CN106636186B - 蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用 - Google Patents

蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用。所述蛋白质ZmVps29为氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质。所述籽粒性状为粒长，和/或，粒宽，和/或，粒长/粒宽。实验证明，在野生型拟南芥中过表达ZmVPS29基因，得到转ZmVps29基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转ZmVps29基因拟南芥的粒长增加和粒长/粒宽增加。实验还证明，在黄早四或郑58中过表达ZmVPS29基因，可以显著的减少10粒宽、增加10粒长/10粒宽和增加单穗产量，籽粒变为细长籽粒。因此，蛋白质ZmVps29在培育籽粒性状优良和/或植物产量高的植物中具有重要的理论意义和实用价值。

Description

蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用。
背景技术
玉米(Zea mays L.)是世界上重要的粮食、饲料和工业原料三元作物。随着世界人口的增加，对于粮食的需求与日俱增，进而对一系列主要粮食作物的产量提出了更高的要求。在可耕地面积的持续减少的情况下，选育单产突出的玉米新品种是稳定和提高玉米总产量最经济有效的途径。玉米总产量受单位面积有效穗数、穗粒数和粒重三个因素的影响，三者关系的协调是取得玉米高产的关键。作为产量构成因子之一的粒重相对最稳定且受环境条件的影响相对较小，历来被育种者所重视，因此提高玉米粒重是玉米高产育种的重要途径之一。玉米籽粒性状(如粒长，粒宽)是决定粒重的重要因子。因此，寻找与玉米籽粒性状相关的蛋白质对培育玉米新品种具有重要的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何使植物籽粒性状更优和如何提高植物产量。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和/或调控植物产量中的应用；所述籽粒性状可为d1)和/或d2)和/或d3)：d1)粒长/粒宽；d2)粒长；d3)粒宽。
上述应用中，所述蛋白质ZmVps29可为a1)或a2)或a3)：
a1)氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
a3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与植物籽粒性状和/或植物产量相关的蛋白质。
其中，序列表中序列2由188个氨基酸残基组成。
为了使a1)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。
表1标签的序列
上述a3)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述a3)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述a3)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子在调控植物籽粒性状和/或调控植物产量中的应用也属于本发明的保护范围；所述籽粒性状可为d1)和/或d2)和/或d3)：d1)粒长/粒宽；d2)粒长；d3)粒宽。
上述应用中，编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质ZmVps29的DNA分子；
b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质ZmVps29的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列1由567个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码所述蛋白质ZmVps29的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的所述蛋白质ZmVps29的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码所述蛋白质ZmVps29，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列表的序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质ZmVps29的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述应用中，所述调控植物籽粒性状可为植物籽粒性状优；所述籽粒性状优可体现为e1)和/或e2)和/或e3)：e1)粒长/粒宽大；e2)粒长长；e3)粒宽小。
上述应用中，所述调控植物产量可为增加植物产量。
为解决上述技术问题，本发明还提供了培育转基因植物的方法。
本发明所提供的培育转基因植物的方法，可包括将编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的产量增加和/或籽粒性状改变。
上述培育转基因植物的方法中，所述籽粒性状改变可为粒长/粒宽增加。
上述培育转基因植物的方法中，所述籽粒性状改变可为粒长增加。
上述培育转基因植物的方法中，所述籽粒性状改变可为粒宽减少。
上述方法中，编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子可为如下b1)或b2)或b3)或b4)所示的DNA分子：
b1)编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；
b2)核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；
b3)与b1)或(b2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述蛋白质ZmVps29的DNA分子；
b4)在严格条件下与(b1)或(b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述蛋白质ZmVps29的DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
其中，序列表中序列1由567个核苷酸组成，序列表中序列1的核苷酸编码序列表中序列2所示的氨基酸序列。
上述方法中，所述“将编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子导入受体植物中”可通过向受体植物中导入重组载体实现；所述重组载体可为向表达载体插入编码所述蛋白质ZmVps29的核酸分子得到的重组质粒。
所述重组载体具体可为重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29。所述重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29具体可为向载体pCAMBIA3301的限制性内切酶BglⅡ和PmlI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子得到的重组质粒。
为解决上述技术问题，本发明还提供了植物育种方法。
本发明所提供的植物育种方法，可包括如下步骤：增加植物中所述蛋白质ZmVps29的含量或活性，从而产量增加和/或籽粒性状改变。
上述植物育种方法中，所述籽粒性状改变可为粒长/粒宽增加。
上述植物育种方法中，所述籽粒性状改变可为粒长增加。
上述植物育种方法中，所述籽粒性状改变可为粒宽减少。
上述任一所述粒长/粒宽即粒长与粒宽的比值。
上述任一所述粒长/粒宽可为10粒长/10粒宽。
上述任一所述产量可为籽粒产量。所述籽粒产量可为单穗产量。
上述任一所述植物可为如下c1)至c10)中的任一种：c1)双子叶植物；c2)单子叶植物；c3)禾本科植物；c4)十字花科植物；c5)拟南芥；c6)野生型拟南芥；c7)玉米自交系黄早四；c8)玉米自交系旅28；c9)玉米自交系郑58；c10)玉米品种Hi-Ⅱ。
本发明还保护如序列表的序列3所示的分子标记甲或如序列表的序列4所示的分子标记乙。
本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别玉米籽粒性状的方法，该方法可包括如下步骤：检测待测玉米的基因组DNA中基于ZmVps29基因的启动子的基因型为P1纯合型还是P2纯合型；P1纯合型玉米的籽粒性状优于P2纯合型；所述籽粒性状优体现为e1)和/或e2)和/或e3)：e1)粒长/粒宽大；e2)粒长长；e3)粒宽小；P1纯合型指的是基因组DNA具有序列表中序列4所示的DNA分子且为纯合型；P2纯合型指的是基因组DNA具有序列表中序列3所示的DNA分子且为纯合型。
本发明还保护一种鉴别或辅助鉴别玉米产量的方法，该方法可包括如下步骤：检测待测玉米的基因组DNA中基于ZmVps29基因的启动子的基因型为P1纯合型还是P2纯合型；P1纯合型玉米的产量高于P2纯合型；P1纯合型指的是基因组DNA具有序列表中序列4所示的DNA分子且为纯合型；P2纯合型指的是基因组DNA具有序列表中序列3所示的DNA分子且为纯合型。
上述方法中，所述产量可为籽粒产量。所述籽粒产量可为单穗产量。
实验证明，在野生型拟南芥中过表达ZmVPS29基因，得到转ZmVps29基因拟南芥；与野生型拟南芥相比，转ZmVps29基因拟南芥的粒长增加和粒长/粒宽增加。实验还证明，在黄早四或郑58中过表达ZmVPS29基因，可以显著的减少10粒宽、增加10粒长/10粒宽和增加单穗产量，籽粒变为细长籽粒。因此，蛋白质ZmVps29在培育籽粒性状优良和/或植物产量高的植物中具有重要的理论意义和实用价值。
附图说明
图1为实施例3步骤一的实验结果。
图2为实施例3步骤二的实验结果。
图3为实施例4的实验结果。
图4为实施例5步骤二的实验结果。
图5为实施例5步骤三的实验结果。
图6为实施例5步骤四的实验结果。
图7为实施例5步骤五的实验结果。
图8为实施例6步骤二的实验结果。
图9为实施例6步骤三中1的实验结果。
图10为实施例6步骤四的实验结果。
图11为实施例6步骤四的实验结果。
图12为实施例6步骤五中1的实验结果。
图13为实施例6步骤五中1的实验结果。
图14为实施例6步骤五中2的实验结果。
图15为实施例6步骤五中2的实验结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
玉米自交系黄早四、玉米自交系旅28、玉米自交系郑58、玉米品种Hi-Ⅱ和玉米自交系B73均来源于国家种质资源库(网址为：http://www.cgris.net/)。公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人处)获得，以重复本实验。在下文中，玉米自交系黄早四简称黄早四或HZS或HZ4，玉米自交系旅28简称旅28或LV28，玉米自交系郑58简称郑58或Z58，玉米品种Hi-Ⅱ简称Hi-Ⅱ，玉米自交系B73简称B73。
TRIzol试剂和M-MLV均为Invitrogen公司的产品。pLB零背景快速克隆试剂盒为天根生化科技(北京)有限公司的产品，产品目录号为VT205-01。克隆载体pLB Vector为pLB零背景快速克隆试剂盒中的组件。
SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒为北京六合通经贸有限公司的产品，产品目录号为RR420A。2×SYBR Premix Ex Taq和50×ROX Reference Dye II均为SYBR Premix Ex TaqII试剂盒中的组件。
载体pGreen-GFP和载体pCAMBIA3301均记载于如下文献中：Lu M，Ying S，Zhang DF，et al.A maize stress-responsive NAC transcription factor，ZmSNAC1，confersenhanced tolerance to dehydration in transgenic Arabidopsis[J].Plant CellReports，2012，31(9):1701-1711.，公众可从中国农业科学院作物科学研究所(即申请人处)获得，以重复本实验。
酶解液：先将Cellase 0.3g、离析酶0.08g、甘露醇1.456g、KCl 0.03g和MES0.078g溶于20mL超纯水，调节pH值至5.7；然后55℃水浴10min；最后冷却至室温后，加入CaCl2 0.0294g、BSA 0.02g和β-巯基乙醇5μL。
W5溶液：将NaCl 9.0g、CaCl2 13.875g、2.5mL浓度为2M KCl水溶液和4mL pH5.7、0.5M MES缓冲液溶于适量超纯水，然后用超纯水定容至1L。
MMg溶液：将1.5mL浓度为1M的MgCl2水溶液、0.8mL pH5.7、0.5M MES缓冲液和7.3g甘露醇溶于适量超纯水，然后用超纯水定容至100mL。
40％PEG溶液：将PEG4000 40g、甘露醇3.64g、10mL浓度为1M的CaCl2水溶液溶于适量超纯水，然后用超纯水定容至100mL。
实施例1、ZmVps29基因的克隆
黄早四和旅28具有不同的籽粒性状：黄早四粒长较短，粒宽较大，表现为圆形籽粒；旅28粒长较长，粒宽较小，表现为细长籽粒；黄早四的粒长/粒宽远小于旅28的粒长/粒宽，二者的籽粒性状存在显著差异。本申请的发明人根据前期玉米籽粒性状主效QTL的挖掘与图位克隆等实验结果，推测玉米基因组中ZmVps29基因与玉米籽粒性状相关。克隆ZmVps29基因的步骤如下：
1、采用TRIzol试剂提取黄早四的幼嫩叶片组织的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到叶片组织的cDNA。
2、以步骤1得到的叶片组织的cDNA为模板，以F1：5’-ACTCggATCATggTgTgCAg-3’和R1：5’-CgCATgAACAggTAgAAAgCg-3’为引物进行PCR扩增，得到约721bp的PCR扩增产物。
3、按照pLB零背景快速克隆试剂盒说明书的步骤，将步骤2得到的PCR扩增产物和克隆载体pLB Vector连接，得到重组质粒pLB-ZmVps29-HZS。
对重组质粒pLB-ZmVps29-HZS进行测序。测序结果表明，重组质粒pLB-ZmVps29-HZS中含有序列表中序列1所示的DNA分子(以下命名为ZmVps29基因)，表达序列表中序列2所示的蛋白质(以下命名为ZmVps29蛋白或蛋白质ZmVps29)。
按照上述方法，将步骤1中的黄早四的幼嫩叶片组织替换为旅28的幼嫩叶片组织，其它步骤均不变，得到重组质粒pLB-ZmVps29-LV28。对重组质粒pLB-ZmVps29-LV28进行测序。测序结果表明，重组质粒pLB-ZmVps29-LV28中也含有序列表中序列1所示的ZmVps29基因，表达序列表中序列2所示的蛋白质ZmVps29。
上述结果表明，黄早四和旅28的基因组DNA中，均含有ZmVps29基因。
实施例2、ZmVps29基因的启动子的克隆
1、采用CTAB法提取处于三叶一心时期黄早四幼苗的叶片组织的基因组DNA，得到叶片组织的基因组DNA。
2、以步骤1得到的叶片组织的基因组DNA为模板，以F2：5’-CTCACCCCCACAAGTCAAGA-3’和R2：5’-CCGACCGAACCAAACAAACA-3’为引物进行PCR扩增，得到约2351bp的PCR扩增产物。
3、按照pLB零背景快速克隆试剂盒说明书的步骤，将步骤2得到的PCR扩增产物和克隆载体pLB Vector连接，得到重组质粒丙。
对重组质粒丙进行测序。结果表明，重组质粒丙中含有序列表中序列3所示的DNA分子。
按照上述方法，将步骤1中处于三叶一心时期的黄早四幼苗的叶片组织替换为处于三叶一心时期旅28幼苗的叶片组织，其它步骤均不变，得到重组质粒丁。对重组质粒丁进行测序。结果表明，重组质粒丁中含有序列表中序列4所示的DNA分子。
将序列表中序列3所示的DNA分子和序列表中序列4所示的DNA分子进行比对，结果表明，黄早四和旅28的基因组DNA中ZmVps29基因的启动子的核苷酸序列不同。推测ZmVps29基因的启动子的核苷酸序列不同造成蛋白质ZmVps29的表达量不同，进而形成不同的籽粒性状。
实施例3、表达模式分析
一、不同组织的表达模式
1、采用TRIzol试剂提取黄早四材料(黄早四处于三叶一心时期的根、黄早四处于三叶一心时期的茎、黄早四处于三叶一心时期的叶片、黄早四的雌穗、黄早四的雄穗、黄早四的穗位叶、黄早四的花丝或黄早四的籽粒)的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到黄早四材料的cDNA。黄早四材料的cDNA中，DNA浓度为500ng/μL。
2、以步骤1得到的黄早四材料的cDNA为模板，采用RT-PCR检测ZmVps29基因的表达量(以GAPDH基因作为内参基因)。
检测ZmVps29基因的引物为正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。检测GAPDH基因的引物为正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。
实验结果见图1(M为DNA marker，1为黄早四处于三叶一心时期的根，2为黄早四处于三叶一心时期的茎，3为黄早四处于三叶一心时期的叶片，4为黄早四的雌穗，5为黄早四的雄穗，6为黄早四的穗位叶，7为黄早四的花丝，8为黄早四的籽粒)。结果表明，黄早四的基因组DNA中ZmVps29基因为组成型表达基因，在上述黄早四各个组织中均表达。
按照上述方法，将黄早四替换为旅28，其它步骤均不变。结果表明，旅28的基因组DNA中ZmVps29基因为组成型表达基因，在旅28各个组织中均表达。
二、不同时期的玉米籽粒组织的表达模式
1、采用TRIzol试剂提取籽粒(黄早四自交授粉第6天的籽粒、黄早四自交授粉第12天的籽粒、黄早四自交授粉第18天的籽粒、黄早四自交授粉第24天的籽粒、旅28自交授粉第6天的籽粒、旅28自交授粉第12天的籽粒、旅28自交授粉第18天的籽粒或旅28自交授粉第24天的籽粒)的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到籽粒的cDNA。籽粒的cDNA中，DNA浓度为500ng/μL。
2、以步骤1得到的籽粒的cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒检测ZmVps29基因的相对表达量(以GAPDH基因作为内参基因)。
检测ZmVps29基因的引物为正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。检测GAPDH基因的引物为正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。
反应体系为20μL，由10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、0.4μL浓度为10μM的正向引物、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.4μL 50×ROX Reference Dye II、0.8μL黄早四籽粒的cDNA和8.0μL无核酸酶水组成。
荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40个循环；在95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec时收集溶解曲线，通过采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen，2001)分析籽粒的cDNA中ZmVps29基因的相对表达量。
以黄早四自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量作为1，其它籽粒的ZmVps29基因的相对表达量见图2(注：NS表示差异不显著，**表示差异极显著)。结果表明，旅28自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量显著高于黄早四自交授粉第6天的籽粒，旅28自交授粉第12天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量显著高于黄早四自交授粉第12天的籽粒，旅28自交授粉第18天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量显著高于黄早四自交授粉第18天的籽粒。可见，与黄早四相比，旅28表达的蛋白质ZmVps29较多。因此，蛋白质ZmVps29的表达量越高，则粒长越长，粒宽越小，粒长/粒宽越大。
实施例4、亚细胞定位分析
一、重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP的构建
1、以实施例1步骤3得到的重组质粒pLB-ZmVps29-HZS为模板，以F3：5’-TTTTCTAGACATGGTGCTTGTGCT-3’(下划线为限制性内切酶XbaI的识别位点)和R3：5’-TTTGATATCGCCGTGCATCGTC-3’(下划线为限制性内切酶EcoRⅤ的识别位点)为引物进行PCR扩增，得到约590bp的PCR扩增产物。
2、按照pLB零背景快速克隆试剂盒说明书的步骤，将步骤2得到的PCR扩增产物和克隆载体pLB Vector连接，得到重组质粒pLB-ZmVps29。
3、用限制性内切酶XbaI和EcoRⅤ双酶切重组质粒pLB-ZmVps29，回收约590bp的片段甲。
4、用限制性内切酶XbaI和EcoRⅤ双酶切载体pGreen-GFP，回收约5300bp的载体骨架甲。
6、将片段甲和载体骨架甲连接，得到重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP。
根据测序结果，对重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP进行结构描述如下：向载体pGreen-GFP的限制性内切酶XbaI和EcoRⅤ酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1自5’末端起第1位至第564位所示的DNA分子。
二、亚细胞定位分析
1、制备玉米原生质体
(1)取B73的种子，置于培养箱，25℃黑暗培养7-10天，得到玉米幼苗。
(2)先切下步骤(1)得到的玉米幼苗第二片叶子的中间部分，然后切割成0.5mm×0.5mm小块，将这些小块命名为玉米组织。
(3)将步骤(2)得到的玉米组织置于锥形瓶，加入20mL酶解液；然后用锡箔纸包裹锥形瓶，抽真空30min(15个大气压)；最后置于摇床上，先25℃、40rpm振荡培养3-4h，再25℃、80rpm振荡培养5min，得到消化液。
(4)取步骤(3)得到的消化液，用尼龙网过滤，得到滤液。
(5)取步骤(4)得到的滤液，1000rpm离心2min(离心机设置为缓慢升降速模式)，弃上清，将沉淀用W5溶液洗涤1-2次，即为制备的玉米原生质体。
2、转化
(1)取步骤1中(5)制备的玉米原生质体，加入适量的W5溶液，然后置于冰上放置30min；离心弃上清，向沉淀中加入适量MMg溶液进行重悬，得到原生质体浓度为5×105个/mL的原生质体溶液。
(2)将190μL原生质体溶液、10μL的重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP(约15-20μg重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP)和200μL浓度为40％PEG溶液轻轻混匀，25℃静置18min；然后加入1.6mL W5溶液，轻轻混匀，1000rpm离心1min，弃上清，将沉淀用W5溶液洗涤1-2次。
(3)完成步骤(2)后，取所述原生质体，加入1.6mL W5溶液，置于细胞培养板中暗培养12-24h；然后置于载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察
按照上述方法，将重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP替换为载体pGreen-GFP，其它步骤均不变，在共聚焦显微镜下观察，作为对照。
实验结果见图3(A为载体pGreen-GFP，其中左上为红光下视野，左下为红光和绿光叠加下视野，右上为绿光下视野，右下为白光下视野；B为重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP，其中左上为红光下视野，左下为红光和绿光叠加下视野，右上为绿光下视野，右下为白光下视野)：载体pGreen-GFP转化玉米原生质体后，在细胞核、细胞质和细胞膜上均可观察到绿色荧光；重组质粒ZmVps29-pGreen-GFP转化玉米原生质体后，仅在细胞膜上观察到绿色荧光。因此，蛋白质ZmVps29定位在细胞膜。
实施例5、转基因拟南芥的获得及鉴定
一、重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29、GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29和GV3101/pCAMBIA3301的获得
1、重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29的获得
(1)以实施例1步骤3得到的重组质粒pLB-ZmVps29-HZS为模板，以F4：5’-ccccAGATCTAATGGTGCTTGTGCTTGCGCT-3’(下划线为限制性内切酶BglⅡ的识别位点)和R4：5’-ttttCACGTGCTAGCCGTGCATCGTCGCAG-3’(下划线为限制性内切酶PmlI的识别位点)为引物进行PCR扩增，得到约590bp的PCR扩增产物。
(2)按照pLB零背景快速克隆试剂盒说明书的步骤，将步骤(1)得到的PCR扩增产物和克隆载体pLB Vector连接，得到中间质粒。
(3)用限制性内切酶BglⅡ和PmlI双酶切中间质粒，回收约590bp的片段乙。
(4)用限制性内切酶BglⅡ和PmlI双酶切载体pCAMBIA3301，回收约9000bp的载体骨架乙。
(5)将片段乙和载体骨架乙连接，得到重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29。
根据测序结果，对重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29进行结构描述如下：向载体pCAMBIA3301的限制性内切酶BglⅡ和PmlI酶切位点之间插入核苷酸序列是序列表中的序列1所示的DNA分子。
2、GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29的获得
将重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29。
3、GV3101/pCAMBIA3301的获得
将载体pCAMBIA3301导入根癌农杆菌GV3101，得到重组农杆菌，命名为GV3101/pCAMBIA3301。
二、转基因拟南芥的获得
哥伦比亚生态型拟南芥为Arabidopsis Biological Resource Center的产品，详见网址http://abrc.osu.edu/。在下文中，哥伦比亚生态型拟南芥简称为野生型拟南芥或WT。
1、采用拟南芥花序浸花转化法(Clough，S.J.，andBent，A.F..Floraldip:asimplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsisthaliana.Plant J.(1998)16，735-743.)，将步骤一中2制备的GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29转至野生型拟南芥中，获得T1代转ZmVps29基因拟南芥的种子。
2、将T1代转ZmVps29基因拟南芥的种子种植于营养土中，25℃培养4周，然后喷施Basta筛选，能够正常生长的拟南芥(抗性苗)即为T1代转ZmVps29基因阳性苗。T1代转ZmVps29基因阳性苗收到的种子即为T2代转ZmVps29基因拟南芥的种子。
3、将步骤2筛选出的不同株系的T2代转ZmVps29基因拟南芥的种子播种于含7mg/L草铵膦(phosphinothricin，PPT)的MS培养基上进行筛选，如果某株系中能够正常生长的拟南芥(抗性苗)的数目与不能够正常生长的拟南芥(非抗性苗)的数目比例为3：1，则该株系为ZmVps29基因插入一个拷贝的株系，该株系中的抗性苗收到的种子即为T3代转ZmVps29基因拟南芥的种子。
4、将步骤3筛选出的T3代转ZmVps29基因拟南芥的种子再次播种于含7mg/L PPT的MS培养基上进行筛选，均为抗性苗的即为T3代纯合转ZmVps29基因拟南芥。将其中13个T3代纯合转ZmVps29基因拟南芥的株系依次命名为OE12-1至OE12-13，并进行后续实验。
T1代转ZmVps29基因拟南芥的Basta筛选具体见图4(A和B均为喷施Basta前，C为喷施Basta后)。
按照上述方法，将GV3101/pCAMBIA3301-ZmVps29替换为GV3101/pCAMBIA3301，其它步骤均相同，得到T3代纯合转空载体拟南芥的植株，简称转空载体拟南芥。
三、分子鉴定
1、分别取OE12-1至OE12-13的T3代种子，种植于营养土中，25℃培养4周，得到OE12-1至OE12-13的幼苗。
2、分别提取OE12-1至OE12-13的幼苗的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用F4：5’-ccccAGATCTAATGGTGCTTGTGCTTGCGCT-3’和R4：5’-ttttCACGTGCTAGCCGTGCATCGTCGCAG-3’组成的引物对1进行PCR扩增，然后进行电泳。
3、分别提取OE12-1至OE12-13幼苗的叶片的基因组DNA并以其作为模板，采用F6：5’-GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC-3’和R6：5’-GTCTGCACCATCGTCAACC-3’组成的引物对2进行PCR扩增，然后进行电泳。
按照上述方法，将OE12-1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为水，其它步骤均相同，作为阴性对照。
按照上述方法，将OE12-1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为转空载体拟南芥的幼苗的叶片的基因组DNA，其它步骤均相同，作为对照。
按照上述方法，将OE12-1的幼苗的叶片的基因组DNA替换为重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29，其它步骤均相同，作为阳性对照。
部分实验结果见图5(A为采用引物对1的PCR扩增结果，B为采用引物对2的PCR扩增结果；其中M为DNA Marker，泳道1-10为OE12-1至OE12-10)。结果表明，以OE12-1至OE12-13的幼苗的叶片的基因组DNA或重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29为模板，采用引物对1均能扩增得到587bp的条带，采用引物对2均能扩增得到444bp的条带；以水或转空载体拟南芥的幼苗的叶片的基因组DNA为模板，采用引物对1均不能扩增得到587bp的条带，采用引物对2均不能扩增得到444bp的条带。
经过分子鉴定，OE12-1至OE12-13均为转ZmVps29基因拟南芥。
四、检测转ZmVps29基因拟南芥的cDNA中ZmVps29基因的相对表达量
1、采用TRIzol试剂提取拟南芥幼苗(野生型拟南芥幼苗、转空载体拟南芥幼苗、OE12-1的幼苗、OE12-2的幼苗、OE12-3的幼苗、OE12-4的幼苗、OE12-6的幼苗、OE12-7的幼苗、OE12-8的幼苗、OE12-9的幼苗、OE12-11的幼苗或OE12-13的幼苗)的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到拟南芥幼苗的cDNA。拟南芥幼苗的cDNA中，DNA浓度为500ng/μL。
2、以步骤1得到的拟南芥幼苗的cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒检测拟南芥幼苗的ZmVps29基因的相对表达量(以Actin基因作为内参基因)。
检测ZmVps29基因的引物为F4：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和R4：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。检测Actin基因的引物为正向引物6：5’-AGGTATCGCTGACCGTATGAG-3’和反向引物6：5’-GCTGAGGGAAGCAAGAATG-3’。
反应体系为20μL，由10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、0.4μL浓度为10μM的正向引物、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.4μL 50×ROX Reference Dye II、0.8μL拟南芥幼苗的cDNA和8.0μL无核酸酶水组成。
荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40个循环；在95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec时收集溶解曲线，通过采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen，2001)分析拟南芥幼苗的cDNA中ZmVps29基因的相对表达量。
各个拟南芥幼苗的cDNA中ZmVps29基因的相对表达量见图6(WT为野生型拟南芥幼苗)。结果表明，OE12-1的幼苗、OE12-2的幼苗、OE12-3的幼苗、OE12-4的幼苗、OE12-6的幼苗、OE12-7的幼苗、OE12-8的幼苗、OE12-9的幼苗、OE12-11的幼苗和OE12-13的幼苗的cDNA中ZmVps29基因均有一定程度的表达，野生型拟南芥幼苗和转空载体拟南芥幼苗的cDNA中均没有ZmVps29基因的表达。
五、转ZmVps29基因拟南芥的籽粒性状的鉴定
实验重复三次取平均值，每次重复的步骤如下：分别将野生型拟南芥种子、转空载体拟南芥种子、OE12-1的T3代种子、OE12-2的T3代种子、OE12-3的T3代种子、OE12-4的T3代种子、OE12-6的T3代种子、OE12-7的T3代种子、OE12-8的T3代种子、OE12-9的T3代种子、OE12-11的T3代种子和OE12-13的T3代种子种植于营养土中，25℃培养至成熟，收获种子。将收获的种子置于40倍体视镜下拍照，利用Image J软件测量种子的粒长和粒宽，并计算粒长/粒宽。
部分实验结果见图7(WT为野生型拟南芥)和表2：转ZmVps29基因拟南芥的种子为细长籽粒，均表现为粒长增加、粒长/粒宽增加，大部分籽粒的粒宽增加；野生型拟南芥种子和转空载体拟南芥种子的粒长、粒宽和粒长/粒宽无显著差异；与野生型拟南芥种子相比，OE12-8的T3代种子、OE12-6的T3代种子、OE12-9的T3代种子和OE12-11的T3代种子的粒长和粒宽均有显著差异、粒长/粒宽无显著差异，E12-1的T3代种子、OE12-2的T3代种子和OE12-7的T3代种子的粒长、粒宽和粒长/粒宽均有显著差异，OE12-3的T3代种子、OE12-4的T3代种子和OE12-13的T3代种子的粒长和粒长/粒宽均有显著差异。
表2
拟南芥 粒长/粒宽 P值 粒长 P值 粒宽 P值
WT 1.732 无 93.885 无 54.412 无
OE12-8 1.733 NS 108.940 ** 63.071 **
OE12-6 1.746 NS 107.880 ** 61.925 **
OE12-9 1.778 NS 111.630 ** 63.078 **
OE12-11 1.783 NS 101.470 ** 57.178 **
OE12-2 1.784 * 104.110 ** 58.596 **
OE12-1 1.798 * 105.020 ** 58.639 **
OE12-7 1.804 ** 105.490 ** 58.691 **
OE12-4 1.843 ** 101.960 ** 55.560 NS
OE12-13 1.875 ** 103.940 ** 55.729 NS
OE12-3 1.913 ** 101.680 ** 53.434 NS
注：NS表示P＞0.05，即差异不显著；*表示0.01＜P≤0.05，即差异显著；**表示P≤0.01，差异极显著。
上述结果表明，蛋白质ZmVps29可调控拟南芥籽粒的性状。
实施例6、转基因玉米的获得及鉴定
一、重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29和EHA105/pCAMBIA3301-ZmVps29的获得
1、重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29的获得
同实施例4步骤一中1。
2、EHA105/pCAMBIA3301-ZmVps29的获得
将重组质粒pCAMBIA3301-ZmVps29导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌，命名为EHA105/pCAMBIA3301-ZmVps29。
二、T0代转ZmVps29基因玉米的获得
采用农杆菌侵染玉米幼胚的转化方法，将步骤一中2制备的EHA105/pCAMBIA3301-ZmVps29转至Hi-Ⅱ中，获得T0代拟转ZmVps29基因玉米。在T0代拟转ZmVps29基因玉米的叶片上涂抹Basta，叶片能够正常生长的植株(抗性苗)即为T0代转ZmVps29基因玉米。
T0代拟转ZmVps29基因玉米的Basta筛选具体见图8(左图为玉米叶片能够正常生长，右图为玉米叶片不能够正常生长)。
将得到三个T0代转ZmVps29基因玉米分别命名为ZmVPS12-1、ZmVPS12-2和ZmVPS12-3。
三、T1代转ZmVps29基因玉米的获得
1、T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的获得
(1)采集ZmVPS12-1的花粉，与黄早四进行杂交，得到T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1。
(2)分别提取T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的叶片的基因组DNA并以其作为模板，以F7：5’-CCTTCGCAAGACCCTTCCTC-3’和R7：5’-TCGCCGTCAATCAGCTCGTA-3’为引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，然后进行如下判断：如果能够获得584bp的PCR扩增产物，则相应的T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1；如果不能获得584bp的PCR扩增产物，则相应的T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1为T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1。
部分实验结果见图9(M为DNA Marker，泳道1-75为75个T1代拟转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1。采用上述方法可以得到T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1和T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1。
2、T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2的获得
按照步骤1的方法，将“ZmVPS12-1的花粉”替换为“ZmVPS12-2的花粉”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2和T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2。
3、T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的获得
按照步骤1的方法，将“ZmVPS12-1的花粉”替换为“ZmVPS12-3的花粉”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3和T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3。
4、T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ的获得
采集Hi-Ⅱ的花粉，与黄早四进行杂交，得到T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ。
5、T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1的获得
按照步骤1的方法，将“黄早四”替换为“郑58”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1和T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1。
6、T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2的获得
按照步骤1的方法，将“黄早四”替换为“郑58”且将“ZmVPS12-1的花粉”替换为“ZmVPS12-2的花粉”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2和T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2。
7、T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的获得
按照步骤1的方法，将“黄早四”替换为“郑58”且将“ZmVPS12-1的花粉”替换为“ZmVPS12-3的花粉”，其它步骤均不变，得到T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3和T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3。
8、T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ的获得
采集Hi-Ⅱ的花粉，与郑58进行杂交，得到T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ。
四、检测T1代转ZmVps29基因玉米中的ZmVps29基因的相对表达量
1、玉米材料的获得
(1)随机取5株T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1，进行如下操作：分别取旗叶，混合，得到黄早四*ZmVPS12-1的叶片材料；分别取自交授粉第6天的籽粒，混合，得到黄早四*ZmVPS12-1的籽粒材料。
(2)按照步骤(1)的方法，将T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1替换为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2，其它步骤均不变，得到黄早四*ZmVPS12-2的叶片材料和黄早四*ZmVPS12-2的籽粒材料。
(3)按照步骤(1)的方法，将T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1替换为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3，其它步骤均不变，得到黄早四*ZmVPS12-3的叶片材料和黄早四*ZmVPS12-3的籽粒材料。
(4)按照步骤(1)的方法，将T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1替换为T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ，其它步骤均不变，得到黄早四*Hi-Ⅱ的叶片材料和黄早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料。
2、采用TRIzol试剂提取玉米材料(黄早四*ZmVPS12-1的叶片材料、黄早四*ZmVPS12-1的籽粒材料、黄早四*ZmVPS12-2的叶片材料、黄早四*ZmVPS12-2的籽粒材料、黄早四*ZmVPS12-3的叶片材料、黄早四*ZmVPS12-3的籽粒材料、黄早四*Hi-Ⅱ的叶片材料或黄早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料)的总RNA，将该总RNA用M-MLV反转录出第一链cDNA，得到玉米材料的cDNA。玉米材料的cDNA中，DNA浓度为500ng/μL。
3、以步骤2得到的玉米材料的cDNA为模板，使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂盒检测玉米材料的ZmVps29基因的相对表达量(以GAPDH基因作为内参基因)。
检测ZmVps29基因的引物为正向引物1：5’-CTTTGCCCTGATCTCCATATTACC-3’和反向引物1：5’-CACGCCTCCCTCGTGCTTAT-3’。检测GAPDH基因的引物为正向引物2：5’-CCCTTCATCACCACGGACTAC-3’和反向引物2：5’-TCCCACCACGGTTCTTCCAA-3’。
反应体系为20μL，由10μL 2×SYBR Premix Ex Taq、0.4μL浓度为10μM的正向引物、0.4μL浓度为10μM的反向引物、0.4μL 50×ROX Reference Dye II、0.8μL拟南芥幼苗的cDNA和8.0μL无核酸酶水组成。
荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性1min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸31sec，40个循环；在95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸15sec时收集溶解曲线，通过采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen，2001)分析玉米材料的ZmVps29基因的相对表达量。
以黄早四*Hi-Ⅱ的叶片材料的ZmVps29基因的相对表达量作为1，其它叶片材料的相对表达量见图10(WT为黄早四*Hi-Ⅱ的叶片材料，ZmVPS12-1为黄早四*ZmVPS12-1的叶片材料，ZmVPS12-2为黄早四*ZmVPS12-2的叶片材料，ZmVPS12-3为黄早四*ZmVPS12-3的叶片材料)。以黄早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料的ZmVps29基因的相对表达量作为1，其它籽粒材料的相对表达量见图11(WT为黄早四*Hi-Ⅱ的籽粒材料，ZmVPS12-1为黄早四*ZmVPS12-1的籽粒材料，ZmVPS12-2为黄早四*ZmVPS12-2的籽粒材料，ZmVPS12-3为黄早四*ZmVPS12-3的籽粒材料)。
结果表明，T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1、T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2或T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的叶片或自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量均显著高于T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ。
按照上述方法，将“T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1”替换为“T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1”，将“T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2”替换为“T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2”，将“T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3”替换为“T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3”，将“T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ”替换为“T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ”，其它步骤均不变，得到各个玉米材料的相对表达量。结果表明，T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1、T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2或T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的叶片或自交授粉第6天的籽粒的ZmVps29基因的相对表达量均显著高于T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ。
五、籽粒性状的鉴定
1、测量待测果穗上种子的10粒长(cm)和10粒宽(cm)。待测果穗为步骤三中1得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中1得到的T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中2得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中2得到的T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中3得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的果穗、步骤三中3得到的T1代未转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的果穗、步骤三中5得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中5得到的T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中6得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中6得到的T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中7得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的果穗或步骤三中7得到的T1代未转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的果穗。
部分实验结果图12和图13。
2、测量待测果穗上种子的10粒长(cm)、10粒宽(cm)、10粒长/10粒宽和单穗产量(g)。待测果穗为步骤三中1得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中2得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中3得到的T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3的果穗、步骤三中4得到的T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ的果穗、步骤三中5得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1的果穗、步骤三中6得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2的果穗、步骤三中7得到的T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3的果穗或步骤三中8得到的T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ的果穗。
实验结果见图14(左上为10粒长，右上为10粒宽，左下为10粒长/10粒宽，右下为单穗产量；WT为T1代未转ZmVps29基因的黄早四*Hi-Ⅱ，ZmVPS12-1为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-1，ZmVPS12-2为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-2，ZmVPS12-3为T1代转ZmVps29基因的黄早四*ZmVPS12-3)和图15(左上为10粒长，右上为10粒宽，左下为10粒长/10粒宽，右下为单穗产量；WT为T1代未转ZmVps29基因的郑58*Hi-Ⅱ，ZmVPS12-1为T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-1，ZmVPS12-2为T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-2，ZmVPS12-3为T1代转ZmVps29基因的郑58*ZmVPS12-3)。
上述结果表明，在黄早四或郑58中过表达ZmVPS29基因，可以显著的减少10粒宽、增加10粒长/10粒宽和增加单穗产量，籽粒变为细长籽粒。因此，蛋白质ZmVps29可调控玉米籽粒的性状和单穗产量。
<110> 中国农业科学院作物科学研究所
<120> 蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和产量中的应用
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 567
<212> DNA
<213> 玉米Zea mays L.
<400> 1
atggtgcttg tgcttgcgct gggggatctg cacatcccgc accgggcgcc cgacctcccc 60
gccaaattca agtccatgct cgtgcccggc aagatccaac acatcatctg cactggcaat 120
ctctgcatca aggaagtcca tgactacctg aaaagccttt gccctgatct ccatattacc 180
agaggtgaac atgatgagga tgctcgatac ccagagacta agacacttac aattggtcag 240
tttaagcttg ggctgtgcca tggccatcag gttgttccat ggggcgacct ggactccctg 300
gcgatgctcc agcggcagct ggacgtggac atcctggtga ccgggcacac gcaccagttc 360
aaggcatata agcacgaggg aggcgtggtg atcaaccctg gctctgccac gggcgcctac 420
agcagcatca cttacgacgt gaacccaagc tttgtgctga tggacatcga cgggctccgt 480
gtggtggtgt acgtctacga gctgattgac ggcgaggtga aggtggacaa aatcgacttc 540
aagaagactg cgacgatgca cggctag 567
<210> 2
<211> 188
<212> PRT
<213> 玉米Zea mays L.
<400> 2
Met Val Leu Val Leu Ala Leu Gly Asp Leu His Ile Pro His Arg Ala
1 5 10 15
Pro Asp Leu Pro Ala Lys Phe Lys Ser Met Leu Val Pro Gly Lys Ile
20 25 30
Gln His Ile Ile Cys Thr Gly Asn Leu Cys Ile Lys Glu Val His Asp
35 40 45
Tyr Leu Lys Ser Leu Cys Pro Asp Leu His Ile Thr Arg Gly Glu His
50 55 60
Asp Glu Asp Ala Arg Tyr Pro Glu Thr Lys Thr Leu Thr Ile Gly Gln
65 70 75 80
Phe Lys Leu Gly Leu Cys His Gly His Gln Val Val Pro Trp Gly Asp
85 90 95
Leu Asp Ser Leu Ala Met Leu Gln Arg Gln Leu Asp Val Asp Ile Leu
100 105 110
Val Thr Gly His Thr His Gln Phe Lys Ala Tyr Lys His Glu Gly Gly
115 120 125
Val Val Ile Asn Pro Gly Ser Ala Thr Gly Ala Tyr Ser Ser Ile Thr
130 135 140
Tyr Asp Val Asn Pro Ser Phe Val Leu Met Asp Ile Asp Gly Leu Arg
145 150 155 160
Val Val Val Tyr Val Tyr Glu Leu Ile Asp Gly Glu Val Lys Val Asp
165 170 175
Lys Ile Asp Phe Lys Lys Thr Ala Thr Met His Gly
180 185
<210> 3
<211> 2351
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 3
ctcaccccca caagtcaaga acaggtacca caggatgagg cgcatggagg atgctgcgat 60
gtgttcgtga gaggtctagg ccgtcgtctc ctagtcaact ttgggttgct ggatcgttgt 120
ctccttacca tgtaattatt tatttatttt gtacagaact cctattatat agtaaagtta 180
ttacattcat ttctgtacca tgatttatca tatgtgtgag acttggtccc agcacacctg 240
gtgattatgt tcgcgcctgg gtccctaaaa ctcgagtgtg acagagggcg tgcggagatg 300
gccggaaaac gcgtgaacgt ggacgcatcc acgatggggg cgtgggtggg aggttaggga 360
cgaggtctga cgggtgggtc cgcaggacag agagagagga tgagcgcgtg cgaggggatc 420
agcaccgaca ggccgacccc acagagcaca gagagagaga gaaggggtgc gtgggctggc 480
gccgataggc cgggtccgtc tgtccgactt gggctgaaat ggttttttct atttttcagg 540
gaatttctag tgtttttcta tttatgttct ctagggtttt gaattcaaat tcaaactaaa 600
tcaaacatgt gcaacaattt aaaaaatatt tggagctcag cacgatgcaa catttcatga 660
ctcatattat tttgacaaaa taaaataatc aacccctcac taattaagct aattctacta 720
aaaagaaaaa gagagagaaa ctagagagag aggagtaaca cctgaatttg gtaggtaatt 780
agaaagaaat tttatacccc caaatttagg gtgttacaac ctctgcggac aaggcaaaat 840
gcgcagttat ttgaaaggaa tattcgaacc aaggttcgat ctaccacggc cacggcccgc 900
cggcggcggc ggcacgcgcg tgtgtggtcg tctttcattc ttttcccaac ttcttaatag 960
atgcaccaat tggtgcacct atttaagttg attgattgat ctcttaaact tacaatatgg 1020
tactaaatta ttagtacacc atatcattaa agtggaccac tagcattgac tattattgaa 1080
tattaattgg gccaagccaa cattaatcca atataaacaa tgataattag gtaatatttt 1140
gaataatatg gatgacataa atcttgaaaa tataggatac atggagatta tgtattgaac 1200
ttgagaaatc tatagacaga gtttctgaat tgaactaggt aaatctgtaa acgggaatac 1260
tgaattatac tccctctctt tagaaaatta acaaattctt acaatacttg atgtatgtat 1320
tatatatatg tgtatagatt tattatcatt catttgaata tagacataaa accaagatct 1380
aaaacgaata ctattttaga cggagagagt atagatttgt aagaatctat ttagctgatg 1440
tatcctttca gttaggattc aatttttttt taataggagg attcaaattt tttgatagta 1500
catctagatt ctagaccgtc gatctttcaa acgttgaaaa gaggaagaag agcttgacgt 1560
tttgcttagc ttaacgctag cccaacgaac ttggcgaaac cgatggagcc tcaaacgggc 1620
cgtatccgtc gtgcacagca tgctaaagcc cagtgctgac gacgacgaac aacactcatc 1680
cggcccggtc atgagcccaa tgcggggcca cttcgtcgtt tttgacaagt agacccacag 1740
tggccccacg tgcttgcccc tccctttctc ttctcccctt gtgtcgcgct cgcgcatctg 1800
aagcaagggg gggaagggcc aagggggatc ggtcttgttc tcggagaggg ttgagctgct 1860
tgacggtttt gactcggatc atggtgtgca gctctatcag atagagagct gacgtgaggt 1920
gtgagacgcg gatcgtggag tactactcag taggagaggt ggggaggggg aagaaggcga 1980
tagccgggga ggatggtgct tgtgcttgcg ctgggggatc tgcacatccc gcaccgggcg 2040
cccgacctcc ccgccaaatt caagtccatg ctcgtgcccg gcaagatcca acacatcatc 2100
tgcactggca atctctgcat caaggtaacc ttaccttccg cgcctggccg gccggccggg 2160
taaccggcgt ccctcggcga tcgattttac aatcctttcc tctcgcctca tgtgtccaat 2220
ttttgcgctg gctaggtcgt actgccgcgg atagttgcat cacgtgagaa atcgttatgg 2280
ttcttaggtc gtgctgggat cagccgcatc gctgtattag tctactgcag ttgtttgttt 2340
ggttcggtcg g 2351
<210> 4
<211> 2367
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223>
<400> 4
ctcaccccca caagtcaaga acaggtacca caggatgagg cgcatggagg atgctgcgat 60
gtgttcgtga gaggtctagg ccgtcgtctc ctagtcaact ttgggttgat ggatcgttgt 120
ctccttacca tgtatttatt tatttatttt gtacagaact cctattatat agtaaagtta 180
ttacattcgt ttctgtacca tgatttatca tatgtgtgag acttggtccc agcgcacctg 240
gtgattatgt tcgcgcccgg gtccctaaaa cccgagtgtg acagagggcg tgcggagatg 300
gccggaaaac gcgtgaacgt ggacgcatcc acgatggggg cgtgggtggg aggttaggga 360
cgaggtctga cgggtgggtc cgcagggcag agagagagga tgagcgcgtg cgaggggatc 420
agcaccgaca ggccgacccc acagagcaga gagagagaga gagaaggggt gcgtgggctg 480
gcgccgatag gccgggtccg tctgtccgac ttgggctgaa atggtttttt ctatttttca 540
gggaatttct aatgtttttc tatttatgtt ctctagggtt ttgaattcaa attcaaacta 600
aatcaaacat gtgcaacaat ttaaaaaata tttggagctc accacgatgc aacatttcat 660
gactcatatt gttttgacaa aataaaataa tcaacccctc actaattaag ctaattctac 720
taaaaagaaa aagagagaga aactagagag agaggagtaa cacctgaatt tggtaggtaa 780
ttagaaagaa attttatacc cccaaattta gggtgttaca acctctgcgg acaaggcaaa 840
atgcgcagtt atttgaaagg aatattcgaa ccaaggttcg atctaccacg gccacggccc 900
gccggcggcg gcggcacgcg cgcgtgtggt cgtttttcat tcttttccca acttcttaat 960
agatgcacca attggtgcac ctatttaagt tgattgattg atctcttgaa cttacaatat 1020
gatactaaat tattagtata ccatatcatt aaagtggacc actagcattg actattattg 1080
aatattaatt gggccaagcc aacattaatc caatataaac aatgataatt aggtaatatt 1140
ttgaataata tggatggcat aaatcttgaa aatataggat acatggagat tatgtattga 1200
acttgagaaa tctatagaca gagtttctga attgaactag gtaaatctgt aaacgggaat 1260
actgaattat actccctctc tttagaaaat taacaaattc ttacaatact tgatgtatgt 1320
attatatata tgtgtataga tttattatca ttcatttgaa tatagacata aaaaccaaga 1380
tctaaaacga atactatttt agacggagag agtatagatt tgtaagaatc tatttagctg 1440
atgtatcctt tcagttagga ttcaattttt ttttaatagg aggattcaaa ttttttgata 1500
gtacatctag attctagacc gtcgatcttt caaacgttga aaagaggaag aagagcttga 1560
cgttttgctt agcttaacgc tagcccaacg aacttggcga aaccgatgga gcctcaaacg 1620
ggccgtatcc gtcgtgcaca gcatgctaaa gcccagtgct gacgacgacg aacaacactc 1680
atccggcccg gtcatgagcc caatgcgggg ccacttcgtc gtttttgaca agtagaccca 1740
cagtggcccc acgtgcttgc ccctcccttt ctcttctccc cttgtgtcgc gctcgcgcat 1800
ctgaagcaag ggggggaagg gccaaggggg atcggtcttg ttctcggaga gggttgagct 1860
gcttgacggt tttgactcgg atcatggtgt gcagctctat cagatagaga gctgacgtga 1920
ggtgtgagac gcggatcgtg gagtactact cagtaggaga tcaagaggaa ggaggtgggg 1980
agggggaaga aggcgatagc cggggaggat ggtgcttgtg cttgcgctgg gggatctgca 2040
catcccgcac cgggcgcccg acctccccgc caaattcaag tccatgctcg tgcccggcaa 2100
gatccaacac atcatctgca ctggcaatct ctgcatcaag gtaaccttac cttccgcgcc 2160
tggccggccg gccgggtaac cggcgtccct cggcgatcga ttttacaatc ctttcctctc 2220
gcctcatgtg tccaattttt gcgctggcta ggtcgtactg ccgcggatag ttgcatcacg 2280
tgagaaatcg ttatggttct taggtcgtgc tgggatcagc cgcatcgctg tattagtcta 2340
ctgcagttgt ttgtttggtt cggtcgg 2367

Claims (9)

1.蛋白质ZmVps29在调控植物籽粒性状和/或调控植物产量中的应用；所述籽粒性状为d1）和/或d2）和/或d3）：d1）粒长/粒宽；d2）粒长；d3）粒宽；
所述蛋白质ZmVps29为a1）或a2）：
a1）氨基酸序列是序列表中序列2所示的蛋白质；
a2) 在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；
所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
2.编码权利要求1所述应用中所述蛋白质ZmVps29的核酸分子在调控植物籽粒性状和/或调控植物产量中的应用；所述籽粒性状为d1）和/或d2）和/或d3）：d1）粒长/粒宽；d2）粒长；d3）粒宽；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述调控植物籽粒性状为植物籽粒性状优；所述籽粒性状优体现为e1）和/或e2）和/或e3）：e1）粒长/粒宽大；e2）粒长长；e3）粒宽小；所述调控植物产量为增加植物产量。
4.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物；所述单子叶植物为禾本科植物。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥；所述单子叶植物为玉米自交系黄早四、玉米自交系旅28、玉米自交系郑58或玉米品种Hi-Ⅱ。
6.一种培育转基因植物的方法，包括将编码权利要求1所述应用中所述蛋白质ZmVps29的核酸分子导入受体植物中，得到转基因植物的步骤；与所述受体植物相比，所述转基因植物的产量增加和/或籽粒性状改变；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
7.一种植物育种方法，包括如下步骤：增加植物中权利要求1所述应用中所述蛋白质ZmVps29的含量或活性，从而产量增加，和/或，粒长/粒宽增加；所述植物为双子叶植物或单子叶植物。
8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为十字花科植物；所述单子叶植物为禾本科植物。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述十字花科植物为拟南芥；所述单子叶植物为玉米自交系黄早四、玉米自交系旅28、玉米自交系郑58或玉米品种Hi-Ⅱ。
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Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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NP_001147749.1;Schnable PS等;《Genbank》;20151227;全文相关 *
Retromer Subunits VPS35A and VPS29 Mediate Prevacuolar Compartment (PVC) Function in Arabidopsis;Tomasz Nodzyński等;《Molecular Plant》;20130614;第6卷(第6期);全文相关 *

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