CN106659705A - 通过prostratin靶向k‑ras介导的信号转导通路和恶性肿瘤 - Google Patents

Abstract

本发明提供治疗对象中表达K‑Ras的癌症的方法，所述方法包括向对象施用治疗量的prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。还提供用于治疗对象中表达K‑Ras的癌症的组合物和试剂盒。

Description

通过PROSTRATIN靶向K-RAS介导的信号转导通路和恶性肿瘤

相关申请的交叉引用

本申请要求于2014年9月10日提交的美国临时申请第62/048,761号的优先权，将其全部内容通过引用并入本文以用于全部目的。

发明背景

胰腺癌是通常具有不良预后的癌症，即使在其早期阶段被检测到。据估计，对于所有阶段的胰腺癌组合，只有6％的患者在诊断后存活五年。已知胰腺癌的最常见形式(胰腺导管腺癌(PDAC))具有极差的预后。尽管对于接受手术切除的患者而言，存活时间有所改善，但是PDAC通常未在手术切除是可行时被诊断出。

癌基因K-Ras在诸如胰腺癌、肺癌和结肠直肠癌的癌症中通常是突变的，在超过90％的PDAC中存在激活的K-Ras突变。然而，迄今为止，还没有成功研发出直接封闭K-Ras功能并在临床前模型中显示功效的小分子抑制剂。

发明概述

在一个方面，提供治疗对象中的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述对象施用治疗量的prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。

在一些实施方案中，所述癌症为表达K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症为表达野生型K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症为表达突变型K-Ras的癌症。

在一些实施方案中，所述癌症为胰腺癌、结肠直肠癌或肺癌。在一些实施方案中，所述癌症为胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)。

在一些实施方案中，向对象施用prostratin或者其盐或异构体。在一些实施方案中，向对象施用prostratin类似物或者其盐或异构体。在一些实施方案中，prostratin类似物具有下述结构式：

其中R为乙基、甲酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、苯甲酸酯、乙酸苯酯、乙酸环己酯、乙酸五氟苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、(5,6,7,8)四氢-1-萘基乙酸酯、乙酸联苯酯、乙酸金刚烷酯或者对苯乙酸苄酯。

在一些实施方案中，经口服、静脉内或者腹腔内施用prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。

在一些实施方案中，将prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体与化疗剂组合施用。在一些实施方案中，所述化疗剂是吉西他滨。在一些实施方案中，将prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体与化疗剂同时施用。在一些实施方案中，将prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体与化疗剂依次施用。

在另一方面，提供用于治疗癌症的组合物和试剂盒。在一些实施方案中，所述组合物或试剂盒包含：

Prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体；以及

化疗剂。

在一些实施方案中，组合物和试剂盒用于治疗表达K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症是表达野生型K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症是表达突变型K-Ras的癌症。在一些实施方案中，组合物或试剂盒是用于治疗癌症的组合物或试剂盒，所述癌症是胰腺癌、结肠直肠癌或肺癌。在一些实施方案中，组合物或试剂盒用于治疗胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)。

在一些实施方案中，组合物或试剂盒包含prostratin或者其盐或异构体。在一些实施方案中，组合物或试剂盒包含如本文所述的prostratin类似物或者其盐或异构体。

在一些实施方案中，化疗剂是吉西他滨。

在另一方面，提供包含prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体的组合物，其用于治疗癌症。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)。在一些实施方案中，癌症是表达K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症是表达野生型K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症是表达突变型K-Ras的癌症。在一些实施方案中，将包含prostratin或prostratin类似物的组合物与化疗剂组合使用。在一些实施方案中，包含prostratin或prostratin类似物的组合物还包含化疗剂。在一些实施方案中，化疗剂是吉西他滨。

而在另一方面，提供包含prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体的组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。在一些实施方案中，癌症是胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)。在一些实施方案中，癌症是表达K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症是表达野生型K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症是表达突变型K-Ras的癌症。在一些实施方案中，包含prostratin或prostratin类似物的组合物还包含化疗剂。在一些实施方案中，化疗剂是吉西他滨。

附图简述

图1.K-Ras^V12和H-Ras^V12具有不同的肿瘤起始特性，尽管具有相当的经典信号转导输出。(A)如通过Raf-RBD或Ral-GDS-RBD pull-down分析所测量的相当水平的总Ras蛋白以及GTP结合的Ras。(B)H-Ras^V12或K-Ras^V12转化的细胞中相当水平的磷酸化Erk和Akt。(C)K-Ras^V12转化的NIH3T3细胞呈现出增加的球体形成。左图：形成的球体的大体形态。右图：球形成效率(N＝6)。(D)当注射细胞的数目为1,000个(左上图)或100个(右上图)时，H-Ras^V12和K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的肿瘤起始能力。当注射细胞的数目变得有限时，与H-Ras^V12转化的细胞相比，K-Ras^V12转化的细胞呈现出增加的肿瘤起始能力(下表)。(E)通过EGF促进BxPC3球体的形成。上图：形成的球体的形态。下图：通过用接种细胞数标准化的球体的数目计算的球形成效率(N＝6)。(F)K-Ras而非H-Ras的敲低削弱了EGF对BxPC3球体形成的刺激(下图)或者球形成效率的增加(上方图)(N＝6)。(G)突变K-Ras的敲低阻抑了PANC1球形成效率。左上图：蛋白质印迹证实了敲低效率。左下图和右图：当与载体对照相比时，具有K-Ras shRNA表达的PANC1形成的球体具有更小的尺寸和数目(N＝6)。(H)突变K-Ras的敲低降低了PANC1肿瘤起始能力。左图：无瘤生存率曲线。右图：肿瘤形成频率。N.S.无显著性；*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图2.K-Ras而非H-Ras抑制Fzd8。(A)通过qPCR阵列所评估的H-Ras^V12和K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中差异表达的干细胞因子的热点图(N＝3)。(B)在H-Ras^V12和K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中差异表达的基因Bmpr1b、Fzd8和Gli2的散点图(左)和鉴定。(C)当与载体对照或者H-Ras^V12转化的细胞相比时，K-Ras转化的NIH/3T3细胞中降低的Fzd8表达和Wnt/Ca²⁺信号转导(上方的8幅图)，以及当与具有突变Raf的那些细胞相比时，具有致癌K-Ras突变的小鼠PDAC细胞中降低的Fzd8表达和Wnt/Ca²⁺信号转导(下方的4幅图)。(D)当分别与具有H-Ras^v12或B-Raf的那些细胞相比时，在K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中(上方图)以及在具有K-Ras突变的小鼠PDAC细胞(下方图)中增加的TCF4和β-连环蛋白复合物。(E)与载体对照或H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞相比，K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中增加的TCF/β-连环蛋白活性(N＝4)。(F)K-Ras的敲低导致PANC2.13和PANC1细胞中Fzd8表达在mRNA水平上的增加(N＝3)。(G)具有包含Kras和HrasKI等位基因突变的wt H-Ras KO的皮肤肿瘤中，Fzd8表达和CaMKii磷酸化水平的降低。(H)K-Ras的敲低增加了Fzd8蛋白水平、增强非经典Wnt信号转导(p-CaMKii)，并增加了β-连环蛋白的磷酸化。(I)如通过TOPFlash分析(N＝4)所揭示的，PANC2.13细胞中K-Ras的敲低减弱经典Wnt信号转导。

图3.Fzd8介导的非经典Wnt/Ca2⁺信号转导抑制H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的肿瘤促进特性。(A)Fzd8在非经典Wnt/Ca²⁺信号转导通路中的示意图及其与经典的Wnt信号转导的串扰的示意图。使用小分子KN-93和针对Fzd8的shRNA来封阻CaMKii活性和Fzd8表达，以用于下述实验。(B)通过KN-93抑制CaMKii降低了CaMKii的磷酸化，并降低了Fzd8的表达。(C)在H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中，KN-93的处理刺激了β-连环蛋白的转录活性(N＝4)。(D)通过KN-93抑制CaMKii增加了H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞而非K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的球体形成(N＝6)。(E-F)在H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中，Fzd8的敲低降低了磷酸化CaMKii的水平(E)并刺激β-连环蛋白的转录活性(N＝4)(F)。(G)在H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中，Fzd8的敲低促进了球体形成和重新铺板率(N＝6)。(H)在H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中，Fzd8的敲低增强了其肿瘤起始能力。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图4.Fzd8的下调是K-Ras增强肿瘤起始所需的。(A-B)在K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中，Fzd8表达的恢复增强了Wnt/Ca²⁺信号转导(A)并降低了β-连环蛋白的转录活性(B)(N＝4)。(C)在K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中，Fzd8的恢复降低了球形成效率和重新铺板率(N＝6)。(D)Fzd8的恢复降低了K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的肿瘤起始能力。(E)在PANC1细胞中，Fzd8的恢复增强了Wnt/Ca²⁺信号转导(N＝4)，如通过NF-AT的转录活性所揭示的，并降低了β-连环蛋白活性(N＝4)。(F)Fzd8的恢复降低了PANC1细胞的肿瘤起始能力。(G)人胰腺肿瘤组织中Fzd8的下调。左图：人胰腺正常组织和恶性组织中的针对Fzd8进行免疫染色的组织切片的显微图。(H)胰腺组织阵列中的Fzd8免疫反应性的H评分，所述胰腺组织包括正常的或者恶性的胰腺组织。(I)对癌邻近的胰腺正常组织以及胰腺腺癌中的人Fzd8进行探查的RNAscope原位杂交。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图5.钙调蛋白(CaM)-K-Ras相互作用是抑制K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中钙调蛋白激酶II(CaMKii)活性和Fzd8表达所必需的。(A)如在EDTA或Ca²⁺存在的情况下通过CaMpull-down分析所揭示的，钙调蛋白与K-Ras^V12而非与H-Ras^V12相互作用。(B)当与K-Ras^V12或K-Ras^V12-S181A突变体相比时，CaM与K-Ras^V12-S181D突变体之间的相互作用的丧失。(C)当与K-Ras^V12或K-Ras^V12-S181A突变体相比时，K-Ras^V12-S181D突变体呈现减弱的抑制Fzd8启动子活性的能力。(D)当与K-Ras^V12-或–S181A组相比时，在NIH/3T3-K-Ras^V12-S181D细胞中Fzd8的表达在RNA水平上增加(N＝3)。(E)当与NIH/3T3-K-Ras^V12或S181A细胞相比时，表达K-Ras^V12-S181D的NIH/3T3细胞显示出增加的Fzd8表达水平和磷酸化CaMKii水平。在这三种细胞系中，K-Ras蛋白水平和磷酸化Erk水平无显著差异。(F)当与K-Ras^V12-或–S181A组相比时，NIH/3T3-K-Ras^V12-S181D细胞呈现显著增加的NF-AT转录活性(左图)和显著降低的Wnt/β-连环蛋白的活性(右图)(N＝4)。(G)通过Wnt/β-连环蛋白信号转导通路，在K-Ras介导的Fzd8表达的抑制和K-Ras促进的干细胞性中CaM-K-Ras相互作用的示意图。提出Prostratin通过激活PKC使K-Ras磷酸化来干扰所述相互作用。(H)如通过CaM pull-down分析所揭示的，通过prostratin处理抑制钙调蛋白与K-Ras^V12的相互作用。WCB：全细胞裂解物。IB：免疫印迹。(I)在K-Ras^V12而非K-Ras^V12-S181A突变体或H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中，通过prostratin处理升高的CaMKii活性。(J)在对prostratin处理的应答中，K-Ras^V12、K-Ras^V12-S181A突变体和H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的细胞形态。将DMSO用作介质对照。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图6.Prostratin阻止了具有突变K-Ras的人胰腺癌中的肿瘤起始。(A)皮下注射的PANC1和PANC2.13在对介质或prostratin处理的应答中的肿瘤起始率。上方图：实验设计的示意图。在肿瘤移植之前一天，口服施用prostratin。将裸鼠用于皮下注射，以及将SCID小鼠用于原位移植。(B)在对药物处理的应答中，来源于PANC2.13的皮下肿瘤的肿瘤生长曲线(N＝10)。(C)在对药物处理的响应中，来源于PANC2.13的皮下肿瘤的生物发光成像(BLI)信号转导变化(N＝10)。(D)在对药物处理的应答中，来源于PANC2.13的皮下肿瘤的肿瘤增殖率和Ki67染色。肿瘤增殖率(D27-36)＝(D36天的肿瘤大小-D27天的肿瘤大小)/D36天的肿瘤大小*100。(E)在对药物处理的应答中，来源于PANC2.13的原位肿瘤的肿瘤起始率和BLI信号转导活性。(F)正常小鼠胰腺和来源于PANC2.13的原位肿瘤的H&E染色。(G)在对药物处理的应答中，来源于PANC2.13的原位肿瘤的Ki67染色。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。对于(B)&(C)，数据是平均值±SEM。

图7.Prostratin阻抑由致癌K-Ras驱使的体内恶性肿瘤。(A)对于来源于PANC1或PANC2.13的0.5X10⁶个细胞的建立的皮下肿瘤，Prostratin显示出抗肿瘤效果(N＝7；数据是平均值±SEM)。(B)Prostratin抑制通过cfDNA值所测量的原位肿瘤负荷(对于PANC2.13组，N＝5；对于PANC2.03组，N＝6)。(C)Prostratin降低了LRIG1cre/ER/LSL-Ras^G12V GEMM中乳头状瘤形成的发生率。左图：LRIG1cre/ER/LSL-Ras^G12V小鼠中乳头状瘤产生的示意图。右图：用介质或prostratin进行处理的携带K-Ras^G12V诱导的乳头状瘤的小鼠的图片。(D)Prostratin差异性地影响LRIG1cre/ER/LSL-H-和K-Ras^G12V小鼠中的乳头状瘤的起始。(E)在用介质(上方图)或prostratin处理(下方图)的K-Ras^G12V诱导的乳头状瘤中，H&E染色以及针对E-钙粘蛋白和波形蛋白的IHC染色。

图8.(A)被H-Ras^V12或K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中类似水平的磷酸化Erk，无论培养基中的血清浓度如何。(B)如通过K-LISA所测量的H-Ras^V12或K-Ras^V12转化的细胞中类似的Akt活性(N＝4)。(C)由K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞形成的球体的增加的重新铺板率。左图：球体的形态及其随后置于包含血清的培养基之后的变化。中间图：活细胞的结晶紫染色。右图：重新铺板率(N＝8)。(D)如Erk的磷酸化所指示的在含有野生型Ras蛋白的BxPC3细胞中EGF的信号转导效力。(E-F)通过shRNA选择性敲低BxPC3细胞中的H-Ras或K-Ras。(G)K-Ras敲低之后，PANC2.13(左)和PANC1(右)细胞的形态。(H-I)在PANC2.13或PANC1细胞中，K-Ras的敲低降低了蛋白水平(H)或mRNA(I)水平的干细胞性特征。(J)突变的K-Ras的敲低减少了PANC2.13细胞中球体的形成和重新铺板(N＝6)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图9.(A)当与载体对照和H-Ras^V12相比时，用K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中c-Myc和TCF1mRNA水平的表达增加(N＝3)。(B)在Rasless MEF-K-Ras^G12V细胞中，Fzd8介导的非经典信号转导通路受抑。(左图)在表达K-Ras^G12V的Rasless MEF中，蛋白质印迹显示降低的磷酸化CaMKii。(右图)表达H-Ras^G12V和K-Ras^G12V的Rasless MEF中的小鼠Fzd8的qPCR阵列(N＝3)。(C)在相同数目的注射细胞下，Rasless MEF K-Ras^G12V细胞比Rasless MEF H-Ras^G12V细胞显示出更高的肿瘤起始频率。(D)来源于Rasless MEF K-Ras^G12V细胞的肿瘤显示出显著增加的增殖率。数据是平均值±SEM。(E)H-Ras^V12和K-Ras^V12转化的NIH/3T3显示出类似的Wnt3a和Wnt5a表达水平。(F)对在含有或不含Wnt3a或Wnt5a的无血清培养基中培养的NIH/3T3细胞中磷酸化CaMKii进行的蛋白质印迹。(G)在含有或不含Wnt3a或Wnt5a的培养基中的NIH/3T3细胞的TOPFlash分析(N＝4)。(H)在对Wnt3a或Wnt5a的应答中，NIH/3T3细胞的球体形成分析。**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图10.(A)在结肠癌细胞系中，突变K-Ras的敲低增加了Fzd8的表达以及CaMKii的磷酸化或者NFAT的转录活性(N＝3)。(B)在K-Ras已敲低的结肠癌细胞系中的TOPFlash(N＝3)。(C)在K-Ras已敲低的结肠癌细胞系中的类器官形成分析(N＝6)。(D)使用BrdU掺入分析来评估K-Ras已敲低的结肠癌细胞系中的细胞增殖率。将表达pLKO.1的细胞用作对照以用于标准化(N＝6)。(E)用不同的端锚聚合酶抑制剂处理12小时的NIH/3T3细胞中的相对TOPFlash活性。将DMSO处理的细胞用于标准化(对于各化合物，浓度：0.5μM)(N＝4)。(F)用不同的端锚聚合酶抑制剂处理12小时的NIH/3T3细胞中的球体形成分析。将DMSO处理的细胞用于标准化(N＝6)。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001。

图11.(A)在存在或不存在Fzd8过表达的NIH/3T3-K-Ras^V12细胞中，Wnt3a或Wnt5a的存在未影响磷酸化CaMKii的水平。(B)用Wnt3a或Wnt5a处理的过表达Fzd8的NIH/3T3-K-Ras^V12细胞中的TOPFlash分析。将表达GFP载体的细胞用作对照(N＝3)。(C-D)在PANC2.13细胞中，Fzd8的恢复降低了干细胞特征，并增强了CaMKii的磷酸化(C)，同时降低了经典Wnt通路中的靶基因的表达(D)(N＝3)。(E)在PANC1细胞中，Fzd8的过表达降低了CD44和CD24mRNA水平的表达(N＝3)。(F)在PANC2.13或PANC1细胞中，Fzd8的恢复模拟了K-Ras敲低的表型。(G)对人胰腺正常组织和恶性组织中以及不同阶段的人胰腺肿瘤组织中的Fzd8进行免疫染色的组织切片的显微图。(H)不同的公开数据集中人Fzd8表达Oncomine分析。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

图12.(A)用于NIH/3T3转化的K-Ras^V12表达构建体上的点突变的示意图。(B)K-Ras蛋白在具有K-Ras^V12、-S181D和-S181A表达的NIH/3T3细胞中的膜定位。(C)在存在EDTA或Ca²⁺的情况下，钙调蛋白与K-Ras^V12而非N-Ras^V12的相互作用，如通过CaM pull-down分析所揭示的。(D)过表达N-Ras^G12V的Rasless MEF比Rasless MEF-K-Ras^G12V显示出更高的磷酸化CaMKii水平。(E)当与K-Ras^G12V相比时，N-Ras^G12V增强了Rasless MEF中Fzd8在mRNA水平上的表达(N＝3)。(F)过表达N-Ras^G12V或K-Ras^G12V的Rasless MEF中的TOPFlash分析(N＝4)。**P<0.01。

图13.(A)在多种细胞系中，在对prostratin的应答中，通过DMSO处理组进行标准化的相对PKC活性(N＝3)。(B)以不同剂量prostratin处理的PANC1和PANC2.13中Fzd8和LEF1mRNA表达水平(N＝3)。(C)在过表达K-Ras^G12V而非H-Ras^G12V的Rasless MEF中，Prostratin增加了CaMKii的磷酸化水平，并降低了细胞活性率(对于细胞活性分析，N＝6)。(D)(左图)在经i.p.注射或者口服灌胃的裸鼠中，Prostratin降低了K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞而非H-Ras^V12转化的细胞的肿瘤起始率。(右图)体重变化指示，prostratin处理在动物中无全身毒性效应。(E)在来源于K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的肿瘤中，Prostratin增加了CaMKii的磷酸化水平。(F)在prostratin处理后的不同时间点收获的无胸腺NUDE小鼠的血清或胰腺中的PKC活性。*P<0.05；**P<0.01。

图14.(A)(左图)用prostratin处理的PANC1和PANC2.13的细胞形态。(右图)用prostratin处理的PANC1和PANC2.13的相对细胞活力或增殖率(N＝6)。(B)(左图)原位注射的PANC1的肿瘤起始率。(右图)来源于PANC1的原位肿瘤的H&E和Ki67染色。(C)比较用介质或者prostratin处理的接受原位注射PANC2.13的NOD SCID小鼠的腹膜的图片。(D)在对每天的prostratin处理的应答中，来自PANC2.13的建立的肿瘤显示切割的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3增加。(E)当与介质处理的肿瘤相比时，来源于K-Ras^G12V的乳头状瘤显示出显著降低的肿瘤增殖率。

发明详述

I.前言

本发明部分基于这样的惊人发现：尽管K-Ras和H-Ras共有相同的效应物，并具有类似的特性，但是只有致癌的K-Ras而非H-Ras抑制非经典的Wnt/Ca²⁺信号转导(有力地导致K-Ras的致瘤特性的效应)。已经发现K-Ras通过与钙调蛋白结合来发挥其致瘤作用，所述结合降低了钙调蛋白依赖性激酶II的活性并导致Fzd8表达的降低。进一步显示，利用prostratin促进K-Ras与钙调蛋白的解离恢复Fzd8介导的Wnt/Ca²⁺信号转导抑制了肿瘤的形成和生长。因此，一方面，本发明提供通过施用治疗量的prostratin或prostratin类似物治疗对象中的癌症的方法，所述癌症如表达野生型K-Ras的癌症或者表达突变型K-Ras的癌症。

在另一方面，本发明还提供用于治疗癌症的组合物和试剂盒，所述癌症如表达K-Ras的癌症，所述组合物和试剂盒包含prostratin或prostratin类似物。

II.定义

本文使用的术语“K-Ras”指“Kirsten大鼠肉瘤病毒癌基因同系物”。由K-Ras基因编码的蛋白是在细胞内信号转导中起作用的小GTPase。人K-Ras的基因和蛋白序列在例如Genbank登录号M54968.1和AAB414942.1中示出。存在于人癌症中的一些常见K-Ras的基因和蛋白含有位于12号密码子、密码子、61号密码子、146号密码子和/或其它并列位点处的突变。K-Ras突变的非限制性实例包括位于以下密码子处的突变：5号密码子(例如，K5E)、9号密码子(例如，V9I)、12号密码子(例如，G12A、G12C、G12D、G12F、G12R、G12S、G12V、G12Y)、13号密码子(例如，G13C、G13D、G13V)、14号密码子(例如，V14I、V14L)、18号密码子(例如，A18D)、19号密码子(例如，L19F)、22号密码子(例如，Q22K)、23号密码子(例如，L23R)、24号密码子(例如，I24N)、26号密码子(例如，N26K)、33号密码子(例如，D33E)、36号密码子(例如，I36L、I36M)、57号密码子(例如，D57N)、59号密码子(例如，A59E、A59G、A59T)、61号密码子(例如，Q61H、Q61K、Q61L、Q61R)、62号密码子(例如，E62G、E62K)、63号密码子(例如，E63K)、64号密码子(例如，Y64D、Y64H、Y64N)、68号密码子(例如，R68S)、74号密码子(例如，T74P)、92号密码子(例如，D92Y)、97号密码子(例如，R97I)、110号密码子(例如，P110H、P110S)、117号密码子(例如，K117N)、118号密码子(例如，C118S)、119号密码子(例如，D119N)、135号密码子(例如，R135T)、138号密码子(例如，G138V)、140号密码子(例如，P140H)、146号密码子(例如，A146T、A146V)、147号密码子(例如，K147N)、153号密码子(例如，D153N)、156号密码子(例如，F156L)、160号密码子(例如，V160A)、164号密码子(例如，R164Q)、171号密码子(例如，I171M)、176号密码子(例如，K176Q)、185号密码子(例如，C185R、C185S)和188号密码子(例如，M188V)。

“表达K-Ras的癌症”指具有可检测的(野生型或其突变形式)K-Ras表达水平的癌症。在一些实施方案中，当癌症组织样本中至少0.1％的细胞对于K-Ras激活(例如，野生型K-Ras或者位于12号密码子、13号密码子、61号密码子和/或其它密码子处的K-Ras激活突变)而言为阳性时，癌症具有可检测的表达水平。在一些实施方案中，癌症具有可检测的野生型K-Ras的表达水平。在一些实施方案中，癌症具有可检测的突变型K-Ras的表达水平。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症中的K-Ras(例如，野生型K-Ras或突变型K-Ras)的表达水平比对照(例如，不表达K-Ras的非病变细胞或组织，如正常的人外周淋巴细胞)中的K-Ras表达水平高至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、150％或200％。

术语“癌症”指特征为异常细胞不受控制生长的疾病。该术语包括所有已知的癌症和瘤病况(无论其特征为恶性、良性、软组织还是实体的)，以及所有阶段和等级的癌症(包括转移前和转移后的癌症)。不同类型的癌症的实例包括但不限于，消化癌和胃肠癌，如胃部癌症(例如，胃癌)、结肠直肠癌、胃肠间质瘤、胃肠类癌瘤、结肠癌、直肠癌、肛门癌、胆管癌、小肠癌和食道癌；乳腺癌；肺癌；胆囊癌；肝癌；胰腺癌；阑尾癌；前列腺癌，卵巢癌；肾癌；中枢神经系统的癌症；皮肤癌(例如，黑素瘤)；淋巴瘤；神经胶质瘤；绒毛膜癌；头颈癌；骨肉瘤；以及血癌。本文使用的“肿瘤”包含一个或多个癌性细胞。在一些实施方案中，所述癌症为胰腺癌。

“生物样本”包括血液和血液级分或产物(例如，血清、血浆、血小板、红细胞等)；痰或唾液；肾、肺、肝、心脏、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织；培养的细胞，例如，原代培养物、外植体和转化的细胞，干细胞，粪便，尿等。此类生物样本还包括组织切片，如活检和尸检样本，以及用于组织学目的制备的冷冻切片。生物样本通常获自“对象”，即，真核生物，最优选哺乳动物，如灵长类，例如，黑猩猩或人；奶牛；狗；猫；啮齿类，例如，天竺鼠、大鼠或小鼠；兔；或鸟；爬行动物；或鱼。

物质(例如，prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体)的“治疗量”或“治疗有效量”是预防、减轻、减缓或降低对象中的癌症(例如，表达K-Ras的癌症)症状的严重性的量。

术语“prostratin”也被称为12-脱氧佛波醇-13-乙酸酯，其指具有下述结构的化合物：

术语“prostratin类似物”指为prostratin的结构衍生物的化合物，其中一个或多个原子或官能团与prostratin不同。

本文使用的术语“盐”指化合物例如prostratin或prostratin类似物的酸式盐或碱式盐。药学可接受的盐的示例性实例为阳离子盐，如碱和碱土金属(如钠、锂、钾、钙和镁)盐、铵(铵、三甲基铵、二乙基铵和三-(羟甲基)-甲基-铵)盐、矿物酸(氢氯酸、氢溴酸、磷酸等)盐、有机羧酸(乙酸、丙酸、谷氨酸、柠檬酸等)盐、有机磺酸(甲磺酸)盐以及季铵(甲基碘、乙基碘等)盐。应当理解，药学可接受的盐是无毒的。关于合适的药学可接受的盐的其它信息可见于《雷明顿药物科学》(Remington's,Pharmaceutical Sciences)(现行版),MackPublishing Co.,Easton,PA，将其通过引用并入本文。

本文使用的术语“异构体”指具有相同的化学式但在结构上可区别的化合物。

术语“施用(administer)”、“施用(administered)”或“施用(administering)”指将物质、化合物或组合物递送至期望的生物作用位点的方法。这些方法包括但不限于，局部递送、肠胃外递送、静脉内递送、真皮内递送、肌肉内递送、结肠递送、直肠递送或腹膜内递送。任选地与本文所描述的物质和方法一起使用的施用技术包括例如，如Goodman和Gilman,《治疗学的药理学基础》(The Pharmacological Basis of Therapeutics),现行版；Pergamon；和Remington的《药物科学》(Pharmaceutical Sciences)(现行版),MackPublishing Co.,Easton,PA中所讨论的。

III.治疗癌症的方法

在一个方面，提供用于治疗或预防对象中的癌症的方法。在一些实施方案中，所述方法包括向所述对象施用治疗量的prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。在一些实施方案中，所述对象为人，例如，成年人或儿童。

在一些实施方案中，所述癌症为表达K-Ras的癌症，例如，表达或过表达野生型K-Ras的癌症或者表达突变形式的K-Ras的癌症。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症为胰腺癌、结肠直肠癌或肺癌。在一些实施方案中，表达K-Ras的癌症为胰腺癌，例如，胰腺导管腺癌。在一些实施方案中，所述方法还包括测量来自对象的样本(例如，肿瘤组织样本)中K-Ras表达的水平。在一些实施方案中，所述方法还包括测定在来自对象的样本(例如，肿瘤组织样本)中表达的K-Ras基因型。

在一些实施方案中，所述方法还包括：

检测来自对象的样本(例如，来自对象的肿瘤细胞或肿瘤组织样本)中K-Ras表达的水平；

确定来自对象的样本中K-Ras表达的水平是否大于对照(例如，不表达K-Ras的非病变细胞或组织，如正常的人外周淋巴细胞)中K-Ras表达的水平；以及

当来自对象的样本中K-Ras表达的水平大于对照中K-Ras表达的水平时，向所述对象施用prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。

在一些实施方案中，所述癌症不为表达或过表达K-Ras的癌症。作为非限制性实例，在一些实施方案中，所述癌症为未表达或未过表达K-Ras的胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌)。

表达K-Ras的癌症

在一些实施方案中，所述癌症为表达可检测水平的K-Ras的癌症。在一些实施方案中，当癌症组织样本中至少0.1％细胞对于K-Ras激活(例如，野生型K-Ras或者位于12号密码子、13号密码子、61号密码子和/或其它密码子处的K-Ras激活突变)而言为阳性时，癌症具有可检测的K-Ras表达水平。在一些实施方案中，癌症具有可检测的野生型K-Ras的表达水平。在一些实施方案中，癌症具有可检测的突变型K-Ras的表达水平。在一些实施方案中，K-Ras突变为位于以下的一个或多个密码子处的激活突变：5号密码子(例如，K5E)、9号密码子(例如，V9I)、12号密码子(例如，G12A、G12C、G12D、G12F、G12R、G12S、G12V、G12Y)、13号密码子(例如，G13C、G13D、G13V)、14号密码子(例如，V14I、V14L)、18号密码子(例如，A18D)、19号密码子(例如，L19F)、22号密码子(例如，Q22K)、23号密码子(例如，L23R)、24号密码子(例如，I24N)、26号密码子(例如，N26K)、33号密码子(例如，D33E)、36号密码子(例如，I36L、I36M)、57号密码子(例如，D57N)、59号密码子(例如，A59E、A59G、A59T)、61号密码子(例如，Q61H、Q61K、Q61L、Q61R)、62号密码子(例如，E62G、E62K)、63号密码子(例如，E63K)、64号密码子(例如，Y64D、Y64H、Y64N)、68号密码子(例如，R68S)、74号密码子(例如，T74P)、92号密码子(例如，D92Y)、97号密码子(例如，R97I)、110号密码子(例如，P110H、P110S)、117号密码子(例如，K117N)、118号密码子(例如，C118S)、119号密码子(例如，D119N)、135号密码子(例如，R135T)、138号密码子(例如，G138V)、140号密码子(例如，P140H)、146号密码子(例如，A146T、A146V)、147号密码子(例如，K147N)、153号密码子(例如，D153N)、156号密码子(例如，F156L)、160号密码子(例如，V160A)、164号密码子(例如，R164Q)、171号密码子(例如，I171M)、176号密码子(例如，K176Q)、185号密码子(例如，C185R、C185S)和188号密码子(例如，M188V)。在一些实施方案中，K-Ras突变为氨基酸残基G12的突变(例如，G12C、G12V、G12D、G12A、G12S、G12R或G12F置换)。在一些实施方案中，K-Ras突变为氨基酸残基G13的突变(例如，G13C或G13D置换)。在一些实施方案中，K-Ras突变为氨基酸残基Q61的突变(例如，Q61H或Q61K置换)。在一些实施方案中，K-Ras突变为氨基酸残基A146的突变(例如，A146T或A146V置换)。在一些实施方案中，表达可检测水平的野生型或突变型K-Ras的癌症为胰腺癌、肺癌或结肠直肠癌。

在一些实施方案中，所述癌症为过表达K-Ras的癌症。如本文所用，如果K-Ras(例如，野生型K-Ras或突变型K-Ras)的表达水平相对于阈值或对照样本(例如，不表达K-Ras的无病变细胞或组织，如正常的人外周淋巴细胞，或者已知K-Ras的表达为阴性的来自对象的癌症样本)有所增加，则癌症“过表达”K-Ras。在一些实施方案中，如果K-Ras(例如，野生型K-Ras或突变型K-Ras)的表达水平比阈值或对照样本(例如，已知K-Ras的表达为阴性的癌症)中的K-Ras表达水平高至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、150％或200％，则癌症过表达K-Ras。在一些实施方案中，如果K-Ras(例如，野生型K-Ras或突变型K-Ras)的表达水平是相对于阈值或对照样本(例如，已知K-Ras的表达为阴性的癌症)中K-Ras表达水平的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或更多倍，则癌症过表达K-Ras。在一些实施方案中，过表达野生型或突变型K-Ras的癌症为胰腺癌、肺癌或结肠直肠癌。

可以根据本领域已知的方法测量癌症中的K-Ras的表达水平。在一些实施方案中，测量癌症中的K-Ras基因表达的水平。在一些实施方案中，测量癌症中的K-Ras蛋白表达的水平。可以在来自对象的生物样本中，测量K-Ras基因或蛋白表达的水平或者检测K-Ras基因型。在一些实施方案中，生物样本包括癌细胞(例如，从肿瘤获得或得到的细胞)。在一些实施方案中，生物样本为肿瘤组织样本。

可以使用本领域已知的多种免疫分析中的任一种测量K-Ras蛋白表达的水平。免疫分析的技术和方案通常描述于Price和Newman，《免疫分析的原理和实践》(Principlesand Practice of Immunoassay)，第2版，Grove词典，1997；和Gosling，《免疫分析：实用方法》(Immunoassays:A Practical Approach)，Oxford University Press，2000。可以使用各种免疫分析技术，包括竞争性和非竞争性的免疫分析(参见，例如，Self等人,Curr.Opin.Biotechnol.,7:60-65(1996))。术语免疫分析包括这样的技术：其包括不限于，酶免疫分析(EIA)，如酶放大免疫分析技术(EMIT)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、IgM抗体捕获ELISA(MAC ELISA)和微粒子酶免疫分析(MEIA)；毛细管电泳免疫分析(CEIA)；放射免疫分析(RIA)；免疫放射测定分析(IRMA)；免疫荧光(IF)；荧光偏振免疫分析(FPIA)；和化学发光分析(CL)。若需要，此类免疫分析可以是自动化的。免疫分析还可以与激光诱导荧光法联合使用(参见，例如，Schmalzing等人,Electrophoresis,18:2184-93(1997)；Bao,J.Chromatogr.B.Biomed.Sci.,699:463-80(1997))。

可以直接或间接地检测抗体与蛋白(例如，K-Ras)的特异性免疫学结合。直接标记包括荧光或冷光标签、金属、染料、放射性核素等，所述标记被连接至抗体。可以使用被碘-125(¹²⁵I)标记的抗体。使用对蛋白标志物具有特异性的化学发光抗体进行的化学发光分析适合于敏感、非放射性地检测蛋白水平。被荧光染料标记的抗体也是合适的。荧光染料的实例包括不限于，DAPI、荧光素、Hoechst 33258、R-藻蓝蛋白、B-藻红蛋白、R-藻红蛋白、罗丹明、德克萨斯红和丽丝胺。间接标记包括本领域众所周知的多种酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、脲酶等。辣根过氧化物酶检测系统可以例如与显色底物四甲基联苯胺(TMB)一起使用，在过氧化氢的存在下其产生于450nm下可检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测系统可以与显色底物对硝基苯磷酸酯一起使用，例如，其产生于405nm下容易检测的可溶产物。类似地，β-半乳糖苷酶检测系统可以与显色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)一起使用，其产生于410nm下可检测的可溶产物。脲酶检测系统可以与底物如尿素-溴甲酚紫(Sigma Immunochemicals；St.Louis,MO)一起使用。

可以分析来自直接或间接标记的信号，例如，使用分光光度计检测来自显色底物的颜色；使用辐射计数器检测辐射，如使用γ计数器检测¹²⁵I；或者使用荧光计检测某一波长光的存在下的荧光。为了检测酶联抗体，可以使用分光光度计如EMAX酶标仪(MolecularDevices；Menlo Park,CA)，根据生产商的说明书，进行定量分析。若需要，本发明的分析可以是自动化的或机器进行的，并且可以同时检测来自多个样本的信号。在一些实施方案中，可以使用自动化的高含量成像系统，对信号量进行定量。高含量成像系统可以商购获得(例如，ImageXpress,Molecular Devices Inc.,Sunnyvale,CA)。

抗体可以被固定在各种固体支持物上，如磁性或色谱基体颗粒、分析板的表面(例如，微量滴定孔)、固体基底材料片或膜(例如，塑料、尼龙、纸)等。可以通过将抗体或多种抗体以阵列形式包被在固体支持物上来制备分析条。然后可以将该条浸入测试样本并通过洗涤和检测步骤快速处理，以产生可测量的信号，如有色斑点。

可以使用常规技术来实现K-Ras核酸表达水平或K-Ras基因型的分析，所述常规技术如Southern分析、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)或基于与互补于目的编码序列的一部分的核酸序列杂交的任何其它方法(例如，条形印迹杂交)，所述任何其它方法也在本发明的范围内。可适用的PCR扩增技术描述于，例如，在前的Ausubel等人和Innis等人。通常的核酸杂交方法描述于Anderson,“Nucleic Acid hybridization,”BIOS ScientificPublishers,1999。由以微阵列排列的mRNA或cDNA序列也可以进行多个核酸序列(例如，基因组DNA、mRNA或cDNA)的扩增或杂交。微阵列方法通常描述于Hardiman,“MicroarraysMethods and Applications:Nuts&Bolts,”DNA Press,2003；和Baldi等人,“DNAMicroarrays and Gene Expression:From Experiments to Data Analysis andModeling,”Cambridge University Press,2002。

也可以使用本领域已知的技术进行核酸表达水平或基因型的分析，所述技术包括不限于微阵列、基于聚合酶链式反应(PCR)的分析、序列分析和电泳分析。基于PCR分析的非限制性实例包括可获自Applied Biosystems的等位基因鉴别分析。序列分析的非限制性实例包括Maxam-Gilbert测序、Sanger测序、毛细管阵列DNA测序、热循环测序(Sears等人,Biotechniques,13:626-633(1992))、固相测序(Zimmerman等人,MethodsMol.Cell Biol.,3:39-42(1992))、质谱测序如基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF/MS；Fu等人,Nat.Biotechnol.,16:381-384(1998))、焦磷酸测序(Ronaghi等人,Science,281:363-365(1998))以及杂交测序(Chee等人,Science,274:610-614(1996)；Drmanac等人,Science,260:1649-1652(1993)；Drmanac等人,Nat.Biotechnol.,16:54-58(1998))。电泳分析的非限制性实例包括平板凝胶电泳(如琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳)、毛细管电泳和变性梯度凝胶电泳。在一些实施方案中，检测核酸变体的方法包括，例如，来自Third Wave Technologies,Inc.的分析、限制性片段长度多态性(RFLP)分析、等位基因特异性寡核苷酸杂交、异源双链迁移率分析、单链构象多态性(SSCP)分析、单核苷酸引物延伸(SNUPE)和焦磷酸测序。

在本文所描述的分析中可以使用可检测部分。可以使用各种可检测部分，根据所需的敏感性、与抗体缀合的容易性、稳定性需求、以及可用的使用仪器和处理条款，来选择标记。合适的可检测部分包括但不限于，放射性核素、荧光染料(例如，荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon Green^TM、罗丹明、德克萨斯红、四罗丹明异硫氰酸(TRITC)、Cy3、Cy5等)、荧光标志物(例如，绿色荧光蛋白(GFP)、藻红蛋白等)、通过肿瘤相关的蛋白酶激活的自淬灭荧光化合物、酶(例如，荧光素酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、纳米颗粒、生物素、地高辛配基等。

所述分析可以以多种物理形式进行。例如，微量滴定板或自动化的使用可以用来促进大量测试样本的处理。

可选地，为了检测蛋白或核酸表达的水平，可以将抗体或核酸探针应用于被固定在显微镜载片上的对象样本上。所得抗体的染色或原位杂交模式可以使用本领域已知的多种光或荧光显微方法中的任一种来显现。

蛋白或核酸的分析也可以例如通过单独或者与质谱(例如，MALDI/MS、MALDI-TOF/MS、串联MS等)联合的高压液相色谱(HPLC)来实现。

测定K-Ras基因型的方法在本领域有描述。参见，例如，Kramer等人,CellOncol.31:161-167(2009)；Chen等人,J.Chromatogr.A 1216:5147-5154(2009)；Lamy等人,Modern Pathology 24:1090-1100(2011)；Galbiati等人,PLoS ONE 8(3):359939(2013)；和WO 2010/048691。

Prostratin和Prostratin类似物

在一些实施方案中，向有需要的对象(例如，患有癌症如表达或者过表达K-Ras的癌症的对象)施用治疗量的prostratin或者其盐或异构体。Prostratin(12-脱氧佛波醇-13-乙酸酯；CAS 60857-08-1)可商购自，例如Santa Cruz Biotechnology(Dallas,TX)和abcam Biochemicals(Cambridge,MA)。

在一些实施方案中，向有需要的对象(例如，患有癌症如表达或者过表达K-Ras的癌症的对象)施用治疗量的prostratin类似物或者其盐或异构体。在一些实施方案中，prostratin类似物是与prostratin结构上相关的化合物，其具有与prostratin相当的蛋白激酶C(PKC)结合亲和力。在一些实施方案中，prostratin类似物是与prostratin结构上相关的化合物，其相对于prostratin具有改善的PKC结合亲和力。

在一些实施方案中，prostratin类似物是于US 5,021,549、US 8,536,378、WO2009/126949、US 2011/0014699或US 2011/0224297中公开的化合物，将其各自通过引用并入本文。

在一些实施方案中，prostratin的结构类似物可以与母体prostratin化合物共有一种或多种结构特征，但是可以在所选的酯基方面不同。在一些实施方案中，prostratin类似物是具有下述结构式的化合物：

其中：

R³选自OR、卤素、SeR、SR、SOR、SO₂R、芳基、NHR、NR₂以及NHCOR，其中R是1-15个碳的低级烷基(C1至C15)；

R⁴选自氢、烷基(C1至C20)、环烷基(C3至C15)、芳基(C6至C10)、羟基、碳酸烷基酯、氨基甲酸酯、酯、醚、硫醇、胺、膦、磷酸酯、磷酰胺、亚磷酰胺、氨基磷酸酯、亚磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、砜、亚硫酸酯、酰胺、胍和脲；以及

R⁵选自氢、烷基(C1至C20)、环烷基(C3至C15)、芳基(C6至C10)、羟基、碳酸烷基酯、氨基甲酸酯、酯、醚、硫醇、胺、膦、磷酸酯、磷酰胺、亚磷酰胺、氨基磷酸酯、亚磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰、砜、亚硫酸酯、酰胺、胍以及脲。

在一些实施方案中，prostratin类似物是具有下述结构式的化合物：

其中R是乙基、甲酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、苯甲酸酯、乙酸苯酯、乙酸环己酯、乙酸五氟苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、(5,6,7,8)四氢-1-萘基乙酸酯、乙酸联苯酯、乙酸金刚烷酯或对苯乙酸苄酯。

本领域中描述了合成prostratin和prostratin类似物的方法。参见，例如Wender等人，Science 320:649-652(2008)；以及Beans等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 110:11698-11703(2013)，将其各自通过引用并入。本领域中还描述了例如通过PKC结合亲和力分析测试prostratin和prostratin类似物的活性的方法。参见，例如Beans等人，Proc.Natl.Acad.Sci USA 110:11698-11703(2013)。

施用以及组合疗法

治疗剂(例如prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体)的施用途径可以是口服施用、腹腔内施用、经皮施用、皮下施用、通过静脉内或者肌肉内注射施用、通过吸入施用、局部施用、病灶内施用、输注施用；脂质体介导的递送；局部施用、鞘内施用、龈袋施用、直肠施用、支气管内施用、鼻施用、透粘膜施用、肠道施用、眼部或耳部递送或者本领域已知的任何其它方法。在一些实施方案中，口服施用、静脉内施用或者腹腔内施用prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。

在一些实施方案中，以治疗有效的量或剂量施用prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。可以使用下述每日剂量范围：约0.01mg/kg至约500mg/kg，或者约0.1mg/kg至约200mg/kg，或者约1mg/kg至约100mg/kg，或者约10mg/kg至约50mg/kg。然而，剂量可以根据一些因素而改变，所述因素包括所选的施用途径、组合物剂型、患者应答、病况的严重性、对象的体重以及处方医师的判断。根据个体患者的需要，剂量可以随时间增加或减少。在某些情况下，最初给予患者低剂量，然后增加至患者可耐受的有效剂量。有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内。

在一些实施方案中，将prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体与第二治疗剂组合施用。在一些实施方案中，第二治疗剂是化疗剂。在一些实施方案中，化疗剂是烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、白消安、美法仑、氮芥、乌拉莫司汀、塞替派、亚硝基脲或替莫唑胺)、蒽环类药物(例如，多柔比星、阿霉素、道诺红菌素、表柔比星或米托蒽醌)、细胞支架干扰物(例如，紫杉醇或多西紫杉醇)、组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如，伏立诺他或罗米地辛)、拓扑异构酶的抑制剂(例如，伊立替康、拓扑替康、安吖啶、依托泊苷或替尼泊苷)、激酶抑制剂(例如，硼替佐米、埃罗替尼、吉非替尼、伊马替尼、维罗非尼或维莫德吉)、核苷类似物或前体类似物(例如，阿扎胞苷、硫唑嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、巯嘌呤、甲氨蝶呤或硫鸟嘌呤)、肽抗生素(例如，放线菌素或博来霉素)、基于铂的药剂(例如，顺铂、奥沙利铂(oxaloplatin)或卡铂)或者植物生物碱(例如，长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛、鬼臼毒素、紫杉醇或多西紫杉醇)。在一些实施方案中，化疗剂是吉西他滨。

可以一起施用或者分别施用、同时施用或者在不同的时间施用共施用的治疗剂(例如，prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体，以及如本文所述的第二治疗剂)。当施用时，视需要，可以每天一次、二次、三次、四次或者更多或更少次独立地施用治疗剂。在一些实施方案中，每天一次施用所施用的治疗剂。在一些实施方案中，在同一时间或者同时施用所施用的治疗剂，例如以混合物的形式。在一些实施方案中，治疗剂中的一种或多种以缓释制剂的形式施用。

在一些实施方案中，将prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体与第二治疗剂同时施用。在一些实施方案中，首先施用prostratin或prostratin类似物，例如在施用第二治疗剂(例如，化疗剂)之前约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100天或者更多天。在一些实施方案中，首先施用第二治疗剂(例如，化疗剂)，例如在施用prostratin或prostratin类似物之前约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100天或者更多天。

在一些实施方案中，在延长的时段内，向对象施用prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体(以及任选地第二治疗剂，例如如本文所述的化疗剂)，例如，持续至少30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350天或更久。

IV.组合物和试剂盒

另一方面，提供用于治疗或预防对象中的癌症(例如，表达或过表达K-Ras的癌症)的组合物和试剂盒。

在一些实施方案中，提供包含prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体的药物组合物，其用于向患有癌症(例如，表达或过表达野生型K-Ras或突变型K-Ras的癌症)的对象施用。在一些实施方案中，prostratin或prostratin类似物(或者其盐或异构体)如以上第III部分中所述。在一些实施方案中，通过用合适的药学可接受的载体或稀释剂配制而将prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体与第二治疗剂(例如，如本文所述的化疗剂)的组合共同或者分别配制为药物组合物，并且其可被配制为固体、半固体、液体或气体形式的制备物，如片剂、胶囊、丸剂、粉剂、粒剂、糖锭剂、胶体、药浆、软膏、溶液、栓剂、注射剂、吸入剂以及气雾剂。

制备用于本发明的制剂的指导见于，例如，以上Remington:The Science andPractice of Pharmacy,21^st Ed.,2006；Martindale:The Complete Drug Reference,Sweetman,2005,London:Pharmaceutical Press；Niazi,Handbook of PharmaceuticalManufacturing Formulations,2004,CRC Press；以及Gibson,PharmaceuticalPreformulation and Formulation:A Practical Guide from Candidate DrugSelection to Commercial Dosage Form,2001,Interpharm Press，在此将其通过引用并入本文。可以以本领域技术人员已知的方式，即通过常规的混合、溶解、粒化、糖衣制备、磨细、乳化、包封、截留或冻干法来制备本文所述的药物组合物。下述方法和赋形剂仅是示例性的，并且绝非限制性的。

在一些实施方案中，将prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体(以及任选地第二治疗剂，例如如本文所述的化疗剂)制备为以缓释制剂、控释制剂、延长释放制剂、定时释放制剂或延迟释放制剂的形式递送，例如，以含有治疗剂的固体疏水聚合物的半渗透基质的形式递送。已建立了不同类型的缓释材料，并且其为本领域技术人员所熟知。当前的延长释放制剂包括薄膜包衣片、多微粒或丸剂系统、使用亲水或亲脂材料的基质技术以及含有造孔赋形剂的基于蜡的片剂(参见，例如，Huang等人，DrugDev.Ind.Pharm.29:79(2003)；Pearnchob等人，Drug Dev.Ind.Pharm.29:925(2003)；Maggi等人，Eur.J.Pharm.Biopharm.55:99(2003)；Khanvilkar等人，Drug Dev.Ind.Pharm.228:601(2002)；以及Schmidt等人，Int.J.Pharm.216:9(2001))。基于缓释递送系统的设计，其可以在数小时或数天的进程内，例如在4、6、8、10、12、16、20、24小时或更久的时间内释放化合物。通常，可以使用天然存在的或合成的聚合物来制备缓释制剂，所述聚合物例如，聚合的乙烯基吡咯烷酮，如聚乙烯吡咯烷酮(PVP)；羧乙烯基亲水聚合物；疏水性和/或亲水性水状胶体，如甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基纤维素和羟丙基甲基纤维素；以及羧聚亚甲基。

也可利用天然成分来制备缓释或延长释放的制剂，所述天然成分如矿物质，包括二氧化钛、二氧化硅、氧化锌和粘土(参见，美国专利6,638,521，通过引用并入本文)。示例性的延长释放制剂包括美国专利第6,635,680号；第6,624,200号；第6,613,361号；第6,613,358号；第6,596,308号；第6,589,563号；第6,562,375号；第6,548,084号；第6,541,020号；第6,537,579号；第6,528,080号以及第6,524,621号中所述的那些，在此将其各自通过引用并入本文。示例性的控释制剂包括美国专利第6,607,751号；第6,599,529号；第6,569,463号；第6,565,883号；第6,482,440号；第6,403,597号；第6,319,919号；第6,150,354号；第6,080,736号；第5,672,356号；第5,472,704号；第5,445,829号；第5,312,817号以及第5,296,483号中所述的那些，在此将其各自通过引用并入本文。本领域技术人员将容易地认识到其它可适用的缓释制剂。

对于口服施用而言，可以通过与本领域熟知的药学可接受的载体组合容易地配制prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体(以及任选地第二治疗剂，例如如本文所述的化疗剂)。此类载体使得化合物能够被配制为片剂、丸剂、糖锭剂、胶囊、乳剂、亲脂性和亲水性悬液、液体、胶体、糖浆、药浆、悬液等，用于被待治疗的患者口服摄取。可以通过下述获得用于口服使用的药物制备物：将化合物与固体赋形剂混合，任选地研磨得到的混合物，并且若需要，在添加合适的助剂之后处理颗粒混合物，以获得片剂或糖锭剂核心(dragee core)。合适的赋形剂包括，例如，填充剂，如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纤维素制备物，如例如，玉米淀粉、小麦淀粉、米淀粉、马铃薯淀粉、明胶、黄蓍树胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。若需要，可以添加崩解剂，如交联的聚乙烯吡咯烷酮、琼脂或者海藻酸或其盐，如海藻酸钠。

可将prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体(以及任选地第二治疗剂，例如如本文所述的化疗剂)配制为通过注射，例如通过弹丸注射或连续输注肠胃外施用。对于注射而言，可以通过在水性或非水性溶剂中溶解、悬浮或乳化化合物而将其配制为制剂，所述水性或非水性溶剂如植物油或其它类似的油、合成的脂肪酸甘油酯、高级脂肪酸酯或丙二醇；以及若需要，含有常规添加剂，如增溶剂、等渗剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，可在水溶液，优选在生理兼容的缓冲液，如汉克斯液、林格氏液或生理盐水缓冲液中配制化合物。用于注射的制剂可以以单位剂型存在，例如，存在于安瓿或者多剂量容器中，含有添加的防腐剂。组合物可以采取如下形式：油性或水性介质中的悬液、溶液或乳状液，并且可以包含配制剂(formulatory agent)，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。

可以通过透粘膜或者经皮方式全身施用prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体(以及任选地第二治疗剂，例如如本文所述的化疗剂)。对于透粘膜或者经皮施用而言，在制剂中使用适于待渗入屏障的渗透剂。对于局部施用而言，将药剂配制为膏剂、霜剂、药膏、粉剂和胶体。在一个实施方案中，经皮递送剂可以是DMSO。经皮递送系统可以包括，例如贴剂。对于透粘膜施用而言，在制剂中使用适于待渗入屏障的渗透剂。此类渗透剂在本领域通常是已知的。示例性的经皮递送制剂包括美国专利第6,589,549号；第6,544,548号；第6,517,864号；第6,512,010号；第6,465,006号；第6,379,696号；第6,312,717号以及第6,310,177号中所述的那些，在此，将其各自通过引用并入本文。

在一些实施方案中，药物组合物包含可接受的载体和/或赋形剂。药学可接受的载体包括生理兼容的并且优选不干扰或者以其它方式抑制治疗剂的活性的任何溶剂、分散介质或包衣。在一些实施方案中，载体适于静脉内施用、肌肉内施用、口服施用、腹腔内施用、经皮施用、局部施用或者皮下施用。药学可接受的载体可以包含一种或多种生理可接受的化合物，所述组合物用于例如稳定组合物或者增加或降低活性剂的吸收。生理可接受的组合物可以包括，例如碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白；减少活性剂的清除或水解的组合物；或者赋形剂或其它稳定剂和/或缓冲剂。其它药学可接受的载体及其制剂众所周知，并且通常描述于，例如，Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第21版,Philadelphia,PA.Lippincott Williams&Wilkins,2005中。各种药学可接受的赋形剂在本领域众所周知，并且可见于，例如Handbook of Pharmaceutical Excipients(第5版,Rowe等人编著，Pharmaceutical Press,Washington,D.C.)。

在一些实施方案中，提供用于向患有癌症(例如，表达或过表达野生型K-Ras或突变型K-Ras的癌症)的对象施用的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：

Prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体；以及

第二治疗剂。

在一些实施方案中，prostratin或prostratin类似物(或者其盐或异构体)如以上第III部分所述。在一些实施方案中，第二治疗剂是化疗剂。在一些实施方案中，化疗剂是烷化剂、蒽环类药物、细胞支架干扰物、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、激酶抑制剂、核苷类似物或前体类似物、肽抗生素、基于铂的药剂或者植物生物碱。在一些实施方案中，化疗剂是核苷类似物。在一些实施方案中，化疗剂是吉西他滨。

在一些实施方案中，试剂盒还可以包含说明性材料，其含有实践本发明的方法的用法(即，方案)(例如使用试剂盒治疗癌症的说明)。尽管说明性材料通过包括书面材料和打印材料，但是它们不限于此。本发明考虑了能够存储此类说明并将其传达给最终用户的任何媒介物。此类媒介物包括但不限于电子存储媒介物(例如，磁盘、录音带、胶卷、芯片)、光学媒介物(例如，CD ROM)等。此类媒介物可以包含提供此类说明性材料的网站地址。

V.实施例

提供下述实施例以阐明而非限制所要求保护的发明。

实施例1：K-Ras通过阻抑非经典的Wnt信号转导促进致瘤性

前言

Ras超家族的小GTP酶是多个信号转导通路的关键组分。Ras亚家族中的三个经典成员H-Ras、N-Ras和K-Ras在人肿瘤中通常是突变的，并且干扰许多细胞过程，如基因表达、细胞周期进程和凋亡逃避(Giehl,Biol Chem 386:193-205,2005)。过去三十年的大量研究确定Ras蛋白作为恶性转化、肿瘤起始以及肿瘤进展和转移的驱动子，表明致癌Ras是具有高吸引力的治疗靶标(Stephen等人，Cancer Cell 25:272-281,2014)。未解决的问题是H-Ras、N-Ras和K-Ras蛋白是否在生理和病理过程中发挥独特或多余的作用。由于它们高程度的序列同源性以及重叠的上游激活子或下游效应物，这三种Ras同种型长期以来被认为在功能上是冗余的。然而，越来越多的证据表明这些Ras同种型也可能具有不同的生物特性。首先，这三种Ras基因座各自的基因切除导致在转基因动物中显著不同的表型。K-Ras4B缺陷导致胚胎死亡，而N-Ras、H-Ras和K-Ras4A敲除的小鼠未显示出明显异常(Johnson等人，Genes Dev.11:2468-2481,1997；Koera等人，Oncogene 15:1151-1159,1997；Malumbres和Barbacid,Nat Rev Cancer 3:459-465,2003)。然而，K-Ras的该独特生物学表型是由其基因产物的特定功能还是由其不同的表达模式引起的仍待确定(Esteban等人，Mol.CellBiol 21:1444-1452,2001)。其次，已在20％至30％的全部人类肿瘤中发现H-Ras、N-Ras或K-Ras的激活突变，但显示出惊人程度的组织特异性。N-Ras突变在急性白血病中常见，而H-Ras和K-Ras突变罕见(Sakamoto等人，Hum Pathol 32:1225-1231,2001)。相反地，致癌K-Ras突变高频率发生于胰腺癌(90％)、结肠直肠癌(50％)和肺癌(35％)中，而N-Ras和H-Ras突变十分罕见(Prior等人，Cancer Res.72:2457-2467,2012)。

假定K-Ras4B而非N-Ras、H-Ras或K-Ras4A是胚胎发育必不可少的，则K-Ras4B在胚胎干细胞(ESC)中发挥重要且独特的作用是可能的。事实上，已显示一些胚胎基因和信号转导通路，如Myc、Notch信号转导和Wnt信号转导，在正常ESC以及癌细胞的肿瘤起始中具有重叠的调控作用(Harris等人，Expert Opin Ther Targets 16:131-145,2012)。因此，吸引人的可能性是，致癌K-Ras在诱导肿瘤起始和干细胞样特征中发挥重要(但先前未知)的作用，并且这些特征导致K-RAS突变肿瘤的侵略本性。

在Ras蛋白中，K-Ras是最频繁突变的，并且因此是癌症疗法的有吸引力的靶标，特别是在不存在有效疗法的胰腺癌中。然而，尽管K-Ras作为治疗靶标具有极大兴趣，但是在开发直接封闭K-Ras的功能并在临床前模型中显示出功效的小分子抑制剂方面还没有成功(Downward,Nat Rev Cancer 3:11-22,2003；Karnoub和Weinberg,Nat Rev Mol CellBiol9:517-531,2008；Stephen等人，2014)。在该研究中，我们提供了致癌K-Ras通过下调非经典的Wnt/Ca²⁺信号转导并阻抑Fzd8表达引发致瘤表型的证据。这在H-Ras转化细胞中未观察到，从而确立了真正同种型(bona fide isoform)-K-Ras的特异性作用。钙调蛋白(CaM)与K-Ras(特别是4B同种型)的结合，而非与H-Ras的结合，似乎负责该主要差异：CaM与K-Ras的结合降低了CaM依赖性激酶II(CaMKii)的活性，并导致Fzd8表达的减少，所述CaM依赖性激酶II是Wnt/Ca²⁺信号转导通路的主要下游效应物。通过增加的Fzd8表达或者通过阻止K-Ras与CaM的结合恢复Fzd8介导的Wnt/Ca²⁺信号转导损坏了K-Ras介导的致瘤性，这提供了抑制该“无药可靶向的(undruggable)”蛋白的潜在新途径。确实，用prostratin处理小鼠阻抑了由K-Ras^G12V特异性驱动的胰腺癌和乳头状瘤模型中肿瘤的形成和生长，但未阻抑由H-Ras^G12V驱动的胰腺癌和乳头状瘤模型中肿瘤的形成和生长，所述prostratin是促进K-Ras与CaM解离的天然产物。

K-Ras^V12和H-Ras^V12在起始肿瘤形成方面不同，尽管参与相当的经典MAPK和Akt信号转导

为了阐明K-Ras和H-Ras的不同特性，我们在同基因NIH/3T3细胞中表达了受巨细胞病毒启动子控制的致癌H-Ras和K-Ras，并寻找含有这两种致癌基因的细胞之间的表型差异。H-Ras^V12和K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞均显示出类似的形态学变化，指示转化(数据未显示)。GTP结合的Ras结合并激活许多下游效应物，并且可以通过Ras-GTP与C-Raf或RalGDS的Ras结合结构域(RBD)的共免疫沉淀来测量Ras-GTP的水平(Santarpia等人，Expert OpinTher Targets 16:103-119,2012)。H-Ras^V12和K-Ras^V12转化的细胞具有可比较的负载GTP的Ras水平，如C-Raf-RBD-和RalGDS-RBD-pull down分析所显示的(图1A)，并且显示出类似的磷酸化的Erk1/2和Akt水平(图1B)，不考虑培养条件中存在的血清(图1B；图8A)。此外，利用Akt的生物素化肽底物的基于ELISA的分析证实H-Ras^V12-和K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞具有类似的Akt激酶活性，当与载体对照细胞相比时，二者中的Akt激酶活性均升高(图8B)。总地来说，这些数据表明Ras^V12-转化的细胞含有类似水平的活性H-Ras和K-Ras，以及相当的经典下游信号转导通路的激活水平。

接下来，我们研究了Ras^V12转化的细胞是否显示出干细胞样特质以及在体外以单细胞水平自我更新的能力。干细胞特性(stem-ness)或体外自我更新的一个度量是球体的形成以及球体随后在再现(recapitulate)2D培养中细胞指数生长的能力(Fang等人，Cancer Res 65:9328-9337,2005；Fujii等人，Int J Oncol 34:1381-1386,2009；Gou等人，Pancreas 34:429-435,2007；Ponti等人，Cancer Res.65:5506-5511,2005；Singh等人，Cancer Res.63:5821-5828,2003)。使用有限数目的接种细胞，当与H-Ras^V12转化的细胞和载体对照相比时，K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞显示出显著增加的球形成效率(图1C)。重新铺板显示，相对于来自H-Ras^V12转化的细胞的球体的生活力和重新铺板效率的降低，来自K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的球体是有活力的，并且能够重新起始2D培养中指数生长的细胞(图8C)。K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的球形成效率的增加不是由于较高的增殖率，因为当以低密度接种时，H-Ras^V12转化的细胞实际上比K-Ras转化的细胞具有更高的DNA合成率(数据未显示)。

使用在体内的有限且连续的移植，我们接下来评估了K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞的致瘤潜力(Clarke等人，Cancer Res.66:9339-9344,2006)。小鼠皮下注射H-Ras^V12或K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞，并测定无瘤生存率。当移植1,000个细胞时，H-Ras^V12和K-Ras^V12肿瘤以类似的速率产生。然而，当移植细胞的数目降低至100个时，与H-Ras^V12细胞相比，K-Ras^V12转化的细胞显示出显著增加的肿瘤起始率(图1D，左图)。为了进一步研究它们在体内自我更新的能力，我们将分离自原发肿瘤(由1,000个移植的细胞起始的)的细胞重新移植进第二组群的受体小鼠内。在注射500个NIH/3T3-K-Ras^V12细胞时，所有10只注射小鼠均产生肿瘤。相比之下，10只注射H-Ras^V12细胞的小鼠中仅2只成功起始了肿瘤(图1D，右图)。因此，当与H-Ras^V12转化细胞相比时，K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞显示出增加的肿瘤起始频率和升高的在体内再现肿瘤形成的能力。

不同Ras同种型的激活突变以高度组织特异性的方式发生于人癌症中(Hezel等人，Genes Dev.20:1218-1249,2006)，但是这些差异是否反映各同种型的区别特征并不清楚。为了研究K-Ras和H-Ras在诱导致瘤性中是否发挥不同的作用，我们研究了BxPC3细胞(表达野生型H-Ras和K-Ras的胰腺癌细胞系)中的H-Ras和K-Ras在调控恶性肿瘤中的作用。用EGF刺激BxPC3细胞激活MAPK信号转导通路，并显著增加了球形成效率(图1E和图8D)。K-Ras的敲低(非H-Ras的敲低)显著降低了EGF刺激的球形成效率，并降低了起始球体的大小，这支持了K-Ras具有可能导致人胰腺癌细胞中的恶性肿瘤的独特特性的观点(图1F和图8E-F)。

我们接下来确定致癌K-Ras是否是维持人胰腺肿瘤细胞中的致瘤特性所需的。PANC2.13和PANC1细胞系含有不同的突变，并显示出对K-Ras的不同依赖性。当通过shRNA敲低K-Ras时，两种细胞系显示出分化形态(图8G)。已显示细胞表面抗原CD44和CD24的表达与胰腺癌患者中的不良临床诊断高度相关(Ohara等人，Cancer Sci 104:1127-1134,2013)。PANC2.13和PANC1细胞中致癌K-Ras的耗竭显著降低了CD44和CD24的表达(图9H-I)。K-Ras耗竭的PANC2.13细胞显示出显著降低的在体外形成具有重新铺板潜能的球体的能力(图1G和图9J)，再次表明K-Ras在维持与恶性肿瘤相关的表型中的重要作用。

先前将PANC1描述为K-Ras非依赖性细胞系(Scholl等人，Cell 137:821-834,2009；Singh等人，Cancer Cell 15:489-500,2009；Wei等人，Cancer Lett 322:58-69,2012)。与这些报道一致，K-Ras的敲低减缓了细胞增殖，但并未影响PANC1细胞在2D中生长的活力(数据未显示)。然而，使用有限数目的移植细胞，我们发现当与对照PANC1细胞相比时，K-Ras的敲低显著降低了肿瘤起始率(图1H)。这些数据表明致癌K-Ras介导了人胰腺癌细胞系中的致瘤表型，该功能看上去与其在维持2D培养中的细胞活力和增殖中的作用不同。

K-Ras阻抑Frizzled 8和CaMKii的活性

接下来，我们旨在研究K-Ras比H-Ras更有效地促进致瘤性的背后机制，尽管具有相当水平的经典Ras信号转导。K-Ras4B而非N-Ras、H-Ras或K-Ras4A是基因工程化的动物模型的胚胎发育必不可少的(Johnson等，Genes Dev.11:2468-2481,1997；Koera等人，Oncogene 15:1151-1159,1997；Malumbres和Barbacid,Nat Rev Cancer 3:459-465,2003)。此外，K-Ras(4B)^V12而非H-Ras^V12或N-Ras^V12阻止了小鼠胚胎癌干细胞中视黄酸诱导的分化，同时维持它们的增殖和干细胞特性(Quinlan等人，Mol Cell Biol 28:2659-2674,2008)。因此，K-Ras4B在胚胎干细胞(ESC)中发挥重要且独特的作用是可能的。使用聚焦信号转导的PCR阵列(SABioscience,PAMM047A)来定性由H-Ras或K-Ras介导的干细胞相关基因(图2A；下文表1和表2)。鉴定了三种小鼠干细胞信号转导相关基因，所述基因的表达在H-Ras^V12-和K-Ras^V12-转化的NIH/3T3细胞之间具有大于四倍的变化(图2B；下文表3)。1B型骨髓蛋白受体(bmpr1b)在K-Ras^V12转化的细胞中上调，而Gli2和Frizzled 8(Fzd8)在NIH/3T3-K-Ras^V12细胞中显著下调。由于bmpr1b的低内源表达水平，我们决定不研究bmpr1b，或者不研究Gli2，因为与小鼠相比时，Gli2的N端阻遏物结构域在人类中是缩短的，这表明在这两个物种中的不同作用(Sasaki等人，Development 126:3915-3924,1999)。

表1.用于H-Ras转化的NIH/3T3细胞的qPCR阵列的质量控制

表2.用于K-Ras转化的NIH/3T3细胞的qPCR阵列的质量控制

七次跨膜G蛋白偶联受体Frizzled 8(Fzd8)是参与调控Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的frizzled基因家族的成员。在10个frizzled家族成员中，Fzd1、Fzd4和Fzd10已经被鉴定为Wnt/β-连环蛋白通路的激活剂(Lhomond等人，Development 139:816-825,2012；Nagayama等人，Cancer Sci 100:405-412,2009)。最近，Fzd8被报道为维持造血干细胞的静止的非经典Wnt/Ca²⁺信号转导的主要调节物(Sugimura等人，Cell 150:351-365,2012)。需要激活CaMKii和转录因子NF-AT的非经典Wnt/Ca²⁺通路抑制β-连环蛋白/TCF信号转导(Saneyoshi等人，Nature 417:295-299,2002；Semenov等人，Cell 131:1378,2007；Sugimura和Li.,Birth Defects Res C Embryo Today 90:243-256,2010)。因此，我们确定致癌K-Ras转化细胞中Fzd8的下调是否导致非经典Wnt/Ca²⁺信号转导的阻抑以及随后β-连环蛋白/TCF活性的激活。

蛋白质印迹分析证实与H-Ras^V12转化的细胞和载体对照相比，Fzd8在K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中下调(图2C)。K-Ras^V12转化的细胞也具有大幅降低的激活CaMKii的水平，如通过Thr286位的自我磷酸化降低所指示的(图2C)。活性NF-AT的基因产物抑制蓬乱蛋白(disheveled)介导的GSK3β阻抑，这导致β-连环蛋白的磷酸化、胞质积聚和降解(Saneyoshi等人，Nature 417:295-299,2002)。细胞分级分离分析显示,与载体对照和NIH/3T3-H-Ras^V12细胞相比，NF-AT的激活和核异位在NIH/3T3-K-Ras^V12细胞中降低(图2C)。蛋白质印迹分析进一步表明，β-连环蛋白的磷酸化形式在这些细胞中降低(图2C)。有趣的是，当与分离自致癌B-Raf诱导的mPDAC的肿瘤细胞相比时，分离自致癌K-Ras驱使的小鼠PDAC(mPDAC)的肿瘤细胞也显示出降低的Fzd8表达和阻抑水平的磷酸化CaMKii(图2C)。

CaMKii通路的激活还通过阻断β-连环蛋白与TCF的相互作用，从而抑制β-连环蛋白依赖性转录而阻抑经典Wnt信号转导(Semenov等人，Cell 131:1378,2007；Sugimura和Li.,Birth Defects Res C Embryo Today 90:243-256,2010)。共免疫沉淀指示，当与CaMKii活性升高的H-Ras^V12转化的细胞相比时，CaMKii很少磷酸化的K-Ras^V12转化的NIH3T3细胞显示β-连环蛋白与TCF4之间的相互作用增加(图2D)。此外，NIH/3T3-K-Ras^V12细胞中CaMKii和NF-AT激活的降低导致β-连环蛋白的核定位的增加，而在CaMKii和NF-AT高度激活的载体对照和NIH/3T3-H-Ras^V12细胞中，核β-连环蛋白几乎检测不到(图2C)。与B-Raf^mt诱导的小鼠mPDAC相比，含有突变K-Ras的肿瘤细胞显示出增加的β-连环蛋白-TCF4相互作用(图2D)。TOPFlash分析进一步证实，当与载体和NIH/3T3-H-Ras^V12细胞相比时，β-连环蛋白的转录活性在NIH/3T3-K-Ras^V12细胞中极大升高(图2E)。必然地，与载体对照或H-Ras^V12转化的细胞相比，β-连环蛋白靶基因c-Myc和TCF1的mRNA表达在K-Ras^V12转化的细胞中上调(图9A)。

突变/致癌Ras-驱使的信号转导活性和致瘤性长期以来被认为不依赖于野生型Ras同种型。然而，有越来越多的证据表明致癌K-Ras的生物输出受野生型Ras蛋白依赖的调节的影响(Grabocka等人，Cancer Cell 25:243-256,2014；Young等人，Cancer Discov 3:112-123,2013)。为了确定野生型Ras等位基因的存在是否影响明显由致癌K-Ras介导的Fzd8-CaMKii信号转导通路，我们在缺乏Ras蛋白的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)中表达了N-Ras^V12、H-Ras^V12或K-Ras^V12(H‐Ras^-/-；N‐Ras^-/-和K‐Ras^lox/lox)(Drosten等人，EMBO J 29:1091-1104,2010)。如图9B中所示，仅表达K-Ras(4B)^V12的“Rasless”MEF比仅表达H-Ras^V12的细胞显示出更低的Fzd8和磷酸化CaMKii表达。有趣的是，体内有限的移植分析表明，与Ras^-/-MEF-H-Ras^V12相比，Ras^-/-MEF-K-Ras(4B)^V12以较高频率起始肿瘤形成(图9C)。此外，源自Ras^-/-MEF-K-Ras(4B)^V12的肿瘤比由Ras^-/-MEF-H-Ras^V12起始的肿瘤显示出显著更高的生长速率(图9D)。合起来，我们关于NIH\3T3和被拯救的Rasless细胞的数据表明，不管野生型Ras蛋白是否存在，K-Ras和H-Ras在致瘤性以及在经非经典Wnt/Ca²⁺信号转导通路的信号转导方面明确不同。

接下来，我们询问非经典的Wnt/Ca²⁺信号转导在由H-Ras或K-Ras驱使的肿瘤中是否不同。为此，我们将来自野生型小鼠的肿瘤与来自基因工程化小鼠模型的肿瘤进行了比较，所述基因工程化小鼠模型缺乏内源H-Ras但表达敲进内源K-Ras基因座的野生型H-Ras。然后通过用DMBA/TPA局部处理诱导肿瘤发生以及K-Ras或H-Ras突变。该模型允许在相同的细胞背景下，对受相同内源调控元件控制的K-Ras和H-Ras致癌基因进行等同比较(Potenza等人，EMBO Rep 6:432-437,2005；To等人，Nat Genet 40:1240-1244,2008)。有趣的是，当与具有K-Ras突变的皮肤肿瘤相比时，在该模型中的突变H-Ras驱使的皮肤肿瘤具有升高水平的Fzd8蛋白和增加水平的磷酸化CaMKii(图2G)。该数据进一步表明，该独特的K-Ras介导的信号转导不能由H-Ras再现，即使当其被敲入K-Ras基因座。

尽管它们具有不同的下游效应物，活性经典和非经典的Wnt信号转导级联通常由frizzled受体与Wnt配体的结合来调控。与其它WNT家族成员如优选激活Wnt/β-连环蛋白/TCF信号转导的WNT3a不同，WNT5a是典型的非经典Wnt信号转导通路激活剂(Weekes和Winn,Cancers3:3676-3686,2011)。为了评估不同的WNT配体是否参与调节可辨别的致癌H-Ras和K-Ras的Wnt/Ca²⁺信号转导活性，我们对WNT-5a和WNT-3a在Ras^V12转化的NIH\3T3细胞中的表达水平和功能进行了进一步评估。如图9E中所示，致癌Ras^V12转化的细胞比对照细胞表达更多的WNT-3a和-5a蛋白，但是在H-Ras^V12和K-Ras^V12之间的表达水平不存在明显差异。此外，WNT配体的额外存在不改变H-Ras^V12或K-Ras^V12转化的细胞中的CaMKii活性、β-连环蛋白/TCF/LEF转录活性以及球形成效率(图9F-H)。数据表明H-Ras和K-Ras在非经典的Wnt/Ca²⁺信号转导方面的显著差异不依赖于WNT配体的存在。

由于致癌K-Ras导致NIH/3T3细胞中Fzd8表达的阻抑和CaMKii磷酸化的降低，我们接下来在癌来源细胞系中确定致癌K-Ras的敲低对Fzd8的影响。在人胰腺癌细胞中，K-Ras敲低增加了胰腺癌细胞系中Fzd8的表达并增加了CaMKii的磷酸化(图2H)。如TOPFlash分析所评估的，当K-Ras表达被敲低时，PANC2.13细胞显示出显著降低的β-连环蛋白活性(图2I)。基于以上结果，我们得出结论，在小鼠和人癌细胞中，致癌K-Ras而非H-Ras阻抑Fzd8的表达和CaMKii的活性，其为Wnt/Ca²⁺通路的主要效应物。

在此，我们报道了在K-Ras^V12转化的细胞以及在含有致癌K-Ras的胰腺癌细胞中，经典Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的活性受Fzd8介导的非经典Wnt/Ca²⁺通路调控。然而，参与经典Wnt/β-连环蛋白活性的基因的突变发生于许多类型的癌症中。在结肠直肠癌中，其中K-Ras突变发生于约50％的病例中，Wnt/β-连环蛋白信号转导通路中的突变作为主要起始驱使子通常通过使APC(腺瘤性结肠息肉病)基因失活的突变发挥作用。因此，我们旨在研究APC损失/突变是否使得与K-Ras相关的恶性肿瘤特征与结肠直肠癌细胞中的Fzd8下调和干细胞特性无关。在多种结肠癌细胞系中，与野生型或突变的APC的状态无关，K-Ras的敲低促进了Fzd8的表达和NF-AT或CaMKii的激活(图10A)。如从我们的模型中所预期的，在表达野生型β-连环蛋白的SW480(突变的APC)中，K-Ras的敲低显著阻抑了β-连环蛋白/TCF/LEF的转录活性，而在具有β-连环蛋白功能突变的HCT15(突变的APC)或HCT116(野生型APC)中没有(图10B)。尽管通过shRNA阻抑K-Ras的表达不影响HCT15和HCT116细胞中的β-连环蛋白/TCF/LEF转录活性，但是其仍然抑制3D培养中它们的球体形成能力(图10C)。然而，在HCT15和HCT116中，当K-Ras敲低时，通过BrdU的掺入所指示的细胞增殖率未被抑制(图10D)。该结果导致了有趣的问题：K-Ras介导的恶性肿瘤是否独立于经典Wnt/β-连环蛋白/TCF/LEF的转录活性？

为了解决该问题，我们用一系列端锚聚合酶抑制剂JW55、JW67和心肌原1(cardionogen 1)对致癌H-Ras^V12或K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞进行了处理。JW55和JW67的功能是通过直接降解β-连环蛋白作为经典Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的强效抑制剂，以及心肌原1抑制Wnt/β-连环蛋白/TCF/LEF的转录活性。TOPFlash分析显示，在Ras^V12转化的细胞中，端锚聚合酶抑制剂成功阻抑了β-连环蛋白/TCF/LEF的转录活性(图10E)。然而，阻抑的β-连环蛋白的功能未相应地影响其在3D培养中的生长：在JW55、JW67或心肌原1存在的情况下，K-Ras^V12转化的细胞仍维持其球形成效率，而这些化合物抑制载体对照或H-Ras^V12转化的NIH/3T3的球体形成(图10F)。数据指示，尽管我们将β-连环蛋白/TCF/LEF转录活性的变化用作含有野生型β-连环蛋白的细胞中的非经典Wnt/Ca²⁺信号转导活性的读出的事实，但是K-Ras驱使的恶性肿瘤独立于Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的功能。

CaMKii的抑制增强了H-Ras^V12细胞的球体形成

为了确定K-Ras转化的细胞中观察到的Wnt/Ca²⁺信号转导通路的抑制是否是获得干细胞样特性的原因，我们用选择性CaMKii抑制剂KN-93对NIH/3T3-H-Ras^V12和载体对照细胞进行了处理(图3A)。该处理降低了CaMKii的磷酸化(图3B)。明显地，KN-93也降低了NIH/3T3-H-Ras^V12细胞中Fzd8的表达(图3B)并增加了β-连环蛋白的转录活性，这证实了Wnt/Ca^{2 +}/CaMKii信号转导对经典Wnt通路的抑制作用(图3C)。此外，KN-93的处理显著提高了NIH/3T3-H-Ras^V12细胞的球形成效率和类球体集落的大小(图3D)，这表明CaMKii活性的下调是诱导K-Ras转化的细胞中观察到的恶性肿瘤特征所必需的。

Fzd8的敲低诱导H-Ras^V12细胞中的致瘤性

为了进一步确定Fzd8在Wnt/Ca²⁺信号转导中的作用，我们用shRNA敲低了NIH/3T3-H-Ras^V12细胞中的Fzd8(图3A&E)。我们观察到降低的磷酸化CaMKii水平以及增加的β-连环蛋白活性(图3E-F)。当在NIH/3T3-H-Ras^V12细胞中敲低Fzd8时，具有重新铺板能力的球体的体外形成也增强(图3G)。重要的是，在有限的移植分析中，当与表达Fzd8的亲本对照细胞相比时，皮下注射50个NIH/3T3-H-Ras^V12shFzd8细胞的小鼠显示出显著降低的无瘤生存率(图3H)。因此，Fzd8表达的抑制以及随后Wnt/Ca²⁺通路的阻抑增强了H-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞中的肿瘤起始，表型模拟了致癌K-Ras的作用。

Fzd8在K-Ras驱使的癌症中的作用

接下来，我们测试了Fzd8的下调是否是NIH/3T3-K-Ras^V12细胞起始肿瘤形成所需的。NIH/3T3-K-Ras^V12细胞中Fzd8表达的恢复提高了磷酸化CaMKii的水平，降低了细胞生长，并降低了β-连环蛋白的活性(图4A-B)。此外，Fzd8的恢复显著降低了NIH/3T3-K-Ras^V12细胞在体外的球形成效率，以及其连续传代之后的再现能力(图4C)。在皮下注射了50个NIH3T3-K-Ras^V12细胞的裸鼠中，Fzd8的过表达完全废除了肿瘤形成，而对照细胞仍维持体内的高肿瘤起始率(9/10)(图4D)。

有趣的是，在NIH3T3-K-Ras^V12细胞中，外源添加的WNT3a或WNT5a配体未影响增加的磷酸化CaMKii，以及由Fzd8的过表达引起的β-连环蛋白的活性的抑制(图11A-B)。这些数据表明，由Fzd8过表达导致的K-Ras^V12转化的细胞中改变的Wnt/Ca²⁺信号转导通路和β-连环蛋白活性不能通过经典或非经典的Wnt通路配体来拯救。

当Fzd8在K-Ras依赖的人胰腺癌PANC2.13细胞中过表达时，我们观察到磷酸化CaMKii水平的增加，伴随着CD44和CD24表达的同时降低(图11C)。当与对照细胞相比时，Fzd8过表达的PANC2.13细胞显示出多种β-连环蛋白靶向基因(包括CCND-1、LEF1和c-Myc)的显著下调，这与阻抑的β-连环蛋白/TCF转录活性一致(图11D)。PANC1细胞中Fzd8的过表达导致NF-AT转录活性升高、β-连环蛋白活性降低，如通过荧光素酶报告子分析所评估的，以及CD44和CD24的表达减少(图4E和图11E)。有趣的是，在这些胰腺癌系中Fzd8的过表达诱导了分化样的形态学变化，表型模拟了K-Ras敲低时所观察到的那些(图11F)。此外，当与对照组相比时，皮下异种移植过表达Fzd8的PANC1的裸鼠在注射后至多90天具有增加的无瘤生存率(图4F)。该结果确立，恢复Fzd8的表达(增强Wnt/Ca²⁺信号转导并抑制经典Wnt信号转导)降低了K-Ras^V12转化的细胞或者具有致癌K-Ras的胰腺肿瘤细胞的肿瘤形成。

人Fzd8通常在脑、心脏、肾脏、骨骼肌中以及在胰腺中表达(Saitoh等人，Int JOncol 18:991-996,2001)。然而，尚未研究胰腺肿瘤起始和进展期间Fzd8的表达模型。四种不同的人胰腺组织阵列(BioMax、PAN241、PA242a、PA483b和T143)的免疫组织化学显示，尽管Fzd8的表达在正常的胰腺腺泡和胰岛细胞中是丰富的，但是其在恶性胰腺组织中的表达通常是损失的(图4G和图11G)。有趣的是，组织阵列T143、B1、B2、B5和B6显示，Fzd8在胰岛细胞肿瘤中的表达无明显降低，所述胰岛细胞肿瘤大部分是良性的，并且其中K-Ras很少突变(图11G)。此外，Fzd8的表达在I期胰腺腺癌中被强烈阻抑(图4G)，这表明Fzd8表达的抑制发生在胰腺癌变的早期阶段，其中K-Ras的致癌激活很可能已经发生。H评分进一步提供了指示当与正常组织相比时Fzd8在人恶性胰腺样本中明显被阻抑的半定量分析(图4H)。

为了进一步证实在人胰腺组织中Fzd8的表达，我们使用了RNAscope，其为新型RNA原位杂交方法。通过使用新的探针设计策略和基于杂交的信号放大系统同时放大信号并抑制背景，实现了个体细胞中的单分子可视化(Wang等人，J.Mol Diagn 14:22-29,2012)。如图4I中所示，正常胰腺组织和癌邻近的正常组织与人Fzd8特异性探针杂交(Advanced CellDiagnostics)，而恶性胰腺组织在RNAcope原位杂交分析中未显示检测到Fzd8的表达。此外，允许我们通过多个公开的微阵列数据集研究人Fzd8在RNA水平的表达水平的Oncomine在线软件(Life Technologies)表明，Fzd8不仅在人胰腺导管腺癌中显著下调，而且在多种类型的人类癌症(包括乳腺癌、胶质母细胞瘤和结肠癌)中显著下调(参见，例如图11H)。

通过K-Ras-CaM相互作用调节的Wnt/Ca2+信号转导

钙调蛋白(CaM)是通过直接结合来激活CaMKii的钙结合信使蛋白，其优先与GTP结合的K-Ras4B结合，而不与H-Ras4A、N-Ras4A或K-Ras4A优先结合(Klee和Vanaman,AdvProtein Chem 35:213-321,1982；Schulman,Curr Opin Cell Biol 5:247-253,1993；Villalonga等人，Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001)。该结合可以改变CaM的亚细胞定位，并因此减少可用于激活CaMKii以及随后激活非经典的Wnt/Ca²⁺信号转导通路的CaM库。因此，我们旨在确定K-Ras与CaM之间的相互作用是否是通过K-Ras下调Wnt/Ca²⁺信号转导的原因。

我们首先证实K-Ras^V12(而非H-Ras^V12)与CaM结合，并且以钙依赖的方式结合(图5A)。K-Ras的高变区是其与CaM的相互作用所需的，并且K-Ras 4B Ser181的磷酸化废除了该相互作用(Lopez-Alcala等人，J Biol Chem 283:10621-10631,2008；Villalonga等人，Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001)。我们构建了编码模拟磷酸化的突变体(S181D)或者不能经受磷酸化的突变形式的K-Ras^V12(S181A)的逆转录病毒构建体，然后将这些突变体引入NIH/3T3细胞内(图12A)。在NIH/3T3细胞中，K-Ras^V12-S181D不能与CaM免疫共沉淀，而在类似条件下，野生型和S181A突变体维持与CaM的相互作用(图5B)。K-Ras^V12突变体S181D和S181A仍是法尼基化的，其被正确转运至质膜，并且当与K-Ras^V12相比时，不导致NIH/3T3细胞中的形态学差异(图12B，并且数据未显示)。与K-Ras^V12-转化或K-Ras^V12-S181A转化的细胞相比，K-Ras-CaM相互作用废除且磷酸化CaMKii水平增加的表达K-Ras^V12-S181D的NIH/3T3细胞在Fzd8启动子活性以及Fzd8的mRNA和蛋白水平的表达方面均显著增加(图5C-E)。有趣的是，尽管它们显示出相当的K-Ras蛋白表达水平和磷酸化Erk水平，但是当与K-Ras^V12-转化或K-Ras^V12-S181A转化的细胞相比时，K-Ras^V12-S181D感染的NIH/3T3细胞显示出升高水平的活性CaMKii(图5E)。表达K-Ras^V12-S181D的细胞还显示出增加的NF-AT转录活性和β-连环蛋白转录活性的阻抑，NF-AT是Wnt/Ca²⁺信号转导通路的另一主要下游调节物(图5F)。这些数据显示，K-Ras通过与钙调蛋白的特异性相互作用调控Fzd8介导的非经典Wnt/Ca²⁺信号转导以及随后经典的Wnt信号转导(图5G)。相比之下，致癌H-Ras转化的肿瘤细胞含有足以激活CaMKii的CaM，导致Wnt/Ca²⁺信号转导的激活和Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的抑制(图5G)。与H-Ras一样，N-Ras不能与CaM结合(图12C)。因此，N-Ras转化的细胞与H-Ras转化的细胞类似，包括CaMKii的磷酸化、Fzd8的表达升高以及β-连环蛋白/TCF/LEF转录活性降低(图12D-F)。

综合考虑，这些数据表明通过刺激S181的磷酸化破坏K-Ras与CaM之间的相互作用可能是抑制致癌K-Ras驱使的恶性肿瘤的有吸引力的方法。

通过prostratin对K-Ras进行的磷酸化损害了(compromise)K-Ras与CaM的结合以及致瘤性

已知蛋白激酶C(PKC)通过多元区内S181的磷酸化调控K-Ras(Bivona等人，MolCell 21:481-483,2006)。虽然作为PKC激活剂的典型的佛波酯(如佛波醇-12-十四酸酯-13-乙酸酯(PMA))显示是肿瘤促进性的，但是非典型的PKC激活剂prostratin(12-脱氧佛波醇-13-乙酸酯)对肿瘤促进的效力小得多(Szallasi等人，Nat Genet 40:1240-1244,1993；Zayed等人，Planta Med 50:65-69,1984)。Prostratin最近被建议为治疗AIDS的新型治疗剂，因为其重新激活含有潜伏的原病毒的记忆型CD4+T细胞中的HIV-1，同时下调CD4受体，防止新的HIV感染。(Hezareh,Drug News Prespect 18:496-500,2005；Williams等人，JBiol Chem 279:42008-42017,2004；Witvrouw等人，Antivir Chem Chemother 14:321-328,2003)。在此，我们确定该非肿瘤促进性的PKC激活剂是否能够被重定为减少K-Ras介导的恶性肿瘤的新型药剂。

Prostratin以剂量依赖的形式激活PKC(图13A)，其废除了Ras^V12转化的细胞以及多种人胰腺癌细胞系中K-Ras与CaM之间的内源性相互作用(图5H)。随后，细胞在对prostratin的应答中显示出显著升高水平的磷酸化CaMKii(图5H-I)。此外，在人胰腺癌细胞中，用prostratin进行的处理增加了Fzd8的表达并降低了β-连环蛋白靶基因LEF1的表达，这进一步表明通过prostratin激活PKC改变了由致癌性K-Ras介导的下游Wnt/Ca²⁺信号转导的活性(图13B)。值得注意的是，用prostratin进行的处理未改变被H-Ras^V12或K-Ras^V12-S181D转化的细胞中CaMKii的活性，所述H-Ras^V12或K-Ras^V12-S181D无CaM结合能力(图5I)。此外，K-Ras^V12转化的NIH/3T3细胞而非H-Ras^V12或K-Ras^V12-S181D转化的NIH/3T3细胞对于prostratin是敏感的，并且显示显著降低的细胞活力(图5J)。此外，我们展示了，在拯救的“Rasless”MEF中，H-Ras^V12和K-Ras^V12有差异地介导Fzd8的表达以及随后Wnt/Ca2+信号转导。同样地，当用prostratin处理时，用K-Ras(4B)^V12拯救的MEF显示出增加的磷酸化CaMKii和降低的细胞活力，而用H-Ras^V12拯救的Rasless MEF显示对prostratin的最小应答(图13C)。这些显著的体外应答导致询问prostratin是否能够作为治疗K-Ras驱使的恶性肿瘤的新型药剂？

有趣的是，口服或者腹腔内施用的prostratin显著抑制了K-Ras^V12转化的细胞的致瘤性，其中无全身毒性的证据(图13D)。当与用介质对照处理的那些相比时，在prostratin存在的情况下，来源于K-RasV12-NIH/3T3细胞的单一皮下肿瘤小的多，并且磷酸化CaMKii大大增加(图13D-E)。

Prostratin抑制人胰腺癌的肿瘤起始和生长

在针对prostratin处理的应答中，具有不同的突变K-Ras同种型的人胰腺癌细胞系显示细胞形态的变化，其表型模拟了因K-Ras敲低或Fzd8过表达观察到的那些(图14A，左图)。此外，prostratin的处理显著降低了人胰腺癌细胞的细胞活力和增殖率(图14A，右图)。

为了测试prostratin对K-Ras驱使的人胰腺癌的体内抗癌影响，我们首先研究了prostratin是否能够阻止异种移植模型中的胰腺肿瘤形成。如图6A所示，当与介质处理组相比时，prostratin显著降低了在皮下部位建立的异种移植胰腺肿瘤中肿瘤形成的频率。此外，在prostratin存在的情况下建立的肿瘤的平均大小比对照组中的肿瘤小得多(图6B)。用荧光素酶标记胰腺肿瘤细胞，以更准确地检测肿瘤形成。生物发光成像(BLI)确认，用prostratin进行的处理大大抑制了肿瘤起始和肿瘤大小(图6C)。此外，当与对照组中的肿瘤相比时，用prostratin处理的异种移植胰腺肿瘤在治疗期间显示显著降低的肿瘤生长率，以及降低的Ki67表达(图6D)。

除了测试对皮下肿瘤的预防效果，我们评估了prostratin在具有突变K-Ras的人胰腺癌细胞的原位模型中的抗癌效果。基于ELISA的PKC活性分析揭示，为了将prostratin有效递送至胰腺，相对于腹腔内途径，优选口服途径(图13F)。与对照处理的小鼠相比，每天接受口服prostratin处理的免疫妥协NOD-SCID小鼠在原位部位具有较低的肿瘤负荷：BLI分析揭示，当与对照相比时，prostratin显著降低了动物中原位肿瘤的大小(图6E和图14B)。此外，用prostratin进行的处理降低了原位胰腺癌模型中至腹膜的转移(图6E和图14C)。如图6F和图14B所示，H&E染色揭示，大部分prostratin处理的小鼠在胰腺中未显示原发肿瘤的形成，而对照组的小鼠具有明显的原位肿瘤，并且几乎检测不到正常的胰腺组织。此外，当与对照肿瘤相比时，prostratin处理组中的原位肿瘤表达少得多的Ki67(图6G和图14B)。综合考虑，我们的数据表明，prostratin显著降低了异种移植模型中人胰腺癌的肿瘤起始频率。

接下来，我们测试了prostratin对建立的人胰腺异种移植肿瘤的抗肿瘤效果。将人胰腺癌细胞皮下或者原位植入免疫妥协小鼠中。在注射后约10至14天开始每天的口服prostratin处理，这取决于实验细胞系和模型(图7A)。有趣的是，当与介质处理的肿瘤相比时，prostratin显示对人胰腺皮下肿瘤的抗肿瘤活性，这由显著降低的生长率确定(图7A)。此外，prostratin处理的皮下肿瘤显示出切割的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3的表达增强(图14D)，这表明其对建立的肿瘤发挥细胞毒性作用。

在癌症患者的血流中发现升高水平的无细胞DNA(cfDNA)，并且其浓度显示与有效治疗或者肿瘤复发之后的原发肿瘤大小的近乎完全的相关性(Anker等人，CancerMetastasis Reviews 18:65-73,1999；Sozzi等人，J.Clin Oncol 21:3902-3908,2003)。因此，对血浆cfDNA的绝对水平的定量可能是诊断或监测某些类型的癌症的有效工具，所述癌症包括胰腺恶性肿瘤(Sikora等人，The International Journal of Biological Markers30,e136-141,2015)。在此，我们应用Taqman探针特异性检测已原位植入人胰腺癌细胞的小鼠中的人cfDNA(Cheng等人，Cancer Sci 100:303-309,2009)(图7B)。在肿瘤移植后第14天，人cfDNA的水平增加超过本底水平6倍以上，这时开始prostratin处理。在prostratin处理的动物中，人特异性cfDNA的浓度随时间显著降低，而在介质处理组中，人特异性cfDNA的浓度显示阳性动态变化(图7B)。这些数据证明，prostratin显著降低了原位异种移植模型中人胰腺癌的负荷。

综合考虑，我们的数据表明，PKC的非典型激活剂prostratin能够有效降低K-Ras与CaM的相互作用，从新接通Wnt/Ca2+信号转导，并抑制胰腺癌中致癌K-Ras介导的恶性肿瘤。

Prostratin特异性抑制K-Ras^G12V诱导的乳头状瘤

我们进一步研究了prostratin对基因工程化小鼠模型(GEMM)中致癌Ras诱导的肿瘤的影响。我们首先使用由受皮肤干细胞启动子Lrig1控制的H-Ras^G12V或K-Ras^G12V驱使的乳头状瘤模型(图7C)(Jaks等人，Exp Cell Res 316:1422-1428,2010；Page等人，Cell StemCell 13,471-482,2013)。在该GEMM中，他莫昔芬诱导的Cre重组酶起始致癌H-Ras^G12V或K-Ras^G12V的表达，并且强制的致癌Ras的表达破坏了伤口愈合期间的皮肤稳态，并进一步诱导了乳头状瘤的形成(图7C)。

每天的prostratin处理显著延迟/降低了由K-Ras^G12V驱使的乳头状瘤的形成，而其显示对H-Ras^G12V诱导的肿瘤的起始无作用(图7D)。应当注意，在相同的遗传背景下，与致癌H-Ras相比，致癌K-Ras以高得多的频率驱使皮肤肿瘤的起始，并且来自GEMM的结果与在植入Ras^V12转化的MEF的异种移植模型中观察到的结果一致。

上皮组织(如表皮)的众所周知的特征是多种干细胞群的共存。Lrig1是与上部毛囊皮脂腺单元中的干细胞相关的多种标志物之一(Jaks等人，2010；Jensen等人，NatProtoc 5:898-911,2010)。在表皮中，这些Lrig1⁺细胞能够有助于皮肤重构分析(skin-reconstitution assay)中的所有表皮谱系(Jensen等人，2010)。在此，我们显示，在相同的Lrig1启动子下，与H-Ras^G12V相比，K-Ras^G12V以高得多的速率起始皮肤肿瘤，这进一步支持了致癌K-Ras而非H-Ras对癌症干细胞或者肿瘤起始细胞的功能性作用。此外，prostratin不仅降低肿瘤起始频率，而且显著减缓K-Ras^G12V诱导的乳头状瘤的生长率(图14E)。有趣的是，对照组中的K-Ras^G12V驱使的皮肤肿瘤显示出上皮间质转型(EMT)特性，包括E-钙粘蛋白的表达降低和波形蛋白的表达增加，而prostratin处理的肿瘤维持上皮标志物的强表达(图7E)。这些数据表明，在该GEMM中，prostratin可以选择性抑制由致癌K-Ras驱使的乳头状瘤的形成和发展。

总之，我们的结果指示，在免疫活性小鼠(immunocompetent mice)中，prostratin选择性抑制由致瘤K-Ras导致的皮肤肿瘤的形成。综合异种移植模型中的数据，我们表明prostratin可以是针对致癌K-Ras驱使的癌症具有选择性活性的新型有效药物。

讨论

历史上，突变的H-Ras、N-Ras和K-Ras癌基因的高度序列同源性，结合其转化培养中的细胞并激活常见的细胞信号转导通路的类似能力，支持下述观点：这三种Ras基因产物在功能上是冗余的。在本文，我们报道了H-Ras和K-Ras的不同在于其诱导肿瘤起始的能力，并且所述不同与K-Ras抑制Fzd8介导的非经典Wnt/Ca²⁺信号转导通路的能力直接相关。

由负调节因子APC的功能丧失突变和/或β-连环蛋白的功能获得突变驱使的经典Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的组成型激活与数种类型的肿瘤(最显著的是结肠癌)的起始直接相关。然而，经典的β-连环蛋白调控蛋白的此种遗传损伤在人胰腺癌中极少发生(Abraham等人，Am J Pathol 160:1361-1369,2002；Gerdes等人，Digestion 60:544-548,1999；Seymour等人，Cancer Res 54:2761-2764,1994)，这表明用于激活PDAC中的Wnt/β-连环蛋白信号转导通路的替代路径。在突变K-Ras的背景下，通过siRNA耗竭β-连环蛋白的表达降低了增殖，并促进小鼠胰腺癌的细胞凋亡(Pasca di Magliano等人，PLoS One 2:e1155,2007)。此外，β-连环蛋白的水平与PanIN分级和侵略性PDAC的发展正相关(Al-Aynati等人，Clin Cancer Res 10:1235-1240,2004；Pasca di Magliano等人，2007；Wang等人，Cancer Cell 15:207-219,2009)，指示Wnt/β-连环蛋白信号转导对PDAC维持的潜在贡献。然而，在腺泡和内分泌细胞中表达β-连环蛋白的激活突变的小鼠显示增加的核β-连环蛋白的年龄依赖性积聚以及Wnt/β-连环蛋白-靶基因的表达，并最后未能发展为胰腺肿瘤(Strom等人，Development 134:2719-2725,2007)。综合Cre诱导的β-连环蛋白的稳定/激活不能与K-Ras协同驱使转基因小鼠中的胰腺上皮内损伤(PanIN)或者PDAC的证据(Heiser等人，Gastroenterology 135:1288-1300,2008)，看起来Wnt/β-连环蛋白信号转导通路不足以起始PDAC。在此，我们报道了，在体外通过端锚聚合酶抑制剂抑制β-连环蛋白活性未显示对K-Ras介导的恶性肿瘤的任何负效应(图10)。此外，在结肠癌细胞系中通过shRNA阻抑致癌K-Ras的表达显著抑制了其在“类器官”培养中的生长，与突变的或野生型APC的存在无关(图10)。综合考虑，我们推断：致癌K-Ras强于H-Ras的肿瘤起始能力不仅仅是由于经典Wnt/β-连环蛋白信号转导的增强。尽管非经典的Wnt/Ca²⁺信号转导通路在致癌Ras介导的肿瘤起始中发挥重要作用，但是经典的β-连环蛋白信号转导级联不是通过其来调节致癌K-Ras驱使的肿瘤的恶性特征的唯一下游路径。因此，需要鉴定Fzd8介导的非经典Wnt/Ca²⁺信号转导的其它潜在下游通路。

非经典Wnt/Ca²⁺信号转导通路的主要调节物是钙调蛋白依赖性激酶II(CaMKii)。CaMKii由其与钙调蛋白的结合来调控(Bachs等人，Cell Calcium 16:289-296,1994；Klee和Vanaman,Adv Protein Chem 35:213-321,1982；Stewart等人，FEBS Lett 137:80-84,1982)。有趣的是，发现钙调蛋白排他性结合K-Ras4B，而不结合其它N-、H-或K-Ras4A，并且具有钙调蛋白的CaMKii结合结构域的序列的肽能够封阻该特异性相互作用(Villalonga等人，Mol Cell Biol 21:7345-7354,2001)。我们的研究证实，K-Ras^V12而非H-Ras^V12能够以Ca²⁺依赖性方式与钙调蛋白结合。虽然致癌K-Ras与钙调蛋白组成型结合，但是野生型K-Ras蛋白仅在当其被激活时才能与钙调蛋白结合，例如在BxPC3细胞中通过EGF激活。此外，K-Ras与钙调蛋白的结合通过高变区中Ser181的磷酸化而减弱，而模拟K-Ras的Ser181磷酸化形式的K-Ras^V12变体(S181D)不与钙调蛋白结合。K-Ras^V12S181D变体丧失抑制CaMKii活性和Fzd8表达的能力，表明K-Ras与钙调蛋白之间的相互作用是K-Ras抑制Fzd8介导的非经典Wnt/Ca²⁺信号转导的重要途径，所述相互作用是同种型特异性的、GTP依赖性的且被高度调控。因此，封阻K-Ras与钙调蛋白之间的该特异性相互作用可以提供选择性地靶向K-Ras的新方法。

在本文中，我们报道了通过prostratin激活PKC导致K-Ras-CaM相互作用的解离，激活非经典的Wnt/Ca²⁺信号转导，并抑制致癌K-Ras介导的恶性肿瘤。我们的发现导致了下述未解决的问题：虽然PKC同功酶通过佛波酯的激活长期被认为促进肿瘤发生，但是是什么引起通过prostratin和其它典型的激活剂如PMA导致的PKC激活之间的差异？

蛋白激酶C(PKC)涉及肿瘤发生已超过30年，因为它首先被表征为促进肿瘤的佛波酯的受体(Castagna等人，J.Biol Chem 257:7847-7851,1982)。然而，近期的研究将PKC表征为相关的同种型家族，分为常规的(α、βI、βII和γ)、新型的(δ、ε、η和θ)以及非典型的(ζ、λ/τ)(Basu和Pal,Scientific World Journal 10:2272-2284,2010)，并且所述PKC同功酶可以显示出重叠的以及相对的功能(Steinberg,Physiol Rev 88:1341-1378,2008)。例如，PKCδ被认为作为肿瘤抑制子发挥功能，因为PKCδ的下调而非激活与肿瘤促进相关(Lu等人，Mol Cell Biol 17:3418-3428,1997)。出人意料地，近期的研究揭示，PKC亚型中的大部分癌症相关的突变是功能丧失的(LOF)(Antal等人，Cell 160:489-502,2015)。通过CRISPR介导的基因组编辑进行的PKCβ的LOF突变的修正抑制患者来源的结肠癌细胞的体外和体内恶性肿瘤(Antal等人，2015)。更重要的是，存在于PKC同功酶中的数种突变是显性阴性的，其功能为抑制整体的PKC信号转导输出(Antal等人，2015)。这建立了新的假说：PKC同功酶的功能通常是作为肿瘤抑制子，因此抗癌疗法应当关注恢复PKC活性而非抑制PKC活性。该提议也已被Bivona及其同事证明(Bivona等人，Mol Cell 21:481-493,2006)，基于它们的下述观察：PKC介导的K-Ras丝氨酸-181的磷酸化影响K-Ras的活性。有趣的是，已经显示PMA和prostratin在其对PKCα和PKCδ的生物活性(激活vs.亚细胞转位)方面实质性不同(Marquez等人，Biochem Pharmacol 75:1370-1380,2008)，这可能解释了它们在肿瘤促进方面的不同特性。

总之，K-Ras通过与钙调蛋白的直接结合，导致CaMKii活性降低并下调Fzd8表达，从而抑制Wnt/Ca²⁺信号转导通路。Fzd8表达通过K-Ras的下调导致Wnt/Ca²⁺信号转导的持续阻抑，这继而引起经典的Wnt信号转导和致瘤性的增强。可将所述的K-Ras同种型特异性活性用作替代靶标，以封阻K-Ras的致癌活性但不影响其它Ras同种型。

实验程序

细胞系

NIH/3T3、BxPC3、PANC1和PANC2.03细胞来自ATCC。小鼠胰腺腺癌细胞由UCSF的Eric Collisson博士惠赠。表达H-、N-或K-Ras的Rasless MEF由UCSF的Cameron Pitt惠赠。小鼠细胞系在37℃，5％CO₂，于添加有10％FBS(或者对于NIH/3T3细胞而言，为CS)的达尔伯克改良伊戈尔培养基(DMEM)中生长。将人胰腺癌细胞系维持在添加有15％FBS和人重组胰岛素(Gibco 12585-014)的ATCC改良RPMI-1640培养基中。

将K-Ras和H-Ras构建体亚克隆至pBabe逆转录病毒表达载体，并使用标准诱变技术(Agilent QuikChange II XL定点诱变试剂盒)引入丝氨酸181位点突变。在293细胞中包装各表达构建体的病毒颗粒，并以大约1MOI转导NIH/3T3细胞。然后在补充有2μg/ml嘌呤霉素的生长培养基中筛选转导的细胞。

端锚聚合酶抑制剂JW55、Cardinogen1和JW67购自R&D Systems。将细胞用0.5μM抑制剂处理12小时，以用于TOPFlash分析。对于球体形成分析，在含有不同的端锚聚合酶抑制剂的完全培养基中培养细胞。

动物研究

所有实验均被旧金山的加利福尼亚大学的IACUC批准。将Ras^V12转化的NIH/3T3细胞以每侧50、100或1,000个细胞皮下注射进雌性裸鼠中(Nu/Nu)。一周两次测量可触知的肿瘤。将动物分成每组五只小鼠。来源于Braf^CA和Kras^LSL-G12D小鼠的胰腺腺癌细胞由EricCollisson提供，并且如所述进行基因分型(Collison等人，Nat Med 17:500-503,2011；Dankort等人，Genes Dev 21:379-384,2007；Hingorani等人，Cancer Cell 4:37-450,2003)。使用28.5号针，将100个细胞以在20μL 50％Matrigel中的形式原位移植进6至8周龄的FVB/n小鼠。将小鼠监测一个月，并且当其痛苦时使之安乐死。

如之前所述，通过两阶段化学致癌方案，使用7,12-二甲苯蒽(DMBA)和12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)诱导皮肤肿瘤(Balmain和Pragnell,Nature 303:72074,1983)。通过常规方法将组织学证实的皮肤癌处理为DNA、RNA和蛋白质，以用于分子分析。如之前所述，通过直接测序鉴定Kras和HrasKI等位基因中的突变(To等人，Nat Genet 40:1240-1244,2008)。

用于动物处理的prostratin购自Santa Cruz Biotechnology(sc-203422A)。将药物通过口服灌胃(OG)以1mg/kg或者通过腹腔内(I.P)注射以0.5mg/kg每天施用于NOD-SCID或无胸腺的裸鼠。将10％DMSO、10％克列莫佛和80％盐溶液用作溶剂和介质对照。通过监测至少30天的体重变化来评估介质或prostratin的毒性效果。

使Lrig1Cre/ER/LSL Hras和Lrig1Cre/ER/LSL-Kras^G12D小鼠回交多代至FVB/N背景，以使遗传异质性对肿瘤发展的影响最小化。在两组小鼠中，通过施用单一剂量的4oht(他莫昔芬)，激活Cre重组酶，所述施用在8周龄时局部应用。在其后第7天，通过切2cm的切口诱导其背部损伤，以发展乳头状瘤。

来自小鼠血浆样本的DNA提取

将所有血液样本收集于含有K₂EDTA的管中(BD Microtainer,Ref 365974)，并在1,500g下离心10min。然后从血浆的顶部小心收集上清液，以排除细胞污染物的可能性。将血浆在-80℃下储存直至进一步使用。使用NucleoSpin Plasma XS试剂盒(Macherey-Nagel；740900)，从100μL血浆中提取cfDNA。

小鼠血浆中的人核酸的定量

根据制造商的方案，使用AB7900HT(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)和TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)，通过定量聚合酶链式反应(PCR)测量所有血浆样本中的核酸浓度。为了定量小鼠血浆样本中的人β-肌动蛋白基因组DNA，使用下述定制引物和探针组：正向引物，5’-ATCCTAAAAGCCACCCCACT-3’；

反向引物，5’-CTCAAGTTGGGGGACAAAAA-3’；以及

探针，5’-FAM-CACAGGGGAGGTGATAGCAT-TAMURA-3’。

RNA干扰

针对H-Ras、K-Ras和Fzd8的shRNA载体购自Open Biosystems。使用标准方案，通过使用第3代慢病毒包装系统将shRNA构建体包装为慢病毒。包装质粒来自Addgene。

RasGTP pull-down分析

将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，并在补充有1mmol/L DTT以及蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的1％TX100-TNM裂解缓冲液中裂解(20mmol/L Tris pH 7.5，5mmol/L MgCl₂，150mmol/L NaCl，1％Triton X-100)。向含10μL包装GST-Raf-RBD或Ral-GDS-RBD珠子的300至500μL 1％TX100-TNM裂解缓冲液中添加来自各样本的等量蛋白，并在4℃旋转1至2小时。将珠子用1mL冷的裂解缓冲液洗涤3次，并在十二烷基硫酸锂(LDS)样本缓冲液(Invitrogen)中煮沸。

K-LISA Akt活性分析

K-LISA Akt活性试剂盒购自EMD Millipore(CBA019)。将细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，并在补充有1mmol/L DTT以及蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(Sigma-Aldrich)的1％TX100-TNM裂解缓冲液(20mmol/L Tris pH 7.5，5mmol/L MgCl₂，150mmol/L NaCl，1％Triton X-100)中裂解。将含有等量蛋白的细胞裂解物与生物素化的肽底物孵育，所述肽底物可以被Akt1、Akt2和Akt3磷酸化。根据制造商的说明书，实施全部程序和板读取。

蛋白质印迹分析

将实验细胞在冰冷的PBS中洗涤两次，并在补充有蛋白酶抑制剂混合物(Roche)的1％Triton裂解缓冲液[25mmol/L Tris pH 7.5，150mmol/L NaCl，1％Triton X-100，1mmol/L EDTA，1mmol/L EGTA，20mmol/L NaF，1mmol/L Na₂VO₄和1mmol/L DTT]中裂解，以及通过离心清除。通过Bio-Rad蛋白分析(Bio-Rad)确定蛋白浓度。使用SDS-PAGE(NuPAGE；Invitrogen)溶解等量的蛋白提取物，将其转移至硝酸纤维素膜，并用指定的初级抗体，随后用被IRDye800(Rockland)或Alexa Fluor 680(Molecular Probes)标记的第二抗体进行免疫印迹，以及使用LI-COR Odyssey扫描仪使其可视化。初级抗体的完整列表提供于延伸的实验程序中。

球体形成和重新铺板分析

收获细胞、计数并以每孔10个或100个细胞将其接种至Ultra Low AttachmentCulture 96孔板内(Corning Life Science,Catalog number 3261)。在含有0.1％FBS或CS的低血清培养基中维持接种的细胞和形成的球体。对起始的球体每周观察两次。接种后一个月对形成的球体的数目进行计数。收获球体，并以每孔一个球体将其重新接种至含有完全生长培养基的12孔板或24孔板内。对重新铺板的集落进行染色，并通过0.05％结晶紫(在0.1％甲醇中)染色使其可视化。

药物敏化分析

首先将细胞以每孔10,000个细胞接种至96孔板内，并用prostratin(Santa CruzBiotech,sc-203422A)处理72小时。移除死细胞，并且根据制造商的说明书，实施MTS分析(Promega,G5430)以确定活细胞的百分比。将DMSO用作介质对照，并用于标准化。

定量PCR

使用QIAGEN RNAeasy试剂盒分离并纯化总RNA。使用用于RT-PCR的SuperScript^TM第一链合成系统(Invitrogen)将每个样本的1μg RNA逆转录为cDNA。通过DNase I处理排除基因组DNA的可能污染。使用SYBR Green(Applied Biosystem)实施定量实时PCR阵列分析。使用Windows的GraphPad Prism 4.00(GraphPad Software)计算倍数差异和统计学分析。96孔板上的小鼠干细胞信号转导RT²Profiler PCR阵列(PAMM-047Z)购自SABiosciences。

TOPFlash和NFat荧光素酶分析

通过使用Fugene6(Roche)，用TOPFlash(Addgene#12456)、FOPFlash(Addgene#12457)或pGL3-NFAT(Addgene#17870)荧光素酶报告子构建体转染细胞。在转染后第48小时，使用Bright-Glo荧光素酶分析系统(Promega)，根据制造商的说明书，测量细胞裂解物中的荧光素酶活性。免疫组织化学

5μm厚的胰腺组织微阵列(PAN241、PA242a、PA483b和T143)购自Biomax,Inc。将脱蜡组织在电锅中用Cell MarqueTM Trilogy试剂(ALS)暴露30分钟。通过在室温将切片置于H₂O₂/甲醇中10分钟，而将其淬灭。使用 SP试剂盒(Invitrogen)对人和小鼠胰腺组织进行染色，并且根据制造商的说明书实施整个程序。根据产品应用注解使用初级抗体的稀释液。

RNAscope原位杂交

为了通过放大靶标特异性的信号而非来自非特异性杂交的背景噪声探索RNA ISH的信噪比，我们使用了新用户设计的人Fzd8靶探针和RANSCOPE2.0High Definition-Brown染色试剂盒(Advanced Cell Diagnostics)。根据制造商的说明书实施整个程序。

尽管出于清楚理解的目的，已通过说明和实施例的方式在一定程度上详细描述了前述发明，但是本领域技术人员将会理解可在所附权利要求的范围内实践的某些变化和修改。此外，将本文提供的各参考文献通过引用整体并入，达到如同将各参考文献通过引用单独并入的程度。

Claims (28)

1.治疗对象中表达K-Ras的癌症的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗量的prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述表达K-Ras的癌症为表达野生型K-Ras的癌症。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述表达K-Ras的癌症为表达突变型K-Ras的癌症。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述表达K-Ras的癌症为胰腺癌、结肠直肠癌或肺癌。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述表达K-Ras的癌症为胰腺癌。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述胰腺癌为胰腺导管腺癌。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中向所述对象施用prostratin或者其盐或异构体。

8.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中向所述对象施用prostratin类似物或者其盐或异构体。

9.如权利要求8所述的方法，其中所述prostratin类似物具有下述结构式：

其中R为乙基、甲酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、苯甲酸酯、乙酸苯酯、乙酸环己酯、乙酸五氟苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、(5,6,7,8)四氢-1-萘基乙酸酯、乙酸联苯酯、乙酸金刚烷酯或者对苯乙酸苄酯。

10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，其中经口服、静脉内或者腹腔内施用所述prostratin或所述prostratin类似物或者以上的盐或异构体。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中将所述prostratin或所述prostratin类似物或者以上的盐或异构体与化疗剂组合施用。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述化疗剂为吉西他滨。

13.如权利要求11或12所述的方法，其中将所述prostratin或所述prostratin类似物或者以上的盐或异构体与所述化疗剂同时施用。

14.如权利要求11或12所述的方法，其中将所述prostratin或所述prostratin类似物或者以上的盐或异构体与所述化疗剂依次施用。

15.治疗对象中的胰腺癌的方法，所述方法包括向所述对象施用治疗量的prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体。

16.如权利要求15所述的方法，其中所述胰腺癌为胰腺导管腺癌。

17.如权利要求15或16所述的方法，其中向所述对象施用prostratin或者其盐或异构体。

18.如权利要求15或16所述的方法，其中向所述对象施用prostratin类似物或者其盐或异构体。

19.如权利要求18所述的方法，其中所述prostratin类似物具有下述结构式：

其中R为乙基、甲酸酯、丙酸酯、丁酸酯、戊酸酯、己酸酯、苯甲酸酯、乙酸苯酯、乙酸环己酯、乙酸五氟苯酯、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、(5,6,7,8)四氢-1-萘基乙酸酯、乙酸联苯酯、乙酸金刚烷酯或者对苯乙酸苄酯。

20.如权利要求15-19中任一项所述的方法，其中经口服、静脉内或者腹腔内施用所述prostratin或所述prostratin类似物或者以上的盐或异构体。

21.如权利要求15-20中任一项所述的方法，其中将所述prostratin或所述prostratin类似物或者以上的盐或异构体与化疗剂组合施用。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述化疗剂为吉西他滨。

23.如权利要求21或22所述的方法，其中将所述prostratin或所述prostratin类似物或者以上的盐或异构体与所述化疗剂同时施用。

24.如权利要求21或22所述的方法，其中将所述prostratin或所述prostratin类似物或者以上的盐或异构体与所述化疗剂依次施用。

25.治疗表达K-Ras的癌症的试剂盒，所述试剂盒包含：

prostratin或prostratin类似物或者以上的盐或异构体；以及

化疗剂。

26.如权利要求25所述的试剂盒，其包含prostratin或者其盐或异构体。

27.如权利要求25所述的试剂盒，其包含prostratin类似物或者其盐或异构体。

28.如权利要求25-27中任一项所述的试剂盒，其中所述化疗剂为吉西他滨。