果是准确而可靠的。

为了更进一步证明黄连碱对肺癌的作用，在细胞实验的基础上，通过裸鼠移植瘤模型实验证明黄连碱对肺癌的作用。

实施例4：黄连碱可抑制裸鼠移植瘤模型肿瘤的生长

在本实验过程中，通过向成功移植肿瘤的裸鼠腹腔注射我们本项目中第一项发明的黄连碱注射液，观察黄连碱对肿瘤的抑制作用。剂量换算根据首先是根据中国医科大学肿瘤研究所刘晓东等人《体外测试肿瘤化敏感性指标的研究》换算出细胞与人临床剂量的关系，得到100μM的体外黄连碱细胞作用浓度相当于黄连碱人临床剂量D=1.28mg/kg/day。

其后根据美国食品药品监督管理局（FDA）在《药物临床实验中健康成人受试对象安全给药剂量的估算》（《Estimating the Safe Starting Dose in Clinical Trials forTherapeutics in Adult Healthy Volunteers》）中给出的，达到相同生物学效应所需的人体与小鼠（即实验验证中的裸鼠）的注射剂量换算比（1∶12.3）。再依此换算比，对照实施例2中所记载的剂量来换算出实验用裸鼠的用药剂量，即D小鼠≈16mg/kg。

1．裸鼠的选择

取6～8 周龄无特异病原微生物（SPF）级裸鼠6只，体重范围为20±2g，在昼夜交替、室温（20～23）℃环境饲养，自由饮水、进食。

2．实验分组及给药剂量（共2组）

所有裸鼠随机分为两组后，每只右大腿外侧接种1×10⁷个用人肺癌A549细胞所制悬液0.2mL，待瘤体形成后开始按以下方式给药。

（1）对照组：与处理组体积相同的生理盐水腹腔注射，1次/日；

（2）黄连碱组：按裸鼠体重16mg/kg的剂量，腹腔注射黄连碱注射溶液，1次/日（配制1.6mg/ml黄连碱注射液，腹腔注射200μL/只/天）。

3．测量与记录

（1）每7天后测量、记录一次各组裸鼠的体重；

（2）每7天后用游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度、记录一次各组裸鼠肿瘤体部分的体积；肿瘤体积按照以下公式计算：

肿瘤体积（mm³）＝肿瘤长度（mm）×肿瘤宽度的平方（mm²）/2

体重记录结果如图10所示，纵坐标表示各组裸鼠的平均体重；横坐标表示测量时间点；各种线条节点表示各处理组；各点的数值为各组平均体重。由图10可见，黄连碱组裸鼠体重与对照组比较未见显著差异。表明黄连碱对裸鼠的毒性小，不会影响裸鼠的正常生长，这与前面细胞实验的结果一致。

肿瘤体积记录结果如图11所示，纵坐标表示各组裸鼠的肿瘤体积；横坐标表示测量时间点；各种线条节点表示各处理组；各点的数值为各组肿瘤体积的平均值。图11中的“**”同样表示p＜0.01，同样可以认定使用黄连碱组比对照组肿瘤体积减小出现错误的可能性小，这一验证结果也是准确而可靠。结果表明黄连碱可抑制肿瘤的生长。

图12为给药5周后对裸鼠进行安乐死并剥离肿瘤后的实物图。该图更为直观地展示了黄连碱注射液对裸鼠移植瘤的显著抑制情况，即黄连碱组与对照组相比，肿瘤体积均明显减小。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种黄连碱注射液，其特征在于，所述黄连碱注射液的原料包括增溶剂、稳定剂、等渗调节剂；所述增溶剂采用HP-β-CD。

2.根据权利要求1所述的黄连碱注射液，其特征在于，所述HP-β-CD与黄连碱的摩尔比为1：1。

3.根据权利要求1所述的黄连碱注射液，其特征在于，所述稳定剂采用烟酰胺，所述烟酰胺的浓度为1.25~2.5%。

4.根据权利要求1所述的黄连碱注射液，其特征在于，所述等渗调节剂采用葡萄糖，葡萄糖的浓度为5%。

5.根据权利要求1所述的黄连碱注射液，其特征在于，所述黄连碱注射液的原料还包括pH调节剂，用于调节pH值至4~6。

6.根据权利要求1~5任一所述的黄连碱注射液，其特征在于，每1000mL所述黄连碱注射液可以包括以下组分：

黄连碱 5~8g；

HP-β-CD 30~35g；

稳定剂 12.5~25g；

等渗调节剂 50g；

注射用水 加至1000mL。

7.根据权利要求6所述的黄连碱注射液，其特征在于，每1000mL所述黄连碱注射液可以包括以下组分：

黄连碱 6.5g；

HP-β-CD 31.3g；

稳定剂 12.5g；

等渗调节剂 50g；

注射用水 加至1000mL。

8.一种如权利要求1~7任一所述的黄连碱注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

在50℃条件下，将HP-β-CD溶解于注射用水中，加入黄连碱、稳定剂、等渗调节剂；再通过pH调节剂调节pH值至4~6。

9.根据权利要求8所述的黄连碱注射液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将HP-β-CD加入到处方量80%的注射用水中，放于水浴上加热至50℃，待其溶解；再将黄连碱缓慢加入到HP-β-CD水溶液中，充分搅拌；再加入稳定剂和等渗调节剂，继续于50℃环境下搅拌；加入剩余20%处方量的注射用水，完全溶解后冷却至室温，用1mol/L的盐酸调节pH至4~6，调整体积至1000ml，过滤、灌封，灭菌。

10.一种如权利要求1~7任一所述的黄连碱注射液的应用，其特征在于，将所述黄连碱注射液用作抗肺癌药物。