CN106636279A - 一种缢蛏抗高血肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种缢蛏抗高血肽的制备方法，操作步骤为：1）酶解；2）超滤；3）制备缢蛏抗高血肽。有益效果为：采用复合酶制剂酶解缢蛏，不仅能得到抗高血肽，不会破坏抗高血肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间；加入助溶剂能抗高血肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率；析出剂能使抗高血肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；制备的缢蛏抗高血肽纯度高，活性强，抗高血压作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗高血肽绿色安全，可放心用于抗高血压药物的生产。

Description

一种缢蛏抗高血肽的制备方法
技术领域
本发明涉及多肽的制备技术领域，具体是一种缢蛏抗高血肽的制备方法。
背景技术
海洋贝类资源丰富且富含许多生理活性物质，因而逐渐被广泛研究和应用。缢蛏（Sinonovaculaconstricta）俗名蛏子，属瓣鳃纲、异齿亚纲、帘蛤目、灯塔蛤科、缢蛏属，在我国沿海均有分布，产量较大，为我国四大养殖贝类之一，缢蛏肉味鲜美，营养丰富，富含人体生命活动所需的各种必需氨基酸、不饱和脂肪酸等营养物质。缢蛏性寒、可补阴去邪热，治烦闷、冷痢、热痢、妇人产后虚损、虚热等症，具有较高的药用食用价值，对缢蛏肉的酶解条件进行研究，发现提取得到的糖胺聚糖对体外培养的HL-60细胞均有一定抑制作用，且随着用量增加抑制作用增强。张永娟等，提取缢蛏多肽能促进小鼠胸腺和脾脏发育及迟发型变态反应的发生，提高小鼠碳廓清能力及血清溶血素水平；PSD还能提高血清SOD、GSH-Px水平，降低血清MDA 含量。
活性多肽由于具有敏感性高、稳定性好及副作用少等优点，已被用作抗肿瘤药物开发的一个重要来源。研究已经证实，食物蛋白通过蛋白酶酶解方式，可以得到功能多样的活性多肽。对于缢蛏，在抗高血压方面的研究还很少，特别是利用酶解技术提取多肽在抗肿瘤方面的研究并未见报道。
现在已有很多研究采用酶解技术成功提取了动物多肽，说明从缢蛏中提取抗高血肽可行性很高。现有技术如授权公告号为CN104004808B的中国专利，公开了一种具有抗凝血与溶血栓全蝎多肽及其酶解制备方法与应用，制备方法包括：全蝎干体清洗干燥，粉粹成粉末；加入水均匀搅拌，pH 调至7~10，以100~300r/min 的速度匀速搅拌1h~3h，离心，上清液pH 调至3~7，得蛋白沉淀；将蛋白加水溶解，比例为5~20g ：100mL，pH 调至7.5~10，再加入碱性蛋白酶，该酶体积与蛋白重量之比0.1~5mL ：100g，温度40~80℃，搅拌速度100~300r/min，时间1~5h ；将酶解液通过阴离子交换柱分离纯化，收集干燥，得抗凝血肽粉。该方法为抗凝血类活性物质增加了新来源，实现原料的充分利用，具有产品活性高、制备过程方便可行、环保等优点，所制得的抗凝血肽粉可作为预防血栓、溶血栓、降血稠类食品的原料。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单，提取率高，提取的抗高血肽纯度高，活性强的缢蛏抗高血肽的制备方法。
本发明针对背景技术提到的问题，采取的技术方案为：
1）酶解：将缢蛏用冰水冲洗2~4次，将泥沙和附着缢蛏表面的污渍和微生物清洗干净，沥干。在鼓风机中干燥，温度为50~70℃，干燥时间1~2h，用粉碎机粉碎，过100~400目筛，按料液体积比为1:20~1:30加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8 mol/L，水浴加热搅拌，用盐酸调节pH。加入复合酶制剂木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亚硫酸钠0.05~0.08份，氯化钙0.2~0.5份，ε-多聚赖氨酸0.02~0.04份和硫胺0.01~0.02份和助溶剂水杨酸钠4~12份，硫代甜菜碱0.5~1.5份和二烯丙基二硫0.1~0.3份。使用上述复合酶制剂酶解缢蛏不仅能得到抗高血肽，不会破坏抗高血肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间。加入助溶剂能抗高血肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解温度为50~60℃，pH为6.5~7.2，酶解时间为3~5h，离心取上清液，加入析出剂硫酸铵2~5份，氯化钠1~4份和共轭亚油酸0.4~0.8份，静置过滤得粗抗高血肽。上述析出剂能使抗高血肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；
2）超滤：在步骤1得到的抗高血肽中按体积比1:10~1:15加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8 mol/L，选用2500~3500Da的超滤膜进行超滤，压力为500~1000Pa；
3）制备缢蛏抗高血肽：将步骤2得到的超滤液过HPLC柱，固定相为ZrO2/SiO2，流动相为含0.0002~0.0004%双乙酸钠1.2~1.8 mol/L 的Tris—HCl缓冲液，收集含抗高血肽的洗脱液，旋转蒸发掉流动相留下缢蛏抗高血肽固体，冷冻干燥，研磨，得到缢蛏抗高血肽粉末。上述方法制备的缢蛏抗高血肽纯度高，活性强，抗高血压作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗高血肽绿色安全，可放心用于抗高血压药物的生产。
与现有技术相比，本发明的优点在于：采用复合酶制剂木瓜蛋白酶，中性蛋白酶，半胱氨酸，亚硫酸钠，氯化钙，ε-多聚赖氨酸和硫胺酶解缢蛏，不仅能得到抗高血肽，不会破坏抗高血肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间；加入助溶剂水杨酸钠，硫代甜菜碱和二烯丙基二硫能抗高血肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率；析出剂硫酸铵，氯化钠和共轭亚油酸能使抗高血肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；制备的缢蛏抗高血肽纯度高，活性强，抗高血压作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗高血肽绿色安全，可放心用于抗高血压药物的生产。
具体实施例
下面通过实施例对本发明作进一步说明：
实施例1：
一种缢蛏抗高血肽的制备方法，具体操作步骤为：
1）酶解：将缢蛏用冰水冲洗2~4次，将泥沙和附着缢蛏表面的污渍和微生物清洗干净，沥干。在鼓风机中干燥，温度为50~70℃，干燥时间1~2h，用粉碎机粉碎，过100~400目筛，按料液体积比为1:20~1:30加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8 mol/L，水浴加热搅拌，用盐酸调节pH。加入复合酶制剂木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亚硫酸钠0.05~0.08份，氯化钙0.2~0.5份，ε-多聚赖氨酸0.02~0.04份和硫胺0.01~0.02份和助溶剂水杨酸钠4~12份，硫代甜菜碱0.5~1.5份和二烯丙基二硫0.1~0.3份。使用上述复合酶制剂酶解缢蛏不仅能得到抗高血肽，不会破坏抗高血肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间。加入助溶剂能抗高血肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解温度为50~60℃，pH为6.5~7.2，酶解时间为3~5h，离心取上清液，加入析出剂硫酸铵2~5份，氯化钠1~4份和共轭亚油酸0.4~0.8份，静置过滤得粗抗高血肽。上述析出剂能使抗高血肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；
2）超滤：在步骤1得到的抗高血肽中按体积比1:10~1:15加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8 mol/L，选用2500~3500Da的超滤膜进行超滤，压力为500~1000Pa；
3）制备缢蛏抗高血肽：将步骤2得到的超滤液过HPLC柱，固定相为ZrO2/SiO2，流动相为含0.0002~0.0004%双乙酸钠1.2~1.8 mol/L 的Tris—HCl缓冲液，收集含抗高血肽的洗脱液，旋转蒸发掉流动相留下缢蛏抗高血肽固体，冷冻干燥，研磨，得到缢蛏抗高血肽粉末。上述方法制备的缢蛏抗高血肽纯度高，活性强，抗高血压作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗高血肽绿色安全，可放心用于抗高血压药物的生产。
实施例2：
一种缢蛏抗高血肽的制备方法，最优选操作步骤为：
1）酶解：将缢蛏用冰水冲洗3次，将泥沙和附着缢蛏表面的污渍和微生物清洗干净，沥干。在鼓风机中干燥，温度为65℃，干燥时间1.5h，用粉碎机粉碎，过200目筛，按料液体积比为1:25加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.5 mol/L，水浴加热搅拌，用盐酸调节pH。加入复合酶制剂木瓜蛋白酶8份，中性蛋白酶6份，半胱氨酸0.6份，亚硫酸钠0.07份，氯化钙0.3份，ε-多聚赖氨酸0.02份和硫胺0.01份和助溶剂水杨酸钠9份，硫代甜菜碱1.0份和二烯丙基二硫0.3份。使用上述复合酶制剂酶解缢蛏不仅能得到抗高血肽，不会破坏抗高血肽的活性，而且酶解速度快，缩短反应时间。加入助溶剂能抗高血肽在Tris—HCl缓冲液中溶解度增加，提高抗高血肽的提取率。酶解温度为55℃，pH为7.0，酶解时间为4h，离心取上清液，加入析出剂硫酸铵3份，氯化钠2份和共轭亚油酸0.6份，静置过滤得粗抗高血肽。上述析出剂能使抗高血肽分子周围的水化膜减弱或消失，析出率高，而且杂质蛋白质和多肽的析出少；
2）超滤：在步骤1得到的抗高血肽中按体积比1:12加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.5mol/L，选用3000Da的超滤膜进行超滤，压力为800Pa；
3）制备缢蛏抗高血肽：将步骤2得到的超滤液过HPLC柱，固定相为ZrO2/SiO2，流动相为含0.0003%双乙酸钠1.5mol/L 的Tris—HCl缓冲液，收集含抗高血肽的洗脱液，旋转蒸发掉流动相留下缢蛏抗高血肽固体，冷冻干燥，研磨，得到缢蛏抗高血肽粉末。上述方法制备的缢蛏抗高血肽纯度高，活性强，抗高血压作用很好；使用酶解技术制备缢蛏抗高血肽绿色安全，可放心用于抗高血压药物的生产。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，本领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此，所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。

Claims (9)

1.一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于以下步骤：
酶解：将缢蛏清洗干净，干燥，粉碎，加Tris—HCl缓冲液，加热搅拌，加入复合酶制剂和助溶剂，继续搅拌，离心取上清液，加入析出剂，静置过滤得粗抗高血肽；
超滤：在步骤1得到的抗高血肽中加入Tris—HCl缓冲液，挑选超滤膜进行超滤；
制备缢蛏抗高血肽：将步骤2得到的超滤液过HPLC柱，收集含抗高血肽的洗脱液，旋转蒸发，冷冻干燥，研磨，得到缢蛏抗高血肽粉末。
2.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于：所述的复合酶制剂成份及其重量份为：木瓜蛋白酶6~12份，中性蛋白酶5~10份，半胱氨酸0.5~1.2份，亚硫酸钠0.05~0.08份，氯化钙0.2~0.5份，ε-多聚赖氨酸0.02~0.04份和硫胺0.01~0.02份。
3.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于：所述的助溶剂成份及其重量份为：水杨酸钠4~12份，硫代甜菜碱0.5~1.5份和二烯丙基二硫0.1~0.3份。
4.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中酶解温度为50~60℃，pH为6.5~7.2，酶解时间为3~5h。
5.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于：所述的析出剂成份及其重量份为：硫酸铵2~5份，氯化钠1~4份和共轭亚油酸0.4~0.8份。
6.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤2中按料液体积比为1:20~1:30加入Tris—HCl缓冲液，浓度为1.2~1.8 mol/L。
7.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤2选用2500~3500Da的超滤膜进行超滤。
8.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中固定相为ZrO2/SiO2。
9.根据权利要求1所述的一种缢蛏抗高血肽的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中流动相为含0.0002~0.0004%双乙酸钠的Tris—HCl缓冲液。
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