CN106659772A - 在疾病和紊乱的治疗中调节肾酶的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于结合和抑制肾酶的组合物和方法。在一个实施方式中，肾酶结合分子抑制肾酶活性。因此，在其中肾酶活性降低有益的疾病或病症中，这样的抑制性肾酶结合分子充当治疗剂。

Description

在疾病和紊乱的治疗中调节肾酶的组合物和方法
关于联邦资助的研究或研发的声明
本发明在由美国国立卫生研究院授予的批准号RC1DK086465、RC1DK086402、DK54021和R01DK081037下利用政府支持进行。政府享有本发明中的某些权利。
背景技术
肾酶(Renalase)(RNLS)是主要在肾脏、心脏、骨骼肌、睾丸和以较小程度在其它组织中产生的蛋白质(Xu等，2005J Clin Invest.115(5):1275-80和Wang等，2008Mol BiolRep.35(4):613-20)。已经描述了肾酶的两个同种型变体：肾酶-1和肾酶-2。由于最终外显子的差别剪接，这两种形式的肾酶不同。肾酶已经被描述为新型的含有黄素腺嘌呤二核苷酸的单胺氧化酶，其具有选择性地使儿茶酚胺类肾上腺素、去甲肾上腺素和多巴胺脱氨基的活性。已经描述了与健康个体相比在患有晚期肾脏疾病的患者的血浆中肾酶缺乏。通过对心输出量和血管阻力的作用，儿茶酚胺类在血压的保持和调节中——包括在疾病中——起着主要作用。将重组形式的肾酶输注入大鼠引起心肌收缩力、心率和血压的降低。患有肾衰竭的患者具有与高血压相关联的升高水平的循环儿茶酚胺类和通过心血管并发症的更高死亡率的特征。因此，蛋白质肾酶可以在控制和维持儿茶酚胺诱发的血压改变中起作用并且在肾脏疾病患者中观察到的肾酶缺乏对结果可能是有害的。
已经描述了与健康个体相比在患有晚期肾脏疾病的患者的血浆中肾酶缺乏。患有肾衰竭的患者具有与高血压相关联的升高水平的循环儿茶酚胺类和通过心血管并发症的更高死亡率的特征。因此，蛋白质肾酶可以在控制和维持儿茶酚胺诱发的血压改变中起作用并且在肾脏疾病患者中观察到的肾酶缺乏对结果可能是有害的。但是，关于肾酶在癌症中的作用知之甚少。
癌症的基本特征是细胞衰老和死亡的失调。肾酶(RNLS)是一种分泌型黄素蛋白，其通过发信号通过质膜钙腺苷三磷酸酶PMCA4b以激活PI3K/AKT和MAPK途径来防护缺血性和毒性细胞损伤。
皮肤癌是一种常见的人恶性肿瘤，并且其发病率在发达国家中正在增加(Gray-Schopfer等，2007Nature.445:851-7；Lowe等，2014Mayo Clinic Proceedings.89:52-9；Lesinski等，2013Future oncology.9:925-7)。黑素瘤是最致命形式的皮肤癌，一旦其变得不可切除将具有低存活率(Lowe等，2014Mayo Clinic Proceedings.89:52-9)。其是分子异质疾病并且已经鉴定参与疾病发展和进展的信号传导途径中的一些关键改变。Ras/Raf/MEK/ERK和PI3K/AKT信号传导途径在黑素瘤的发病机理中起着关键作用(Gray-Schopfer等，2007Nature.445:851-7；Lesinski等，2013Future oncology.9:925-7；Yajima等，2012Dermatology research and practice.2012:354191)。Ras、Raf、PI3K或PTEN(PI3K抑制剂)中的突变可以导致ERK和AKT的持续激活，其又促进细胞存活和增殖。Dankort等利用小鼠中BRafV600E的条件性黑素细胞特异性表达很好地证明了这一点，没有一只小鼠发展为黑素瘤，但是，当与Pten肿瘤抑制基因的沉默结合时揭示了100％外显率的黑素瘤发展(Dankort等，2009Nature genetics.41:544-52)。这些致病途径的阐明已经促进了靶向超活化激酶的特异性抑制剂的开发。虽然这些药剂已经证明了在患有转移性黑素瘤患者的选择组的治疗中是有效的，但是它们的有益作用常常是短暂的，因此对于额外的治疗靶点的鉴定是急需的。
RNLS表达在黑素瘤肿瘤中显著地增加，并且特别是在CD163+肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中显著地增加。在患有原发性黑素瘤的患者的人群(cohort)中，疾病特异性存活与肿瘤块中RNLS表达负相关，这暗示RNLS的致病作用。使用siRNA、抗RNLS抗体或RNLS衍生的抑制肽抑制RNLS信号传导显著地降低体外黑素瘤细胞存活。利用单克隆抗体的抗RNLS疗法明显地抑制异种移植小鼠模型中的黑素瘤肿瘤生长。利用m28-RNLS(也称为1D-28-4)的治疗引起CD163+TAM中内源RNLS表达以及总的和磷酸化的STAT3的显著降低。肿瘤细胞中增加的细胞凋亡与B细胞淋巴瘤2相关蛋白Bax的p38MAPK介导的激活时间相关。细胞周期抑制剂p21的表达增加并且细胞周期停滞被记录。这些结果表明通过CD163+TAM的增加的RNLS产生通过激活STAT3促进黑素瘤生长，并且RNLS信号传导的抑制在黑素瘤处理中具有潜在的治疗应用。
体液和组织中肾酶检测的改进方法可以帮助肾脏疾病、心血管疾病和/或癌症的诊断和预后。但是，肾酶作为相关生物标记的确认需要高选择性试剂进行其检测。基于抗体的技术被广泛地用于生物标记的检测。迄今为止，仅具有少量的针对肾酶培养的试剂抗体——不具有表征至具有最低表征。
胰腺癌是最致命的瘤之一，在全球引起大约330,000人死亡和在美国引起40,000人死亡(World Cancel Report 2014.WHO Press:2014)。胰腺癌难以检测，并且大多数病例在晚期被诊断(Nolen等，2014PLoS ONE.9(4):e94928)。虽然在该癌症的化疗应用中已经有了一些进展，但是该疾病对所有药物疗法保持非常大的抗性(Hidalgo等，2010New EnglandJournal of Medicine.362(17):1605-17)。患有胰腺癌的个体的总体5年存活率<5％(Hidalgo等，2010New England Journal of Medicine.362(17):1605-17)，并且需要额外的治疗靶点。
胰腺癌的发展依靠基因突变的逐步积累(Jones等，2008Science.321(5897):1801-6)，基因突变中的一些引起异常的MAPK、PI3K和JAK-STAT信号传导。从最低程度的发育异常的上皮到发育异常再到浸润性癌的进展反映了激活致癌基因(例如KRAS2)，或使肿瘤抑制基因(例如CDKN2a/INK4a、TP53和DPC4/SMaD4)失活的基因突变的逐步积累(Hidalgo等，2012Annals of Oncology.23(suppl 10):x135-x8)。95、90和75％的胰腺肿瘤分别携带KRAS2、CDKN2a和TP53中的突变。这些突变导致表征癌生长的持续的和失调的增殖。胰腺导管腺癌(PDAC)中的突变图谱(landscape)和核心信号传导途径已经通过综合遗传分析24例晚期PDAC限定(Jones等，2008Science.321(5897):1801-6)。这些数据表明大部分PDAC包含大量主要为点突变的遗传变化，并且其影响了大约12个细胞信号传导途径。
那项研究还鉴定了在PDAC中过表达的541种基因——在90％肿瘤中过表达至少10倍。这包括在肿瘤中或在肿瘤衍生的细胞系中最近表征的蛋白质肾酶(RNLS)的2到4倍增加。RNLS，一种具有NADH氧化酶活性(Farzaneh-Far等，2010PLoS One.5(10):e13496；Beaupre等，2015Biochemistry.54(3):795–806)的新型分泌型黄素蛋白(Xu等，2005J ClinInvest.115(5):1275-80；Desir等，2012J Am Heart Assoc.1(e002634；Desir等，2012J AmSoc Hypertens.6(6):417-26；Li等，2008Circulation.117(10):1277-82)，通过独立于其固有酶活性的受体介导的过程(Wang等，2014Journal of the American Society ofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)促进细胞和器官存活(Lee等，2013J Am SocNephrol.24(3):445-55)。RNLS迅速激活蛋白激酶B(AKT)、细胞外信号调节激酶(ERK)和促分裂原活化蛋白激酶(p38)。ERK或AKT的化学抑制废除了RNLS的保护作用(Wang等，2014Journal of the American Society of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。
因此，对于结合肾酶用于检测、诊断、预防和治疗包括肾脏疾病、心血管疾病和癌症在内的疾病或紊乱的改进方法和组合物比如抗体存在需要。本发明满足了该需要。
发明内容
本发明包括包含肾酶抑制剂的组合物，所述肾酶抑制剂可以是化合物、蛋白质、肽、肽模拟(peptidomemetic)、肾酶受体、肾酶受体片段、抗体、抗体片段、抗体模拟、核酶、小分子化合物、短发夹RNA、反义核酸分子、siRNA、miRNA、编码反义核酸分子的核酸、编码蛋白质的核酸序列。在一些实施方式中，肾酶抑制剂是肾酶结合分子。在一些实施方式中，肾酶结合分子是抗体或其结合部分。在一些实施方式中，肾酶结合分子以至少10-6M的亲和力特异性地结合至肾酶。在一些实施方式，肾酶结合分子特异性地结合选自SEQ ID NO:1-7的肽序列。在一些实施方式中，肾酶是人肾酶。在各个实施方式中，抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、免疫连接物、去岩藻糖基化抗体(defucosylated antibody)和双特异性抗体。在一些实施方式中，免疫连接物包括治疗性药剂或检测部分。在各个实施方式中，抗体可以是人源化抗体、嵌合抗体、全人抗体、抗体模拟。在一个实施方式中，抗体包括选自如下的至少一种：a)选自SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:19的重链CDR1序列；b)选自SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:20的重链CDR2序列；c)选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:21的重链CDR3序列；d)选自SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:22的轻链CDR1序列；e)选自SEQ ID NO:15和SEQID NO:23的轻链CDR2序列；f)选自SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24的轻链CDR3序列。在一些实施方式中，抗体特异性地结合包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，抗体包括选自如下的至少一种：a)选自SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:35的重链CDR1序列；b)选自SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:36的重链CDR2序列；c)选自SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:37的重链CDR3序列；d)选自SEQ ID NO:30和SEQ ID NO:38的轻链CDR1序列；e)选自SEQ IDNO:31和SEQ ID NO:39的轻链CDR2序列；f)选自SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40的轻链CDR3序列。在一些实施方式中，抗体特异性地结合包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，抗体包括选自如下的至少一种：a)重链CDR1序列SEQ ID NO:43；b)重链CDR2序列SEQ ID NO:44；c)重链CDR3序列SEQ ID NO:45；d)轻链CDR1序列SEQ ID NO:46；e)轻链CDR2序列SEQ ID NO:47；f)轻链CDR3序列SEQ ID NO:48。在一些实施方式中，抗体特异性地结合包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽。在一些实施方式中，抗体包括选自SEQ ID NO:9、17、25、33和41的重链序列。在一些实施方式中，抗体包括选自SEQ ID NO:10、18、26、34和42的轻链序列。在实施方式中，本发明是包含抗体的组合物，所述抗体结合至肾酶并与权利要求3所述的抗体与肾酶的结合竞争。
在另一个实施方式中，本发明是治疗或预防对象中与肾酶相关联的疾病或紊乱的方法，其包括给对象施用至少一种肾酶抑制剂的步骤。在一些实施方式中，肾酶抑制剂与第二治疗性药剂组合施用至对象。在一些实施方式中，与肾酶相关联的疾病或紊乱选自肾脏疾病、心血管疾病、癌症和其任意组合。在一些实施方式中，当疾病或紊乱是癌症时，癌症是胰腺癌或黑素瘤。
在另一个实施方式中，本发明是编码肾酶结合分子——比如但不限于抗体——的分离的核酸分子。在另一个实施方式中，本发明是包含编码肾酶结合分子——比如但不限于抗体——的核酸分子的表达载体。在另一个实施方式中，本发明是包含编码肾酶结合分子——比如但不限于抗体——的核酸分子的宿主细胞。
在另一个实施方式中，本发明是诊断有需要的对象中的疾病或紊乱的方法，该方法包括如下步骤：测定对象的生物学样本中肾酶的水平，将对象的生物学样本中肾酶的水平与比较物对照进行比较，并且当与比较物对照的肾酶的水平比较时对象的生物学样本中肾酶的水平升高时，诊断对象患有疾病或紊乱。在一个实施方式中，该方法包括给诊断为患有疾病或紊乱的对象施用治疗的额外步骤。在一个实施方式中，生物学样本中肾酶的水平通过测量生物学样本中肾酶mRNA的水平来测定。在一个实施方式中，生物学样本中肾酶的水平通过测量生物学样本中肾酶多肽的水平来测定。在一个实施方式中，生物学样本中肾酶多肽的水平使用肾酶结合分子测定。在一个实施方式中，生物学样本中肾酶的水平通过测量生物学样本中肾酶多肽的活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)来测定。在一个实施方式中，当与比较物对照比较时肾酶的水平增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％时，生物学样本中肾酶的水平被确定为升高。在各个实施方式中，比较物对照是选自如下的至少一种：阳性对照、阴性对照、历史对照、历史标准或生物学样本中参考分子的水平。在一个实施方式中，疾病或紊乱为选自肾脏疾病、心血管疾病、癌症和其任意组合中的至少一种。在一个实施方式中，当疾病或紊乱是癌症时，该癌症是胰腺癌或黑素瘤。在一个实施方式中，对象是人。
附图描述
当结合附图阅读时，前述发明内容以及本发明的优选实施方式的下面的详细描述将被更好地理解。出于说明本发明的目的，附图中示出了当前优选的实施方式。但是，应当理解，本发明不限于附图中示出的实施方式的精确布置和手段。
图1，包括图1A和1B，是显示肾酶依赖性细胞信号传导的时间过程的一系列图像。图1A显示了利用肾酶培育的人胚肾细胞(HK-2)以及通过蛋白质印迹分析测定的蛋白激酶B(AKT)和细胞外信号调节激酶(ERK)的激活；示出了有代表性的印迹(n＝3)；信号标准化为甘油醛-3-磷酸脱氢酶加样对照(n＝3)；对于ERK和AKT(T308)在1到60分钟时以及对于AKT(S473)仅在30分钟时，超过基线的改变是统计学上显著的。图1B示出了肾酶上调HK-2细胞和人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的抗细胞凋亡分子Bcl-2。
图2是显示肾酶同种型Ren1–7的图像：从1到10编号的外显子；RP-224，Ren1或Ren2的肾酶肽氨基酸224 233；RP-220，氨基酸220–239；RP-H220，组氨酸标记的RP-220；RP-Scr220，乱序的(scrambled)RP-220。
图3是显示ERK或AKT抑制废除肾酶肽的保护作用的图：WT小鼠经历假手术(shamsurgery)或30分钟的肾缺血和再灌注；RP-H220或媒介(盐水)在肾缺血前10分钟注射。ERK抑制剂PD98059或PI3K/AKT抑制剂渥曼青霉素废除RP-H220的保护作用。
图4是显示表1中肽的序列比对的图像，并且其中这些肽对应于肾酶-1或2序列。
图5，包括图5A到5J，是显示结合至肾酶的抗体的序列的一系列图像；对互补决定区(CDR)加下划线。图5A和5B分别显示了1D‐28‐4重链和轻链编码序列的序列。图5C和5D分别显示了1D‐37-10重链和轻链编码序列的序列。图5E和5F分别显示了1F‐26‐1重链和轻链编码序列的序列。图5G和5H分别显示了1F‐42‐7重链和轻链编码序列的序列。图5I和5J分别显示了3A-5-2重链和轻链编码序列的序列。
图6是显示癌细胞系中肾酶表达的图：表达通过定量PCR测定并标准化为肌动蛋白。
图7是显示黑素细胞中肾酶表达的图像：与正常皮肤相比，痣和黑素瘤中的肾酶表达显著增加。
图8是显示抗肾酶单克隆抑制培养中A375.S2黑素瘤细胞的图并显示了与替莫唑胺(temozolamide)的协同作用：在处理后72小时，细胞活力通过WST-1方法测量；RenAb-10：肾酶单克隆，10μ/ml；TMZ：替莫唑胺，100或150μg/ml。
图9是显示抗肾酶单克隆抑制培养中A375.S2黑素瘤细胞的图并显示了与达卡巴嗪的协同作用：在处理后72小时，细胞活力通过WST-1方法测量；RNLSMono：肾酶单克隆。
图10是显示抗肾酶单克隆抑制培养中Sk-Mel-28黑素瘤细胞的图并显示了与替莫唑胺的协同作用：在处理后72小时，细胞活力通过WST-1方法测量；RenAb-10：肾酶单克隆，10μ/ml；TMZ：替莫唑胺，100μg/ml。
图11是显示抗肾酶单克隆抑制培养中白血病细胞系的图：在培养中利用抗肾酶单克隆抗体处理CCL-119细胞24小时；细胞存活通过WST-1方法测量(n＝3，*P，0.05)。
图12是显示抗肾酶单克隆抑制胰腺癌细胞系MiaPac的图。
图13是显示抗肾酶单克隆抑制胰腺癌细胞系Panc1的图。
图14是比较具有和不具有肾酶单克隆的培养中的黑素瘤细胞的显微照片。肾酶抗体显著地降低活细胞的数目。
图15是证明肾酶单克隆抗体1C-22-1和1D-37-10抑制培养中黑素瘤细胞的图。
图16是显示患有黑素瘤的表达高肾酶水平的患者中增加的死亡率的一系列图：在来自患有黑素瘤的263个患者的活检试样中通过AQUA测量肾酶表达；使用针对S-100和gp100的抗体获得肿瘤掩蔽(tumor mask)；在x轴上以月随访时间；％累积存活在Y轴上显示。
图17，包括图17A到17D，是显示黑素瘤中RNLS过表达和与差的患者结果相关联的一系列图像和图。图17A是显示使用抗RNLS-m28对正常人皮肤(n＝15)、良性痣(n＝295)和恶性黑素瘤(n＝264)的组织微阵列免疫荧光染色检测到的RNLS表达的图像；对于每一种显示代表性的结果，蓝色：细胞核，绿色：黑素细胞，和红色：RNLS。图17B是描绘使用AQUAnalysisTM软件——Yale TMA——定量的荧光强度的图：正常人皮肤(n＝15)、良性痣(n＝295)和恶性黑素瘤(n＝264)。图17C是显示使用AQUAnalysisTM软件——US BiomaxTMA——定量的荧光强度的图：正常人皮肤(n＝14)、良性痣(n＝14)、原发性黑素瘤(n＝35)和转移性黑素瘤(n＝11)，*表示p＝0.009和**表示p<0.001。图17D描绘了黑素瘤特异性死亡的Kaplan-Meier存活曲线；从1997到2004收集119个连续的原发性黑素瘤，通过中值AQUA得分＝75,764.45将肿瘤分为低和高RNLS表达，*表示p＝0.008。
图18，包括图18A和18B，是显示RNLS过表达有助于癌细胞存活的两个图。图18A是描绘血清饥饿，然后用BSA(30μg/ml)或rRNLS(30μg/ml)处理的A375.S2、MeWo、Skmel5和Skmel28细胞，和72小时后使用WST-1分析测量的细胞活力的图；n＝6，*表示p<0.05和**表示p<0.005。图18B是描绘血清饥饿24小时，然后不处理或用30μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)或rRNLS培育3天的A375.S2细胞的图；使用锥虫蓝和自动细胞计数器测定总细胞数目和活细胞数目；n＝6，**表示p<0.001。
图19，包括图19A到19D，是显示RNLS信号传导的抑制对于体外黑素瘤细胞具有细胞毒性的一系列图像和图。图19A是描绘使用RNLS特异性siRNA或非特异性对照siRNA瞬时转染黑素瘤细胞A375.S2和SK-Mel-28之后的相对细胞活力的图，其中72小时之后使用WST-1分析评估细胞活力；n＝6，*表示p＝0.03和**表示p＝0.003。图19B包括描绘相对细胞活力的两个图：左图：细胞用指示的抗体处理72小时并且细胞活力使用WST-1测定；m28-RNLS(也称为1D-28-4)、m37-RNLS(也称为1D-37-10)：针对RNLS肽RP220培养的单克隆抗体；右图：A375.S2细胞用增加剂量的m28-RNLS处理72小时并且利用WST-1分析测定细胞活力；n＝6，*表示p<0.05和**表示p<0.005。图19C包括用对照兔IgG或m28-RNLS培育72小时后A375.S2、SkMel28和SkMel5的代表性的照片。图19D是描绘相对细胞活力的图，包括RNLS肽拮抗剂(RP220A)的氨基酸(AA)序列。A375.S2细胞用指示浓度的BSA或RP220A处理，并且72小时之后使用WST-1分析测量细胞活力；n＝6，**表示p<0.005。
图20，包括图20A和20B，包括显示RNLS信号传导的抑制阻断体内黑素瘤生长的图和两个图像。图20A是显示在用A375.S2细胞异种移植的裸无胸腺小鼠中肿瘤体积增加的图，用2mg/kg的兔IgG作为阴性对照或用RNLS单克隆Ab——m28-RNLS——每3天处理之前测量肿瘤大小；n＝14每组；将每日肿瘤生长速率计算为自先前测量的肿瘤大小的变化；*表示p<0.05。图20B包括对来自用m28-RNLS或对照兔IgG处理的A375.S2异种移植肿瘤(n＝14每个)的切片的细胞增殖标记Ki67进行IHC染色的代表性的图像；棕色：Ki67阳性细胞。
图21，包括图21A到21F，是显示RNLS信号传导的抑制阻断RNLS表达和STAT3激活并且诱导细胞凋亡和细胞周期停滞的一系列图像和图。图21A包括显示用兔IgG作为阴性对照或用RNLS单克隆Ab处理的并且通过免疫荧光对RNLS、磷酸化STAT3和总STAT3探测的异种移植肿瘤的一系列图像；磷酸STAT3＝p-Y705-STAT3；对每一种显示代表性的结果，蓝色：细胞核，绿色：RNLS，和红色：磷酸STAT3(左图)或总STAT3(右图)。图21B是显示用兔IgG作为阴性对照或用RNLS单克隆Ab处理的异种移植肿瘤的图像，并且通过蛋白质印迹探测肿瘤细胞溶胞产物的RNLS、磷酸化STAT3、总STAT3和p21；p-Y705-STAT3：酪氨酸705处磷酸化；代表性的研究。图21C是描绘图21B中示出的样本中STAT3蛋白表达的定量的图；p-Y705-STAT3信号标准化为总STAT3，总STAT3信号标准化为蛋白加样测量；n＝3，*表示p<0.05和**表示p<0.005。图21D是显示用兔IgG作为阴性对照或用RNLS单克隆Ab处理的异种移植肿瘤(n＝14每个)并且通过qPCR对人和小鼠RNLS表达探测的图，*表示p<0.05。图21E包括对来自用m28-RNLS或对照兔IgG处理的A375.S2异种移植的肿瘤(n＝14每个)的切片IHC染色进行TUNEL分析来标记凋亡细胞或细胞周期抑制剂p21的代表性的图像；棕色：分别为TUNEL或p21阳性细胞。图21F是显示用抗RNLS抗体或对照山羊IgG处理的A375.S2细胞的图像；p38磷酸化和Bax表达的时间进程通过蛋白质印迹评估；p-p38＝磷酸化的p38；Bax＝bcl-2样蛋白4。
图22，包括图22A到图22C，是显示RNLS在黑素瘤中的CD163+TAM中表达的一系列图像和图。图22A包括显示如下的图像：上图：通过IF检查组织微阵列人黑素瘤样本的RNLS和全巨噬细胞(pan-macrophage)标记CD68的共表达；蓝色：细胞核，绿色：RNLS，和红色：所有巨噬细胞；DAPI：细胞核染色，RNLS-CD68：融合的RNLS和CD68染色；中图：通过IF检查黑素瘤样本的RNLS和可选激活的巨噬细胞(M2)标记CD163的共表达；蓝色：细胞核，绿色：RNLS，和红色：M2巨噬细胞；DAPI：细胞核染色，RNLS-CD163：融合的RNLS和CD163染色。观察到RNLS和CD163的显著的共表达；下图：通过IF检查黑素瘤样本的RNLS和经典激活的巨噬细胞(M1)标记CD86的共表达；蓝色：细胞核，绿色：RNLS，和红色：M1巨噬细胞；DAPI：细胞核染色，RNLS-CD163：融合的RNLS和CD86染色；没有观察到RNLS和CD186的显著共表达。图22B包括显示用兔IgG作为阴性对照或用m28-RNLS处理并且通过免疫荧光对RNLS和M2TAM(CD163+细胞)探测的异种移植肿瘤的两个图像；对于每一种显示代表性的结果：绿色：M2巨噬细胞，和红色：RNLS。m28-RNLS处理降低CD163+TAM和RNLS表达。图22C描绘了提出的m28-RNLS-TAM的作用机制：肿瘤相关的巨噬细胞，CD163：可选激活的巨噬细胞(M2)标记，CD86：经典激活的巨噬细胞(M1)标记，RNLS：肾酶，m28-RNLS：抗肾酶单克隆抗体，t-STAT3：总STAT3，p-STAT3：磷酸化的STAT3。
图23，包括图23A到23E，是显示一些癌症中RNLS表达和与PDAC中差的患者结果相关联的一系列图像和图。图23A是显示cDNA阵列——包含来自15个不同肿瘤类型的182个人肿瘤样本(OriGene Technologies)——中通过qPCR测量的RNLS mRNA水平的图；*表示p<0.05，**表示p＝0.0001。图23B是显示在正常胰腺(n＝6)、胰腺导管腺癌(n＝11)和胰腺神经内分泌肿瘤(n＝23)中通过qPCR测量的RNLS mRNA水平的图；*表示p＝0.05；**表示p＝0.00017。图23C是显示使用m28-RNLS在正常人胰腺组织(左图，n＝90)、导管腺癌(1-4级，n＝20每个)中通过免疫组织化学检测的RNLS蛋白表达的图像；对于每一种显示代表性的结果；RNLS蛋白染色为棕色。图23D显示使用抗RNL-m28对正常人胰腺组织(左图，n＝90)、导管腺癌(中图，n＝90)的组织微阵列的免疫荧光染色检测的RNLS表达；对每一种显示代表性的结果，蓝色：细胞核，绿色：细胞角蛋白，和红色：RNLS；右图：使用AQUAnalysisTM软件定量的荧光强度，正常人胰腺组织(n＝90)、导管癌(n＝90)，***表示p＝0.00013。图23E显示用于存活率的Kaplan-Meier存活曲线；69个PDAC的Biomax人群分为低(n＝35，RNLS AQUA得分<中值)和高(n＝34，RNLS AQUA得分>中值)RNLS表达，*表示p＝0.0001。
图24，包括图24A和24D，是显示RNLS过表达有助于癌细胞存活的一系列图。图24A显示PDACC系BxPC3、Panc1和MiaPaCa2被血清饥饿48小时，然后用30μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)或rRNLS培育3天；使用锥虫蓝和自动细胞技术器测定总细胞数目和活细胞数目；n＝4，**表示p<0.0001。图24B是描绘相对于对照的细胞活力的图：MiaPaCa2细胞被血清饥饿并且然后用BSA(30μg/ml)或rRNLS(30μg/ml)处理——用或不用MEK1抑制剂U0126预处理，和72小时之后使用WST-1分析测量细胞活力；n＝6，*表示p<0.005。图24C包括显示PMCA4b表达的siRNA介导的抑制阻断RNLS介导的MAPK信号传导的图像和图；左图和中图：MiaPaCa2细胞用非靶向或PMCA4b siRNA转染，维持在无血清培养基中持续3天并用25μg的BSA或25μg的RNLS肽RP-220处理指示的时间；通过蛋白质印迹评估的RP-220介导的ERK和STAT3激活，并显示了代表性的免疫印迹；p-ERK＝磷酸化的ERK，p-Y705-STAT3＝磷酸化的STAT3，p-S727-STAT3＝磷酸化的STAT3，BSA＝牛血清白蛋白，RP-220＝RNLS肽激动剂；右图：磷酸化的ERK(p-ERK)的定量，信号标准化为甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)加样对照；n＝3，*＝P<0.05。图24D显示用BSA(30μg/ml)或rRNLS(30μg/ml)处理的MiaPaCa2细胞的荧光激活细胞分选(FACS)分析的曲线图，n＝3。
图25，包括图25A到25E，是显示RNLS信号传导的抑制在体外和体内对癌细胞有细胞毒性的一系列图和图像。图25A是如此图，其显示使用RNLS特异性siRNA或非特异性对照siRNA瞬时转染Panc1细胞之后的相对细胞活力，和96h之后使用WST-1试剂测试的细胞活力；n＝6，**表示p<0.001。图25B是显示当细胞用指示的抗体处理72小时的相对细胞活力和使用WST-1测定的细胞活力的图；m28-RNLS和m37-RNLS：针对RNLS肽RP220培养的单克隆抗体，ab31291：针对RP-220的部分序列培养的Abcam多克隆抗体；n＝6，*表示p<0.005。图25C显示在用m28-RNLS培育3天之后MiaPaCa2细胞的代表性照片，n＝10。图25D是显示在无胸腺裸小鼠接受用RNLS shRNA(sh-RNLS)或对照(sh-对照)转导的Panc1细胞的皮下注射之后肿瘤体积增加的图；每23天测量肿瘤体积，持续多达30天，n＝6每个；*表示p<0.05。图25E是显示在裸小鼠异种移植有BxPC3之后肿瘤体积增加的图；在每3-4天用2mg/kg的兔IgG作为阴性对照或用m28-RNLS处理之前测量肿瘤体积，n＝10，*表示p<0.05。
图26，包括图26A到26E，是显示RNLS信号传导的抑制诱导细胞凋亡和细胞周期停滞的一系列图像和图。图26A显示了对来自用抗m28-RNLS或对照兔IgG处理的BxPC3异种移植的肿瘤(n＝14每个)的切片进行TUNEL染色的代表性的图像；箭头：TUNEL阳性细胞。图26B是描绘用m28-RNLS(30μg/ml)或100μM依托泊苷(阳性对照)处理4天的培养中Panc1细胞的FACS分析的图；n＝3，*表示p<0.05。图26C是显示用多克隆ab31291或用山羊IgG作为阴性对照处理的Panc1细胞的图像，并且通过蛋白质印迹探测细胞溶胞产物的p38和Bax激活。图26D显示对来自用抗m28-RNLS或对照兔IgG处理的BxPC3异种移植的肿瘤(n＝14每个)的切片的细胞增殖标记ki67和细胞周期抑制剂p21进行IHC染色的代表性的图像。图26E是显示由FACS分析测定的m28-RNLS对Panc1细胞的细胞周期作用的图；绿色曲线：未处理，紫色曲线：兔IgG，红色曲线：m28-RNLS 30μg/ml。
图27，包括图27A到27E，是显示RNLS和STAT3之间的相互作用和通过m28-RNLS的抑制的机理模型的一系列图像和图。图27A是显示在Panc1细胞中通过RNLS激活STAT3的图像；培养中的Panc1细胞用BSA或RNLS处理，并且通过蛋白质印迹评估STAT3磷酸化；p-Ser727-STAT3：丝氨酸727处磷酸化，p-Y705-STAT3：酪氨酸705处磷酸化；代表性的研究。图27B是描绘定量利用RNLS的STAT3磷酸化的图；信号标准化为总STAT3；n＝3，*＝P<0.05。图27C是显示m28-RNLS抑制STAT3磷酸化的图像；培养中的Panc1细胞用兔IgG或抗RNLS单克隆m28-RNLS处理多达4天，并且通过蛋白质印迹评估STAT3磷酸化；p-Ser727-STAT3：丝氨酸727处磷酸化，p-Y705-STAT3：酪氨酸705处磷酸化；GAPDH加样对照；代表性的研究。图27D是显示定量利用m28-RNLS的STAT3磷酸化的图；信号标准化为GAPDH加样对照；n＝3，*＝P<0.05。图27E描绘了提出的m28-RNLS的抗肿瘤活性的机理模型。
图28包括描绘RNLS表达存在于PDAC等级1-4和主要定位于癌细胞的图像。
图29包括显示胰腺的神经内分泌肿瘤中的RNLS表达和显示RNLS在遍及肿瘤的细胞中表达的图像。
图30是描绘标准化为β-肌动蛋白的相对RNLS mRNA水平的图，其显示RNLS基因表达在具有KRAS突变的胰腺导管腺癌细胞(PDACC)系(MiaPaCa2和Panc1)中比具有野生型KRAS的那些比如BxPC3中更高。
图31是描绘用β-肌动蛋白标准化的相对RNLS mRNA水平的图，其显示了降低RNLS表达对体外细胞活力的作用——由通过siRNA的RNLS敲低评估；这种处理显著地降低了PDACC系Panc1和MiaPaCa2的活力。
图32是显示通过靶向RNLS的shRNA抑制RNLS表达导致其受体PMCA4b的表达的显著降低，这暗示RNLS和PMCA4b表达被共同调控。
图33是描绘培养中Panc1细胞的FACS分析的一系列图，其确认了m28-RNLS引起细胞凋亡。
图34包括显示如下的图像和图：阳性RNLS-STAT3反馈环通过如下观察暗示，在用RNLS处理的HK-2细胞中，在丝氨酸727(p-Ser727-STAT3)和酪氨酸705(p-Y705-STAT3)处的STAT3磷酸化分别增加2和4倍，但是STAT1未受影响。
具体实施方式
本发明涉及使用肾酶的抑制剂抑制肾酶。在各个实施方式中，本发明涉及通过给有需要的对象施用肾酶的抑制剂治疗个体中肾酶相关病理或肾酶相关病症的组合物和方法。在各个实施方式中，使用本发明的组合物和方法可诊断、可预防和可治疗的疾病和紊乱包括急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病和癌症。
在一个实施方式中，本发明宽泛地涉及癌症的治疗、预防和诊断。在一个实施方式中，本发明涉及用于癌症的诊断、治疗、抑制、预防或减轻的方法和组合物。在一个实施方式中，本发明提供了用于调节肾酶的水平、产生和活性中的一个或多个的组合物和方法。在癌症以及相关疾病和紊乱的背景下，本发明提供了用于降低肾酶的水平、产生和活性中的一个或多个的组合物和方法。本发明的一些方面提供用于癌症转移的治疗、预防、诊断或预后的方法和组合物。
定义
除非另有限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。虽然与本文描述的那些类似或等价的任何方法和材料可以用于实践或测试本发明，但是描述了优选的方法和材料。
一般而言，本文使用的命名法，细胞培养、分子遗传学、有机化学和核酸化学以及杂交中的实验室程序是本领域中公知的和通常采用的那些。
标准技术被用于核酸和肽合成。技术和程序通常根据本领域和各种一般参考文献(例如，Sambrook和Russell，2012,Molecular Cloning,A Laboratory Approach,ColdSpring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY，和Ausubel等，2012,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY)中的常规方法执行，其遍及该文件提供。
本文使用的命名法和下面描述的分析化学和有机合成中使用的实验室程序是本领域中公知的和通常采用的那些。标准技术和其修改被用于化学合成和化学分析。
冠词“一个”(a，an)在本文中用于指一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例而言，“一个要素”意思是一个要素或多于一个要素。
如本文所使用，当提及可测量的值比如量、时间段等时，“大约”意欲包含自规定值的±20％、或±10％、或±5％、或±1％、或±0.1％的变化，因为这些变化适合于执行本公开的方法。
当在器官、组织、细胞或其组分的背景下使用时，术语“异常”指的是在至少一个可观察的或可检测的特征(例如，年龄、治疗、现状等)方面与展示“正常”(预期的/自身稳定的)各自特征的那些器官、组织、细胞或其组分不同的那些器官、组织、细胞或其组分。对于一种细胞、组织类型或对象而言为正常的或预期的特征对于不同的细胞或组织类型而言可能是异常的。
如本文所使用，术语“类似物”通常指如此化合物：其通常结构上类似于它们是类似物的化合物或“母体”化合物。一般而言，类似物将保留母体化合物的某些特征，比如生物学或药理学活性。类似物可以缺少其它的较不期望的特征，例如抗原性、蛋白水解不稳定性、毒性等。类似物包括如此化合物：其中母体的特定生物学活性降低，同时母体的一种或多种有区别的生物学活性在“类似物”中不受影响。当应用至多肽时，术语“类似物”可以具有与母体化合物不同范围的氨基酸序列同一性，例如，母体的或母体的选定部分或结构域的给定氨基酸序列中至少大约70％、更优选地至少大约80％-85％或大约86％-89％，和仍然更优选地至少大约90％、大约92％、大约94％、大约96％、大约98％或大约99％的氨基酸。当应用至多肽时，术语“类似物”通常指由大约至少3个氨基酸的区段组成的多肽，该区段与结合结构域融合蛋白的至少一部分具有实质的同一性。类似物通常为至少5个氨基酸长、至少20个氨基酸长或更长、至少50个氨基酸长或更长、至少100个氨基酸长或更长、至少150个氨基酸长或更长、至少200个氨基酸长或更长和更通常地至少250个氨基酸长或更长。一些类似物可以缺乏实质的生物学活性但是仍然可以被采用用于各种用途，比如用于募集(raising)抗体至预定表位，作为免疫学试剂以通过亲和色谱法检测和/或纯化反应性抗体，或作为结合结构域融合蛋白功能的竞争性或非竞争性激动剂、拮抗剂或部分激动剂。
如本文所使用，术语“抗体”指能够特异性地结合至结合伴侣分子(partnermolecule)的特异性表位的免疫球蛋白分子。抗体可以是衍生自天然来源或来自重组来源的完整免疫球蛋白并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应性部分。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab、Fab’、F(ab)2和F(ab’)2，以及单链抗体(scFv)、重链抗体，比如骆驼科(camelid)抗体和人源化抗体(Harlow等，1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,NY；Harlow等，1989,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor,New York；Houston等，1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等，1988,Science242:423-426)。
术语“抗体片段”指完整抗体的至少一部分并且指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段、线性抗体、sdAb(VL或VH)、骆驼科VHH结构域、scFv抗体和由抗体片段形成的多特异性抗体。术语“scFv”指融合蛋白，其包括包含轻链的可变区的至少一个抗体片段和包含重链的可变区的至少一个抗体片段，其中轻链和重链可变区经由短的柔性多肽连接体邻近地连接，并且能够被表达为单链多肽，并且其中scFv保留了scFv衍生自其的完整抗体的特异性。除非另有规定，如本文所使用，scFv可以具有任意顺序——例如相对于多肽的N末端和C末端——的VL和VH可变区，scFv可以包括VL-连接体-VH或者可以包括VH-连接体-VL。
如本文所使用，“抗体重链”指以它们天然存在的构象的抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较大者，并且其正常地决定抗体所属的类别。
如本文所使用，“抗体轻链”指以它们天然存在的构象的抗体分子中存在的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所使用，术语“合成抗体”意思是使用重组DNA技术生成的抗体，比如，例如，如本文所描述的通过噬菌体表达的抗体。该术语还应当被解释为意思是已经通过合成编码抗体的DNA分子——并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定抗体的氨基酸序列——生成的抗体，其中DNA或氨基酸序列已经使用本领域中可利用的和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
“嵌合抗体”指工程化抗体类型，其包含衍生自供体抗体的天然存在的可变区(轻链和重链)联合衍生自受体抗体的轻链和重链恒定区。
“人源化抗体”指如此工程化抗体的类型，其CDR衍生自非人供体免疫球蛋白，分子的剩余免疫球蛋白衍生部分衍生自一种(或多种)人免疫球蛋白(一种或多种)。此外，框架支撑残基(support residue)可以被改变以保持结合亲和力(参见，例如，1989,Queen等，Proc.Natl.Acad Sci USA,86:10029-10032；1991,Hodgson等，Bio/Technology,9:421)。适合的人受体抗体可以是通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列同源选自常规数据库，例如，KABAT数据库、Los Alamos数据库和Swiss Protein数据库的人受体抗体。通过与供体抗体的框架区同源(基于氨基酸)表征的人抗体可以适合于提供重链恒定区和/或重链可变框架区用于插入供体CDR。能够供给轻链恒定区或可变框架区的适合的受体抗体可以以类似的方式选择。应当注意，受体抗体重链和轻链不要求起源于相同的受体抗体。现有技术描述了产生这种人源化抗体的数种途径(参见例如EP-A-0239400和EP-A-054951)。
术语“供体抗体”指如此抗体(单克隆和/或重组)，其向第一免疫球蛋白伴侣贡献其可变区、CDR、或其它功能片段或其类似物的氨基酸序列，从而给改变的免疫球蛋白编码区以及得到的表达的改变的抗体提供供体抗体的结合特异性和中和活性特征。
术语“受体抗体”指与供体抗体异源的抗体(单克隆和/或重组)，其向第一免疫球蛋白伴侣贡献编码其重和/或轻链框架区和/或其重和/或轻链恒定区的所有(或任意部分，但是在一些实施方式中为所有)氨基酸序列。在某些实施方式中，人抗体是受体抗体。
“CDR”被限定为抗体的互补决定区氨基酸序列，其是免疫球蛋白重和轻链的高变区。参见，例如，Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第四版，U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987)。在免疫球蛋白的可变部分中存在三种重链和三种轻链CDR(或CDR区)。因此，如本文所使用的“CDR”指所有三种重链CDR，或所有三种轻链CDR(或所有重和所有轻链CDR二者，如果适合的话)。抗体的结构和蛋白折叠可以意思是其它残基被视为结合区的部分并且将被本领域技术人员理解为如此。参见例如Chothia等，(1989)Conformations ofimmunoglobulin hypervariable regions；Nature 342,p 877-883。
术语“框架”或“框架序列”指可变区减去CDR的剩余序列。因为CDR序列的精确限定可以由不同的系统决定，因此框架序列的含义相应地经历不同的解释。六种CDR(轻链的CDR-L1、-L2和-L3，和重链的CDR-H1、-H2和-H3)也将轻链和重链上的框架区分为每个链上的子区(FR1、FR2、FR3和FR4)，其中CDR1位于FR1和FR2之间，CDR2位于FR2和FR3之间，和CDR3位于FR3和FR4之间。在不指定具体的子区为FR1、FR2、FR3或FR4的情况下，框架区，如被其它提及的，代表单一天然存在的免疫球蛋白链的可变区内的组合的FR's。FR代表四个子区中的一个，并且FRs代表组成框架区的四个子区中的两个或更多个。
如本文所使用，“免疫分析”指使用能够特异性地结合至靶分子的抗体来检测和定量靶分子的任何结合分析。
术语“特异性地结合”，如本文中关于抗体所使用的，意思是识别特异性结合伴侣分子，但是基本上不识别或结合样本中的其它分子的抗体。例如，特异性结合至来自一个物种的结合伴侣分子的抗体还可以结合至来自一个或多个物种的该结合伴侣分子。但是，这种跨种反应性自身不改变抗体的类别为特异性的。在另一个实例中，特异性地结合至结合伴侣分子的抗体还可以结合至结合伴侣分子的不同等位形式。但是这种交叉反应性自身不改变抗体的类别为特异性的。
在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可以被用于指抗体、蛋白质或肽与第二结合伴侣分子的相互作用，意思是该相互作用依赖于结合伴侣分子上特定结构(例如，抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合至特定的蛋白结构而不是通常地结合至蛋白质。如果抗体对于表位“A”是特异性的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中包含表位A(或自由的、未标记的A)的分子的存在将降低与抗体结合的标记的A的量。在一些情况下，术语“特异性结合”和“特异性地结合”指选择性结合，其中抗体识别对于增强与伴侣分子结合的亲和力重要的序列或构象表位。
如本文所使用，术语“中和”指当结合蛋白特异性地结合肾酶时，中和肾酶的生物学活性。优选地，中和结合蛋白是中和抗体，其与肾酶的结合导致抑制肾酶的生物学活性。优选地，中和结合蛋白结合肾酶并降低肾酶的生物学活性至少大约20％、40％、60％、80％、85％或更多。在一些实施方式中，肾酶是人肾酶。
术语“表位”具有由抗体或其结合部分或其它结合分子——比如例如scFv——识别的结合伴侣分子上的位点的其通常意义。表位可以是氨基酸的分子或区段，包括代表完整蛋白质或多肽的小部分的区段。表位可以是构象的(即不连续的)。即，它们可以由被一级序列的非邻接部分——其已经通过蛋白折叠而并列——编码的氨基酸形成。
如本文所使用，短语“生物学样本”意欲包括包含细胞、组织或体液——其中核酸或多肽的表达可以被检测——的任何样本。这样的生物学样本的实例包括但不限于血液、淋巴、骨髓、活体组织切片(biopsy)和涂片。本质上为液体的样本在本文中称为“体液”。生物学样本可以通过多种技术自患者获得，包括，例如通过刮擦或擦拭区域或通过使用针来获得体液。用于收集不同身体样本的方法在本领域中是公知的。
如本文所使用，术语“癌症”被限定为由畸变细胞的异常生长表征的疾病。癌细胞可以局部地传播或通过血流和淋巴系统传播至身体的其它部分。不同癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌(例如，黑素瘤)、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、肉瘤等。
如本文所使用，“缀合”指一个分子共价附接至第二分子。
基因的“编码区”由基因的编码链的核苷酸残基和基因的非编码链的核苷酸——其分别与由基因的转录产生的mRNA分子的编码区同源或互补——组成。
mNRA分子的“编码区”也由mRNA分子的核苷酸残基组成，该核苷酸残基在mRNA分子的翻译期间与转移RNA分子的反密码子区匹配或者编码终止密码子。编码区可以因而包括如此核苷酸残基，其包含在由mRNA分子编码的成熟蛋白质中(例如，蛋白输出信号序列中的氨基酸残基)不存在的氨基酸残基的密码子。
如本文所使用，涉及核酸的“互补”指的是两个核酸链的区之间或者同一核酸链的两个区之间的序列互补性的宽泛概念。已知的是如果残基是胸腺嘧啶或尿嘧啶，则第一核酸区的腺嘌呤残基能够与第二核酸区——其与第一区反平行——的残基形成特定的氢键(“碱基配对”)。类似地，已知的是如果残基是鸟嘌呤，则第一核酸链的胞嘧啶残基能够与第二核酸链——其与第一链反平行——的残基碱基配对。如果当两个区以反平行方式排列时，第一区的至少一个核酸残基能够与第二区的残基碱基配对，则核酸的第一区与相同或不同核酸的第二区互补。优选地，第一区包括第一部分和第二区包括第二部分，借此，当第一和第二部分以反平行方式排列时，第一部分的核苷酸残基的至少大约50％，和优选地至少大约75％、至少大约90％或至少大约95％能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。更优选地，第一部分的所有核苷酸残基均能够与第二部分中的核苷酸残基碱基配对。
如本文所使用，术语“衍生物”包括多肽、多核苷酸或其它分子的化学修饰。在本发明的背景下，“衍生物多肽”，例如，通过糖基化、聚乙二醇化或任意类似的方法修饰的衍生物多肽保留结合活性。例如，术语结合结构域的“衍生物”包括如，例如，已经通过添加一种或多种聚乙二醇分子、糖类、磷酸盐和/或其它这样的分子化学修饰的结合结构域融合蛋白、变体或片段，其中该一种或多种分子不天然地附接至野生型结合结构域融合蛋白。多肽的“衍生物”进一步包括通过相对于参考多肽氨基酸具有置换、缺失或插入而“衍生”自参考多肽的那些多肽。因此，多肽可以“衍生”自野生型多肽或自任何其它多肽。如本文所使用，化合物，包括多肽，还可以“衍生”自特定的来源，例如，自特定有机体、组织类型，或自特定多肽、核酸或存在于特定有机体或特定组织类型中的其它化合物。
如本文所使用，术语“DNA”被限定为脱氧核糖核酸。
“编码”指的是多核苷酸——比如基因、cDNA或mRNA——中核苷酸的特异性序列在生物学过程中充当用于合成具有限定序列的核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)或限定序列的核酸和由其得到的生物学性质的其它聚合物和大分子的模板的固有性质。因此，如果与基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物学系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。编码链——其核苷酸序列与mRNA序列相同并且通常在序列表中提供——和非编码链——其被用作基因或cDNA的转录的模板——二者可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其它产物。
除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此的简并版本并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语核苷酸序列——其编码蛋白质或RNA——还可以包括内含子，在这种意义上，编码蛋白质的核苷酸序列可以在一些版本中包含内含子(一个或多个)。
“疾病”是动物的健康状况，其中动物不能维持体内平衡，并且其中如果疾病得不到改善，则动物的健康继续恶化。
相比之下，动物中的“紊乱”是如此健康状况：其中动物能够维持体内平衡，但是其中动物的健康状况与其不存在紊乱时相比是较不利的。不经过治疗，紊乱不一定使得动物健康状况进一步降低。
如果疾病或紊乱的征兆或症状的严重性、患者经历这种征兆或症状的频率、或二者降低，则疾病或紊乱“减轻”。
化合物的“有效量”或“治疗有效量”是足以为施用该化合物的对象提供有益效果的化合物的那个量。
本文描述的用于结合结构域多肽的术语“高亲和力”指至少大约10-6M、优选地至少大约10-7M、更优选地至少大约10-8M或更强、更优选地至少大约10-9M或更强、更优选地至少大约10-10M或更强，例如，多达10-12M或更强的解离常数(Kd)。但是对于其它结合结构域多肽，“高亲和力”结合可以改变。
如本文所使用，术语“抑制”意思是抑制或阻断活性或功能，例如，相对于对照值的大约10％。优选地，与对照值相比活性被抑制或阻断50％，更优选地75％，和甚至更优选地95％。如本文所使用，“抑制”还意思是降低分子、反应、相互作用、基因、mRNA、和/或蛋白质的表达、稳定性、功能或活性的水平可测量的量或使其完全阻止。抑制剂是化合物，例如拮抗剂，例如，其结合至，部分地或全部地阻断活性，降低、阻止、延迟激活，灭活，脱敏，或下调蛋白质、基因和mRNA稳定性、表达、功能和活性。
如本文中以其不同形式使用的术语感兴趣分子的“调节剂”和“调节”意欲包含与感兴趣的蛋白酶相关联的活性的拮抗作用、激动作用(agonism)、部分拮抗作用或部分激动作用。在各个实施方式中，“调节剂”可以抑制或刺激蛋白酶表达或活性。这样的调节剂包括蛋白酶分子的小分子激动剂和拮抗剂、反义分子、核酶、三链体分子(triplex molecule)和RNAi多核苷酸，等。
如本文所使用，“指导性材料”包括出版物、记录、图表或任何其它表达介质，其可以被用于在用于实现本文叙述的各种疾病或紊乱的减轻的试剂盒中传达本发明的化合物、组合物、载体或递送系统的有用性。任选地或可选地，指导性材料可以描述减轻哺乳动物细胞或组织中的疾病或紊乱的一种或多种方法。例如，本发明的试剂盒的指导性材料可以贴附至包含本发明的鉴定的化合物、组合物、载体或递送系统的容器，或者可以与包含鉴定的化合物、组合物、载体或递送系统的容器一起运送。可选地，指导性材料可以与容器分开运送，目的是指导性材料和化合物被接受者合作地使用。
“分离的(isolated)”意思是由天然状态改变或移出。例如，在活体动物中以其正常情况天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然情况的共存物质部分或完全分开的相同核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非原生环境比如宿主细胞中。
“分离的核酸”指已经与天然存在状态下位于其侧面的序列分开的核酸区段或片段，即，已经从正常地邻近该片段的序列——即在天然存在的基因组中邻近该片段的序列——移出的DNA片段。该术语还应用于已经从天然伴随核酸——即在细胞中天然地伴随核酸的RNA或DNA或蛋白质——的其它组分基本上纯化的核酸。因此，该术语包括，例如，重组DNA，其被并入载体，并入自主复制的质粒或病毒，或并入原核生物或真核生物的基因组DNA，或者其作为独立于其它序列的单独分子(即，作为通过PCR或限制性内切酶消化产生的cDNA或基因组或cDNA片段)存在。其还包括为编码另外的多肽序列的杂合基因的一部分的重组DNA。
在本发明的背景下，通常出现的核酸碱基使用下列缩写。“A”指腺苷，“C”指胞嘧啶，“G”指鸟苷，“T”指胸苷和“U”指尿苷。如本文所使用，术语“多核苷酸”被限定为核苷酸的链。而且，核酸是核苷酸的聚合物。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有核酸是多核苷酸——其可以被水解为单体“核苷酸”——的一般知识。单体核苷酸可以被水解为核苷。如本文所使用，多核苷酸包括但不限于通过本领域中可利用的任何手段——其非限制性地包括重组手段，即，使用普通克隆技术和PCR等从重组文库或细胞基因组克隆核酸序列——和通过合成手段获得的所有核酸序列。
如本文所使用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地使用，并且指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且在可以构成蛋白质的或肽的序列的氨基酸的最大数目方面没有限制。多肽包括含有通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所使用，该术语指的是短链和较长链二者，短链在本领域中还通常被称为例如肽、寡肽和寡聚物，较长链在本领域中通常被称为存在许多类型的蛋白质。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同型二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
术语“保守置换”，当描述多肽时，指的是不实质上改变多肽活性的多肽的氨基酸组成的改变，即，氨基酸置换为具有类似性质的其它氨基酸。提供功能上类似的氨基酸的保守置换表在本领域中是公知的。下面的六组每个包含通常理解为代表彼此的保守置换的氨基酸：(1)丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；(2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；(3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；(4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；(5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；和(6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)(还参见，Creighton,1984,Proteins,W.H.Freeman and Company)。除了上面限定的保守置换之外，氨基酸残基的其它修饰也可导致“保守修饰的变体”。例如，可以看待所有带电荷的氨基酸为彼此的置换，不管它们是正的还是负的。此外，保守修饰的变体也可以来源于在编码的序列中改变、添加或缺失单个氨基酸或小百分比——例如通常小于5％——的氨基酸的个别置换、缺失或添加。进一步，保守修饰的变体可以通过将由天然或野生型基因采用的氨基酸的密码子置换为相同氨基酸的不同密码子由重组多肽制备。
如本文所使用，术语“RNA”被限定为核糖核酸。如本文所使用，术语“重组DNA”被限定为通过连接来自不同来源的DNA片产生的DNA。
如本文所使用，术语“重组多肽”被限定为通过使用重组DNA方法产生的多肽。
“药学上可接受的”意思是，例如，载体、稀释剂或赋形剂与制剂的其它成分是相容的并且对于施用给其接受者通常是安全的。如本文所使用，“药学上可接受的载体”包括任何物质，当与缀合物结合时其保留缀合物的活性并且与对象的免疫系统是不反应性的。实例包括但不限于任何标准药物载体比如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液比如油/水乳液、和各种类型的润湿剂。其它载体也可以包括无菌溶液、包括包衣片剂在内的片剂和胶囊。通常地，这些载体包含赋形剂，比如淀粉、牛奶、糖、某些类型的粘土、明胶、硬脂酸或其盐——硬脂酸镁或钙、滑石、植物脂肪或油类、树胶、乙二醇或其它已知的赋形剂。这些载体还可以包括调味或着色添加剂或其它成分。包含这些载体的组合物通过公知的常规方法配制。
术语“患者”、“对象”、“个体”等在本文中可互换地使用，并且指的是具有补体系统的任何动物，优选地哺乳动物，并且最优选地人，包括对于病症或其后遗症需要疗法的人，或者易受病症或其后遗症影响的人。因而，个体可以包括，例如，狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠、猴子、以及小鼠和人。
短语“百分比(％)同一性”指在两个或更多个氨基酸序列的比较中发现的序列相似性的百分比。百分比同一性可以使用任何适合的软件电子地测定。同样，两个多肽(或者它们中的任一个或二者的一个或多个部分)之间的“相似性”通过将一个多肽的氨基酸序列与第二多肽的氨基酸序列进行比较来测定。对于这样的比较有用的任何适合的算法可以适合于在本发明的背景下应用。
“治疗性”处理是出于减弱或消除病理征兆的目的给表现病理征兆的对象施用的治疗。
“治疗有效量”是当施用给患者时，改善疾病的症状的本发明的化合物的量。组成“治疗有效量”的本发明的化合物的量将根据化合物、疾病状态和其严重性、待治疗的患者的年龄等改变。治疗有效量可以由本领域普通技术人员根据其自身知识和本公开内容常规地测定。
术语“治疗(处理，treat，treating和treatment)”指的是本文描述的治疗性或预防性措施。“治疗”的方法采用给需要这种治疗的对象——例如，受疾病或紊乱折磨的对象，或者最终可能患有这种疾病或紊乱的对象——施用本发明的组合物，以便预防、治愈、延迟、降低严重性、或减轻紊乱或复发性紊乱的一种或多种症状，或者以便延长对象的存活超过不存在这种治疗的情况下所预期的。
如本文所使用，术语“变体”是在序列方面分别与参考核酸序列或肽序列不同，但是保留了参考分子的基本生物学性质的核酸序列或肽序列。核酸变体的序列的变化可以不改变由参考核酸编码的肽的氨基酸序列，或者可以导致氨基酸置换、添加、缺失、融合和截短。肽变体的序列的变化通常是限制性的或保守的，使得参考肽和变体的序列总的来说是密切相似的，并且在一些区域中是相同的。变体和参考肽可以通过以任意组合的一种或多种置换、添加、缺失而在氨基酸序列方面不同。核酸或肽的变体可以是天然发生的，比如等位变体，或者可以是不已知为天然发生的变体。核酸和肽的非天然发生的变体可以通过诱变技术或通过直接合成来制备。
范围：遍及本公开内容，本发明的各个方面可以以范围形式呈现。应当理解，以范围形式的描述仅仅是出于便利和简单的目的，并且不应当被解释为对本发明范围的僵化限制。因此，范围的描述应当被视为已经具体地公开了所有可能的子范围以及所述范围内的单个数值。例如，范围比如1到6的描述应当被视为已经具体地公开了子范围，比如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等，以及所述范围内的单个数字，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这都适用。
描述
本发明涉及涉及使用肾酶的抑制剂抑制肾酶。在各个实施方式中，本发明涉及通过给有需要的对象施用肾酶的抑制剂治疗个体中肾酶相关疾病或紊乱的组合物和方法。在一些实施方式中，肾酶抑制剂是肾酶结合分子。在一些实施方式中，肾酶结合分子是抗体。在各个实施方式中，使用本发明的组合物和方法可诊断、可预防和可治疗的疾病和紊乱包括急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病和癌症。
在一个实施方式中，本发明宽泛地涉及癌症的治疗、预防和诊断。在一个实施方式中，本发明涉及用于癌症的诊断、分级、治疗、抑制、预防或减轻的方法和组合物。在一个实施方式中，本发明提供了用于调节肾酶的水平、产生和活性中的一个或多个的组合物和方法。在癌症以及相关疾病和紊乱的背景下，本发明提供了用于降低肾酶的水平、产生和活性中的一个或多个的组合物和方法。本发明的一些方面提供用于癌症转移的治疗、预防、诊断或预后的方法和组合物。
治疗性抑制剂组合物和使用方法
在各个实施方式中，本发明包括治疗或预防疾病或紊乱的肾酶抑制剂组合物和方法，其中肾酶的降低水平或活性是期望的。可以利用本发明的组合物和方法治疗或预防的疾病或紊乱的一个非限制性的实例包括癌症，在该实例中肾酶的降低水平或活性是期望的。在各个实施方式中，本发明的治疗或预防的肾酶抑制剂组合物和方法减少肾酶多肽的量、肾酶肽片段的量、肾酶mRNA的量、肾酶酶活性的量、肾酶底物结合活性的量、肾酶受体结合活性的量或其组合。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解肾酶水平的降低包括肾酶表达——包括转录、翻译或二者——的降低，并且还包括促进肾酶的降解，包括在RNA水平(例如，RNAi、shRNA等)下和蛋白质水平(例如，泛素化等)下。一旦武装有本发明的教导，本领域技术人员还将领会肾酶水平的降低包括肾酶活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的降低。因此，降低肾酶的水平或活性包括但不限于降低编码肾酶的核酸的转录、翻译或二者；并且其还包括降低肾酶多肽或其肽片段等的任何活性。本发明的肾酶抑制剂组合物和方法可以选择性地抑制肾酶，或者可以抑制肾酶和另一种分子二者。
肾酶的抑制可以使用多种方法评估，包括本文描述的那些，以及本领域中已知的或者在未来将被研发的方法。即，基于本文提供的公开内容，墨守成规者(routiner)将领会，降低肾酶的水平或活性可以容易地使用评估生物学样本中存在的编码肾酶的核酸(例如，mRNA)的水平、肾酶多肽或其肽片段的水平、肾酶活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的水平或其组合的方法进行评估。
基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解本发明在有需要的对象中治疗或预防是有用的，不管该对象是否正在利用其它药物或疗法治疗。进一步，基于本文提供的教导，本领域技术人员将领会可以由本文描述的组合物和方法治疗的疾病或紊乱包括任何疾病或紊乱，其中肾酶发挥作用并且其中降低的肾酶水平或活性将促进积极的治疗结果。在各个实施方式中，使用本公开内容的化合物和方法可治疗或可预防的疾病或紊乱包括急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病或紊乱(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状性左心室功能紊乱、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或紊乱、肾脏疾病或紊乱、胃肠道疾病或紊乱、肝脏疾病或紊乱、肺疾病或紊乱、胰腺疾病或紊乱(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊乱(例如，抑郁、焦虑等)或神经学疾病或紊乱。
在另一个实施方式中，本发明的肾酶抑制剂可以被施用至正在利用外源肾酶、重组肾酶、肾酶片段和/或肾酶激活剂治疗的患者，以便控制、逐步增加(titrate)、减少或稳定患者中内源和/或外源肾酶的水平或活性。
降低肾酶或肾酶片段的水平或活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的本发明的肾酶抑制剂组合物和方法包括，但是不应当被解释为限于，化合物、蛋白质、肽、肽模拟、抗体、抗体片段、抗体模拟、核酶、小分子化合物、短发夹RNA、RNAi、反义核酸分子(例如siRNA、miRNA等)、编码反义核酸分子的核酸、编码蛋白质的核酸序列、肾酶受体、肾酶受体片段或其组合。在一些实施方式中，抑制剂是变构抑制剂。基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将容易领会肾酶抑制剂组合物包括降低肾酶或其片段的水平或活性的任何化合物。另外，肾酶抑制剂组合物包括化学修饰的化合物和衍生物，如化学领域的技术人员公知的。
降低肾酶或肾酶片段的水平或活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的本发明的肾酶抑制剂组合物和方法包括抗体和其片段。本发明的抗体包括多种形式的抗体，其包括，例如，多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab和F(ab)2、单链抗体(scFv)、重链抗体(比如骆驼科抗体)、合成抗体、嵌合抗体和人源化抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体是特异性地结合至肾酶的抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体是双特异性抗体，其中第一特异性针对肾酶和第二特异性针对细胞或组织上的靶分子以引导该双特异性抗体至解剖学位置，在该解剖学位置中存在靶分子并且在该解剖学位置中肾酶结合是期望的。在一些实施方式中，本发明的抗体是双特异性抗体，其中第一特异性针对肾酶和第二特异性针对第二结合伴侣分子(即，有效负载)，其由抗体第二特异性携带并且被部署至肾酶结合期望的解剖学位置。
在一些实施方式中，给对象施用本发明的肾酶抑制剂(例如，肾酶结合分子)治疗癌症有助于通过对象的抗癌症的免疫系统而引发和/或补充免疫应答。对象的抗癌症的免疫应答可以是任何宿主防御或应答，包括先天性免疫应答、体液免疫应答、细胞介导免疫应答或其组合。
进一步，当配备有本公开内容和本文示例的方法时，本领域技术人员将领会肾酶抑制剂组合物包括如在未来发现的这类抑制剂，如可以通过药理学领域中的公知标准确定的，比如如本文中详细描述的和/或如本领域中已知的抑制肾酶的生理学结果。因此，本发明绝不限于如本文中示例的或公开的任何具体的肾酶抑制剂组合物；而是，本发明包括将由墨守成规者理解为有用的那些抑制剂组合物，如在本领域中已知的和如在将来发现的。
鉴定和生产肾酶抑制剂组合物的进一步的方法对于本领域普通技术人员是公知的，其包括但不限于，从天然来源(例如，链霉菌属某种(Streptomyces sp.)、假单胞菌属某种(Pseudomonas sp.)、Stylotella aurantium等)获得抑制剂。可选地，肾酶抑制剂可以化学合成。进一步，基于本文提供的教导，墨守成规者将领会肾酶抑制剂组合物可以从重组有机体获得。用于化学合成肾酶抑制剂和用于从天然来源获得它们的组合物和方法在本领域中是公知的并且在本领域中描述。
本领域技术人员将领会抑制剂可以作为化合物、蛋白质、肽、肽模拟、抗体、抗体片段、抗体模拟、核酶、小分子化合物、短发夹RNA、RNAi、反义核酸分子(例如siRNA、miRNA等)、编码反义核酸分子的核酸、编码蛋白质的核酸序列、肾酶受体、肾酶受体片段、或其组合施用。用于施用蛋白质或编码蛋白质的核酸构建体至细胞或组织的众多载体和其它组合物和方法是公知的。因此，本发明包括施用为肾酶抑制剂的蛋白质或编码为肾酶抑制剂的蛋白质的核酸的方法。(Sambrook等，2012,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York；Ausubel等，1997,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,New York)。
本领域技术人员将认识到降低分子的量或活性——该分子自身增加肾酶的水平或活性——可以在本发明的组合物和方法中用以降低肾酶的水平或活性。
反义寡核苷酸是与RNA分子的一些部分互补的DNA或RNA分子。当存在于细胞中时，反义寡核苷酸与存在的RNA分子杂交并且抑制翻译为基因产物。使用反义寡核苷酸抑制基因的表达是本领域中公知的(Marcus-Sekura,1988,Anal.Biochem.172:289)，如在细胞中表达反义寡核苷酸的方法(Inoue，美国专利号5,190,931)。本发明的方法包括使用反义寡核苷酸来降低肾酶的量，或者降低引起肾酶的量或活性增加的分子的量，从而降低肾酶的量或活性。
本发明考虑的是通过本领域普通技术人员公知的方法合成和提供至细胞的反义寡核苷酸。作为实例，反义寡核苷酸可以被合成为在大约10和大约100个核苷酸长之间，更优选地大约15和大约50个核苷酸长之间。核酸分子的合成在本领域中是公知的，如与未修饰的反义寡核苷酸相比改善生物活性的修饰的反义寡核苷酸的合成(Tullis，1991，美国专利号5,023,243)。
类似地，基因的表达可以通过反义分子与基因的启动子或其它调控元件的杂交从而影响基因的转录来抑制。用于鉴定与感兴趣基因相互作用的启动子或其它调控元件的方法在本领域中是公知的，并且包括如此方法，比如酵母双杂交体系(Bartel和Fields,eds.,In:The Yeast Two Hybrid System,Oxford University Press,Cary,N.C.)。
可选地，抑制表达肾酶的基因或抑制表达增加肾酶水平或活性的蛋白质的基因可以通过使用核酶完成。使用抑制基因表达的核酶对于本领域技术人员是公知的(参见例如,Cech等，1992,J.Biol.Chem.267:17479；Hampel等，1989,Biochemistry 28:4929；Altman等，美国专利号5,168,053)。核酶是具有切割其它单链RNA分子能力的催化性RNA分子。已知核酶是序列特异性的，并且因此可以被修饰为识别特异性核苷酸序列(Cech,1988,J.Amer.Med.Assn.260:3030)，使得对特异性mRNA分子的选择性切割。在提供本公开内容和并入本文的参考文献的情况下，给出分子的核苷酸序列，本领域技术人员可以合成反义寡核苷酸或核酶而不需要过度实验。
可选地，抑制表达肾酶的基因或抑制表达增加肾酶水平或活性的蛋白质的基因可以通过使用短发夹RNA或反义RNA——包括siRNA、miRNA和RNAi——完成。在提供本公开内容和并入本文的参考文献的情况下，给出分子的核苷酸序列，本领域技术人员可以合成这样的短发夹RNA或反义RNA而不需要过度实验。
本领域技术人员将领会肾酶或肾酶片段的抑制剂可以快速地(例如，在短时间段内，比如一天、一周或一个月)或长期地(例如在长时间段内，比如几个月或一年或更长)施用。本领域技术人员将领会肾酶的抑制剂可以单独施用或者以与其它药剂的任意组合施用。进一步，肾酶抑制剂可以单独施用或者以时间意义的任意组合施用，因为它们可以同时地、或在彼此之前和/或之后施用。基于本文提供的公开内容，本领域普通技术人员将领会肾酶抑制剂组合物可以被用于治疗或预防有需要的对象中的疾病或紊乱，和抑制剂组合物可以单独使用或以与另一种抑制剂的任意组合使用以实现治疗结果。
在各个实施方式中，本文描述的本发明的肾酶或肾酶片段的任何抑制剂可以单独施用或以与癌症相关联的其它分子的其它抑制剂组合施用。
当武装有包含本文详述的方法的本公开内容时，本领域技术人员将领会本发明不限于治疗已经建立的疾病或紊乱，比如癌症。具体而言，疾病或紊乱不需要已经表现为到达损害对象的点；事实上，在施用治疗之前，疾病或紊乱不需要在对象中被检测到。即，在本发明可以提供益处之前，显著的疾病或紊乱不必须发生。因此，本发明包括用于预防对象中的疾病或紊乱的方法，因为肾酶抑制剂组合物，如本文前面在别处讨论的，可以在疾病或紊乱的发病之前施用给对象，从而预防疾病或紊乱发展。本文描述的预防性方法也包括治疗处于缓解的对象，用于预防疾病或紊乱复发。
当武装有本文的公开内容时，本领域技术人员将领会疾病或紊乱的预防包括给对象施用肾酶抑制剂组合物作为抗疾病或紊乱——包括癌症——的预防性措施。如本文别处更充分讨论的，降低肾酶的水平或活性的方法包括不仅用于降低肾酶活性，而且用于降低编码肾酶的核酸的表达——包括转录的降低、翻译的降低、或二者——的许多技术。
另外，如本文别处公开的，一旦武装有本文提供的教导，本领域技术人员将理解本发明包括预防多种疾病、紊乱和病理的方法，其中肾酶的表达和/或活性的降低调节、治疗或预防疾病、紊乱和病理。用于评估疾病是否涉及肾酶的水平或活性的方法在本领域中是已知的。进一步，本发明包括治疗或预防在未来发现的这类疾病。
本发明包括施用肾酶的抑制剂以实践本发明的方法；基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将理解如何配制适合的肾酶抑制剂并将其施用给对象。但是，本发明不限于任何具体的施用方法或治疗方案。
本发明提供了结合至肾酶的组合物。在一个实施方式中，肾酶结合剂抑制肾酶水平或活性。因而，在其中肾酶活性的降低将有益的疾病和病症中，这样的抑制性肾酶结合剂可以潜在地用作治疗剂。
在一些情况下，除了其潜在的治疗作用之外，肾酶还可以被用作疾病或紊乱的诊断标记，所述疾病或紊乱包括但不限于急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病和癌症。不具有正常行使肾脏功能的患者具有低肾酶水平。因此，本发明也包括基于使用本发明的肾酶结合剂检测和/或定量肾酶来诊断对心血管、心脏、肾脏、胃肠道、肝脏、肺、胰腺以及精神和神经学相关病症、紊乱和疾病——包括癌症——的易感性的方法。例如，通过测定肾酶水平，比如肾酶蛋白水平，可以诊断、评价和监测心血管病症、紊乱和疾病，比如高血压、无症状性左心室功能紊乱、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常和动脉粥样硬化；精神病症、紊乱和疾病，比如抑郁和焦虑；和心脏病症、紊乱和疾病，比如肺动脉高血压。例如，肾酶蛋白的降低水平将是与增加的交感输出相关联的紊乱的诊断标记。本发明的组合物和方法可以被用于治疗、预防、减轻或改善高血压，包括收缩期高血压、单纯收缩期高血压和糖尿病高血压。而且，对于更罕见的高血压疾病——肺动脉高血压——以及胰腺炎，相同的益处被预期。肺动脉高血压是肺的罕见的血管紊乱，其中肺动脉(由心脏通至肺的血管)中的血压上升至正常水平之上并且可能变得威胁生命。肺床中升高的血压的发展与糖尿病高血压中和单纯收缩期高血压中全身血压的增加的相似性暗示涉及了类似的机制。
降低肾酶的水平或活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的本发明的肾酶抑制剂组合物包括但不应当被解释为限制于化合物、蛋白质、肽、肽模拟、抗体、抗体片段、抗体模拟、核酶、小分子化合物、短发夹RNA、RNAi、反义核酸分子(例如，siRNA、miRNA等)、编码反义核酸分子的核酸、编码蛋白质的核酸序列、肾酶受体、肾酶受体片段或其组合。在一些实施方式中，抑制剂是变构抑制剂。基于本文提供的公开内容，本领域技术人员将容易领会肾酶抑制剂组合物包括降低肾酶的水平或活性的化合物。另外，肾酶抑制剂组合物包括化学修饰的化合物，和衍生物，如化学领域的技术人员公知的。
降低肾酶的水平或活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的本发明的肾酶抑制剂组合物包括抗体和其片段。本发明的抗体包括多种形式的抗体，其包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、细胞内抗体(“胞内抗体”)、Fv、Fab和F(ab)2、单链抗体(scFv)、重链抗体(比如骆驼科抗体)、合成抗体、嵌合抗体和人源化抗体。在一个实施方式中，本发明的抗体是特异性地结合至肾酶的抗体。在一些实施方式中，本发明的抗体是双特异性抗体，其中第一特异性针对肾酶和第二特异性针对靶分子以引导该双特异性抗体至肾酶结合期望的解剖学位置。在一些实施方式中，本发明的抗体是双特异性抗体，其中第一特异性针对肾酶和第二特异性针对第二结合伴侣分子，其被携带并且被部署至其中肾酶结合期望的解剖学位置。
在某些实施方式中，本发明的抗体——包括其肾酶结合片段——包括由任意适合的多核苷酸编码的本文公开的抗体氨基酸序列，或任何分离的或配制的抗体。进一步，本公开内容的抗体包括具有本文描述的抗肾酶抗体的结构和/或功能特征的抗体。在一个实施方式中，抗肾酶抗体结合肾酶，并由此部分地或基本上改变肾酶的至少一种生物学活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)。在一些实施方式中，肾酶是人肾酶。
在一个实施方式中，本发明的抗肾酶抗体免疫特异性地结合对肾酶蛋白、肽、亚基、片段、蛋白质或其任意组合特异的至少一种指定的表位并且不特异性地结合至其它多肽，除了来自其它物种的肾酶之外。至少一种表位可以包括包含肾酶蛋白的至少一部分的至少一个抗体结合区。如本文所使用，术语“表位”指能够结合至抗体的蛋白决定簇。表位通常由化学活性表面分组(grouping)的分子比如氨基酸或糖侧链组成并且通常具有特定的三维结构特性，以及特定的电荷特性。构象和非构象表位是有区别的，因为在变性溶剂的存在下，失去对前者而不是后者的结合。
在一些实施方式中，本发明包括包含特异性地结合至肾酶的抗体(例如，抗体的结合部分)的组合物。在一个实施方式中，抗肾酶抗体是多克隆抗体。在另一个实施方式中，抗肾酶抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，抗肾酶抗体是嵌合抗体。在进一步实施方式中，抗肾酶抗体是人源化抗体。在一些实施方式中，肾酶是人肾酶。在一些实施方式中，本发明的抗体特异性地结合至SEQ ID NO:1-7、8、50、92、94和其片段中的至少一种。
抗体的结合部分包括保留特异性地结合至结合伴侣分子(例如，肾酶)的能力的抗体的一个或多个片段。已经显示了抗体的结合功能可以由全长抗体的片段执行。在术语抗体的“结合部分”内包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab')2片段，包括在铰链区处由二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，其由VH和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，其由抗体的单臂的VL和VH结构域组成，(v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341:544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。而且，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由单独的基因编码，但是它们可以使用重组方法通过能够使得它们制备为单一蛋白链的合成连接体接合，在该单一蛋白链中VL和VH区配对以形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见例如，Bird等(1988)Science242:423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883)。这样的单链抗体也意欲包含在术语抗体的“结合部分”内。这些抗体片段使用本领域技术人员已知的常规技术获得，并且以与完整抗体相同的方式针对实用性筛选片段。结合部分可以通过重组DNA技术，或通过完整免疫球蛋白的酶促或化学切割产生。
结合至本发明的肾酶的抗体是在体外、原位和/或在体内抑制、阻断或干扰至少一种肾酶活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的抗体。适合的抗肾酶抗体、指定的部分或变体还可以任选地影响至少一种肾酶活性或功能，比如但不限于RNA、DNA或蛋白质合成、蛋白质释放、肾酶信号传导、肾酶切割、肾酶活性、肾酶受体结合、肾酶产生和/或合成。
在一个实施方式中，本发明的抗体结合肾酶。在一个实施方式中，抗体特异性地结合至肾酶-1。在另一个实施方式中，抗体特异性地结合至肾酶-2。在又另一实施方式中，抗体特异性地结合至肾酶-1和肾酶-2二者。此外，已经生成了表位特异性抗体。本发明的优选的抗体包括单克隆抗体1C-22-1、1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7和3A-5-2。双重特异性抗体的实例——例如识别肾酶-1和肾酶-2的抗体——包括抗体1C-22-1、1D-28-4、1D-37-10和如表1中描述的多克隆抗体。肾酶类型特异性抗体的实例包括1F-26-1、1F42-7，其对于肾酶-1是特异性的。3A-5-2对于肾酶-2是特异性的。编码抗肾酶单克隆抗体的序列在图5中提出。
单克隆抗体1D-28-4的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:52)和氨基酸序列(SEQID NO:9)在图5中可见。单克隆抗体1D-28-4的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:53)和氨基酸序列(SEQ ID NO:10)在图5中可见。
单克隆抗体1D-37-10的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:60)和氨基酸序列(SEQID NO:17)在图5中可见。单克隆抗体1D-37-10的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:61)和氨基酸序列(SEQ ID NO:18)在图5中可见。
单克隆抗体1F-26-1的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:68)和氨基酸序列(SEQID NO:25)在图5中可见。单克隆抗体1F-26-1的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:69)和氨基酸序列(SEQ ID NO:26)在图5中可见。
单克隆抗体1F-42-7的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:76)和氨基酸序列(SEQID NO:33)在图5中可见。单克隆抗体1F-42-7的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:77)和氨基酸序列(SEQ ID NO:34)在图5中可见。
单克隆抗体3A-5-2的重链编码序列的核酸(SEQ ID NO:84)和氨基酸序列(SEQ IDNO:41)在图5中可见。单克隆抗体3A-5-2的轻链编码序列的核酸(SEQ ID NO:85)和氨基酸序列(SEQ ID NO:42)在图5中可见。
序列的每个中带下划线的序列并入重链和轻链的每个的CDR1、CDR2和CDR3序列。
考虑到单克隆抗体中的某些可以结合至肾酶蛋白，VH和VL序列可以“混合并匹配”以创建本公开内容的其它抗肾酶结合分子。这样的“混合并匹配”抗体的肾酶结合可以使用上面和实施例中描述的结合分析进行测试(例如，免疫印迹、Bia-Core等)。优选地，当VH和VL链混合并匹配时，来自特定VH/VL配对的VH序列被结构相似的VH序列替换。同样，优选地，来自特定VH/VL配对的VL序列被结构相似的VL序列替换。
因此，在一方面，本公开内容提供了分离的单克隆抗体，或其结合部分，其包括：(a)重链可变区，其包括选自SEQ ID NO:9、17、25、33和41的氨基酸序列；和(b)轻链可变区，其包括选自SEQ ID NO:10、18、26、34和42的氨基酸序列，其中抗体特异性地结合肾酶蛋白。
优选的重和轻链组合包括：(a)包括SEQ ID NO:9的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:10的氨基酸序列的轻链可变区；或(b)包括SEQ ID NO:17的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:18的氨基酸序列的轻链可变区；或(c)包括SEQ ID NO:25的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:26的氨基酸序列的轻链可变区；或(d)包括SEQID NO:33的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:34的氨基酸序列的轻链可变区；或(e)包括SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区和包括SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区。
在另一方面，本公开内容提供了包括1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的重链和轻链CDR1、CDR2和CDR3，或其组合的抗体。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7和3A-5-2的VH CDR1的氨基酸序列分别并入SEQ ID NO:11、19、27、35和43中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VH CDR2的氨基酸序列分别并入SEQ ID NO:12、20、28、36和44中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VH CDR3的氨基酸序列分别并入SEQ ID NO:13、21、29、37和45中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VK CDR1的氨基酸序列分别并入SEQ ID NO:14、22、30、38和46中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VK CDR2的氨基酸序列分别并入SEQ ID NO:15、23、31、39和47中示出的序列。1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的VκCDR3的氨基酸序列分别并入SEQ ID NO:16、24、32、40和48中示出的序列。CDR区使用Kabat系统描绘(Kabat,E.A.等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIHPublication No.91-3242)。
考虑到这些抗体中的每种可以结合至肾酶家族成员和结合特异性主要地由CDR1、CDR2和CDR3区提供，VH CDR1、CDR2和CDR3序列以及VL CDR1、CDR2和CDR3序列可以“混合并匹配”(即，来自不同抗体的CDR可以混合并匹配，但是每种抗体必须包含VH CDR1、CDR2和CDR3以及VL CDR1、CDR2和CDR3)以创建本公开内容的其它抗肾酶结合分子。这样的“混合并匹配”抗体的肾酶结合可以使用上面和实施例中描述的结合分析进行测试(例如，免疫印迹、分析等)。优选地，当VH CDR序列混合并匹配时，来自特定VH序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列被结构相似的CDR序列(一种或多种)替换。同样，当VL CDR序列混合并匹配时，来自特定VL序列的CDR1、CDR2和/或CDR3序列优选地被结构相似的CDR序列(一种或多种)替换。对于本领域普通技术人员还将容易显而易见的是，可以通过将一个或多个VH和/或VL CDR区序列置换为与来自本文公开的单克隆抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2的CDR序列的结构相似的序列来创建新型VH和VL序列。
因此，在一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体，或其结合部分，其包括选自如下的至少一种：(a)重链可变区CDR1，其包括选自SEQ ID NO:11、19、27、35和43的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包括选自SEQ ID NO:12、20、28、36和44的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包括选自SEQ ID NO:13、21、29、37和45的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包括选自SEQ ID NO:14、22、30、38和46的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包括选自SEQ ID NO:15、23、31、39和47的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包括选自SEQ IDNO:16、24、32、40和48的氨基酸序列；其中抗体特异性地结合肾酶。
在另一个实施方式中，抗体包括选自下列的CDR中的至少一种：(a)包括SEQ IDNO:11的重链可变区CDR1；(b)包括SEQ ID NO:12的重链可变区CDR2；(c)包括SEQ ID NO:13的重链可变区CDR3；(d)包括SEQ ID NO:14的轻链可变区CDR1；(e)包括SEQ ID NO:15的轻链可变区CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:16的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，抗体包括选自下列的CDR中的至少一种：(a)包括SEQ IDNO:19的重链可变区CDR1；(b)包括SEQ ID NO:20的重链可变区CDR2；(c)包括SEQ ID NO:21的重链可变区CDR3；(d)包括SEQ ID NO:22的轻链可变区CDR1；(e)包括SEQ ID NO:23的轻链可变区CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:24的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，抗体包括选自下列的CDR中的至少一种：(a)包括SEQ IDNO:27的重链可变区CDR1；(b)包括SEQ ID NO:28的重链可变区CDR2；(c)包括SEQ ID NO:29的重链可变区CDR3；(d)包括SEQ ID NO:30的轻链可变区CDR1；(e)包括SEQ ID NO:31的轻链可变区CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:32的轻链可变区CDR3。
在另一个其它实施方式中，抗体包括选自下列的CDR中的至少一种：(a)包括SEQID NO:35的重链可变区CDR1；(b)包括SEQ ID NO:36的重链可变区CDR2；(c)包括SEQ IDNO:37的重链可变区CDR3；(d)包括SEQ ID NO:38的轻链可变区CDR1；(e)包括SEQ ID NO:39的轻链可变区CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:40的轻链可变区CDR3。
在另一个实施方式中，抗体包括选自下列的CDR中的至少一种：(a)包括SEQ IDNO:43的重链可变区CDR1；(b)包括SEQ ID NO:44的重链可变区CDR2；(c)包括SEQ ID NO:45的重链可变区CDR3；(d)包括SEQ ID NO:46的轻链可变区CDR1；(e)包括SEQ ID NO:47的轻链可变区CDR2；和(f)包括SEQ ID NO:48的轻链可变区CDR3。
上述的分离的抗肾酶抗体CDR序列建立肾酶结合蛋白的新家族，其根据本发明分离，并且包括包含列举的CDR序列的多核苷酸。为了生成和选择具有肾酶结合和/或肾酶检测和/或肾酶中和活性的本发明的CDR's，可以使用用于生成本发明的结合蛋白和评估那些结合蛋白的肾酶和/或肾酶结合和/或检测和/或中性特性的本领域中已知的标准方法，其包括但不限于本文具体描述的那些。
优选地，本发明的肾酶结合分子(例如，抗体等)表现了在盐、化合物和其它多肽的复杂混合物中检测和结合肾酶的高能力，例如，如通过本领域中已知的数种体外和体内分析中的任一种评估的。本领域技术人员将理解本文描述的在诊断、治疗和预防疾病中有用的肾酶结合分子(例如，抗体等)也在本发明的程序和方法中有用，其包括但不限于免疫色谱分析、免疫斑点分析、Luminex分析、ELISA分析、ELISPOT分析、蛋白微阵列分析、蛋白质印迹分析、质谱分光光度分析、放射免疫分析(RIA)、放射免疫扩散分析、液相色谱-串联质谱分析、乌赫特朗尼式免疫扩散分析、反相蛋白微阵列、火箭免疫电泳分析、免疫组织染色分析、免疫沉淀分析、补体结合分析、FACS、蛋白芯片分析、分离和纯化过程、和亲和色谱法(还参见2007,Van Emon,Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques,CRC Press；2005,Wild,Immunoassay Handbook,Gulf Professional Publishing；1996,Diamandisand Christopoulos,Immunoassay,Academic Press；2005,Joos,Microarrays inClinical Diagnosis,Humana Press；2005,Hamdan and Righetti,Proteomics Today,John Wiley and Sons；2007)。
更优选地，本发明的肾酶结合分子(例如，抗体等)表现了降低或中和肾酶活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的高能力，如通过本领域中已知的数种体外和体内分析中的任一种评估的。例如，这些肾酶结合分子(例如，抗体等)中和肾酶相关或肾酶介导的疾病或紊乱。优选地，本发明的肾酶结合分子(例如，抗体等)还表现降低或中和肾酶活性的高能力。在一些实施方式中，肾酶是人肾酶。
如本文所使用，“特异性地结合至肾酶蛋白”的肾酶结合分子(例如，抗体等)意欲指结合至任何动物的肾酶蛋白的肾酶结合分子(例如，抗体等)。在一些实施方式中，那种抗体结合至人肾酶。优选地，肾酶结合分子(例如，抗体等)以1×10-6M或更小、更优选地1×10-7M或更小、更优选地1×10-8M或更小、更优选地5×10-9M或更小、更优选地1×10-9M或更小或甚至更优选地3×10-10M或更小的KD结合至肾酶蛋白。术语“基本上不结合”至蛋白质或细胞，如本文所使用的，意思是不结合至蛋白质或细胞或者不以高亲和力结合至蛋白质或细胞，即，以大于1×106M或更大、更优选地1×105M或更大、更优选地1×104M或更大、更优选地1×103M或更大、甚至更优选地1×102M或更大的KD结合至蛋白质或细胞。术语“KD”，如本文所使用，意欲指解离常数，其获得自Kd与Ka的比(即，Kd/Ka)并表达为摩尔浓度(M)。肾酶结合分子(例如，抗体等)的KD值可以使用本领域中很好地建立的方法测定。用于测定结合分子(例如，抗体等)的KD的优选方法通过使用表面等离子体共振，优选地使用生物传感器系统比如系统进行。
如本文所使用，术语对IgG抗体的“高亲和力”指的是抗体对目标结合伴侣分子具有1×10-7M或更小、更优选地5×10-8M或更小、甚至更优选地1×10-8M或更小、甚至更优选地5×10-9M或更小和甚至更优选地1×10-9M或更小的KD。但是，“高亲和力”结合对于其它抗体同种型可以改变。例如，对IgM同种型的“高亲和力”结合指的是抗体具有10-6M或更小、更优选地10-7M或更小、甚至更优选地10-8M或更小的KD。
在某些实施方式中，抗体包括重链恒定区，比如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重链恒定区或IgG4重链恒定区。而且，抗体可以包括轻链恒定区，κ轻链恒定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括κ轻链恒定区。可选地，抗体蛋白可以是，例如Fab片段或单链Fv片段。
抗肾酶抗体的生成
本发明提供了结合至肾酶的组合物。本文公开的肾酶分子是一类分子，其包括与本文公开的其它多肽具有高和/或显著序列同一性的那些分子。更具体地，推定的肾酶将与具有序列SEQ ID NO:49或51的核酸共享至少大约40％序列同一性。更优选地，编码肾酶的核酸与本文公开的SEQ ID NO:49或51具有至少大约45％同一性、或至少大约50％同一性、或至少大约55％同一性,、或至少大约60％同一性、或至少大约65％同一性、或至少大约70％同一性、或至少大约75％同一性、或至少大约80％同一性、或至少大约85％同一性、或至少大约90％同一性、或至少大约95％同一性、或至少大约98％、或至少大约99％序列同一性。甚至更优选地，核酸是SEQ ID NO:49或51或93或95。术语“肾酶”还包括肾酶同种型。肾酶基因包括在人基因组的10号染色体中横跨310188bp的9个外显子。本文公开的肾酶克隆(SEQ ID NO:49，GenBank登录号：BC005364)是包含外显子1、2、3、4、5、6、8的基因。存在至少两种额外可选-剪接形式的肾酶蛋白，如人基因组数据库中所示的。一种可选剪接形式包含外显子1、2、3、4、5、6、9，在人基因组数据库中通过克隆鉴定GenBank登录号AK002080和NMJ)18363，其序列通过引用明确地并入本文。其它可选剪接形式包含外显子5、6、7、8，在人基因组数据库中通过克隆鉴定为GenBank登录号BX648154，其序列通过引用明确地并入本文。除非另有说明，“肾酶”包括所有已知的肾酶(例如，大鼠肾酶和人肾酶)，和待发现的肾酶，包括但不限于人肾酶和黑猩猩肾酶，其具有本文公开的肾酶的特性和/或物理特征。
另外，推定的肾酶与具有序列SEQ ID NO:8或50的多肽共享至少大约60％序列同一性。更优选地，肾酶与本文公开的SEQ ID NO:8或50具有至少大约45％同一性、或至少大约50％同一性、或至少大约55％同一性、或至少大约60％同一性、或至少大约65％同一性、或至少大约70％同一性、或至少大约75％同一性、或至少大约80％同一性、或至少大约85％同一性、或至少大约90％同一性、或至少大约95％同一性、或至少大约98％、或至少大约99％序列同一性。甚至更优选地，肾酶多肽具有SEQ ID NO:8或50或92或94的氨基酸序列。
在一个实施方式中，本发明的抗体可以通过使用衍生自肾酶序列的肽生成以免疫动物，由此动物产生针对免疫原的抗体。示例性的免疫原包括衍生自肾酶的肽。即，具有肾酶序列的片段的肽可以在本发明中使用。肽可以以多种方式——包括作为重组肽表达、作为更大的多肽表达——产生并且被酶促地或化学地切割。可选地，它们可以合成地产生，如本领域中已知的。如用于生成本发明的亲和试剂的优选的肽在表1(SEQ ID NO:1-7)中可见。
本发明的抗肾酶抗体可以任选地通过多种技术产生，包括Kohler和Milstein(1975)Nature 256:495的标准体细胞杂交技术(杂交瘤方法)。在杂交瘤方法中，小鼠或其它适合的宿主动物，比如仓鼠或猕猴，如本文描述的进行免疫以引起产生或者能够产生抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性地结合至用于免疫的蛋白质。可选地，淋巴细胞可以在体外被免疫。然后，使用适合的融合剂比如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103(Academic Press,1986))。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法在本领域中是常规的和公知的。在一个实施方式中，本发明提供了生成单克隆抗体的方法以及通过该方法——其包括培养分泌本发明的抗体的杂交瘤细胞——产生的抗体，其中，优选地，杂交瘤通过如下过程生成：将从利用本发明的多肽或肽免疫的小鼠或兔或其它物种分离的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，然后筛选由融合产生的杂交瘤找出分泌能够结合本发明的多肽的抗体的杂交瘤克隆。简言之，小鼠可以利用肾酶多肽或其肽免疫。在优选的实施方式中，肾酶多肽或其肽与佐剂一起施用以刺激免疫应答。这样的佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合物)。这样的佐剂可以通过将多肽隔绝在局部沉积物(deposit)中而防止多肽快速处置，或者它们可以包含刺激宿主分泌对于免疫系统的巨噬细胞和其它成分具有趋化性的因子的物质。优选地，如果多肽正被施用，则免疫安排将包括在数周内分散地两次或多次施用多肽。
可选地，兔可以利用肾酶多肽或其肽免疫。在该实施方式中，全长肾酶蛋白或衍生自肾酶的肽可以被用作免疫原。
在本发明中使用的肾酶可以采用多种形式。例如，它们可以包括纯化的肾酶蛋白或其片段、重组产生的肾酶或其片段。在一些实施方式中，肾酶是人肾酶。当使用重组肾酶时，其可以在真核或原核细胞中产生，如本领域中已知的。另外的免疫原包括衍生自肾酶的肽。即，具有肾酶序列的片段的肽可以在本发明中使用。肽可以以多种方式——包括作为重组肽表达、作为更大的多肽表达——产生并且被酶促地或化学地切割。可选地，它们可以合成地产生，如本领域中已知的。如用于生成本发明的亲合试剂的优选的肽在表1(SEQ IDNO:1-7)中可见。人肾酶的全长氨基酸序列在SEQ ID NO:8中描绘，其中已知的多态性是可能的，如所指示的(与SEQ ID NO.92比较)。肾酶-2的氨基酸序列在SEQ ID NO:50中可见，再次，其中已知的多态性是可能的，如所指示的(与SEQ ID NO.94比较)。应当领会存在其它多态性。这些也包括在肾酶的定义中。在一些实施方式中，本发明的肾酶结合分子特异性地结合至SEQ ID NO:1-7、8、50、92、94和其片段中的至少一个。
抗肾酶抗体还可以任选地通过免疫能够产生人抗体的所有组成成分的转基因动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、非人灵长类等)生成，如本文描述的和/或本领域中已知的。产生人抗肾酶抗体的细胞可以使用适合的方法比如本文描述的方法从这样的动物分离并无限增殖。可选地，抗体编码序列可以通过本文教导的方法和本领域中已知的那些方法进行克隆，引入适合的载体并用于转染宿主细胞用于抗体的表达和分离。
使用在它们的种系构型中携带人免疫球蛋白(Ig)基因座的转基因小鼠提供了针对多种目标的高亲和力全人单克隆抗体的分离，这些目标包括正常人免疫系统对其能耐受的人自身抗原。(Lonberg,N.等，美国专利号5,569,825，美国专利号6,300,129和1994，Nature368:856-9；Green等，1994,Nature Genet.7:13-21；Green,L.&Jakobovits,1998,Exp.Med.188:483-95；Lonberg,N.and Huszar,D.,1995,Int.Rev.Immunol.13:65-93；Kucherlapati等，美国专利号6,713,610；Bruggemann,M.等，1991,Eur.J.Immunol.21:1323-1326；Fishwild,D.等，1996,Nat.Biotechnol.14:845-851；Mendez,M.等，1997,Nat.Genet.15:146-156；Green,L.,1999,J.Immunol.Methods 231:11-23；Yang,X.等，1999,Cancer Res.59:1236-1243；Bruggemann,M.and Taussig,M J.,Curr.Opin.Biotechnol.8:455-458，1997；Tomizuka等WO02043478)。在这样的小鼠中的内源免疫球蛋白基因座可以被破坏或缺失以消除动物产生由内源基因编码的抗体的能力。另外，公司比如Abgenix,Inc.(Freemont,Calif.)和Medarex(San Jose,Calif.)可以使用如本文别处描述的技术参与提供针对选定靶结合伴侣分子(例如，抗原等)的人抗体。
在另一个实施方式中，人抗体选自噬菌体文库，其中所述噬菌体包括人免疫球蛋白基因并且该文库表达人抗体结合结构域，如，例如，单链抗体(scFv)，如Fab，或一些其它表现成对或未成对抗体可变区的构建体(Vaughan等Nature Biotechnology 14:309-314(1996):Sheets等PITAS(USA)95:6157-6162(1998))；Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.,227:381(1991)；Marks等J.Mol.Biol.,222:581(1991))。本发明的人单克隆抗体还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因的文库的噬菌体展示方法制备。这样的用于分离人抗体的噬菌体展示方法在本领域中是建立的。参见例如：Ladner等的美国专利号5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等的美国专利号5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利号5,969,108和6,172,197；和Griffiths等的美国专利号5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081。
免疫原性抗原的制备和单克隆抗体生产可以使用任何适合的技术比如重组蛋白生产执行。免疫原性抗原可以以纯化蛋白或包括全细胞或细胞或组织提取物的蛋白混合物的形式施用至动物，或者抗原可以在动物的身体中从编码所述抗原或其部分的核酸从头(de novo)形成。
本发明的分离的核酸可以使用(a)重组方法，(b)合成技术，(c)纯化技术，或其组合制备，如本领域中公知的。编码单克隆抗体的DNA容易使用本领域中已知的方法分离和测序(例如，通过使用能够特异性地结合至编码鼠科抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。在产生杂交瘤时，这样的细胞可以充当这样的DNA的来源。可选地，使用其中编码序列和翻译产物被连接的展示技术，比如噬菌体或核糖体展示文库，简化黏合剂和核酸的选择。在噬菌体选择之后，来自噬菌体的抗体编码区可以被分离并用于生成完整抗体，包括人抗体，或任何其它期望的结合片段，并在任何期望的宿主中表达，所述宿主包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母和细菌。
人源化抗体
本发明进一步提供了结合人肾酶的人源化免疫球蛋白(或抗体)。免疫球蛋白的人源化形式具有基本上来自人免疫球蛋白(称为受体免疫球蛋白)的可变框架区(一个或多个)和基本上来自特异性地结合肾酶的非人mAb的CDR。恒定区(一个或多个)——如果存在的话，也基本上来自人免疫球蛋白。人源化抗体表现对肾酶的至少大约10-6M(1μM)、大约10-7M(100nM)或更小的KD。人源化抗体的结合亲和力与它们被衍生自的小鼠抗体的结合亲和力相比更大或更小。为了影响亲和力的改变，改善人源化抗体对肾酶的亲和力，可以在CDR残基或人残基中进行置换。
产生结合至肾酶的人源化抗体的来源优选地是1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2小鼠抗体，其生成、分离和表征在本文中提供的实施例中描述，但是也可以使用其它小鼠抗体，其与1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F42-7或3A-5-2小鼠抗体竞争结合至肾酶。序列表中提出的鉴定的CDR可以是人源化过程的起始点。例如，下面的氨基酸序列(和其相应的核酸序列)中的任一个或多个可以是人源化过程的起始点：(a)重链可变区CDR1，其包括选自SEQ ID NO:11、19、27、35和43的氨基酸序列；(b)重链可变区CDR2，其包括选自SEQ ID NO:12、20、28、36和44的氨基酸序列；(c)重链可变区CDR3，其包括选自SEQ IDNO:13、21、29、37和45的氨基酸序列；(d)轻链可变区CDR1，其包括选自SEQ ID NO:14、22、30、38和46的氨基酸序列；(e)轻链可变区CDR2，其包括选自SEQ ID NO:15、23、31、39和47的氨基酸序列；和(f)轻链可变区CDR3，其包括选自SEQ ID NO:16、24、32、40和48的氨基酸序列。
如果人可变结构域框架采用与CDR来源自的小鼠可变框架相同或相似构象，则小鼠CDR置换入人可变结构域框架内最可能导致它们正确的空间定向的保留。这通过从人抗体获得人可变结构域实现，所述人抗体的框架序列表现与CDR衍生自的鼠科可变框架结构域高度的序列同一性。重链和轻链可变框架区可以衍生自相同或不同的人抗体序列。人抗体序列可以是天然发生的人抗体的序列，衍生自人种系免疫球蛋白序列，或者可以是数种人抗体和/或种系序列的共有序列。
适合的人抗体序列通过小鼠可变区的氨基酸序列与已知的人抗体序列的计算机比较鉴定。该比较对于重链和轻链单独地执行，但是每一种的原理是相似的。
在一个实例中，抗肾酶mAb的氨基酸序列被用于询问从公众抗体序列数据库汇编的人抗体数据库。重链可变区可以被用于发现具有最高序列同一性的人可变区。轻链的可变区可以类似地被用于发现具有最高序列同一性的人可变区。对每个鼠科可变区，制备替换人可变区的CDR的DNA构建体，在该DNA构建体中编码来自鼠科mAb供体的重链可变区之一的CDR的区被转移至选择的人重链可变序列。
鼠科CDR区与人可变框架区的非天然的并列可以导致非天然的构象限制，除非通过置换某些氨基酸残基进行纠正，否则其导致结合亲和力的损失。如上文所注意的，本发明的人源化抗体包括基本上来自人免疫球蛋白的可变框架区(一个或多个)和基本上来自小鼠免疫球蛋白的CDR。已经鉴定了小鼠抗体的CDR和适合的人受体免疫球蛋白序列，下一步是确定来自这些成分的那些残基——如果有的话——是否应当被置换以优化得到的人源化抗体的特性。一般而言，人氨基酸残基置换为鼠科应当被最小化，因为鼠科残基的引入增加了抗体引发人中HAMA应答的风险。基于它们对CDR构象和/或结合至靶结合伴侣分子的可能的影响，选择用于置换的氨基酸。这种可能的影响的研究可以通过建模——特定位置处的氨基酸特征的检查，或特定氨基酸的置换或诱变效果的经验观察——进行。关于经验方法，已经发现特别便利于创建可以对期望的活性、结合亲和力或特异性进行筛选的变体序列的文库。用于创建这样的变体文库的一种形式是噬菌体展示载体。可选地，可以使用其它方法变异(varigation)编码可变结构域内目标残基的核苷酸序列来生成变体。
确定是否需要进一步置换和选择用于置换的氨基酸残基的另一种方法可以使用计算机建模完成。用于产生免疫球蛋白分子的三维图像的计算机硬件和软件是广泛地可获得的。一般而言，从免疫球蛋白链或其结构域的解构的结构开始产生分子模型。将要被建模的链与解构的三维结构的链或结构域进行氨基酸序列相似性比较，并且显示最大序列相似性的链或结构域被选择作为构建分子模型的起始点。解构的起始结构被修改以考虑正被建模的免疫球蛋白链或结构域中的实际氨基酸与起始结构中那些之间的区别。修改的结构然后被装配入复合免疫球蛋白。最终，模型通过能量最小化和通过验证所有原子位于距离彼此适合的距离内和验证键长和键角在化学可接受限制内来改善。
通常，在人源化抗体中的CDR区是基本上相同的，和更通常地，与它们衍生自的小鼠抗体中相应的CDR区基本上相同。虽然不是通常期望的，但是有时可能进行CDR残基的一种或更多种保守氨基酸置换而不明显地影响得到的人源化免疫球蛋白的结合亲和力。偶尔，CDR区的置换可以增强结合亲和力。
除了上面讨论的特定氨基酸置换之外，人源化免疫球蛋白的框架区通常与它们衍生自的人抗体的框架区基本上相同，并且更通常地与其相同。当然，框架区中的许多氨基酸对于抗体的特异性或亲和力很少或没有直接贡献。因此，框架残基的许多个别保守置换在所得到的人源化免疫球蛋白的特异性或亲和力没有显著改变的情况下可以被容忍。
由于密码的简并性，多个氨基酸序列将编码每个免疫球蛋白氨基酸序列。期望的核酸序列可以通过从头(de nova)固相DNA合成或者通过期望的多核苷酸的更早制备的变体的PCR诱变产生。编码在本申请中描述的编码抗体的所有核酸明确地包含在本发明中。
如上文描述产生的人源化抗体的可变区段通常连接至人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。抗体将包含轻链和重链恒定区二者。重链恒定区通常包括CH1、铰链、CH2、CH3，和有时CH4结构域。
人源化抗体可以包括来自任何种类抗体——包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE——和任何子类(同种型)——包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4——的任何类型的恒定结构域。当人源化抗体表现细胞毒活性是期望的时，恒定结构域通常是补体结合恒定结构域和该种类通常是IgG1。当这样的细胞毒活性不期望时，恒定结构域可以具有IgG2种类。人源化抗体可以包括来自多于一个种类或同种型的序列。
编码人源化轻和重链可变区——其任选地连接至恒定区——的核酸被插入表达载体。轻和重链可以在相同或不同的表达载体中克隆。编码免疫球蛋白链的DNA区段可操作地连接至表达载体(一种或多种)中确保免疫球蛋白多肽表达的控制序列。这种控制序列包括信号序列、启动子、增强子和转录终止序列(参见Queen等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,10029(1989)；WO 90/07861；Co等，J.Immunol.148,1149(1992)，其出于所有目的通过引用以其全部被并入本文)。
使用肾酶结合分子的方法
考虑到本发明的肾酶结合分子(例如，抗体等)的性质，肾酶结合分子适合作为诊断、治疗和预防药剂用于诊断、治疗或预防人和动物中肾酶相关病症。
一般而言，使用包括施用治疗或预防有效量的本发明的一种或多种单克隆抗体或结合片段至易感对象或表现病症的对象，已知所述病症中肾酶活性为具有病理性后遗症，比如肿瘤生长和转移。任何活性形式的肾酶结合分子可以被施用，包括抗体Fab和F(ab')2片段。
优选地，使用的肾酶结合分子与接受者物种相容，使得对肾酶结合分子的免疫应答不导致不能接受短的循环半衰期或诱导对象中对肾酶结合分子的免疫应答。优选地，施用的肾酶结合分子表现一些次级功能比如结合至对象的Fc受体和ADCC机制的激活。
个体的治疗可以包括施用治疗有效量的本发明的肾酶结合分子。肾酶结合分子可以在如下文描述的试剂盒中提供。肾酶结合分子可以作为混合物被使用或施用，例如以等量，或者单独地，顺序提供，或者一次全部施用。在给患者提供肾酶结合分子中，施用的药剂的剂量将根据这些因素比如患者的年龄、体重、身高、性别、一般身体状况、既往病史等改变。
一般而言，如果施用全身剂量的肾酶结合分子，给接受者提供如下范围中的肾酶结合分子的剂量是期望的：大约1ng/kg-100ng/kg、100ng/kg-500ng/kg、500ng/kg-1μg/kg、1μg/kg-100μg/kg、100μg/kg-500μg/kg、500μg/kg-1mg/kg、1mg/kg-50mg/kg、50mg/kg-100mg/kg、100mg/kg-500mg/kg(接受者的体重)，但是更低或更高剂量可以被施用。低至大约1.0mg/kg的剂量可以被预期显示一些效力。优选地，大约5mg/kg是可接受的剂量，但是多至大约50mg/kg的剂量水平对于治疗用途而言也是尤其优选的。可选地，可以给出具体量的肾酶结合分子的施用，其不基于患者的体重，比如1μg-100μg、1mg-100mg或1gm-100gm的范围中的量。例如，位点特异性施用可以至体室或体腔，比如关节内(intrarticular)、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内(intracelebellar)、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心肌内、骨骼内(intraosteal)、骨盆内、心包内(intrapericardiac)、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸廓内、子宫内、膀胱内、病灶内(intralesional)、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内、眼科或经皮方式。
肾酶结合分子组合物可以具体地以液体溶液或悬浮液的形式制备用于肠胃外(皮下、肌肉内或静脉内)或任何其它施用；具体地以半固体形式比如，但不限于，乳剂和栓剂制备用于阴道或直肠施用；比如，但不限于，以片剂或胶囊剂的形式制备用于口腔或舌下施用；或鼻内，比如，但不限于，粉末、滴鼻剂或气溶胶或某些剂的形式；或眼(ophthalmically)，比如，但不限于滴眼剂；或用于治疗牙科疾病；或经皮(transdermally)，比如，但不限于，凝胶、药膏、洗涤剂、悬浮液或贴剂递送系统，其具有化学增强剂比如二甲基亚砜以修饰皮肤结构或增加在经皮贴剂中药物浓度，或者具有氧化剂，该氧化剂能够施用包含蛋白质和肽的制剂至皮肤上(WO 98/53847)，或者施用电场以创建瞬时传输途径比如电穿孔，或以增加带电药物通过皮肤的移动性比如离子电渗疗法，或者施用超声波比如超声促渗(美国专利号4,309,989和4,767,402)。
以类似途径，本发明的肾酶结合分子的另一种治疗用途是使用针对本单克隆抗体之一培养的抗独特型抗体主动免疫患者。利用模拟表位结构的抗独特型进行免疫可以引起主动抗肾酶应答(Linthicum,D.S和Farid,N.R.,Anti-Idiotypes,Receptors,andMolecular Mimicry(1988),pp 1-5和285-300)。
本发明的肾酶结合分子可以根据已知方法配制以制备药学上有用的组合物，由此这些材料或它们的功能性衍生物与具有药学上可接受的载体媒介的混合物结合。例如，在Remington's Pharmaceutical Sciences(16th ed.,Osol,A.ed.,Mack Easton Pa.(1980))中描述了适合的媒介或其它制剂，包括其它人蛋白，例如，人血清白蛋白。为了形成适合于有效施用的药学上可接受的组合物，这样的组合物将包含有效量的上述化合物以及适合量的载体媒介。另外的制药方法可以被采用以控制作用的持续时间。控释制品可以通过使用聚合物以复合(complex)或吸收化合物来实现。通过控释制品控制作用的持续时间的另一种可能的方法是将本发明的化合物掺入聚合物材料的颗粒，比如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯醋酸乙烯酯共聚物。可选地，代替将这些药剂掺入聚合物颗粒，可能的是截留这些材料在例如界面聚合制备的微囊剂中，例如，分别地羟甲基纤维素或明胶微囊剂和聚(甲基丙烯酸甲酯)微囊剂，或者在胶体药物递送系统中，例如，脂质体、白蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊或在微乳剂中。
治疗可以以单次剂量安排，或者优选地多次剂量安排进行，其中初次疗程可以具有1-10个单独的剂量，然后在维持和/或加强应答需要的随后时间间隔下给予其它剂量，例如，在1-4个月时给予第二剂量，并且如果需要，在几个月之后给予随后的剂量(一个或多个)。适合的治疗安排的实例包括：(i)0、1个月和6个月，(ii)0、7天和1个月，(iii)0和1个月，(iv)0和6个月，或者足以引起预期为降低疾病症状或降低疾病的严重性的期望应答的其它安排。
本发明还提供了对于实行本发明有用的试剂盒。本试剂盒包括含有上述抗体或者与上述抗体联合包装的第一容器。该试剂盒还包括另一种容器，其含有对于实行本发明必需的或者便于实施本发明的溶液或者与该溶液联合包装。该容器可以由玻璃、塑料或者箔制成，并且可以是管形瓶、瓶、小药袋、管、袋等。该试剂盒还包含书面信息，比如用于实行本发明的程序或者分析信息，比如包含在第一容器工具中的试剂的量。容器还可以连同书面信息在另一种容器装置例如盒或袋中。
本发明的又另一方面是用于检测生物学样本中的肾酶的试剂盒。该试剂盒包括持有结合肾酶的表位的一种或多种肾酶结合分子的容器和出于结合至肾酶以形成复合物并检测该复合物的信息使得该复合物的存在或不存在与样本中肾酶的存在或不存在相关联的使用肾酶结合分子的说明书。容器的实例包括允许对多个样本中的肾酶同时检测的多孔板。
组合疗法
本发明的肾酶结合分子组合物可以与另一种治疗性处理或药剂组合使用以治疗疾病或紊乱。例如，本发明的肾酶结合分子可以被单独施用，或者与一种或多种治疗有效的药剂或者处理组合施用。其它治疗有效的药剂可以缀合至本发明的肾酶结合分子，掺入本发明的肾酶结合分子的同一组合物，或者可以作为单独的组合物施用。其它治疗性药剂或处理可以在施用本发明的抗体或者相关化合物之前、期间和/或之后施用。
在某些实施方式中，本发明的肾酶结合分子与一种或多种其它治疗性药剂或处理共同施用。在其它实施方式中，本发明的肾酶结合分子独立于施用一种或多种其它治疗性药剂或处理进行施用。例如，本发明的肾酶结合分子首先施用，然后施用一种或多种其它治疗性药剂或处理。可选地，一种或多种其它治疗性药剂首先施用，然后施用本发明的肾酶结合分子。作为另一个实例，处理(例如，外科手术、放射等)首先实行，然后施用本发明的肾酶结合分子。
其它治疗有效的药剂/处理包括外科手术、抗瘤剂(包括化疗剂和放射)、抗血管生成剂、针对其它靶标的抗体、小分子、光动力学疗法、免疫疗法、免疫力增强疗法、细胞毒素剂、细胞因子、趋化因子、生长抑制剂、抗激素剂、激酶抑制剂、保心药(cardioprotectant)、免疫刺激剂、免疫抑制剂、和促进血液细胞增殖的药剂。
在一个实施方式中，如本文所使用，“另一种治疗性药剂”是第二、有区别的治疗性药剂或者抗癌药，即，“除了”本发明的肾酶结合分子之外的治疗性药剂或者抗癌药。任何二次治疗性药剂可以与本发明的疗法组合使用。而且，二次治疗性药剂或者“第二抗癌药”可以以实现累加效应、或大于累加效应和潜在的协同效应的观点根据下面的指导进行选择。
为了实践组合的抗肿瘤疗法，将本发明的肾酶结合分子与另一种即第二、有区别的抗癌药组合，以在动物或患者内有效产生它们的组合抗肿瘤作用的方式施用给动物或患者。该药剂将因此以有效的量和有效的时间段进行提供，以导致在肿瘤或肿瘤脉管系统内它们的组合的或同时的存在和在肿瘤环境中它们的组合作用。为了实现该目标，本发明的肾酶结合分子和第二、有区别的抗癌药可以基本上同时地、以单一组合物或者作为使用不同施用途径的两个有区别的组合物施用至动物。
可选地，本发明的肾酶结合分子可以领先或落后第二、有区别的抗癌药达例如范围在数分钟至数周的间隔。在其中本发明的肾酶结合分子和第二、有区别的抗癌药被单独地应用至动物的某些实施方式中，将确保显著的时间段在每次递送的时间期间不过期，使得每种药剂将仍然能够对肿瘤发挥有利组合作用。在这样的例子中，预期肿瘤将与两种药物在彼此之间大约5分钟至大约一周之内，并且更优选地，在彼此之间大约12-72小时内接触，仅大约12-48小时的延迟时间为最优选的。
用于单独定时组合疗法的二次治疗性药剂可以基于某些标准选择，包括本文别处讨论的那些。但是，如果需要，用于选择之前或随后施用的一种或多种第二、有区别的抗癌药的偏好不排除其以基本上同时施用的应用。第二、有区别的抗癌药选择在本发明的初次治疗性药剂“之前”施用，并设计来实现增加的和潜在的协同效应。
选择在本发明的初次治疗性药剂“之后”施用并设计来实现增加的和潜在的协同效应的第二、有区别的抗癌药包括受益于初次治疗性药剂的作用的药剂。因此，用于随后施用的有效的第二、有区别的抗癌药包括抗血管生成剂，其抑制转移；靶向坏死肿瘤细胞的药剂，比如对细胞内结合伴侣分子——其变得体内恶性肿瘤细胞可接近——特异的抗体(美国专利号5,019,368、4,861,581和5,882,626，每个通过引用明确地并入本文)；化疗剂；和抗肿瘤细胞免疫连接物，其攻击任何肿瘤细胞。
本发明的肾酶结合分子还可以与癌症免疫疗法组合施用。癌症免疫疗法可以是如此疗法，其被设计以引起针对对象癌细胞的体液免疫应答，或者针对对象癌细胞的细胞介导的免疫应答，或者针对对象癌细胞的体液应答和细胞介导的应答的组合。在与本发明的肾酶结合分子的组合中有用的癌症免疫疗法的非限制性实例包括癌症疫苗、DNA癌症疫苗、继承性细胞疗法、继承性免疫疗法、CAR T细胞疗法、抗体、免疫力增强化合物、细胞因子、白细胞介素(例如，IL-2等)、干扰素(IFN-α等)和限制点抑制剂(例如，PD-1抑制剂、CTLA-4抑制剂等)。
在一些情况下，可以期望的是显著地延长治疗的时期，其中在各自的施用期间过去(lapse)数天(2、3、4、5、6或7)、数周(1、2、3、4、5、6、7或8)或甚至数月(1、2、3、4、5、6、7或8)。这在如下情况下将是有利的，其中一种治疗意欲基本上破坏肿瘤，比如本发明的初次治疗性药剂，和另一种治疗意欲阻止微转移或肿瘤再生长，比如抗血管生成剂的施用。但是，为了允许有效的伤口愈合，抗血管生成剂应当在外科手术之后谨慎的时间(careful time)时施用。抗血管生成剂然后可以被施用持续患者终生。
还设想将利用本发明的肾酶结合分子或第二、有区别的抗癌药的多于一个施用。本发明的肾酶结合分子和第二、有区别的抗癌药可以可交换地施用，在交替的天或周时施用；或者可以给予一系列一种药剂治疗，然后给予一系列另一种治疗。在任何事件中，为了实现使用组合疗法肿瘤消退，需要的所有是以发挥抗肿瘤作用有效的组合量递送两种药剂，而不考虑施用次数。
化疗药物可以与本发明的肾酶抑制剂组合使用。化疗药物可以杀死正增殖的肿瘤细胞，增强由总体治疗造成的坏死区域。
本发明的一方面提供了使用本发明的肾酶抑制剂治疗或预防癌症的方法。本领域技术人员将理解治疗或预防患者中的癌症非限制性包括杀死和破坏癌细胞，以及降低癌细胞的增殖或细胞分裂速率。本领域技术人员还将理解癌细胞可以非限制性是原发性癌细胞、癌症干细胞、转移性癌细胞。下面是可以由公开的方法和组合物治疗的癌症的非限制性实例：急性成淋巴细胞性白血病；急性髓性白血病；肾上腺皮质癌；肾上腺皮质癌，儿童；阑尾癌(Appendix Cancer)；基底细胞癌；胆管癌，肝外的；膀胱癌；骨癌；骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤；脑干神经胶质瘤，儿童；脑瘤，成年人；脑瘤，脑干神经胶质瘤，儿童；脑瘤，中枢神经系统非典型畸胎/横纹肌样瘤，儿童；中枢神经系统胚胎瘤；小脑星形细胞瘤；大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤；颅咽管瘤；室管膜母细胞瘤；室管膜瘤；成神经管细胞瘤；髓上皮瘤；中度分化松果体实质肿瘤(Pineal Parenchymal Tumors of intermediateDifferentiation)；幕上原始神经外胚层肿瘤(Supratentorial PrimitiveNeuroectodermal Tumor)和松果体母细胞瘤；视通路和下丘脑神经胶质瘤；脑和脊髓瘤；乳腺癌；支气管肿瘤；伯基特淋巴瘤；类癌瘤；类癌瘤，胃肠道；中枢神经系统非典型畸胎/横纹肌样瘤；中枢神经系统胚胎瘤；中枢神经系统淋巴瘤；小脑星形细胞瘤大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤，儿童；宫颈癌；脊索瘤，儿童；慢性淋巴细胞白血病；慢性粒细胞白血病；慢性骨髓增生性疾病；结肠癌；结肠直肠癌；颅咽管瘤；皮肤T细胞淋巴瘤；食道癌；尤因氏家族肿瘤(Ewing Family of Tumor)；性腺外生殖细胞瘤；肝外胆管癌；眼癌，眼内黑素瘤；眼癌，视网膜母细胞瘤；胆囊癌；胃部(胃)癌；胃肠道类癌瘤；胃肠道间质瘤(GIST)；生殖细胞瘤，颅外；生殖细胞瘤，性腺外；生殖细胞瘤，卵巢；妊娠滋养层肿瘤；神经胶质瘤；神经胶质瘤，儿童脑干；神经胶质瘤，儿童大脑星形细胞瘤；神经胶质瘤，儿童视通路和下丘脑；毛细胞白血病；头颈癌；肝细胞(肝)癌；组织细胞增多症，朗格罕细胞；何杰金淋巴瘤；下咽癌；下丘脑和视通路神经胶质瘤；眼内黑素瘤；胰岛细胞瘤；肾(肾细胞)癌；郎格罕细胞组织细胞增多症；喉癌；白血病，急性成淋巴细胞性；白血病，急性髓性；白血病，慢性淋巴细胞性；白血病，慢性粒细胞性；白血病，毛细胞；嘴唇和口腔癌；肝癌；肺癌，非小细胞；肺癌，小细胞；淋巴瘤，AIDS相关的；淋巴瘤，伯基特；淋巴瘤，皮肤T细胞；淋巴瘤，何杰金；淋巴瘤，非何杰金；淋巴瘤，原发性中枢神经系统；巨球蛋白血症，瓦尔登斯特伦病(Waldenstrom)；骨骼的恶性纤维组织细胞瘤(Histiocvtoma)和骨肉瘤；成神经管细胞瘤；黑素瘤；黑素瘤，眼内(眼)；梅克尔细胞癌；间皮瘤；具有隐性原发性的转移性鳞状颈部癌(Metastatic Squamous Neckcancer with Occult Primary)；嘴癌(mouth cancer)；多发性内分泌腺瘤形成综合征，(儿童)；多发性骨髓瘤/浆细胞瘤；真菌病；蕈样病(Fungoide)；骨髓发育不良综合征；骨髓发育不良/骨髓增生性疾病；粒细胞性白血病，慢性；髓细胞性白血病，成年人急性；髓细胞性白血病，儿童急性；骨髓瘤，多发性；骨髓增生性疾病，慢性；鼻腔和副鼻窦癌(Nasal Cavityand Paranasal Sinus Cancer)；鼻咽癌；成神经细胞瘤；非小细胞肺癌；口癌(oralcancer)；口腔癌；口咽癌；骨肉瘤和骨骼的恶性纤维组织细胞瘤；卵巢癌；卵巢上皮癌；卵巢生殖细胞肿瘤；卵巢低度潜在恶性肿瘤(Ovarian Low Malignant Potential Tumor)；胰腺癌；胰腺癌，胰岛细胞肿瘤；乳头状瘤病；甲状旁腺癌；阴茎癌；咽喉癌；嗜铬细胞瘤；副神经节瘤；中度分化的松果体实质肿瘤；松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤；垂体瘤；浆细胞瘤(Plasma Celt Neoplasm)/多发性骨髓瘤；胸膜肺胚细胞瘤；原发性中枢神经系统淋巴瘤；前列腺癌；直肠癌；肾细胞(肾)癌；肾盂及输尿管移行细胞癌；涉及15号染色体上的NUT基因的呼吸道癌；视网膜母细胞瘤；横纹肌肉瘤；唾腺癌；肉瘤，尤因氏家族肿瘤；肉瘤，卡波西；肉瘤，软组织；肉瘤，子宫；赛塞利综合征；皮肤癌(非黑素瘤)；皮肤癌(黑素瘤)；皮癌(Skin Carcinoma)，梅克尔细胞；小细胞肺癌；小肠癌；软组织肉瘤；鳞状细胞癌，具有隐性原发性的鳞状颈部癌，转移性；胃(胃部)癌；幕上原始神经外胚层肿瘤；T细胞淋巴瘤，表皮的；睾丸癌；喉癌；胸腺瘤和胸腺癌；甲状腺癌；肾盂和输尿管的移行细胞癌；滋养层肿瘤，妊娠期；尿道癌；子宫癌，子宫内膜；子宫肉瘤；阴道癌；外阴癌；瓦尔登斯特伦病巨球蛋白血症；和维尔姆斯肿瘤。
在一个实施方式中，本发明提供了治疗癌症的方法，其包括在施用本发明的肾酶结合分子之前、同时或之后用癌症的补充疗法，比如外科手术、化疗、化疗剂、放射疗法、或激素疗法或其组合，治疗对象。
化疗剂包括细胞毒素剂(例如，5-氟尿嘧啶、顺铂、卡铂、氨甲喋呤、柔红霉素、阿霉素、长春新碱、长春花碱、oxorubicin、卡莫司汀(BCNU)、环己亚硝脲(CCNU)、阿糖胞苷USP、环磷酰胺、雌莫司汀磷酸钠(estramucine phosphate sodium)、六甲蜜胺、羟基脲、异环磷酰胺、甲基苄肼、丝裂霉素、白消安、环磷酰胺、米托蒽醌、卡铂、顺铂、干扰素α-2a重组体、紫杉醇、替尼泊苷和链脲菌素(streptozoci))，细胞毒素烷化剂(例如，白消安、瘤可宁、环磷酰胺、美法仑或乙磺酸(ethylesulfonic acid))，烷化剂(例如，亮氨酸溶肉瘤素(asaley)、AZQ、BCNU、白消安、bisulphan、羧基邻苯二甲酰铂(carboxyphthalateplatinum)、CBDCA、CCNU、CHIP、瘤可宁、氯脲霉素、顺铂、氯乙矾、氰基吗啉基阿霉素(cyanomorpholinodoxorubicin)、cyclodisone、环磷酰胺、环氧乳醇、氟多潘、hepsulfam、羟胺硫蒽酮、异环磷酰胺、美法仑、甲基CCNU、丝裂霉素C、米托唑胺(mitozolamide)、氮芥、PCNU、哌嗪、哌嗪二酮、哌泊溴烷、甲基丝裂霉素、螺乙内酰脲芥(spirohydantoinmustard)、链脲酶素、替罗昔隆、四铂、噻替派、三乙撑蜜胺、尿嘧啶氮芥和Yoshi-864)，抗有丝分裂剂(例如，别秋水仙碱(allocolchicine)、软海绵素M、秋水仙碱、秋水仙碱衍生物、尾海兔素(dolastatin)10、美登素、根霉素(rhizoxin)、紫杉醇衍生物、紫杉醇、硫代秋水仙碱、三苯甲基半胱氨酸、硫酸长春花碱和硫酸长春新碱)，植物生物碱(例如，放线菌素D、博莱霉素、L-天冬酰胺酶、伊达比星、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、光辉霉素(mitramycin)、丝裂霉素、柔红霉素、VP-16-213、VM-26、长春瑞滨和泰素帝)，生物制品(例如，α干扰素、BCG、G-CSF、GM-CSF和白细胞介素-2)，I型拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱、喜树碱衍生物和吗啉基阿霉素)，II型拓扑异构酶抑制剂(例如，米托蒽醌(mitoxantron)、氨萘非特、m-AMSA、蒽吡唑衍生物、甲氧基吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)、HCL双蒽生、柔红霉素、脱氧阿霉素、美诺立尔、N,N-二苄基柔红霉素、oxanthrazole、柔红霉素苯腙(rubidazone)、VM-26和VP-16)，和合成类(例如，羟基脲、甲基苄肼、o,p'-DDD、达卡巴嗪、CCNU、BCNU、顺二氨二氯铂(cis-diamminedichloroplatimun)、米托蒽醌、CBDCA、左旋咪唑、六甲蜜胺、全反式视黄酸、卡氮芥(gliadel)和卟吩姆钠)。
抗增殖剂是降低细胞增殖的化合物。抗增殖剂包括烷化剂、抗代谢物、酶类、生物反应调节物、混杂药剂(miscellaneous agent)、激素和拮抗剂、雄性激素抑制剂(例如，氟他胺和亮丙瑞林醋酸盐)、抗雌激素(例如，它莫西芬柠檬酸盐和其类似物、托瑞米芬、屈洛昔芬和洛昔芬(roloxifene))，具体的抗增殖剂的另外的实例包括，但不限于左旋咪唑、硝酸镓、格雷西隆、沙格司亭锶(sargramostim strontium)-89氯化物、非格司亭、匹鲁卡品、右旋亚胺和昂丹司琼。
本发明的肾酶结合分子可以单独或与其它抗肿瘤药剂——包括细胞毒素/抗肿瘤剂和抗血管生成剂——组合施用。细胞毒素/抗肿瘤剂被定义为攻击和杀死癌细胞的药剂。一些细胞毒素/抗肿瘤剂是烷化剂，其使肿瘤细胞中的遗传物质烷基化，例如，顺铂、环磷酰胺、氮芥、三亚甲基硫代磷酰胺、卡莫丝汀、白消安、瘤可宁、布鲁司汀(belustine)、尿嘧啶芥、丙氯拉嗪(chlomaphazin)和达卡巴嗪(dacabazine)。其它细胞毒素/抗肿瘤剂是肿瘤细胞的抗代谢物，例如，胞嘧啶阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氨甲喋呤、巯基嘌呤(mercaptopuirine)、咪唑硫嘌呤(azathioprime)和甲基苄肼。其它细胞毒素/抗肿瘤剂是抗生素，例如，阿霉素、博莱霉素、放线菌素D、正定霉素、光神霉素、丝裂霉素、丝裂霉素C和柔红霉素。存在许多商业可得的这些化合物的脂质体制剂。仍其它细胞毒素/抗肿瘤剂是有丝分裂抑制剂(长春花生物碱)。这些包括长春新碱、长春花碱和依托泊苷。混杂细胞毒素/抗肿瘤剂包括紫杉醇和其衍生物、L-天冬酰胺酶、抗肿瘤抗体、达卡巴嗪、氮胞苷、氨吖啶、美法仑、VM-26、异环磷酰胺、米托蒽醌和长春地辛。
抗血管生成剂对于本领域技术人员而言是熟知的。用于本公开内容的方法和组合物的适合的抗血管生成剂包括抗VEGF抗体——其包括人源化和嵌合抗体、抗VEGF适配体和反义寡核苷酸。血管生成的其它已知的抑制剂包括制管张素、内皮抑制素、干扰素、白细胞介素1(包括α和β)、白细胞介素12、视黄酸和金属蛋白酶-1和-2的组织抑制剂(TIMP-1和-2)。也可以使用小分子，包括拓扑异构酶比如雷佐生，一种具有抗血管生成活性的II型拓扑异构酶抑制剂。
可以与公开的化合物组合使用的其它抗癌药包括，但不限于：阿西维辛；阿柔比星；盐酸阿考达唑(acodazole)；阿克罗宁；阿多来新(adozelesin)；阿地白介素；六甲蜜胺；二霉素；醋酸阿美蒽醌；氨鲁米特；氨吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素；阿扎胞苷；阿扎替派；含氮霉素；巴马司他；苄替哌；比卡鲁胺；盐酸双蒽生；二甲磺酸双奈法德(bisnafide dimesylate)；比折来新；硫酸博莱霉素；布喹那钠；溴匹立明；白消安；放线菌素C；卡普睾酮；卡醋胺；卡贝替姆；卡铂；卡莫司汀；盐酸卡柔比星；卡折来新；西地芬戈；瘤可宁；西罗霉素；顺铂；克拉屈滨；甲磺酸克雷斯托(crisnatol mesylate)；环磷酰胺；阿糖胞苷；达卡巴嗪；放线菌素D；盐酸正定霉素；地西他滨；右奥马铂；地扎胍宁；甲磺酸地扎胍宁；亚丝醌；多西紫杉醇；阿霉素；盐酸阿霉素；屈洛昔芬；柠檬酸屈洛昔芬；丙酸甲雄烷酮；偶氮霉素；依达曲沙；盐酸依氟鸟氨酸；依沙芦星；恩洛铂；恩普氨酯；依匹哌啶；盐酸表柔比星；厄布洛唑；盐酸依索比星；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸钠；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；氯苯乙嘧胺；盐酸法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；氟尿苷；磷酸氟达拉滨；氟尿嘧啶；氟卡培他滨(fluorocitabine)；磷喹酮；福司曲星钠(fostriecin sodium)；吉西他滨；盐酸吉西他滨；羟基脲；盐酸伊达比星；异环磷酰胺；伊莫福新；白细胞介素II(包括重组白细胞介素II，或rIL2)；干扰素α-2a；干扰素α-2b；干扰素α-n1；干扰素α-n3；干扰素β-I a；干扰素γ-I b；异丙铂；盐酸伊立替康；醋酸兰瑞肽；来曲唑；醋酸亮丙瑞林；盐酸利阿唑；洛美曲索钠(lometrexol sodium)；环己亚硝脲；盐酸洛索蒽醌；马索罗酚；美登素；盐酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美仑孕酮；美法仑；美诺立尔；巯嘌呤；氨甲喋呤；氨甲喋呤钠；氯苯氨啶；美妥替哌；米丁度胺；米托卡星；丝裂红素；米托菌素；米托马星；丝裂霉素；丝裂帕菌素；米托坦；盐酸米托蒽醌；霉酚酸；诺考达唑；诺加霉素；奥马铂；奥昔舒仑；紫杉醇；白蛋白结合型紫杉醇(albumin-bound paclitaxel)；培门冬酶；培利霉素；戊氮芥(pentamustine)；硫酸培洛霉素；培磷酰胺；哌泊溴烷；嗪消安；盐酸吡罗蒽醌；普卡霉素；普洛美坦；卟菲尔钠；甲基丝裂霉素；泼尼莫司汀；盐酸甲基苄肼；嘌呤霉素；盐酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；罗谷亚胺；沙芬戈；盐酸沙芬戈；司莫司汀；辛曲秦；头孢菌素钠(sparfosate sodium)；司帕霉素；盐酸螺锗；螺莫司汀；螺铂；链黑菌素；链脲菌素；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉素；替可加兰钠(tecogalan sodium)；喃氟啶；盐酸替洛蒽醌；替莫泊芬；替尼泊苷；替尼昔隆(teroxirone)；睾内酯；硫咪嘌呤；巯鸟嘌呤；塞替派；噻唑羧胺核苷(tiazofurin)；替拉扎明；柠檬酸托瑞米芬；醋酸曲托龙；磷酸曲西瑞宾；三甲曲沙；三甲曲沙葡萄糖醛酸酯；曲普瑞林；盐酸妥布氯唑；尿嘧啶芥；乌瑞替派；伐普肽；维替泊芬；硫酸长春花碱；硫酸长春新碱；长春地辛；硫酸长春地辛；硫酸长春匹定；硫酸长春甘酯；硫酸长春罗新；长春瑞滨；酒石酸长春瑞滨；硫酸长春罗定；硫酸长春利定；伏罗唑；折尼铂；净司他丁；盐酸佐柔比星。其它抗癌症药物包括但不限于：20-表(epi)-1,25二羟维生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龙；阿柔比星；酰基富烯；腺环戊醇；阿多来新；阿地白介素；ALL-TK拮抗剂；六甲蜜胺；氨莫司汀；美沙酮(amidox)；氨磷汀；氨基乙酰丙酸；氨柔比星；氨吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心莲内酯；血管生成抑制剂；拮抗剂D；拮抗剂G；安雷利克斯(antarelix)；抗背侧化形态发生蛋白-1；抗雄激素，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反义寡核苷酸；甘氨酸阿非迪霉素；细胞凋亡基因调节剂；细胞凋亡调节剂；无嘌呤酸；阿拉伯糖(ara)-CDP-DL-PTBA；精氨酸脱氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿莫司汀；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎司琼；阿扎毒素(azatoxin)；重氮酪氨酸；浆果赤霉素III衍生物；balanol；巴马司他；BCR/ABL拮抗剂；苯并二氢卟酚(benzochlorins)；苯甲酰基十字孢碱(benzoylstaurosporine)；β内酰胺衍生物；β-alethine；betaclamycin B；桦木酸；bFGF抑制剂；比卡鲁胺；双蒽生；双吖丙啶基精胺；双萘法德；bistratene A；比折来新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁胱亚磺酰亚胺；钙泊三醇；卡弗他丁C；喜树碱衍生物；金丝雀痘IL-2；卡培他滨；甲酰胺-氨基-三唑；羧胺三唑；CaRest M3；CARN 700；软骨衍生抑制剂；卡折来新；酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)；栗精胺；杀菌肽B；西曲瑞克；二氢卟吩；氯代喹喔啉磺胺(chloroquinoxaline sulfonamide)；西卡前列素；顺卟啉；克拉屈滨；氯米芬类似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；康普瑞汀A4；康普瑞汀类似物；conagenin；crambescidin 816；克雷斯托；念珠藻素8；念珠藻素A衍生物；curacin A；环戊烷蒽醌类(cyclopentanthraquinones)；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷十八烷基磷酸钠；溶细胞因子；细胞抑制剂；达昔单抗；地西他滨；脱氢膜海鞘素B；地洛瑞林；地塞米松；右异环磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生；右维拉帕米；地吖醌；膜海鞘素B；didox；二乙基去静胺(diethylnorspermine)；二氢-5-氮杂胞苷；二氢紫杉醇，9-；二氧霉素(dioxamycin)；二苯基螺莫司汀；多西紫杉醇；二十二醇；多拉司琼；去氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；多卡米星(duocarmycin)SA；依布硒啉；依考莫司汀；依地福新；依决洛单抗；依氟鸟氨酸；榄香烯；乙嘧替氟；表柔比星；爱普列特；雌莫司汀类似物；雌激素激动剂；雌激素拮抗剂；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法倔唑；法扎拉滨；芬维A胺；非格司亭；非那雄胺；夫拉平度；氟卓斯汀；fluasterone；氟达拉滨；盐酸氟代正定霉素(fluorodaunorunicin hydrochloride)；福酚美克；福美司坦；福司曲星；福莫司汀；钆特沙弗林(gadolinium texaphyrin)；硝酸镓；加洛他滨；加尼瑞克；明胶酶抑制剂；吉西他滨；谷胱甘肽抑制剂；hepsulfam；调蛋白；六亚甲基二乙酰胺；金丝桃素；伊班膦酸；去甲氧基柔红霉素；吲哚昔酚；伊决孟酮；伊莫福新；伊洛马司他；咪唑并吖啶酮；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰岛素样生长因子-1受体抑制剂；干扰素激动剂；干扰素；白细胞介素；碘苄胍；碘阿霉素(iododoxorubicin)；甘薯苦醇，4-；伊罗普拉；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司琼；jasplakinolide；kahalalide F；三醋酸片螺素-N；兰瑞肽；leinamycin；来格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；来曲唑；白血病抑制因子；白细胞α干扰素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；线性聚胺类似物；亲脂性二糖肽；亲脂性铂化合物；lissoclinamide 7；洛铂；蚯吲磷脂；洛美曲索；氯尼达明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛索立宾；勒托替康；lutetium texaphyrin；lysofylline；裂解性肽；美坦辛；制甘糖酶素A(mannostatin A)；马马司他；马司莫单抗；乳腺丝抑蛋白；基质溶解因子抑制剂；基质金属蛋白酶抑制剂；美诺立尔；麦尔巴隆(merbarone)；美替瑞林；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制剂；米非司酮；米替福新；米立司亭；错配的双链RNA；米托胍腙；二溴卫矛醇；丝裂霉素类似物；米托萘胺；迈托毒素(mitotoxin)纤维母细胞生长因子-皂草素；米托蒽醌；莫法罗汀；莫拉司亭；单克隆抗体，人绒膜促性腺激素；单磷酰酯A+分枝杆菌细胞壁SK；莫哌达醇；多重耐药基因抑制剂；多肿瘤抑制基因1-基疗法；芥子抗癌药(mustardanticancer agent)；印度洋海绵B(mycaperoxide B)；分枝杆菌细胞壁提取物；myriaporone；N-乙酰基地那林；N-取代的苯甲酰胺；那法瑞林；nagrestip；纳洛酮+喷他佐辛；napavin；naphterpin；那托司亭；奈达铂；奈莫柔比星；奈立膦酸；中性肽链内切酶；尼鲁米特；nisamycin；氧化氮调节剂；硝基氧抗氧化剂；nitrullyn；O6-苄基鸟嘌呤；奥曲肽；okicenone；寡核苷酸；奥那司酮；昂丹司琼；昂丹司琼；oracin；口服细胞因子诱导物；奥马铂；奥沙特隆；奥沙利铂；Oxaunomycin；太平洋紫杉醇；太平洋紫杉醇类似物；太平洋紫杉醇衍生物；派劳胺(palauamine)；棕榈酰根霉素(palmitoylrhizoxin)；帕米磷酸；人参三醇；帕诺米芬；parabactin；帕折普汀；培门冬酶；培得星(peldesine)；戊聚糖聚硫酸钠；喷司他丁；pentrozole；全氟溴烷；培磷酰胺；紫苏子醇；吩嗪霉素(phenazinomycin)；乙酸苯酯；磷酸抑制剂；溶链菌制剂；盐酸毛果芸香碱；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纤溶酶原激活药抑制剂；铂复合物；铂化合物；铂-三胺复合物；卟吩姆钠；泊非霉素；强的松；丙基二吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶体抑制剂；基于蛋白A的免疫调节物；蛋白激酶C抑制剂；蛋白激酶C抑制剂，微藻；蛋白质酪氨酸磷酸抑制剂；嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂；红紫素；吡唑啉吖啶；吡哆基化的血红素聚氧乙烯缀合物；Raf拮抗剂；雷替曲塞；雷莫司琼；Ras法尼基蛋白质转移酶抑制剂；Ras抑制剂；Ras-GAP抑制剂；去甲基化瑞替普汀；铼Re 186依替膦酸盐；根霉素；核酶；RII维甲酰胺；罗谷亚胺；罗希吐碱；罗莫肽；罗喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；肌肉叶绿醇A；沙格司亭；Sdi 1模拟物；司莫司汀；衰老衍生的抑制剂1；有义寡核苷酸；信号转导抑制剂；信号转导调节子；单链抗原结合蛋白质；西佐喃(sizofuran)；索布佐生；硼卡钠；苯基乙酸钠；solverol；生长调节素结合蛋白质；索钠明；斯帕磷酸；spicamycin D；螺莫司汀；斯耐潘定；海绵抑制素1；角鲨胺；干细胞抑制剂；干细胞分裂抑制剂；密挤青霉酰胺(stipiamide)；溶基质素抑制剂；sulfinosine；超活性血管活性肠肽拮抗剂；suradista；苏拉明；苦马豆碱；合成的糖胺聚糖；他莫司汀；它莫西芬甲碘化物；牛碘莫司汀；他扎罗汀；替可加兰钠；替加氟；tellurapyrylium；端粒酶抑制剂；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；四氯癸氧化物(tetrachlorodecaoxide)；tetrazomine；thaliblastine；硫代珊瑚精(thiocoraline)；血栓形成素；血栓形成素模拟物；胸腺法新；促胸腺生成素受体激动剂；胸腺曲南；甲状腺刺激激素；锡乙基初红紫素(etiopurpurin)；替拉扎明；环戊二烯钛二氯化物；topsentin；托瑞米芬；全能干细胞因子；翻译抑制剂；维A酸；三乙酰尿苷；曲西立滨；三甲曲沙；曲普瑞林；托烷司琼；妥罗雄脲；酪氨酸激酶抑制剂；tyrphostins；UBC抑制剂；乌苯美司；尿生殖窦衍生的生长抑制因子；尿激酶受体拮抗剂；伐普肽；variolin B；载体系统，红血球基因疗法；维拉雷锁；veramine；verdins；维替泊芬；长春瑞宾；vinxaltine；vitaxin；伏氯唑；扎诺特隆；折尼铂；亚苄维C；imilimumab；米氮平；BrUOG 278；BrUOG292；RAD0001；CT-011；folfirinox；替吡法尼；R115777；LDE225；骨化三醇；AZD6244；AMG 655；AMG 479；BKM120；mFOLFOX6；NC-6004；西妥昔单抗；IM-C225；LGX818；MEK162；BBI608；MEDI4736；威罗非尼；易普利姆玛；ivolumab；nivolumab；帕比司他；来氟米特；CEP-32496；阿仑单抗；贝伐单抗；奥法木单抗；帕尼单抗；派姆单抗；利妥昔单抗；曲妥单抗；STAT3抑制剂(例如，STA-21、LLL-3、LLL12、XZH-5、S31-201、SF-1066、SF-1087、STX-0119、隐丹参酮、姜黄色素、二阿魏酰甲烷(diferuloylmethane)、FLLL11、FLLL12、FLLL32、FLLL62、C3、C30、C188、C188-9、LY5、OPB-31121、乙嘧啶、OPB-51602、AZD9150等)；缺氧诱导因子1(HIF-1)抑制剂(例如，LW6、地高辛、laurenditerpenol、PX-478、RX-0047、牡荆黄素、KC7F2、YC-1等)和净司他丁斯酯。在一个实施方式中，抗癌症药物是5-氟尿嘧啶、紫杉醇或亚叶酸。
诊断方法
在一些实施方式中，与比较物相比，对象的细胞、组织或体液中肾酶或肾酶片段的水平的增加在本发明的方法中被用作诊断疾病或紊乱、评估疾病或紊乱的严重性和用于监测疾病或紊乱的治疗效果或效力的标记。在各个实施方式中，疾病或紊乱是急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病或紊乱(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状性左心室功能紊乱、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或紊乱、肾脏疾病或紊乱、胃肠道疾病或紊乱、肝脏疾病或紊乱、肺疾病或紊乱、胰腺疾病或紊乱(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊乱(例如，抑郁、焦虑等)或神经学疾病或紊乱。
在一个实施方式中，本发明是通过评估对象的生物学样本中的肾酶或肾酶片段的水平来诊断对象的疾病或紊乱的方法。在一个实施方式中，对象的生物学样本是细胞、组织或体液。其中肾酶或肾酶片段的水平可被评估的体液的非限制性实例包括但不限于血液、血清、血浆和尿。在各个实施方式中，将对象的生物学样本中的肾酶或肾酶片段的水平与比较物中肾酶或肾酶片段水平进行比较。比较物的非限制性实例包括但不限于阴性对照、阳性对照、对象的预期的正常背景值、对象的历史正常背景值、对象为其成员的群体的预期正常背景值或对象为其成员的群体的历史正常背景值。在各个实施方式中，疾病或紊乱是急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病或紊乱(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状性左心室功能紊乱、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或紊乱、肾脏疾病或紊乱、胃肠道疾病或紊乱、肝脏疾病或紊乱、肺疾病或紊乱、胰腺疾病或紊乱(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊乱(例如，抑郁、焦虑等)或神经学疾病或紊乱。在一些实施方式中，诊断方法包括治疗患者的诊断的疾病或紊乱的进一步步骤。
在另一个实施方式中，本发明是通过评估对象的生物学样本中的肾酶或肾酶片段的水平来评估对象的疾病或紊乱的严重性的方法。在一个实施方式中，对象的生物学样本是细胞、组织或体液。其中肾酶或肾酶片段的水平可被评估的体液的非限制性实例包括但不限于血液、血清、血浆和尿。在各个实施方式中，将对象的生物学样本中的肾酶或肾酶片段的水平与比较物中肾酶或肾酶片段水平进行比较。比较物的非限制性实例包括但不限于阴性对照、阳性对照、对象的预期的正常背景值、对象的历史正常背景值、对象为其成员的群体的预期正常背景值或对象为其成员的群体的历史正常背景值。在各个实施方式中，疾病或紊乱是急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病或紊乱(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状性左心室功能紊乱、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或紊乱、肾脏疾病或紊乱、胃肠道疾病或紊乱、肝脏疾病或紊乱、肺疾病或紊乱、胰腺疾病或紊乱(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊乱(例如，抑郁、焦虑等)或神经学疾病或紊乱。在一些实施方式中，评估严重性的方法包括治疗患者的疾病或紊乱的进一步步骤。
在另一个实施方式中，本发明是通过评估对象的生物学样本中的肾酶或肾酶片段的水平来监测对象的疾病或紊乱的治疗效果的方法。在一个实施方式中，对象的生物学样本是细胞、组织或体液。其中肾酶或肾酶片段的水平可被评估的体液的非限制性实例包括但不限于血液、血清、血浆和尿。在各个实施方式中，将对象的生物学样本中的肾酶或肾酶片段的水平与比较物中肾酶或肾酶片段水平进行比较。比较物的非限制性实例包括但不限于阴性对照、阳性对照、对象的预期的正常背景值、对象的历史正常背景值、对象为其成员的群体的预期正常背景值或对象为其成员的群体的历史正常背景值。在各个实施方式中，疾病或紊乱是急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病或紊乱(例如，高血压、肺动脉高血压、收缩期高血压、糖尿病高血压、无症状性左心室功能紊乱、慢性充血性心力衰竭、心肌梗死、心律失常、动脉粥样硬化等)、癌症、心脏疾病或紊乱、肾脏疾病或紊乱、胃肠道疾病或紊乱、肝脏疾病或紊乱、肺疾病或紊乱、胰腺疾病或紊乱(例如，胰腺炎)、精神疾病或紊乱(例如，抑郁、焦虑等)或神经学疾病或紊乱。在一些实施方式中，监测治疗效果的方法包括治疗患者的疾病或紊乱的进一步步骤。
在各个实施方式中，对象是人对象，并且可以具有任何种族、性别和年龄。代表性的对象包括被怀疑已经经历疾病或紊乱的那些患者，已经被诊断为已经经历疾病或紊乱的那些患者，已经被诊断为患有疾病或紊乱的那些患者，和处于发展疾病或紊乱的风险下的那些患者。
自本文描述的发明的方法获得的信息可以单独使用，或者与来自对象或来自从对象获得的生物学样本的其它信息(例如，疾病状态、疾病史、生命征兆、血液化学等)组合使用。
在本发明的诊断方法中，评估从对象获得的生物学样本的包含在其中的肾酶或肾酶片段的水平。在一个实施方式中，生物学样本是至少包含在本文描述的方法中有用的肾酶多肽的片段的样本。
在本发明的方法的其它各个实施方式中，当与比较物对照比较时，肾酶或肾酶片段的水平增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％时，肾酶的水平被确定为增加。在各个实施方式中，肾酶或肾酶片段的增加水平指示疾病或紊乱。在各个实施方式中，疾病或紊乱是急性肾衰竭(即，急性肾小管坏死或ATN——一种肾脏中的缺血性病症)、心血管疾病和癌症。
在本发明的方法中，评估来自对象的生物学样本：从患者获得的生物学样本中肾酶或肾酶片段的水平。生物学样本中肾酶或肾酶片段的水平可以通过评估生物学样本中的肾酶多肽或片段的量、生物学样本中肾酶mRNA或片段的量、生物学样本中肾酶活性(例如，酶活性、底物结合活性、受体结合活性等)的量或其组合测定。在一些实施方式中，生物学样本中的肾酶的水平在使用本文别处描述的本发明的肾酶结合分子中的至少一种的分析中测定。
在本发明的方法的各个实施方式中，测量从患者获得的生物学样本中肾酶水平的方法包括但不限于免疫色谱分析、免疫斑点分析、Luminex分析、ELISA分析、ELISPOT分析、蛋白微阵列分析、蛋白质印迹分析、质谱分光光度分析、放射免疫分析(RIA)、放射免疫扩散分析、液相色谱-串联质谱分析、乌赫特朗尼式免疫扩散分析、反相蛋白微阵列、火箭免疫电泳分析、免疫组织染色分析、免疫沉淀分析、补体结合分析、FACS、酶-底物结合分析、酶法分析、采用可检测分子——比如发色团、荧光团或放射性底物——的酶法分析、采用这样底物的底物结合分析、采用这样底物的底物替代分析(substrate displacement assay)和蛋白芯片分析(还参见2007,Van Emon,Immunoassay and Other Bioanalytical Techniques,CRC Press；2005,Wild,Immunoassay Handbook,Gulf Professional Publishing；1996,Diamandis and Christopoulos,Immunoassay,Academic Press；2005,Joos,Microarraysin Clinical Diagnosis,Humana Press；2005,Hamdan and Righetti,Proteomics Today,John Wiley and Sons；2007)。在一些实施方式中，生物学样本中肾酶的水平利用如此分析来测量：该分析使用本文别处描述的本发明的肾酶结合分子中的至少一种。
试剂盒
本发明还包括试剂盒，其包括本发明的肾酶结合分子(例如，抗体等)或其组合，和指导材料，其描述例如将肾酶结合分子或其组合施用至个体，作为如本文别处描述的治疗性处理或非治疗用途。在实施方式中，该试剂盒进一步包括适合于溶解或悬浮本发明的治疗性组合物——其包括肾酶结合分子或其组合——的(优选地无菌的)药学上可接受的载体，例如，然后将本发明的肾酶结合分子施用至个体。任选地，试剂盒包括用于施用该肾酶结合分子的施加器。
实验实施例
现在参照下面的实施例描述本发明。这些实施例仅出于说明的目的提供并且本发明决不应当被解释为限于这些实施例，而是应当被解释为包含由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变体。
在没有进一步描述的情况下，据信，本领域普通技术人员可以使用在前的描述和下面的说明性实施例制备和利用本发明的化合物并实践要求保护的方法。下面的工作实施例因此具体地指出了本发明的优选的实施方式，并且不被解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
实施例1：肾酶抗体的开发
肽被用作免疫原。生成的肽范围在9到21个氨基酸并且对应于肾酶-1和肾酶-2蛋白的区域。所有的肽具有N或C末端半胱氨酸残基。肽的序列可见于表1并且这些肽对应于肾酶-1或2序列的位置在图4的序列比对中图解。可见，肾酶-1特异性肽被标记1A-F和肾酶-2特异性肽被标记3A5。每种肽经由半胱氨酸被缀合至佐剂KLH并且被用于免疫6只兔子。自每只动物收集的抗血清使用相关肽(BSA-缀合物)或全长肾酶-1或2二者通过ELISA分析筛选抗肾酶抗体效价。还通过蛋白质印迹测试抗血清检测组织溶胞产物中内源肾酶的能力。使用这些筛选标准，选择产生具有优选特征的抗体的动物。在一些实施例中和对于一些肽，数只动物产生具有需要特异性的抗体。在这些情况下，一只动物最终抗血清出血，用于多克隆抗体生产，并且一只或在一些实施例中其它两只动物被用于收获脾淋巴细胞。在其它实施例中，单只动物最终出血(terminal bleed)并进行脾切除术。针对所有肽培养的多克隆抗体通过如下步骤生成：通过G蛋白色谱法纯化来自最终出血的总IgG，然后使用肽亲和色谱法进一步纯化。进一步和使用标准程序，来自选择的动物的脾脏的淋巴细胞被融合至骨髓瘤细胞用于杂交瘤生成。杂交瘤上清液被筛选用于结合至其培养所针对的肽和针对整个肾酶蛋白二次筛选的肽二者。选择的杂交瘤被亚克隆和扩展用于抗体纯化。通过A蛋白亲和色谱法从条件杂交瘤培养上清液纯化单克隆抗体。
表1-用于生成抗肾酶抗体的肾酶肽的序列
由Biocore测定的抗体亲和力
结合研究使用Biacore T100执行。结合研究在25℃下使用25mM Tris pH 8、150mMNaCl、1mM EDTA、10％甘油、0.005％吐温-20和0.1mg/mL BSA作为电泳缓冲液进行。生物素化抗体在如下面示出的个体链酶亲和素传感器芯片流动池上捕获。由于该研究采用两个传感器芯片，因此在第二传感器芯片上mAb中两个的分析被重复以收集更多数据。以3倍稀释系列，在50nM作为最高浓度下测试肾酶-1。5个浓度中的每个一式二份测试。利用1/1000磷酸的短脉冲再生结合的复合物。数据集被整体拟合以提取在表2中总结的结合常数的估计值。
表2-如通过Biocore测定的肾酶单克隆的亲和力
lgG ka(M-1s-1) kd(s-1) KD(nM)
Bio-1D 28-4 6.467(4)e4 2.04(3)e-5 0.316(5)
Bio-1F 42-7 3.928(5)e4 9.47(6)e-5 2.41(2)
Bio-1D 37-10 1.749(5)e4 4.67(4)e-5 2.67(3)
Bio-1F 26-1 4.526(8)e4 1.020(9)e-4 2.25(2)
1D28-4具有最高亲和力并且在抑制研究中使用。
抗肾酶抗体的核苷酸和氨基酸序列
筛选单克隆抗体1D-28-4、1D-37-10、1F-26-1、1F-42-7和3A-5-2的肾酶结合特异性和高亲和力。使用标准聚合酶链反应过程和简并引物集，自亚克隆的杂交瘤扩增这些抗体的抗体重和轻链可变区的cDNA。1D-28-4的可变区核苷酸和氨基酸序列(RP-220)在图5中示出。以这种方式，示例了具有优选特征的抗体的组合物。
通过抗体抑制肾酶信号传导降低癌细胞的存活
由于肾酶表达在数种癌细胞系(图6)中被上调，因此进行实验以确定肾酶是否对癌细胞提供存活优势。已经发现与正常皮肤相比，肾酶表达在痣和转移性黑素瘤中显著地增加(图7)，这暗示肾酶对黑素细胞提供存活优势。此外，RenMonoAb1(针对RP-220培养的单克隆)在降低A375.S2(具有突变B-Raf(V600E)的黑素瘤细胞系)的活力中是高效的，并展示了与对黑素瘤有效的两种烷化剂的协同作用：替莫唑胺(图8)和达卡巴嗪(图9)。RenMonoAb1在降低黑素瘤细胞系Sk-Mel-28(表达突变B-Raf(V600E)和野生型N-Ras)的活力中也是有效的并且显示了与替莫唑胺的协同作用(图10)。
然后，进行实验以确定RenMonoAb1的抑制作用对黑素瘤是否是特异性的，或者它是否影响更宽范围的肿瘤细胞。CCL-119细胞(CCF-MEC，急性成淋巴细胞性白血病细胞系；美国模式培养物保藏所)快速分裂并且表达高水平的肾酶，在组成NCI-60板的细胞中超过平均值(来自BioGPS.org的微阵列数据)大约3.8倍。RenMonoAb1显著降低了培养中CCL-119细胞的活力(图11)。类似地，RenMonoAb1还抑制两种胰腺癌细胞系MiaPac和Panc1的生长(图12-13)。图14是描绘肾酶单克隆抗体对黑素瘤细胞数目和形态的影响的显微照片。观察到肾酶单克隆(例如，1D-28-4)抑制培养中的黑素瘤细胞。图15显示了两种另外的1C-22-1和D-37-10肾酶单克隆抗体也抑制黑素瘤细胞生长。这些数据表明肾酶抑制可以在数种癌症中是有用的治疗选择。
与黑素瘤患者中的不良结果相关联的肾酶过表达
检查从Yale发现和转移性系列(随访263名患者长达30年)获得的原发性和转移性肿瘤样本中肾酶的表达。使用自动定量分析(AQUA)技术(Gould等，2009Journal ofClinical Oncology,27:5772-5780)——其为在通过用抗S-100和抗gp100二者标记限定的隔室内测定目标抗原表达的方法——进行基于荧光的免疫组织化学染色。发现黑素瘤组织中升高的肾酶表达与疾病特异性死亡率的显著增加相关联(图16)，这暗示肾酶作用的抑制在该疾病中可以是有用的治疗选择。
实施例2：通过可选激活的肿瘤相关巨噬细胞的肾酶表达通过STAT3介导的机制促 进黑素瘤生长
由于RNLS起参与MAPK和PI3K途径的存活因子的功能，并因为其表达受STAT3调节(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)，因此问题是RNLS表达和信号传导是否对癌细胞提供存活优势。焦点在黑素瘤上，黑素瘤是如此疾病：在该疾病中MAPK、PI3K和JAK/STAT途径被异常调节，和对于该疾病另外的治疗靶标将是期望的。
RNLS表达在黑素瘤细胞系和肿瘤样本中显著增加。在患有转移性黑素瘤的患者中，RNLS表达与疾病特异性存活负相关。RNLS在黑素瘤中的表达模式的检查暗示上调主要发生在肿瘤相关基质的细胞成分中，具体地在CD163+巨噬细胞中。实验数据表明募集进入肿瘤的可选激活的巨噬细胞(M2样，CD163+)抑制针对肿瘤的免疫应答，增加血管生成和促进肿瘤细胞迁移、入侵和传播(Ruhrberg等，2010Nat Med.16:861-2；Pollard等，2004NatRev Cancer.4:71-8；Hao等，2012Clinical and Developmental Immunology.2012:11)。TAM占人黑素瘤中和在该工作中描述的异种移植模型中肿瘤质量的显著百分比。
RNLS优选地在CD162+TAM中表达，这暗示M2样TAM可以通过分泌RNLS促进肿瘤进展。图22C图解了并入关键机制的工作模型，该机制是利用抑制RNLS信号传导观察到的抗肿瘤作用的基础。通过RNLS单克隆m28-RNLS抑制RNLS信号传导增加了CD86+与CD163+TAM的比率，并降低了通过CD163+TAM的RNLS分泌。此外，m28-RNLS抑制黑素瘤细胞中RNLS信号传导。净结果是总的和磷酸化的STAT3的急剧下降，这导致细胞凋亡。
调节RNLS基因表达的调节启动子元件和转录因子已经在最近被研究(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)并且这些数据表明STAT3的关键作用。结果暗示RNLS和STAT3之间的前馈环的存在，其中上调STAT3的信号增加RNLS基因表达，其又增加STAT3活性。RNLS和STAT3之间的这样的相互作用的存在对于RNLS信号传导在癌症发病机制中的作用具有重要启示。的确，存在大量数据表明在促进恶性转化和癌症进展的炎性微环境的诱发和维持中，STAT家族蛋白质尤其是STAT3的关键作用(Yu等，2009Nat RevCancer.9:798-809)。STAT3信号传导通常在恶性细胞中持久地激活，并且这样的激活不仅驱动肿瘤细胞增殖，而且增加支撑肿瘤微环境中炎症的大量基因的产生。癌细胞与非转化的和基质细胞之间的STAT3前馈环已经在癌症中证明(Catlett-Falcone等，1999Immunity.10:105-15；Yu等，2007Nat Rev Immunol.7:41-51；Ara等，2009CancerRes.69:329-37)。例如，STAT3在多发性骨髓瘤患者中组成性地激活。在IL-6依赖性人骨髓瘤细胞系U266中，IL-6通过詹纳斯激酶发信号以激活STAT3，其又上调抗细胞凋亡因子，并促进肿瘤细胞的存活(Catlett-Falcone等，1999Immunity.10:105-15)。通过各种机制，STAT3也已经被发现为在大多数黑素瘤中组成性地激活，导致肿瘤细胞存活、增殖、转移、血管生成的增加，和肿瘤免疫应答的降低(Lesinski等，2013Future oncology.9:925-7；Kortylewski等，2005Cancer metastasis reviews.24:315-27；Emeagi等，2013Genetherapy.20:1085-92；Yang等，2010International journal of interferon,cytokineand mediator research:IJIM.2010:1-7)。
通过增加抗细胞凋亡因子Bcl2和阻止效应物胱天蛋白酶的激活，RNLS介导细胞保护作用(Wang等，2014Journal of the American Society of Nephrology DOI:10.1681/asn.2013060665)。A375.S2细胞中RNLS信号传导的抑制与p38MAPK的持续激活，然后细胞凋亡因子Bax的激活，和细胞凋亡相关联。MAPK p38是已经牵连于炎症、细胞分化、细胞周期调节和细胞凋亡的应激激活蛋白激酶(Ono等，2000Cellular Signalling.12:1-13)。例如，显示神经生长因子停药(withdrawal)引起在JNK和p38的持续激活和ERK的下调之后的细胞凋亡(Xia等，1995Science.270:1326-31)。但是，由于在某些条件下p38的抑制可以阻断细胞凋亡(Ono等，2000Cellular Signalling.12:1-130)，因此p38在细胞凋亡中的作用明确地是环境依赖性的(context dependent)。这些数据暗示在A375.S2细胞中，p38的RNLS依赖性激活引起细胞凋亡。
RNLS信号传导的抑制显著地降低了Ki-67在黑素瘤的异种移植(xenograph)中的表达。由于Ki-67是已经被广泛用于评估肿瘤的增殖能力的细胞增殖的明确定义的标记，因此数据被解释为表明RNLS信号传导是肿瘤增殖的关键驱动因素(driver)，并且RNLS抑制降低肿瘤的增殖速率。确定细胞周期进程的许多关键因素已经被鉴定，并且包括一组细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)以及两类CDK抑制剂，即细胞周期蛋白依赖性激酶4的抑制剂(INK4)和CDK互作蛋白(interacting protein)/激酶抑制剂蛋白(CIP/KIP)家族(Jung等，2010Cellular Signalling.22:1003-12)。p21——其为属于CIP/KIP家族的CDK抑制剂——的表达通过RNLS信号传导调节。RNLS信号传导的抑制与p21表达的明显增加相关联。p21是细胞周期的负调节物，其可以维持细胞在G0，阻断G1/S转变，和引起G1或S相间(inter-Sphase)停滞(Jung等，2010Cellular Signalling.22:1003-12)。因此，p21表达的增加可以解释在用抗RNLS抗体治疗的肿瘤中观察到的细胞增殖的降低。此外，还已经显示p38影响细胞周期进展(Ono等，2000Cellular Signalling.12:1-13)，和通过抗RNLS治疗的p38的激活还可以促进细胞周期停滞。
这些发现确认了RNLS为可以促进癌细胞的存活和生长的分泌蛋白，并提供了进一步研究抗RNLS疗法单独或与其它TAM-或黑素瘤-抑制药物比如CSF-1R抑制剂或MAPK途径抑制剂分别联合用于治疗恶性黑素瘤的用途的框架。因为存在用于调节MAPK和PI3K和JAK/STAT3的多种机制和由于存在途径之间的串扰，因此细胞命运取决于多种信号的动态平衡和整合，并且该数据暗示了RNLS抑制将朝向癌细胞死亡的平衡倾斜。
现在描述在该实施例中使用的材料和方法。
试剂
人黑素瘤细胞系A375.S2、SkMel28、SkMel5、MeWo和WM266-4获得自美国模式培养物保藏所并按照推荐保持。重组人RNLS如所描述的表达、纯化、浓缩和针对PBS透析(Desir等，Journal of the American Heart Association.2012；1:e002634)。RNLS肽RP220和突变的肽RP220A在United Peptide下合成。兔抗RNLS单克隆抗体(AB178700)、山羊多克隆抗RNLS抗体(AB31291)、山羊IgG和兔IgG购买自Abcam。
合成抗RNLS单克隆抗体m28-RNLS(也称为1D-28-4)、m37-RNLS(也称为1D-37-10)
RNLS肽RP-220被缀合至KLH和被用于免疫6只兔子，并且来自选择的动物的脾脏的淋巴细胞被融合至骨髓瘤细胞用于杂交瘤生成。杂交瘤上清液针对rRNLS筛选并且选择的杂交瘤被克隆和扩展用于抗体纯化。单克隆抗体从条件性杂交瘤培养物上清液通过A蛋白亲和色谱法纯化。
两种克隆m28-RNLS(也称为1D-28-4)、m37-RNLS(也称为1D-37-10)基于使用Biacore T100系统测定的它们的高结合亲和力(分别为0.316和2.67nM的KD)选择。m28-RNLS的核苷酸序列通过PCR测定，合成并克隆入哺乳动物表达载体。m28-RNLS，其通过在293-F细胞中瞬时表达而合成，通过A蛋白色谱法纯化。
组织试样
人黑素瘤cDNA阵列I和II获得自OriGene Technologies(Rockville,MD,USA)。相关病理学报告是线上可获得的：http://www.origene.com/assets/documents/ TissueScan。自US Biomax(Rockville,MD,USA)获得的人黑素瘤和正常皮肤组织样本被用于免疫组织化学或免疫荧光。
定量RT-PCR
各种基因的相对表达水平通过qRT-PCR评估，如先前描述的(Lee等，2013J Am SocNephrol.24:445-55)。RNLS、2′-5′-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、β-肌动蛋白和18s rRNA的mRNA水平使用TaqMan基因表达实时PCR分析评估(Applied Biosystems,Carlsbad,CA,USA)。结果表达为循环阈值(Ct)。标准化为内源对照18s rRNA或β-肌动蛋白的目标转录物的相对定量通过比较Ct方法(ΔCt)测定并且2-ΔΔCt方法被用于根据制造商的方案(UserBulletin No.2,Applied Biosystems)分析测试的细胞系之间基因表达的相对改变。
免疫组织化学染色和蛋白质印迹分析
免疫组织化学如先前描述的执行(Guo等，2012Cancer science.103:1474-80)。简言之，肿瘤组织被福尔马林固定、石蜡包埋和在载玻片上切成5-μm切片。将载玻片脱蜡并水化合，然后在包含10mM柠檬酸钠，pH6缓冲液的高压锅中抗原修复。切片在3％的过氧化氢中封闭30min和在PBS/0.1％吐温20中的2.5％正常马血清中封闭1h，然后在4℃下用一次抗体和同种型对照IgG培育过夜。在该研究中使用下列抗体：500ng/ml的m28-RNLS；250ng/ml的山羊多克隆抗RNLS(Abcam,ab31291)；兔单克隆抗CD68(BDBioscience,1:100)；兔单克隆抗CD163(AbD Serotec,1:100)；兔单克隆抗CD86(Abcam,1:100)；兔单克隆抗Ki67(VectorLab,VP-RM04,1:100)；兔单克隆抗p21，磷酸-Tyr705-Stat3，和总Stat3(Cell SignalingTechnologies，分别地#2947，1:100，#9145，1:400，和#4904，1:400)。ImmPRESS过氧化物酶-抗兔IgG(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)被用于检测一次抗体。使用VectorDAB底物试剂盒显色并且用苏木精(Vector Laboratories)复染。使用Olympus BX41显微镜和照相机(Olympus America Inc,Center Valley,PA,USA)观察和拍摄载玻片。
蛋白质印迹分析如先前描述的进行(Wang等，2014Journal of the AmericanSociety of Nephrology DOI:10.1681/asn.2013060665)。
组织微阵列
黑素瘤组织微阵列购买自US BioMax,Inc.和耶鲁组织病理学服务中心(Yaletissue pathology services)。该研究被耶鲁大学医学院的人类调查委员会批准(HIC协议号1003006479)。耶鲁黑素瘤组织微阵列如先前描述的构建(Berger等，2003Cancerresearch.63:8103-7；Rimm等，2001Cancer journal.7:24-31)。代表542个总计黑素瘤病例的总计570个组织核心(tissue core)和测量0.6mm的一小系列对照在单个载玻片上隔开0.8mm距离。人群从由耶鲁大学医学院的病理学系的档案获得的福尔马林固定的、石蜡包埋的组织块构建。病理学家检查每个病例以选择组织微阵列中包含的区域。将来自试样的核心活检放置在具有Tissue Micorarrayer(Beecher Instruments,Sun Prairie,WI)的组织微阵列上。组织微阵列然后被切成5-μm切片并放置在具有利用UV交联的胶带转移系统(adhesive tape transfer system)(Instumedics,Inc.,Hackensack,NJ)的载玻片上。试样都取材自在1959和1994之间切除的肿瘤的档案，随访范围为2个月至38年(中值随访时间，60个月)。人群特征在先前描述(Berger等，2004Cancer research.64:8767-72)。
组织微阵列载玻片如先前描述的染色(Berger等，2004Cancer research.64:8767-72；Nicholson等，2014Journal of the American College of Surgeons.219:977-87)。以与对上面描述的免疫组织化学处理的相同方式将载玻片脱蜡、再水化、暴露(unmasked)和阻断。黑素瘤组织阵列在4℃下用在BSA/TBS中稀释的m28-RNLS加抗S100小鼠单克隆(1:100,Millipore,Temecula,CA,USA)和抗HMB45小鼠单克隆(1:100,ThermoScientific,Fremont,CA,USA)的混合物染色过夜。在BSA/TBS中稀释的二次抗体Alexa488-缀合的山羊抗小鼠(1:100,Molecular Probes,Eugene,OR)加Envision抗兔(DAKO)在室温下应用1小时。将载玻片用TBST清洗(三次，每次5分钟)，然后用Cy5-酪胺(tyramide)(Perkin-Elmer Life Science Products,Boston,MA)培育并通过辣根过氧化物酶激活，导致直接邻近辣根过氧化物酶-缀合的二次抗体的许多共价关联的Cy5染料的沉积。使用Cy5是因为其发射峰(红色)充分地在组织自体荧光的绿色-橙色光谱之外。载玻片利用盖玻片——具有包含4′,6-联脒-2-苯基吲哚的Prolong Gold抗褪色试剂——密封以显现细胞核。
细胞活力分析
活细胞的总细胞数和百分比通过锥虫蓝排除评估，并且使用BioRad TC10自动细胞计数仪计数细胞。对于另外的研究，细胞活力根据制造商的指导使用WST-1试剂(RocheDiagnostics,Indianapolis,IN,USA)测定。吸光度使用酶标仪(microplate reader)(Power Waves XS,BioTek Instruments,Winooski,VT,USA)读取。
RNA干扰
靶向RNLS的四个单独的siRNA和siRNASMART库购买自Dharmacon(Lafayette,CO,USA)。使用如由制造商指示的DharmaFECT 4试剂(Dharmacon)利用RNLS siRNA或者通用阴性对照小干扰RNA(对照siRNA，Dharmacon)转染细胞。敲低效率通过qPCR测定。
小鼠肿瘤模型
雌性无胸腺18–20g裸小鼠(nu/nu)获得自Charles River(Willimantic,CT)并安置在微型分离器笼中——其具有在无特异性病原体的设施中高压蒸汽处理的寝具，12-h白天/黑夜循环。动物任意地接受水和食物，并根据由VACHS IACUC批准的研究方案观察肿瘤生长、活动、进食和疼痛的迹象。
异种移植肿瘤通过皮下注射A375.S2细胞(在100μl的PBS，pH 7.6中2×106个)建立。当肿瘤达到50–100mm3的体积时，将小鼠分为对照组(n＝14，用兔IgG治疗，每周一次腹膜内注射(IP)40μg，和每3天在肿瘤位点周围皮下(SQ)40ug)，和实验组(n＝14)，其接受m28-RNLS(40μg IP，每周一次，和40μg SQ，每3天)。肿瘤大小利用数显卡尺测量并且体积根据公式(长度×宽度2)×π/2计算。
在研究结束时，处死小鼠，切除肿瘤并立即在液氮中迅速冷冻，并在-80℃下储存。细胞凋亡使用TUNEL分析(Roche in situ Apoptosis Detection System)根据制造商的指导检查。切片通过光学显微镜检查和细胞凋亡指数通过在10个随机选择的高倍视野(×200放大倍数)中计数≥1000个细胞测定。
统计学分析
Wilcoxon秩和检验和Mann-Whitney U检验分别被用于成对和未成对数据。当适合于非参数重复测量时，ANOVA(Friedman检验)被用于评估统计显著性。当Friedman检验揭示统计显著性时，Dunn检验被用于成对比较。也实行Kaplan-Meier存活分析和多变量Cox回归分析。所有的数据是平均值±平均值的标准误差(平均值±SEM)，并且P<0.05的值被接受为统计学上显著的差别。组织阵列数据的统计学分析使用软件，版本21.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行。
现在描述该实施例的结果。
黑素瘤中的RNLS过表达
为了确定RNLS表达在正常人皮肤和恶性黑素瘤之间是否有区别，检查跨越正常皮肤进展至良性痣至原发性和转移性黑素瘤的组织微阵列(TMAs；Yale Tissue MicroarrayFacility and US Biomax,Inc.)。耶鲁TMA包含福尔马林固定的、石蜡包埋的试样，其获得自在1959到1994之间收集的192个原发性黑素瘤的人群、自1997到2004收集的246个连续的原发性和转移性黑素瘤的人群、具有良性痣的295个患者的人群和来自15个患者的匹配的正常皮肤试样。这些组织微阵列的人口统计资料和临肺特征已经在先前描述(GouldRothberg等，2009Journal of clinical oncology:official journal of the AmericanSociety of Clinical Oncology.27:5772-80)。US Biomax阵列包含74个试样，其包括35个原发性黑素瘤、11个转移性病灶、14个良性痣和14个正常样本。使用定量、自动的免疫荧光(IF)显微镜检查系统(AQUA)检查RNLS蛋白表达的大约600个组织斑点(histospot)揭示从正常皮肤至良性痣至原发性恶性黑素瘤至转移性黑素瘤的进展通过RNLS表达的显著增加完成(图17A-C分别地p＝0.009，p＝0.0003，和p<0.001)。
问题是失调的RNLS表达和信号传导是否可以促进黑素瘤生长，并且因此，充当预后标记。检查来自从1997到2004收集的246个连续的原发性和转移性样本的人群的每个原发性黑素瘤。一百一十九个患者具有适合于通过AQUA技术评估的组织斑点。在该组中，将其肿瘤表达高RNLS水平(RNLS AQUA得分>中值AQUA得分75,764.45)的患者的结果与具有低RNLS表达的那些结果进行比较。高RNLS表达与增加的黑素瘤特异性死亡相关联：5年和10年疾病特异性存活率分别为55％对69％和39.7％对58.5％，p＝0.008(图17D)。在该人群的多变量分析之后，发现RNLS水平独立地预测黑素瘤中的存活率(p＝0.004，HR＝3.130)。也发现诊断时的疾病阶段(p＝0.05，HR＝3.940)、克拉克水平(p＝0.015，HR＝1.687)和原发性肿瘤的溃疡(p＝0.001,HR＝2.54)独立地预测黑素瘤细胞中的存活率。这些发现暗示RNLS表达可以充当黑素瘤中的有用预后标记，并且可以帮助鉴定具有更加侵略性表型的患者子集。
RNLS过表达有利于癌细胞存活
RNLS介导的信号传导是抗细胞凋亡的，并且保护暴露于毒性应激的正常细胞免于细胞凋亡死亡(Wang等，2014J Am Soc Nephrol.；Lee等，2013J Am Soc Nephrol.24:445-55)。为了探索RNLS信号传导是否有利于癌细胞的存活，将重组RNLS(rRNLS)或牛血清白蛋白(BSA)加入至培养中的血清-饥饿的黑素瘤细胞(A375.S2，MeWo，SkMel5，和SkMel28)，并测定细胞活力。与BSA相比，RNLS显著地增加血清-饥饿细胞的存活，并引起如通过WST-1分析测量的增殖速率的明显增加(n＝6，p<0.05，图18A)。利用RNLS治疗的那些的活细胞的总细胞数和百分比被计数以确定增殖速率的明显增加是由于细胞增殖的增加还是由于细胞凋亡速率的降低。如图18B中所示，用RNLS治疗显示了与利用BSA治疗的那些相比增加的细胞计数，和增加的活细胞百分比，这暗示RNLS起抗细胞凋亡的存活因子的功能。
RNLS信号传导的抑制在体外对黑素瘤细胞具有细胞毒性
使用三种途径来确定抑制黑素瘤中RNLS表达和信号传导的功能后果。首先，评价降低RNLS表达对细胞活力的作用。通过siRNA的RNLS敲低显著降低了黑素瘤细胞系A375.S2和SkMel28的活力(分别地，p＝0.03和p＝0.003，图19A)。第二，由于RNLS肽RP-220模拟rRNLS的保护性作用和信号传导特性，因此已经推断它可能与胞外RNLS的受体的关键区相互作用并且针对它定向的抗体可以具有抑制特性。因此，针对RP-220的一组单克隆抗体被开发，并且它们对癌细胞存活的作用被测试。两种单克隆抗体针对RNLS生成，[克隆#28-4(m28-RNLS)、37-10(m37-RNLS)]降低了测试的所有(总共5个)黑素瘤细胞系的活力，并且代表性的实例在图19B-C中示出。m28-RNLS表明了增加的细胞毒性水平与增加的治疗浓度相关联(p<0.05，图19B)。第三，肽拮抗剂(RP-220A)通过降低RP-220的净电荷生成(3个赖氨酸/精氨酸改变为丙氨酸，图19D)。RP220A不介导RNLS依赖性信号传导，而是结合至PMCA4b并拮抗内源RNLS的作用(Wang等，2015PLoS ONE.10:e0122932)。RP-220A证明为在增加剂量中对培养中的黑素瘤细胞具有细胞毒性(p<0.005，图19D)。
RNLS信号传导的抑制阻断体内肿瘤生长
A375.S2(人黑素瘤)细胞被皮下注入无胸腺裸小鼠以生成肿瘤。一旦肿瘤达到约50mm3的体积，则用对照兔IgG或RNLS中和单克隆抗体m28-RNLS治疗动物，因为贯穿研究维持总体动物健康和活动，因此抗体治疗似乎不是毒性的。每隔一天测量肿瘤大小，并且利用m28-RNLS的治疗在所有的测试点处减小了肿瘤体积(p<0.05，图20A)。由于在一些动物中的总体肿瘤大小和溃疡，在第11天时处死动物。来自具有细胞增殖标记Ki67的异种移植的肿瘤的切片的IHC染色揭示了在用抗RNLS抗体治疗的肿瘤内的细胞增殖对用兔IgG治疗的那些的显著降低：对照组中35.1±2.3个阳性细胞/高倍视野对在RNLS Ab治疗的组中13.4±3.0个，n＝14，p＝0.0004(图20B)。
RNLS信号传导的抑制阻断内源RNLS表达和STAT3激活并诱导细胞凋亡和细胞周期 停滞
已知STAT3结合至RNLS基因的启动子区并增加其表达，并且阳性RNLS-STAT3反馈环已经被暗示(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)。这种关系通过免疫荧光组织染色和对来自用对照IgG和m28-RNLS治疗的异种移植肿瘤的细胞溶胞产物的研究进一步调查。在肿瘤样本中注意到RNLS与磷酸化和总STAT3的显著共表达(图21A)，如通过IF评估的。用m28-RNLS的治疗引起RNLS蛋白表达，以及总的和磷酸化的STAT3二者的大幅度减少(图21A)。蛋白表达的改变通过如图21B-C中示出的蛋白质印迹证实。在用m28-RNLS治疗的肿瘤中，在酪氨酸705处的STAT3磷酸化(p-Y705-STAT3)和总STAT3显著降低(n＝8，p<0.005，图21B-C)。
为了测试RNLS表达的显著降低是否主要发生在黑素瘤细胞中，人和小鼠特异性引物被用于扩增肿瘤块中的肿瘤(人)和内源(小鼠)RNLS。如在图21D中描绘的，用m28-RNLS的治疗引起小鼠RNLS表达的显著降低，而不影响人(肿瘤)表达，这暗示肿瘤浸润细胞在RNLS产生和分泌中起关键作用。
此外，注意到细胞周期抑制剂p21的增加的表达。抗体治疗显著地增加了肿瘤样本中细胞周期调节物p21的表达：抗体治疗的组中24.2±2.4个阳性细胞对比对照组中12.2±1.0个，n＝14，p＝0.009(图21E)。末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记(TUNEL)染色揭示了与对照组相比在抗体治疗的肿瘤中经历细胞凋亡的细胞的平均数目的显著增加，平均值为13.3±0.6个阳性细胞对4.3±0.2个，n＝14，p<0.001，(图21E)。细胞凋亡的增加与p38MAPK的磷酸化，和B细胞淋巴瘤2相关蛋白Bax的后续激活时间上相关(图21F)。这些数据表明用抗RNLS抗体治疗引起总的和磷酸化的STAT3的显著降低，降低细胞增殖，和增加肿瘤细胞的细胞凋亡。
RNLS信号传导的抑制增加CD86 + 与CD163+TAM的比率
黑素细胞似乎不是黑素瘤组织斑点中RNLS的主要来源，因为在RNLS和黑素细胞染色之间注意到存在最小重叠(图17A)。黑素瘤常常具有包括巨噬细胞在内的免疫细胞的显著浸润。浸润性巨噬细胞似乎促进大多数肿瘤样RNLS作为在与全巨噬细胞标记CD68显著重叠的每个组织斑点中注意到的RNLS染色的实质成分(图22A上图)。在进一步研究之后，确定了RNLS主要地与CD163+(M2样)TAM共表达(图22A中图)。RNLS与CD86+(M1样)巨噬细胞的共表达是最小的(图22A，下图)。M2样(CD163+)巨噬细胞与免疫逃逸相关联并显示为促进癌症发展和传播，而M1样(CD86+)巨噬细胞通常为促炎的，并且抑制肿瘤生长(Biswas等，2010Nat Immunol.11:889-96；Mantovani等，Trends in Immunology.23:549-55)。用m28-RNLS抗体治疗异种移植体导致CD163+TMA的数目的相当大的降低，并且剩余的细胞不表达可检测水平的RNLS(图22B)。
实施例3：通过质膜钙ATPase PMCA4b的持续肾酶信号传导促进胰腺癌生长
由于RNLS起参与在胰腺癌中失调的MAPK和PI3K途径的存活因子的作用，并且因为其表达受信号转导物和转录激活因子STAT3调节(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)，因此已经假定了RNLS表达和信号传导的异常调节可以对癌细胞提供存活优势，并促进肿瘤形成(Guo等，2014Curr Opin Nephrol Hypertens.23(5):513-8)。
本文显示了RNLS表达在数种类型的癌症中和在患有胰腺导管腺癌(PDAC)的患者的人群中增加，总存活与肿瘤中RNLS表达负相关，这暗示RNLS的致病作用。使用siRNA抑制RNLS表达或抑制性RNLS抗体降低了培养的PDAC细胞活力。在异种移植小鼠模型中，RNLS单克隆抗体m28-RNLS通过下调STAT3以及上调p21和p38抑制PDAC生长，并引起细胞凋亡和细胞周期停滞。肿瘤细胞中RNLS表达的下调导致PMCA4b(RNLS受体)表达的等量降低并导致肿瘤大小的减小，这与利用抑制性RNLS抗体观察到的类似。这些结果揭示了癌症中RNLS途径的先前未认知的促存活功能，显示了RNLS表达可以充当预后标记，并鉴定胰腺癌处理的新型治疗靶点。
对于在PDAC中增加的RNLS表达的致病作用，和对于抑制RNLS信号传导的治疗实用性，在此提供了证据。此外，介导RNLS信号传导的抑制剂的观察到的抗肿瘤活性的分子机制正在被探索。
共同考虑，这些发现表明了上调的RNLS介导的信号传导在PDAC中起致病作用。此处示出了高RNLS肿瘤表达与总体3年死亡率的两倍增加相关联，这支持使用RNLS作为诊断或预后标记。而且，由于RNLS是分泌蛋白，因此其可以被用作肿瘤的初次诊断的生物标记，或者被用作治疗应答或复发的替代标记。
RNLS介导的细胞保护作用的主要机制似乎是其激活AKT、ERK和STAT，增加抗细胞凋亡因子Bcl2，和阻止效应物胱天蛋白酶的激活的能力(Wang等，2014Journal of theAmerican Society of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。Panc1细胞中RNLS信号传导的抑制与p38MAPK的持续激活和细胞凋亡相关联。p38是已经牵连于炎症、细胞分化、细胞周期调节和细胞凋亡的应激激活激酶(Ono等，2000Cellular Signalling.12(1):1-13)。例如，神经生长因子停药引起细胞凋亡以及JNK和p38的持续激活，和ERK的下调(Xia等，1995Science.270(5240):1326-31)。但是，由于在某些条件下，p38的抑制可以阻断细胞凋亡(Ono等，2000Cellular Signalling.12(1):1-13)，因此p38在细胞凋亡过程中的作用明确地是环境依赖性的。本文描述的数据与如下解释一致：在Panc1细胞中，p38的m28-RNLS依赖性激活与细胞凋亡相关联。
RNLS信号传导的抑制明显降低了胰腺癌的异种移植体中Ki-67的表达。由于Ki-67被用于评估细胞分裂的水平，因此数据与如下解释一致：RNLS抑制降低肿瘤的增殖速率。确定细胞周期进展的许多关键因素已经被鉴定，并且包括细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)和两类内源CKD抑制剂，即细胞周期蛋白依赖性激酶4的抑制剂(INK4)和CDK互作蛋白/激酶抑制剂(CIP/KIP)蛋白家族(Jung等，2010Cellular Signalling.22(7):1003-12)。数据揭示p21——其为属于IP/KIP家族的CDK抑制剂——的表达受RNLS信号传导的调节。RNLS信号传导的抑制与p21表达的明显增加相关联。由于p21是细胞周期的负调节物，其可以维持细胞在G0，阻断G1/S转变和引起G1或s相间停滞(Jung等，2010Cellular Signalling.22(7):1003-12)，因此其上调可以解释在用m28-RNLS治疗的肿瘤中观察到的细胞增殖的降低。此外，也已经显示p38影响细胞周期进展(Ono等，2000Cellular Signalling.12(1):1-13)，和其通过抗RNLS治疗的激活也可以促进细胞周期停滞。
调节RNLS基因表达的调节性启动子元件和转录因子已经在近来被研究(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)，并且这些数据指出STAT3的关键作用。结果暗示RNLS和STAT3之间的前馈环：上调STAT3的信号增加RNLS基因表达，并且RNLS又增加STAT3活性。RNLS和STAT3之间的这样的相互作用对于RNLS信号传导在癌症的发病机理中的作用具有重要的启示。STAT家族蛋白，特别是STAT3，牢固地牵连于促进恶性转化和癌症进展的炎性微环境的诱发和维持(Yu等，2009Nat Rev Cancer.9(11):798-809)。STAT3信号传导通常在癌细胞中持久地激活，并且这样的激活不仅驱动肿瘤细胞增殖，而且增加在肿瘤微环境中支撑炎症的大量基因的产生。癌细胞与非转化和基质细胞之间的STAT3前馈环已经在癌症中证明(Catlett-Falcone等，1999Immunity.10(1):105-15；Yu等，2007Nat RevImmunol.7(1):41-51；Ara等，2009Cancer Res.69(1):329-37)。例如，STAT3在多发性骨髓瘤患者中组成性地激活。在IL-6依赖性人骨髓瘤细胞系U266中，IL-6发信号通过詹纳斯激酶以激活STAT3，其又上调抗细胞凋亡因子，并促进肿瘤细胞的存活(Catlett-Falcone等，1999Immunity.10(1):105-15)。同样，STAT3在大多数胰腺导管腺癌中组成性地激活，并且对于KRAS诱导的胰腺肿瘤发生的开始和进展似乎是需要的(Corcoran等，2011CancerRes.71(14):5020-9)。
STAT3途径和RNLS在PDAC发展中也可以具有促进最普遍和重要的环境因素——吸烟——的作用(Muscat等，1997Cancer epidemiology,biomarkers&prevention:apublication of the American Association for Cancer Research,cosponsored bythe American Society of Preventive Oncology.6(1):15-9；Boyle等，1996International journal of Cancer Journal international du cancer.67(1):63-71；Fuchs等，1996Archives of internal medicine.156(19):2255-60)。尼古丁——香烟的一种关键成分，已经显示为加强癌症中的增殖和血管生成的速率(Heeschen等，2002JClin Invest.110(4):527-36；Heeschen等，2001Nat Med.7(7):833-9)。尼古丁的肿瘤生长和转移的作用被认为通过其与乙酰胆碱受体α-7nACHR的相互作用介导，导致JAK-STAT3和MEK-ERK1-2下游的信号传导级联(Momi等，2013Oncogene.32(11):1384-95)。在这个背景下，尼古丁通过Sp1和STAT3的协同作用增加RNLS启动子活性(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)。
PMCA4b先前已经被表征为在细胞信号传导、心脏肥厚和癌症中涉及的质膜ATPase(Cartwright等，2007Annals of the New York Academy of Sciences.1099(1):247-53；Pinton等，2001EMBO J.20(11):2690–2701；Oceandy等，2011Biochimica et BiophysicaActa(BBA)-Molecular Cell Research.1813(5):974-8)。其将Ca2+从细胞溶胶运输至外环境，并且似乎调节局部钙浓度。除了其在调节细胞质的Ca2+中的作用之外，PMCA4b也是可以发信号通过Ras和MAPK的大分子复合物的中心(Ara等，2009Cancer Res.69(1):329-37；Corcoran等，2011Cancer Res.71(14):5020-9；Muscat等，1997Cancer epidemiology,biomarkers&prevention:a publication of the American Association for CancerResearch,cosponsored by the American Society of Preventive Oncology.6(1):15-9)。例如，PMCA4b通过其与肿瘤抑制因子RASSF1的相互作用调节Ras信号传导和ERK激活(Armesilla等，2004Journal of Biological Chemistry.279(30):31318-28)。数据表明RNLS发信号通过PMCA4b，PMCA4b表达的下调或其酶功能的抑制对胰腺癌细胞具有细胞毒性。这些发现暗示PMCA4b在PDAC的处理中代表治疗靶点。
总之，这些发现证明RNLS是可以促进PDAC的存活和生长的分泌蛋白。这提供了进一步研究抑制RNLS的疗法用于治疗癌症的应用的框架。在这个背景下，RNLS调节介导在癌症中活跃的MAPK、PI3K和JAK-STAT3的多种相互关联的信号，该分子可能是特别有吸引力的治疗靶点(图27E)。
现在描述在该实施例中使用的材料和方法
试剂
人导管胰腺腺癌细胞系BxPC-3、Panc1和MiaPaCa-2获得自美国模式培养物保藏所(ATCC)(Manassas,VA,USA)和按照推荐保持。p38和STAT3阻断剂SB203580和Stattic购买自Abcam(Cambridge,UK)。JNK抑制剂SP600125和ERK抑制剂U0126分别获得自Sigma Aldrich(St.Louis,MO,USA)和Cell Signaling Technologies(Beverly MA,USA)。重组人RNLS(rRNLS)表达、纯化、浓缩和针对PBS透析，如先前所述的(Desir等，2012J Am HeartAssoc.1(4):e002634)。兔抗RNLS单克隆(AB178700)、山羊多克隆抗RNLS(AB31291)、山羊IgG和兔IgG购买自Abcam。
合成抗RNLS单克隆抗体m28-RNLS(也称为1D-28-4)、m37-RNLS(也称为1D-37-10)
RNLS肽RP-220被缀合至KLH和被用于免疫6只兔子，并且来自选择的动物的脾脏的淋巴细胞被融合至骨髓瘤细胞用于杂交瘤生成。杂交瘤上清液针对rRNLS筛选并且选择的杂交瘤被克隆和扩展用于抗体纯化。单克隆抗体从条件性杂交瘤培养物上清液通过A蛋白亲和色谱法纯化。
两种克隆m28-RNLS、m37-RNLS基于使用Biacore T100系统测定的它们的高结合亲和力(分别为0.316和2.67nM的KD)选择。m28-RNLS的核苷酸序列通过PCR测定，合成并克隆入哺乳动物表达载体。m28-RNLS，其通过在293-F细胞中瞬时表达而合成，通过A蛋白色谱法纯化。
组织试样
人癌症cDNA阵列(筛选cDNA阵列I和II，胰腺癌cDNA阵列)获得自OriGeneTechnologies(Rockville,MD,USA)。相关病理学报告是线上可获得的：www.origene.com/assets/documents/TissueScan。自US Biomax(Rockville,MD,USA)获得的人胰腺癌和正常组织样本被用于免疫组织化学或免疫荧光。
定量PCR
各种基因的相对表达水平通过qPCR评估。RNLS、2′-5′-寡腺苷酸合成酶1(OAS1)、β-肌动蛋白和18s rRNA的mRNA水平使用TaqMan基因表达实时PCR分析评估(AppliedBiosystems,Carlsbad,CA,USA)。结果表达为循环阈值(Ct)。标准化为内源对照18s rRNA或β-肌动蛋白的目标转录物的相对定量通过比较Ct方法(ΔCt)测定并且2-ΔΔCt方法被用于根据制造商的方案(User Bulletin No.2,Applied Biosystems)分析测试的细胞系之间基因表达的相对改变。
免疫组织化学染色和蛋白质印迹分析
免疫组织化学如先前描述的执行(Guo等，2012Cancer science.103:1474-80)。简言之，肿瘤组织被福尔马林固定、石蜡包埋和在载玻片上切成5-μm切片。将载玻片脱蜡并水化合，然后在包含10mM柠檬酸钠，pH6缓冲液的高压锅中抗原修复。切片在3％的过氧化氢中封闭30min和在PBS/0.1％吐温20中的2.5％正常马血清中封闭1h，然后在4℃下用一次抗体和同种型对照IgG培育过夜。在该研究中使用下列抗体：500ng/ml的m28-RNLS；250ng/ml的山羊多克隆抗RNLS(Abcam,ab31291)；兔单克隆抗Ki67(Vector Lab,VP-RM04,1:100)；兔单克隆抗p21和磷酸-Tyr705-Stat3(Cell Signaling Technologies，分别地#2947，1:100和#9145，1:400)。ImmPRESS过氧化物酶-抗兔IgG(Vector Laboratories,Burlingame,CA,USA)被用于检测一次抗体。使用Vector DAB底物试剂盒显色并且用苏木精(VectorLaboratories)复染。使用Olympus BX41显微镜和照相机(Olympus America Inc,CenterValley,PA,USA)观察和拍摄载玻片。
蛋白质印迹分析如先前描述的进行(Wang等，2014Journal of the AmericanSociety of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。
组织微阵列
胰腺组织微阵列购买自US BioMax。组织微阵列载玻片如先前描述的染色(Nicholson等，2014Journal of the American College of Surgeons.219:977-87)。简言之，试样用m28-RNLS和小鼠单克隆全细胞角蛋白抗体(1:100,DAKO M3515)在4℃下共染色过夜。二次抗体Alexa488-缀合的山羊抗小鼠(1:100,Molecular Probes,Eugene,OR)和Envision抗兔(DAKO)在室温下应用1小时。将载玻片用Tris缓冲盐水清洗(三次，每次5分钟)，和用Cy5-酪胺(Perkin-Elmer Life Science Products,Boston,MA)培育并通过辣根过氧化物酶激活。使用Cy5是因为其发射峰(红色)在组织自体荧光的绿色-橙色光谱之外。载玻片利用盖玻片——具有包含4′,6-联脒-2-苯基吲哚的Prolong Gold抗褪色试剂——密封以促进显现细胞核。
细胞活力分析
细胞活力通过锥虫蓝排除评估，并且使用BioRad TC10自动计数仪计数细胞。对于一些研究，细胞活力如先前所述的(Wang等，2014Journal of the American Society ofNephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)使用WST-1试剂(Roche Diagnostics,Indianapolis,IN,USA)测定。
细胞凋亡和细胞周期分析
对于细胞周期分析，培养的细胞使用10mM EDTA解离，用冰冷的70％乙醇固定，用RNAse A消化，并用碘化丙锭染色。碘化丙锭(Propidium)染色使用BD FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)检测，并使用CellQuest软件分析。
细胞凋亡根据先前的检测和定量(Guo等，2012Cancer Science.103(8):1474-80)。简言之，细胞用FITC标记的膜联蛋白-V和碘化丙锭根据制造商的指导(BenderMedSystems,Burlingame,CA,USA)染色。至少20,000个事件在BD FACSCalibur流式细胞仪(BD Biosciences,San Jose,CA,USA)上收集并使用CellQuest软件分析。
RNA干扰
靶向RNLS的四个单独的siRNA和siRNA SMART库购买自Dharmacon(Lafayette,CO,USA)。使用如由制造商指示的DharmaFECT 4试剂(Dharmacon)利用RNLS siRNA或者通用阴性对照siRNA(对照siRNA，Dharmacon)转染细胞。
为了生成稳定转染的Panc1细胞系，利用携带RNLS shRNA(sh-RNLS)或对照shRNA(sh-对照)的慢病毒(Santa Cruz)根据制造商的方案转导细胞。细胞被转导两次以增加shRNA拷贝数目并且在80μg/ml嘌呤霉素中选择10天之后，建立稳定的克隆。敲低效率通过qPCR测定。
小鼠异种移植肿瘤模型
雌性无胸腺18–20g裸小鼠(nu/nu)获得自Charles River(Willimantic,CT)并安置在微型分离器笼中——其具有在无特异性病原体的设施中高压蒸汽处理的寝具，12-h白天/黑夜循环。动物任意地接受水和食物，并根据由VACHS IACUC批准的研究方案观察肿瘤生长、活动、进食和疼痛的迹象。
异种移植肿瘤通过皮下注射BxPC3细胞(在100μl，pH 7.6的PBS中2×106个)建立。当肿瘤达到50–100mm3的体积时，将小鼠分为对照组(n＝14，用兔IgG治疗，腹膜内注射(IP)40μg)，和实验组(n＝14)，其接受m28-RNLS(40μg IP，每3天)。肿瘤大小利用数显卡尺测量并且体积根据公式(长度×宽度2)×π/2计算。在另一组动物(n＝6每组)中，sh-RNLS或sh-对照Panc1细胞(在100μl，pH 7.6的PBS中2×106个)被皮下注射。这些动物不接受进一步治疗，并且肿瘤大小和体积被测量持续多达30天。
在研究结束时，处死小鼠，切除肿瘤并立即在液氮中迅速冷冻，并在-80℃下储存。细胞凋亡使用TUNEL分析(Roche in situ Apoptosis Detection System)根据制造商的指导检查。切片通过光学显微镜检查和细胞凋亡指数通过在5个随机选择的高倍视野(×200放大倍数)中计数≥1000个细胞测定。
统计学分析
Wilcoxon秩和检验和Mann-Whitney U检验分别被用于成对和未成对数据。当适合时，非参数重复测量ANOVA(Friedman检验)被用于评估统计显著性。当Friedman检验揭示统计显著性时，Dunn检验被用于成对比较。所有的数据是平均值±平均值的标准误差(平均值±SEM)，并且P<0.05的值被接受为统计学上显著的差别。组织阵列数据的统计学分析使用软件，版本21.0(SPSS Inc.,Chicago,IL,USA)进行。
现在描述该实施例的结果。
PDAC中的RNLS过表达和与降低的存活的关联性
为了确定RNLS表达在正常和癌症组织中是否有区别，通过使用定量PCR(qPCR)筛选商业可得的人组织cDNA阵列检查15种不同类型的癌症。RNLS表达在胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌中，以及在黑素瘤中显著的增加(图23A)。由于它们的特别差的存活和有限的治疗选择，因此焦点在胰腺癌上。RNLS表达在PDAC(～3倍)和胰腺神经内分泌(8倍)肿瘤二者中升高(图23B)。使用抗RNLS单克隆m28-RNLS的免疫细胞化学研究显示了RNLS表达在PDAC等级1-4中存在并且主要地定位至癌细胞，如图23C和28中所示的。大部分RNLS似乎在癌细胞中具有细胞质分布；它存在于所有肿瘤等级中，但是在更加分化的癌症(等级I-III)中是最明显的。在胰腺的神经内分泌肿瘤中，RNLS遍及肿瘤在细胞中表达(图29)。RNLS基因表达在具有KRAS突变的胰腺导管腺癌(PDACC)细胞系(MiaPaCa2和Panc1)中比具有野生型KRAS的那些比如BxPC3中更大(图30)。
患有PDAC的69个患者中的RNLS表达使用组织微阵列(TMA)表征，该微阵列由福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤核心以及匹配的邻近正常组织组成。从其获得样本的个体的人口统计资料和临肺特征在表3中示出。使用无偏差的、定量的、自动的免疫显微镜检查系统(AQUA)(Gould Rothberg等，2009Journal of Clinical Oncology.27(34):5772-80)检查来自成对的PDAC肿瘤和它们的非肿瘤邻近组织的138个组织斑点的RNLS蛋白表达，显示了总RNLS水平在PDAC肿瘤中比在它们邻近的非肿瘤胰腺组织中大2倍(p<0.001，图23D)。
表3：患有PDAC的患者人群的特征
为了确定加强的RNLS表达是否可以影响PDAC的临肺行为，表达水平是否影响预后的问题被询问。其肿瘤表达高RNLS水平(n＝34，RNLS AQUA得分>中值)的个体具有大大降低的3年存活率(24％对49％，p＝0.024，图23E)。这些发现表明RNLS表达的肿瘤水平在PADC中可以是有用的预后标记，并且帮助鉴定具有更有侵略性表型的患者子集。
RNLS发信号通过PMCA4b和起胰腺癌细胞的存活因子的功能
RNLS介导的信号传导保护暴露于毒性应激的HK-2细胞免于细胞凋亡(Lee等，2013J Am Soc Nephrol.24(3):445-55；Wang等，2014Journal of the American Societyof Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。为了探索RNLS信号传导是否对暴露于应激的胰腺导管腺癌细胞(PDACC)提供存活优势，从培养的BxPC3、Panc1和MiaPaCa2细胞撤回血清持续48小时，并将重组RNLS(rRNLS)或牛血清白蛋白(BSA)加入至培养基持续另外的72小时；总的和活的(锥虫蓝排除)细胞计数被测定。与BSA相比，rRNLS增加PDACC存活率2到5倍(图24A)。
已经显示了通过将rRNLS添加至暴露于过氧化氢或顺铂损害(injury)的HK-2细胞赋予的细胞保护作用取决于ERK激活(Lee等，2013J Am Soc Nephrol.24(3):445-55；Wang等，2014Journal of the American Society of Nephrology.DOI:10.1681/asn.2013060665)。图24B中示出的结果表明rRNLS还以ERK依赖性方式提高PDACC存活，这是因为利用U0126——MAPK激酶MEK1的抑制剂——的预治疗废除了rRNLS的保护作用。
关于PMCA4b在胰腺癌中RNLS依赖性信号传导中的作用的证据通过使用siRNA特异性地下调PMCA4b表达获得。在对照研究中，非靶向siRNA既不影响PMCA4b基因表达也不影响RNLS介导的ERK磷酸化(图24C)。相比之下，PMCA4b靶向的siRNA降低基因表达超过90％，并降低RNLS依赖性ERK磷酸化约70％(图24C)。PMCA4b抑制对RNLS介导的STAT3磷酸化没有可辨别的作用，这暗示存在另外的RNLS受体(一种或多种)。
在rRNLS的存在下观察到的PDAC细胞数目的增加与阻止细胞死亡和/或增加细胞增殖的RNLS信号传导一致。RNLS对细胞周期的作用通过荧光活化细胞分选(FACS)分析检查以确定PDACC活力的明显增加是由于增加的细胞增殖还是由于死亡细胞率的降低。如图24D中所示，与利用BSA的治疗相比，rRNLS对细胞周期进展没有作用，这表明RNLS不影响增殖过程，而是阻止细胞死亡，并起存活因子的功能。
RNLS信号转导的抑制剂阻断胰腺癌生长
为了确定抑制胰腺癌细胞中的RNLS表达和信号传导的功能后果，通过siRNA的RNLS敲低来评价降低RNLS表达对体外细胞活力的作用。这种治疗显著地降低了PDACC系Panc1和MiaPaCa2的活力(图25A和31)。由于RNLS肽RP-220模拟rRNLS的保护性作用和信号传导特性，因此已经推断它可能与胞外RNLS的受体的关键区相互作用，并且针对它生成的抗体可以是抑制性的。从针对RP-220在兔中生成的一组单克隆抗体中，两种克隆m28-RNLS、m37-RN基于它们的高结合亲和力(KD分别为0.316和2.67nM)选择。m28-RNLS、m37-RNLS和商业可得的多克隆(针对RP-220的部分序列)对PDACC生长的抑制作用由在图25B和25C中描绘的代表性的实例示出。在培养的细胞中的这些研究暗示RNLS可以通过自分泌/旁分泌途径起作用以刺激PDACC生长。
为了确定RNLS信号传导的抑制是否影响体内肿瘤生长，shRNA被用于生成两种稳定转染的Panc1细胞系：一种包含非靶向的shRNA(sh-对照)，和另一种具有RNLS-靶向的shRNA(sh-RNLS)。sh-RNLS细胞中的RNLS表达降低超过90％，如通过qPCR评估的(图31)。出人意料地，通过RNLS-靶向的shRNA抑制RNLS表达导致其受体PMCA4b的表达的明显降低，这暗示RNLS和PMCA4b表达被共同调节(图32)。转染的细胞被皮下注入无胸腺裸小鼠并且肿瘤大小在30天时期内评估。从第8天到第30天，当动物被处死时，通过sh-RNLS生成的肿瘤体积与sh-对照细胞的肿瘤体积相比显著更小(图25D)。由于通过宿主小鼠的RNLS产生和分泌不受影响，因此这些结果表明sh-RNLS肿瘤细胞对于循环RNLS是无反应的，这是由于RNLS受体PMCA4b的伴随抑制。
为了评价抑制性抗体的治疗潜力，将BxPC3细胞皮下注入用对照兔IgG或m28-RNLS治疗的无胸腺裸小鼠，并且测量肿瘤体积持续上至3周。如在图25E中所示出，与兔IgG相比，m28-RNLS治疗引起肿瘤体积的显著减小。在培养的PDACC细胞和在PDACC的体内模型中的这些研究一起提供了引人注目的证据：RNLS途径调节胰腺癌生长并且可以充当治疗靶点。
通过m28-RNLS诱导肿瘤细胞的细胞凋亡和细胞周期停滞
来自用兔IgG或m28-RNLS治疗以降低RNLS水平的小鼠的BxPC3异种移植肿瘤的切片揭示了抗体治疗的肿瘤中细胞凋亡的～2倍增加(TUNEL染色)(图26A)：m28-RNLS对IgG；28.4±3.3个阳性细胞/高倍视野对IgG-14.8±2.3个，n＝14，p＝0.002。对培养中的Panc1细胞的FACS分析确认了m28-RNLS引起细胞凋亡(图26B和33)。用m28-RNLS抗体治疗引起了p38MAPK的持续磷酸化，其在治疗后第1天时开始(图26C)。
BxPC3肿瘤的m28-RNLS治疗还导致细胞增殖标记Ki67的表达的2.5倍降低(m28-RNLS对IgG：IgG，137.1±14.9个对340.2±11.9个阳性细胞/高倍视野，n＝14，p＝1.4x10-8)(图26D，上图)，和细胞周期调节物p21表达的约4倍增加(m28-RNLS对IgG：IgG，178.1±11.4个对42.2±4.7.6个阳性细胞/高倍视野，n＝14，p＝1.6x10-10)(图26D，下图)。进行Panc1细胞的FACS分析以检查RNLS信号传导抑制对细胞周期的作用。图26E中示出的数据确定了RNLS抑制引起细胞凋亡，如通过大的前-G1峰的出现证明的。它们还揭示了G2中的明显降低，这表明通过m28-RNLS抑制RNLS信号传导引起前-G1细胞周期停滞。
阳性RNLS-STAT3反馈环的存在和其被m28-RNLS中断
STAT3结合至RNLS基因的启动子区并增加其表达(Sonawane等，2014Biochemistry.53(44):6878–6892)。阳性RNLS-STAT3反馈环通过如下观察暗示：在用RNLS治疗的HK-2细胞中，在丝氨酸727(p-Ser727-STAT3)和酪氨酸705(p-Y705-STAT3)处的STAT3磷酸化分别增加2和4倍，但是STAT1不受影响(图34)。如图27A-B中描绘的，将RNLS添加至PDACC系Panc1引起了磷酸化的STAT3(p-Ser727-STAT3和p-Y705-STAT3)的快速增加。对RNLS-STAT3反馈环的另外的支持由如下发现提供：通过m28-RNLS抑制Panc1中的RNLS信号传导导致p-Y705-STAT3的持久的和持续的降低(图27C-D)。
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<SEQ ID NO:93-可选的人肾酶-1核酸序列(注意到在核苷酸位置111处可能的多态性；DNA；智人>
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<SEQ ID NO:94-可选的人肾酶-2氨基酸序列(在位置37处导致天冬氨酸氨基酸的多态性；PRT；智人>
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<SEQ ID NO:95-可选的人肾酶-2核酸序列(注意到在核苷酸位置111处可能的多态性；DNA；智人>
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本文引用的每篇专利、专利申请和出版物的公开内容在此通过引用以其全部并入本文。
虽然已经参考具体的实施方式公开可本发明，但是显而易见的是本发明的其它实施方式和变化可以由本领域技术人员设计而不背离本发明的真实精神和范围。所附权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等价变化。
<110> 耶鲁大学
G·戴斯
A·亨特
J·欧乐尔
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<151> 2014-06-26
<160> 95
<170> PatentIn版本3.5
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Cys
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Ala Val Trp Asp Lys Ala Glu Asp Ser Gly Gly Arg Met Thr Thr Ala
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Cys
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Ser Glu Ile Gly Pro
20
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<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 29
Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Arg Ile
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 30
Ser Gln Ser Val Tyr Lys Asn Asn Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 31
Glu Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 32
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Val Asp Phe Met Ala
1 5 10
<210> 33
<211> 457
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 33
Met Glu Thr Gly Leu Arg Trp Leu Leu Leu Val Ala Val Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Gln Ser Val Lys Glu Ser Glu Gly Gly Leu Phe Lys Pro
20 25 30
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50 55 60
Trp Ile Gly Leu Ile Gly Asp Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp
65 70 75 80
Val Asn Gly Arg Ser Thr Ile Thr Arg Asn Thr Asn Leu Asn Thr Val
85 90 95
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100 105 110
Cys Ala Arg Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Arg Ile Trp Gly Pro Gly Thr
115 120 125
Leu Val Thr Val Ala Ser Trp Gln Pro Lys Ala Pro Ser Val Phe Pro
130 135 140
Leu Ala Pro Cys Cys Gly Asp Thr Pro Ser Ser Thr Val Thr Leu Gly
145 150 155 160
Cys Leu Val Lys Gly Tyr Leu Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn
165 170 175
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180 185 190
Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Ser Val Thr Ser Ser
195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Pro Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys
245 250 255
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
260 265 270
Val Val Asp Val Ser Gln Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr
275 280 285
Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg Thr Ala Arg Pro Pro Leu Arg Glu Gln
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370 375 380
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Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys
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<212> PRT
<213> 家兔
<400> 34
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1 5 10 15
Leu Pro Gly Ala Thr Phe Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro
20 25 30
Met Ser Ala Ala Leu Gly Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ser Ser
35 40 45
Gln Thr Val Tyr Asn Asn Asn Tyr Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro
50 55 60
Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Glu Thr Ser Lys Leu Ser Ser
65 70 75 80
Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr
85 90 95
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100 105 110
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Val Asp Phe Met Ala Phe Gly Gly Gly Thr
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Glu Val Val Val Lys Gly Asp Pro Val Ala Pro Thr Val Leu Ile Phe
130 135 140
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Thr Gln Tyr Asn Ser His Lys Glu Tyr Thr Cys Lys Val Thr Gln Gly
210 215 220
Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
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<212> PRT
<213> 家兔
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<212> PRT
<213> 家兔
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Leu Ile Gly Asp Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Val Asn Gly
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<213> 家兔
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Gly Ser Gly Tyr Gly Ala Arg Ile
1 5
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<212> PRT
<213> 家兔
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<213> 家兔
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<213> 家兔
<400> 40
Gln Gly Gly Tyr Ser Gly Val Asp Phe Met
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<212> PRT
<213> 家兔
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Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
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Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Asp
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Asp Pro Glu Val Gln Phe Thr Trp Tyr Ile Asn Asn Glu Gln Val Arg
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Glu Phe Lys Cys Lys Val His Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Arg Gly Gln Pro Leu Glu Pro Lys Val Tyr
340 345 350
Thr Met Gly Pro Pro Arg Glu Glu Leu Ser Ser Arg Ser Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Met Ile Asn Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ser Val Glu Trp
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Glu Lys Asn Gly Lys Ala Glu Asp Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Ala Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Ser Val Pro
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Thr Ser Glu Trp Gln Arg Gly Asp Val Phe Thr Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Ile Ser Arg Ser Pro
435 440 445
Gly Lys
450
<210> 42
<211> 239
<212> PRT
<213> 家兔
<400> 42
Met Asp Thr Arg Ala Pro Thr Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
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Gln Gly Thr Thr Ser Val Val Gln Ser Phe Asn Arg Gly Asp Cys
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<212> PRT
<213> 家兔
<400> 43
Leu Asn Asn Tyr His Ile Tyr
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<212> PRT
<213> 家兔
<400> 44
Ile Ile Phe Asn Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Arg Trp Thr Lys Gly
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<212> PRT
<213> 家兔
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Gly Asp Gly Ile
1
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<211> 11
<212> PRT
<213> 家兔
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<213> 家兔
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Ser Ala Ser Thr Leu Ala Ser
1 5
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<211> 13
<212> PRT
<213> 家兔
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Ala Gly Ser Phe Asp Cys Asn Ser Gly Asp Cys Val Ala
1 5 10
<210> 49
<211> 1029
<212> DNA
<213> 智人
<400> 49
atggcgcagg tgctgatcgt gggcgccggg atgacaggaa gcttgtgcgc tgcgctgctg 60
aggaggcaga cgtccggtcc cttgtacctt gctgtgtggg acaaggctga ggactcaggg 120
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ttagcctatg gcgttttgag gcctctaagc tcgcctattg aaggaatggt gatgaaagaa 300
ggagactgta actttgtggc acctcaagga atttcttcaa ttattaagca ttacttgaaa 360
gaatcaggtg cagaagtcta cttcagacat cgtgtgacac agatcaacct aagagatgac 420
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atgccagttc ctgagattct gcagcttcaa ggtgacatca ccaccttaat tagtgaatgc 540
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tatatttaa 1029
<210> 50
<211> 315
<212> PRT
<213> 智人
<400> 50
Met Ala Gln Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Met Thr Gly Ser Leu Cys
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Ala Ala Leu Leu Arg Arg Gln Thr Ser Gly Pro Leu Tyr Leu Ala Val
20 25 30
Trp Asp Lys Ala Glu Asp Ser Gly Gly Arg Met Thr Thr Ala Cys Ser
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Pro His Asn Pro Gln Cys Thr Ala Asp Leu Gly Ala Gln Tyr Ile Thr
50 55 60
Cys Thr Pro His Tyr Ala Lys Lys His Gln Arg Phe Tyr Asp Glu Leu
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Leu Ala Tyr Gly Val Leu Arg Pro Leu Ser Ser Pro Ile Glu Gly Met
85 90 95
Val Met Lys Glu Gly Asp Cys Asn Phe Val Ala Pro Gln Gly Ile Ser
100 105 110
Ser Ile Ile Lys His Tyr Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Val Tyr Phe
115 120 125
Arg His Arg Val Thr Gln Ile Asn Leu Arg Asp Asp Lys Trp Glu Val
130 135 140
Ser Lys Gln Thr Gly Ser Pro Glu Gln Phe Asp Leu Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Met Pro Val Pro Glu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Asp Ile Thr Thr Leu
165 170 175
Ile Ser Glu Cys Gln Arg Gln Gln Leu Glu Ala Val Ser Tyr Ser Ser
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Arg Tyr Ala Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Ala Gly Thr Lys Ile Asp Val
195 200 205
Pro Trp Ala Gly Gln Tyr Ile Thr Ser Asn Pro Cys Ile Arg Phe Val
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Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser Ser Glu Ile Gly Pro
225 230 235 240
Ser Leu Val Ile His Thr Thr Val Pro Phe Gly Val Thr Tyr Leu Glu
245 250 255
His Ser Ile Glu Asp Val Gln Glu Leu Val Phe Gln Gln Leu Glu Asn
260 265 270
Ile Leu Pro Gly Leu Pro Gln Pro Ile Ala Thr Lys Cys Gln Lys Trp
275 280 285
Arg His Ser Gln Val Pro Ser Ala Gly Val Ile Leu Gly Cys Ala Lys
290 295 300
Ser Pro Trp Met Met Ala Ile Gly Phe Pro Ile
305 310 315
<210> 51
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<212> DNA
<213> 智人
<400> 51
atggcgcagg tgctgatcgt gggcgccggg atgacaggaa gcttgtgcgc tgcgctgctg 60
aggaggcaga cgtccggtcc cttgtacctt gctgtgtggg acaaggctga ggactcaggg 120
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cagtacatca cctgcactcc tcattatgcc aaaaaacacc aacgttttta tgatgaactg 240
ttagcctatg gcgttttgag gcctctaagc tcgcctattg aaggaatggt gatgaaagaa 300
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gaatcaggtg cagaagtcta cttcagacat cgtgtgacac agatcaacct aagagatgac 420
aaatgggaag tatccaaaca aacaggctcc cctgagcagt ttgatcttat tgttctcaca 480
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<210> 52
<211> 1380
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 52
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
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gcggccggcc gattcaccat ctccaaaacc tcgaccacgg tggatctgaa aatcaccagt 300
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accctcacca atggggtacg caccttcccg tccgtccggc agtcctcagg cctctactcg 600
ctgagcagcg tggtgagcgt gacctcaagc agccagcccg tcacctgcaa cgtggcccac 660
ccagccacca acaccaaagt ggacaagacc gttgcgccct cgacatgcag caagcccacg 720
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gatgaccccg aggtgcagtt cacatggtac ataaacaacg agcaggtgcg caccgcccgg 900
ccgccgctac gggagcagca gttcaacagc acgatccgcg tggtcagcac cctccccatc 960
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<210> 53
<211> 720
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 53
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
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<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 54
ctcagtagtt ttgcagtggg c 21
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<211> 48
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 55
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<210> 56
<211> 36
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 56
tatggttata gtggtgatgt taatcggttg gatctc 36
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<212> DNA
<213> 家兔
<400> 57
agtcagagtg tttatgataa caacaactta gcc 33
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 58
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<212> DNA
<213> 家兔
<400> 59
ctaggcgaat ttagttgtag tagtgctgat tgttttgct 39
<210> 60
<211> 1386
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 60
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtggagg agtccggggg tcgcctggtc acgcctggag gatccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct cagtgactat gcaataatct gggtccgcca ggctccaggg 180
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ctgacagccg cggacacggc cacctatttc tgtgccccac gttatgctgg tactactgat 360
tatcatgatg cttttgatcc ctggggccca ggcactttgg tcaccgtctc ctcagggcaa 420
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gtgaccctgg gctgcctggt caaagggtac ctcccggagc cagtgaccgt gacctggaac 540
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cccaaggaca ccctcatgat ctcacgcacc cccgaggtca catgcgtggt ggtggacgtg 840
agccaggatg accccgaggt gcagttcaca tggtacataa acaacgagca ggtgcgcacc 900
gcccggccgc cgctacggga gcagcagttc aacagcacga tccgcgtggt cagcaccctc 960
cccatcgcgc accaggactg gctgaggggc aaggagttca agtgcaaagt ccacaacaag 1020
gcactcccgg cccccatcga gaaaaccatc tccaaagcca gagggcagcc cctggagccg 1080
aaggtctaca ccatgggccc tccccgggag gagctgagca gcaggtcggt cagcctgacc 1140
tgcatgatca acggcttcta cccttccgac atctcggtgg agtgggagaa gaacgggaag 1200
gcagaggaca actacaagac cacgccggcc gtgctggaca gcgacggctc ctacttcctc 1260
tacagcaagc tctcagtgcc cacgagtgag tggcagcggg gcgacgtctt cacctgctcc 1320
gtgatgcacg aggccttgca caaccactac acgcagaagt ccatctcccg ctctccgggt 1380
aaatga 1386
<210> 61
<211> 717
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 61
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
agatgtgccg aagtagtgat gacccagact ccagcctcca tggaggcacc tatgggaggc 120
acagtcacca tcaagtgcca ggccagtcag aacatttaca actacttatc ctggtatcag 180
cagaaaccag ggcagcctcc caagctccta gtctacaagg cctccactct gacttctggg 240
gtcccgtcgc gcttcaaagg cagtggatct gggacacagt tcactctcac catcagcgac 300
ctggagtgtg ccgatgctgc cacttactac tgtcaaatca attactctat ttataatcat 360
tataatatta tttttggcgg agggaccgag gtggtcgtca agggtgatcc agttgcacct 420
actgtcctca tcttcccacc atctgctgat cttgtggcaa ctggaacagt caccatcgtg 480
tgtgtggcga ataaatactt tcccgatgtc accgtcacct gggaggtgga tggcaccacc 540
caaacaactg gcatcgagaa cagtaaaaca ccgcagaatt ctgcagattg tacctacaac 600
ctcagcagca ctctgacact gaccagcaca cagtacaaca gccacaaaga gtacacctgc 660
aaggtgaccc agggcacgac ctcagtcgtc cagagcttca ataggggtga ctgttag 717
<210> 62
<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 62
ctcagtgact atgcaataat c 21
<210> 63
<211> 48
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 63
attattggta gtagtggtga cacattctac gcgacctggg cgaaaggc 48
<210> 64
<211> 42
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 64
cgttatgctg gtactactga ttatcatgat gcttttgatc cc 42
<210> 65
<211> 27
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 65
agtcagaaca tttacaacta cttatcc 27
<210> 66
<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 66
aaggcctcca ctctgacttc t 21
<210> 67
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<212> DNA
<213> 家兔
<400> 67
caaatcaatt actctattta taatcattat aatattatt 39
<210> 68
<211> 1374
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 68
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtgaagg agtccgaggg aggtctcttc aagccaacgg ataccctgac actcacctgc 120
acagtctctg gattctccct cagtagctat ggagtgacct gggtccgcca ggctccaggg 180
aacgggctgg agtggatcgg attgattggt gatcgtggta ctacgttcta cgcgagctgg 240
gcgaaaagcc gatccaccat caccagaaac accaacctga acacggtgac tctgaaaatg 300
accaggctga cagccgcgga cacggccacc tatttctgtg cgagggggag tgggtatggt 360
gctcgcatct ggggcccagg caccctggtc accgtctcct catggcaacc taaggctcca 420
tcagtcttcc cactggcccc ctgctgcggg gacacaccca gctccacggt gaccctgggc 480
tgcctggtca aagggtacct cccggagcca gtgaccgtga cctggaactc gggcaccctc 540
accaatgggg tacgcacctt cccgtccgtc cggcagtcct caggcctcta ctcgctgagc 600
agcgtggtga gcgtgacctc aagcagccag cccgtcacct gcaacgtggc ccacccagcc 660
accaacacca aagtggacaa gaccgttgcg ccctcgacat gcagcaagcc cacgtgccca 720
ccccctgaac tcctgggggg accgtctgtc ttcatcttcc ccccaaaacc caaggacacc 780
ctcatgatct cacgcacccc cgaggtcaca tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggatgac 840
cccgaggtgc agttcacatg gtacataaac aacgagcagg tgcgcaccgc ccggccgccg 900
ctacgggagc agcagttcaa cagcacgatc cgcgtggtca gcaccctccc catcgcgcac 960
caggactggc tgaggggcaa ggagttcaag tgcaaagtcc acaacaaggc actcccggcc 1020
cccatcgaga aaaccatctc caaagccaga gggcagcccc tggagccgaa ggtctacacc 1080
atgggccctc cccgggagga gctgagcagc aggtcggtca gcctgacctg catgatcaac 1140
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tacaagacca cgccggccgt gctggacagc gacggctcct acttcctcta cagcaagctc 1260
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gccttgcaca accactacac gcagaagtcc atctcccgct ctccgggtaa atga 1374
<210> 69
<211> 714
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 69
atggacacga gggcccccac tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
acatttgccc aagtgctgac ccagactcca tcgcctgtgt ctgcagctgt gggaggcaca 120
gtcaccatca attgccagtc cagtcagagt gtttataaga acaactactt agcctggtat 180
cagcagaaac cagggcagcc tcccaagctc cttatctacg aaacatccaa actggcatct 240
ggggtcccac cgcggttcag cggcagtggg tctgggacac agttcactct caccatcagc 300
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agcagcactc tgacactgac cagcacacag tacaacagcc acaaagagta cacctgcaag 660
gtgacccagg gcacgacctc agtcgtccag agcttcaata ggggtgactg ttag 714
<210> 70
<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 70
ctcagtagct atggagtgac c 21
<210> 71
<211> 48
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 71
ttgattggtg atcgtggtac tacgttctac gcgagctggg cgaaaagc 48
<210> 72
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<212> DNA
<213> 家兔
<400> 72
gggagtgggt atggtgctcg catc 24
<210> 73
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<212> DNA
<213> 家兔
<400> 73
agtcagagtg tttataagaa caactactta gcc 33
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<212> DNA
<213> 家兔
<400> 74
gaaacatcca aactggcatc t 21
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<211> 33
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 75
caaggcggtt atagtggtgt tgattttatg gct 33
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<211> 1374
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 76
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
tcggtgaagg agtccgaggg aggtctcttc aagccaacgg ataccctgac actcacctgc 120
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gccttgcaca accactacac gcagaagtcc atctcccgct ctccgggtaa atga 1374
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<211> 714
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 77
atggacacga gggcccccac tcagctcctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
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gtggcgaata aatactttcc cgatgtcacc gtcacctggg aggtggatgg caccacccaa 540
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<210> 78
<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 78
ctcactacct atggagtgac c 21
<210> 79
<211> 48
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 79
ttgattggtg atcgcggtac cacttactac gcgagctggg tgaatggc 48
<210> 80
<211> 24
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 80
gggagtggat atggtgctcg catc 24
<210> 81
<211> 33
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 81
agtcagactg tttataacaa taactactta tcc 33
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 82
gaaacatcca aactgtcatc t 21
<210> 83
<211> 30
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 83
ggcggttata gtggtgttga ttttatggct 30
<210> 84
<211> 1353
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 84
atggagactg ggctgcgctg gcttctcctg gtcgctgtgc tcaaaggtgt ccagtgtcag 60
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accgttgcgc cctcgacatg cagcaagccc acgtgcccac cccctgaact cctgggggga 720
ccgtctgtct tcatcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc acgcaccccc 780
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc caggatgacc ccgaggtgca gttcacatgg 840
tacataaaca acgagcaggt gcgcaccgcc cggccgccgc tacgggagca gcagttcaac 900
agcacgatcc gcgtggtcag caccctcccc atcgcgcacc aggactggct gaggggcaag 960
gagttcaagt gcaaagtcca caacaaggca ctcccggccc ccatcgagaa aaccatctcc 1020
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cagcggggcg acgtcttcac ctgctccgtg atgcacgagg ccttgcacaa ccactacacg 1320
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<211> 720
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 85
atggacacga gggcccccac tcagctgctg gggctcctgc tgctctggct cccaggtgcc 60
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cctactgtcc tcatcttccc accagctgct gatcaggtgg caactggaac agtcaccatc 480
gtgtgtgtgg cgaataaata ctttcccgat gtcaccgtca cctgggaggt ggatggcacc 540
acccaaacaa ctggcatcga gaacagtaaa acaccgcaga attctgcaga ttgtacctac 600
aacctcagca gcactctgac actgaccagc acacagtaca acagccacaa agagtacacc 660
tgcaaggtga cccagggcac gacctcagtc gtccagagct tcaatagggg tgactgttag 720
<210> 86
<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 86
ctcaataact accacatata c 21
<210> 87
<211> 45
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 87
atcattttca atggtggcac atattacgcg agatggacaa aaggc 45
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<211> 12
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 88
ggggacggca tc 12
<210> 89
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<212> DNA
<213> 家兔
<400> 89
agtcagagtg tttttaataa caactattta gcc 33
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<211> 21
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 90
tctgcatcca ctctggcgtc t 21
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<211> 39
<212> DNA
<213> 家兔
<400> 91
gcaggcagtt ttgattgtaa tagtggtgat tgtgttgct 39
<210> 92
<211> 342
<212> PRT
<213> 智人
<400> 92
Met Ala Gln Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Met Thr Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Ala Leu Leu Arg Arg Gln Thr Ser Gly Pro Leu Tyr Leu Ala Val
20 25 30
Trp Asp Lys Ala Asp Asp Ser Gly Gly Arg Met Thr Thr Ala Cys Ser
35 40 45
Pro His Asn Pro Gln Cys Thr Ala Asp Leu Gly Ala Gln Tyr Ile Thr
50 55 60
Cys Thr Pro His Tyr Ala Lys Lys His Gln Arg Phe Tyr Asp Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Gly Val Leu Arg Pro Leu Ser Ser Pro Ile Glu Gly Met
85 90 95
Val Met Lys Glu Gly Asp Cys Asn Phe Val Ala Pro Gln Gly Ile Ser
100 105 110
Ser Ile Ile Lys His Tyr Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Val Tyr Phe
115 120 125
Arg His Arg Val Thr Gln Ile Asn Leu Arg Asp Asp Lys Trp Glu Val
130 135 140
Ser Lys Gln Thr Gly Ser Pro Glu Gln Phe Asp Leu Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Met Pro Val Pro Glu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Asp Ile Thr Thr Leu
165 170 175
Ile Ser Glu Cys Gln Arg Gln Gln Leu Glu Ala Val Ser Tyr Ser Ser
180 185 190
Arg Tyr Ala Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Ala Gly Thr Lys Ile Asp Val
195 200 205
Pro Trp Ala Gly Gln Tyr Ile Thr Ser Asn Pro Cys Ile Arg Phe Val
210 215 220
Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser Ser Glu Ile Gly Pro
225 230 235 240
Ser Leu Val Ile His Thr Thr Val Pro Phe Gly Val Thr Tyr Leu Glu
245 250 255
His Ser Ile Glu Asp Val Gln Glu Leu Val Phe Gln Gln Leu Glu Asn
260 265 270
Ile Leu Pro Gly Leu Pro Gln Pro Ile Ala Thr Lys Cys Gln Lys Trp
275 280 285
Arg His Ser Gln Val Thr Asn Ala Ala Ala Asn Cys Pro Gly Gln Met
290 295 300
Thr Leu His His Lys Pro Phe Leu Ala Cys Gly Gly Asp Gly Phe Thr
305 310 315 320
Gln Ser Asn Phe Asp Gly Cys Ile Thr Ser Ala Leu Cys Val Leu Glu
325 330 335
Ala Leu Lys Asn Tyr Ile
340
<210> 93
<211> 1029
<212> DNA
<213> 智人
<400> 93
atggcgcagg tgctgatcgt gggcgccggg atgacaggaa gcttgtgcgc tgcgctgctg 60
acgaggcaga cgtccggtcc cttgtacctt gctgtgtggg acaaggctga ggactcaggg 120
ggaagaatga ctacagcctg cagtcctcat aatcctcagt gcacagctga cttgggtgct 180
cagtacatca cctgcactcc tcattatgcc aaaaaacacc aacgttttta tgatgaactg 240
ttagcctatg gcgttttgag gcctctaagc tcgcctattg aaggaatggt gatgaaagaa 300
ggagactgta actttgtggc acctcaagga atttcttcaa ttattaagca ttacttgaaa 360
gaatcaggtg cagaagtcta cttcagacat cgtgtgacac agatcaacct aagagatgac 420
aaatgggaag tatccaaaca aacaggctcc cctgagcagt ttgatcttat tgttctcaca 480
atgccagttc ctgagattct gcagcttcaa ggtgacatca ccaccttaat tagtgaatgc 540
caaaggcagc aactggaggc tgtgagctac tcctctcgat atgctctggg cctcttttat 600
gaagctggta cgaagattga tgtcccttgg gctgggcagt acatcaccag taatccctgc 660
atacgcttcg tctccattga taataagaag cgcaatatag agtcatcaga aattgggcct 720
tccctcgtga ttcacaccac tgtcccattt ggagttacat acttggaaca cagcattgag 780
gatgtgcaag agttagtctt ccagcagctg gaaaacattt tgccgggttt gcctcagcca 840
attgctacca aatgccaaaa atggagacat tcacaggtta caaatgctgc tgccaactgt 900
cctggccaaa tgactctgca tcacaaacct ttccttgcat gtggagggga tggatttact 960
cagtccaact ttgatggctg catcacttct gccctatgtg ttctggaagc tttaaagaat 1020
tatatttaa 1029
<210> 94
<211> 315
<212> PRT
<213> 智人
<400> 94
Met Ala Gln Val Leu Ile Val Gly Ala Gly Met Thr Gly Ser Leu Cys
1 5 10 15
Ala Ala Leu Leu Arg Arg Gln Thr Ser Gly Pro Leu Tyr Leu Ala Val
20 25 30
Trp Asp Lys Ala Asp Asp Ser Gly Gly Arg Met Thr Thr Ala Cys Ser
35 40 45
Pro His Asn Pro Gln Cys Thr Ala Asp Leu Gly Ala Gln Tyr Ile Thr
50 55 60
Cys Thr Pro His Tyr Ala Lys Lys His Gln Arg Phe Tyr Asp Glu Leu
65 70 75 80
Leu Ala Tyr Gly Val Leu Arg Pro Leu Ser Ser Pro Ile Glu Gly Met
85 90 95
Val Met Lys Glu Gly Asp Cys Asn Phe Val Ala Pro Gln Gly Ile Ser
100 105 110
Ser Ile Ile Lys His Tyr Leu Lys Glu Ser Gly Ala Glu Val Tyr Phe
115 120 125
Arg His Arg Val Thr Gln Ile Asn Leu Arg Asp Asp Lys Trp Glu Val
130 135 140
Ser Lys Gln Thr Gly Ser Pro Glu Gln Phe Asp Leu Ile Val Leu Thr
145 150 155 160
Met Pro Val Pro Glu Ile Leu Gln Leu Gln Gly Asp Ile Thr Thr Leu
165 170 175
Ile Ser Glu Cys Gln Arg Gln Gln Leu Glu Ala Val Ser Tyr Ser Ser
180 185 190
Arg Tyr Ala Leu Gly Leu Phe Tyr Glu Ala Gly Thr Lys Ile Asp Val
195 200 205
Pro Trp Ala Gly Gln Tyr Ile Thr Ser Asn Pro Cys Ile Arg Phe Val
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Ser Ile Asp Asn Lys Lys Arg Asn Ile Glu Ser Ser Glu Ile Gly Pro
225 230 235 240
Ser Leu Val Ile His Thr Thr Val Pro Phe Gly Val Thr Tyr Leu Glu
245 250 255
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Ile Leu Pro Gly Leu Pro Gln Pro Ile Ala Thr Lys Cys Gln Lys Trp
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Arg His Ser Gln Val Pro Ser Ala Gly Val Ile Leu Gly Cys Ala Lys
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Ser Pro Trp Met Met Ala Ile Gly Phe Pro Ile
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<210> 95
<211> 945
<212> DNA
<213> 智人
<400> 95
atggcgcagg tgctgatcgt gggcgccggg atgacaggaa gcttgtgcgc tgcgctgctg 60
acgaggcaga cgtccggtcc cttgtacctt gctgtgtggg acaaggctga ggactcaggg 120
ggaagaatga ctacagcctg cagtcctcat aatcctcagt gcacagctga cttgggtgct 180
cagtacatca cctgcactcc tcattatgcc aaaaaacacc aacgttttta tgatgaactg 240
ttagcctatg gcgttttgag gcctctaagc tcgcctattg aaggaatggt gatgaaagaa 300
ggagactgta actttgtggc acctcaagga atttcttcaa ttattaagca ttacttgaaa 360
gaatcaggtg cagaagtcta cttcagacat cgtgtgacac agatcaacct aagagatgac 420
aaatgggaag tatccaaaca aacaggctcc cctgagcagt ttgatcttat tgttctcaca 480
atgccagttc ctgagattct gcagcttcaa ggtgacatca ccaccttaat tagtgaatgc 540
caaaggcagc aactggaggc tgtgagctac tcctctcgat atgctctggg cctcttttat 600
gaagctggta cgaagattga tgtcccttgg gctgggcagt acatcaccag taatccctgc 660
atacgcttcg tctccattga taataagaag cgcaatatag agtcatcaga aattgggcct 720
tccctcgtga ttcacaccac tgtcccattt ggagttacat acttggaaca cagcattgag 780
gatgtgcaag agttagtctt ccagcagctg gaaaacattt tgccgggttt gcctcagcca 840
attgctacca aatgccaaaa atggagacat tcacaggtac caagtgctgg tgtgattcta 900
ggatgtgcga agagcccctg gatgatggcg attggatttc ccatc 945

Claims (36)

1.一种包括至少一种肾酶抑制剂的组合物，所述肾酶抑制剂选自化合物、蛋白质、肽、肽模拟、肾酶受体、肾酶受体片段、抗体、抗体片段、抗体模拟、核酶、小分子化合物、短发夹RNA、反义核酸分子、siRNA、miRNA、编码反义核酸分子的核酸、编码蛋白质的核酸序列。
2.权利要求1所述的组合物，其中所述肾酶抑制剂是肾酶结合分子。
3.权利要求2所述的组合物，其中所述肾酶结合分子是抗体或其结合部分。
4.权利要求3所述的组合物，其包括以至少10-6M的亲和力特异性地结合至肾酶的抗体或其结合部分。
5.权利要求3所述的组合物，其中所述抗体特异性地结合选自SEQ ID NO:1-7的肽序列。
6.权利要求3所述的组合物，其中所述肾酶是人肾酶。
7.权利要求3所述的组合物，其中所述抗体选自单克隆抗体、多克隆抗体、单链抗体、免疫连接物、去岩藻糖基化抗体和双特异性抗体。
8.权利要求7所述的组合物，其中所述免疫连接物包括治疗性药剂或检测部分。
9.权利要求3所述的组合物，其中所述抗体选自人源化抗体、嵌合抗体、全人抗体、抗体模拟。
10.权利要求3所述的组合物，其中所述抗体包括选自如下的至少一种：a)选自SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:19的重链CDR1序列；b)选自SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:20的重链CDR2序列；c)选自SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:21的重链CDR3序列；d)选自SEQ ID NO:14和SEQID NO:22的轻链CDR1序列；e)选自SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:23的轻链CDR2序列；f)选自SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:24的轻链CDR3序列。
11.权利要求4所述的组合物，其中所述抗体特异性地结合包括SEQ ID NO:4的氨基酸序列的多肽。
12.权利要求3所述的组合物，其中所述抗体包括选自如下的至少一种：a)选自SEQ IDNO:27和SEQ ID NO:35的重链CDR1序列；b)选自SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:36的重链CDR2序列；c)选自SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:37的重链CDR3序列；d)选自SEQ ID NO:30和SEQID NO:38的轻链CDR1序列；e)选自SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:39的轻链CDR2序列；f)选自SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:40的轻链CDR3序列。
13.权利要求6所述的组合物，其中所述抗体特异性地结合包括SEQ ID NO:6的氨基酸序列的多肽。
14.权利要求3所述的组合物，其中所述抗体包括选自如下的至少一种：a)重链CDR1序列SEQ ID NO:43；b)重链CDR2序列SEQ ID NO:44；c)重链CDR3序列SEQ ID NO:45；d)轻链CDR1序列SEQ ID NO:46；e)轻链CDR2序列SEQ ID NO:47；f)轻链CDR3序列SEQ ID NO:48。
15.权利要求7所述的组合物，其中所述抗体特异性地结合包括SEQ ID NO:7的氨基酸序列的多肽。
16.权利要求3所述的组合物，其中所述抗体包括选自SEQ ID NO:9、17、25、33和41的重链序列。
17.权利要求3所述的组合物，其中所述抗体包括选自SEQ ID NO:10、18、26、34和42的轻链序列。
18.一种包含抗体的组合物，所述抗体结合至肾酶并与权利要求3所述的抗体与肾酶的结合竞争。
19.一种治疗或预防对象中与肾酶相关联的疾病或紊乱的方法，所述方法包括将权利要求1所述的组合物施用给所述对象的步骤。
20.权利要求19所述的方法，其中权利要求1所述的组合物与第二治疗性药剂组合施用至所述对象。
21.权利要求19所述的方法，其中所述与肾酶相关联的疾病或紊乱选自肾脏疾病、心血管疾病、癌症和其任意组合。
22.权利要求21所述的方法，其中所述疾病或紊乱是癌症，并且所述癌症是胰腺癌或黑素瘤。
23.一种分离的核酸分子，其编码权利要求2所述的肾酶结合分子。
24.一种表达载体，其包括权利要求23所述的核酸分子。
25.一种宿主细胞，其包括权利要求23所述的核酸分子。
26.一种诊断有需要的对象中的疾病或紊乱的方法，所述方法包括：
a.测定所述对象的生物学样本中肾酶的水平，
b.将所述对象的生物学样本中肾酶的水平与比较物对照进行比较，和
c.当与所述比较物对照的肾酶的水平比较时对象的生物学样本中肾酶的水平升高时诊断所述对象患有疾病或紊乱。
27.权利要求26所述的方法，包括给被诊断为患有疾病或紊乱的所述对象施用治疗的进一步步骤。
28.权利要求26所述的方法，其中所述生物学样本中肾酶的水平通过测量所述生物学样本中肾酶mRNA的水平来测定。
29.权利要求26所述的方法，其中所述生物学样本中肾酶的水平通过测量所述生物学样本中肾酶多肽的水平来测定。
30.权利要求26所述的方法，其中所述生物学样本中肾酶多肽的水平使用肾酶结合分子来测定。
31.权利要求26所述的方法，其中所述生物学样本中肾酶的水平通过测量所述生物学样本中肾酶多肽的酶活性来测定。
32.权利要求26所述的方法，其中当与比较物对照比较时，所述肾酶的水平增加至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少200％、至少300％、至少400％、至少500％、至少600％、至少700％、至少800％、至少900％、至少1000％时，所述生物学样本中肾酶的水平被确定为升高。
33.权利要求26所述的方法，其中所述比较物对照为选自阳性对照、阴性对照、历史对照、历史标准、或所述生物学样本中参考分子的水平中的至少一种。
34.权利要求26所述的方法，其中所述疾病或紊乱为选自肾脏疾病、心血管疾病、癌症和其任意组合中的至少一种。
35.权利要求34所述的方法，其中所述疾病或紊乱是癌症，并且所述癌症是胰腺癌或黑素瘤。
36.权利要求26所述的方法，其中所述对象是人。
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