CN106636179A - 植物中间表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供的植物中间表达载体为pEXP‑DR，具有序列表中<400>1所示的序列，通过PCR扩增和酶切技术在质粒PSK中连接启动子、终止子获得，在植物基因工程载体构建方面具有重要应用价值。

Description

植物中间表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是植物中间表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

目前，在构建植物表达载体时，为了构建完整的表达盒和选择合适的酶切位点，需要将目的片段在多个中间表达载体之间进行多步构建。

而把表达盒和多克隆位点构建在一个载体上，作为通用载体适应于多条目的片段，并自带表达盒，大大节省了工作人员构建载体的时间，降低了复杂的多步构建中产生的费用，同时也减少了构建过程中出现错误的几率，是现阶段技术人员致力研究的技术内容。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供植物中间表达载体。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述植物中间表达载体的构建方法。

本发明所要解决的另一技术问题在于提供所述植物中间表达载体的应用。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

植物中间表达载体，pEXP-DR，具有序列表中<400>1所示的序列。

上述植物中间表达载体的构建方法，通过PCR扩增和酶切技术在质粒PSK中连接了外源片段DR、启动子、终止子序列，所述外源片段DR序列为序列表中<400>13所示的序列，启动子序列为序列表中<400>2所示的序列，所述终止子序列为序列表中<400>3所示的序列。

上述植物中间表达载体在植物基因工程载体构建方面的应用。

本发明的有益效果是：

本发明所述植物中间表达载体pEXP-DR把表达盒和多克隆位点构建在一个载体上，作为通用载体适应于多条目的片段，并自带表达盒，使植物中间表达载体不仅具有完整的表达盒，而且在各序列的上下游，添加了多克隆位点，便于外源基因片段的导入和该表达盒与各种植物表达载体的连接，大大节省了工作人员构建载体的时间，降低了复杂的多步构建中产生的费用，同时也减少了构建过程中出现错误的几率，使植物基因工程载体构建更加便利和高效。

附图说明

图1为载体PEXP构建流程图；

图2为pT-PA的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M：DNA分子量标准Trans2K plus；泳道1：pT-PA的PCR鉴定；泳道2：pT-PA的酶切鉴定；PA所标示的箭头指向酶切后0.3kb的PA片段；

图3为pT-TP的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M：DNA分子量标准DGL2000；泳道1：pT-TP的PCR鉴定；泳道2：pT-TP的酶切鉴定；TP所标示的箭头指向酶切后0.2kb的TP片段；

图4为pT-35S的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M：DNA分子量标准DGL2000；泳道1：pT-35S的PCR鉴定；泳道2：pT-35S的酶切鉴定；35S所标示的箭头指向酶切后0.8kb的35S片段；

图5为pSK-PA的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M1、M2：DNA分子量标准DGL2000、Trans2K plus；泳道1：pSK-PA的PCR鉴定；泳道2：pSK-PA的酶切鉴定；PA所标示的箭头指向酶切后0.3kb的PA片段；

图6为pSK-TP-PA的PCR和酶切鉴定图，其中，泳道M：DNA分子量标准DGL2000；泳道1：pSK-TP-PA的PCR鉴定；泳道2：pSK-TP-PA的酶切鉴定；TP-PA所标示的箭头指向酶切后0.5kb的TP-PA片段；

图7为pEXP的PCR和酶切鉴定，其中，泳道M：DNA分子量标准DGL2000；泳道1：pEXP的PCR鉴定；泳道2：pEXP的酶切鉴定；35S-TP-PA所标示的箭头指向酶切后1.3kb的整个表达盒35S-TP-PA片段；

图8为中间载体PEXP-DR构建流程图；

图9为测序对比图；

图10为pEXP-DR的质粒及酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M:DNA分子量标准Trans15K；泳道1：pEXP-DR的质粒；泳道2：用NdeI和BglП双酶切pEXP-DR的质粒。

图11为载体1301-PEXP-SmGPPS的构建流程。

图12为克隆SmGPPS基因的琼脂糖有凝胶电泳图，其中泳道M:DNA分子量标准Trans2K PlusП；泳道1：负对照；泳道2：克隆得到的SmGPPS基因。

图13为pEXP-DR-SmGPPS的质粒及酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M:DNA分子量标准DL15000；泳道1：pEXP-DR-SmGPPS的质粒；泳道2：用KpnI和XbaI双酶切pEXP-DR-SmGPPS的质粒。

图14为载体1301-PEXP-SmIS1的构建流程。

图15为克隆SmIS1基因的琼脂糖有凝胶电泳图，其中泳道M:DNA分子量标准Trans2K；泳道1：负对照；泳道2：克隆得到的SmIS1基因。

图16为pEXP-DR-SmIS1的质粒及酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图，其中，泳道M:DNA分子量标准DL15000；泳道1：pEXP-DR-SmIS1的质粒；泳道2：用KpnI和XbaI双酶切pEXP-DR-SmIS1的质粒。

具体实施方式

实施例1

构建载体PEXP，具体流程见图1。根据所述构建流程如下：

首先要获得含有所需各个组件的T载体。

以质粒pCAMBIA1301为模板，PA1、PA2为引物，通过PCR扩增片段PA(PolyA，终止子)后将其与T载体连接，获得pT-PA，PCR和酶切鉴定(见图2)证明pT-PA构建正确，送至公司测序证明其序列也没有错误且酶切位点与设计相符。

以实验室保存的、含有豌豆Rubisco小亚基上叶绿体定位信号肽编码序列的质粒为模板，TP5、TP6为引物，通过PCR扩增片段TP后将其与T载体连接，获得了pT-TP，pT-TP的PCR和酶切鉴定正确(见图3)。送至公司测序证明其序列没有错误且酶切位点与设计相符。

以质粒pCAMBIA1301为模板，35S1、35S2为引物，通过PCR扩增片段35S后将其与T载体连接，获得pT-35S，转化子的PCR和酶切鉴定见图4。送至公司测序证明其序列没有错误且酶切位点与设计相符。

同时用限制性内切酶Kpn I和Sac I双酶切质粒pSK和pT-PA，将pSK双酶切后的大片段(约2.9kb)与pT-PA双酶切后的小片段(约0.3kb)进行回收、纯化、连接后转化大肠杆菌，获得转化子pSK-PA，通过PCR和酶切反应鉴定其正确性(见图5)。

然后同时用限制性内切酶Kpn I和ApaI双酶切pSK-PA和pT-TP，将pSK-PA双酶切后的大片段(约3.2kb)和pT-TP双酶切后的小片段(约0.2kb)进行回收、纯化、连接后转化大肠杆菌，获得转化子pSK-TP-PA，然后通过PCR和酶切反应证明其构建的正确性(见图6)。

最后同时用限制性内切酶Kpn I和Bgl II双酶切pSK-TP-PA和pT-35S，将pSK-TP-PA双酶切后的大片段(约3.4kb)与pT-35S双酶切后的小片段(约0.8kb)进行回收、纯化、连接后转化大肠杆菌，获得转化子pEXP，然后通过PCR(扩增0.8kb的35S组件)和酶切反应(切下1.3kb的整个表达盒35S-TP-PA)。证明其构建无误(见图7)，最后还通过测序证明三个组件连接处也都符合设计。

实施例2

根据PEXP载体进行改造后，构建中间载体PEXP-DR，具体流程见图8。根据所述构建流程：

(1)从SmIS1基因中用引物DR1和DR2克隆一段688bp的片段，该片段中没有本发明所要利用的酶切位点，在片段的上游嫁接酶切位点Bgl II，BamHI和SmaI，下游嫁接酶切位点NdeI，将其连接在pMD19-T1-Simple的载体上。

(2)利用PEXP原有的酶切位点，替换其中的TP序列,TP即导肽,序列为序列表中<400>4所示序列。利用BglII和NdeI这两个酶切位点对PEXP和T-DR进行双酶切。

(3)连接PEXP的大片段和T-DR的小片段，即得到pEXP-DR的载体。

利用已知的SmIS1的部分序列(即DR)进行替换构建，测序结果为序列表中<400>1所示的序列，分析如下：

DR模板上游加酶切位点GGAAGATCT为BglII，GGATCC为BamHI,CCCGGG为SmaI，GGAATTCCATATG为NdeI。测序比对结果见图9，由比对结果可知，在76bp左右有一个错配，没有Gap。由于该段基因并没有任何意义，故而有错配没有问题，只要检查该错配处是否会产生本发明要用到的酶切位点即可。故而主要通过软件检查，该段基因有没有多余的BglII，BamHI,SmaI，NdeI这几个酶切位点。根据下表1可知，在该段基因内部这几个酶切位点都是仅有一个，是在克隆这段基因的时候利用引物给加上去的而不是由于基因内部的那个错配而引起的,故而该错配并没有什么影响，可以用其进行后续的实验。

表1

继续对所构建的中间载体PEXP-DR进行双酶切鉴定，结果见图10，表明载体构建无误。

对于PEXP-DR这个表达载体的具体应用例如下：

实施例3

将SmGPPS这个基因构建在上述表达载体上,构建流程见图11。

用引物SG1、SG2通过PCR扩增目的基因SmGPPS,结果见图12。由于该目的基因内部没有BglII和NdeI这两个酶切位点，故而可用BglII和NdeI对目的基因的PCR产物和PEXP-DR载体进行双酶切。后将二者纯化后用T4连接酶进行连接之后即完成了该基因的植物过表达载体的构建，结果见图13。

实施例4

对于PEXP-DR这个表达载体的具体应用例如下：

将SmIS1这个基因构建在上述表达载体上,构建流程见图14。

用引物S1、S2通过PCR扩增目的基因SmIS1,结果见图15。由于该目的基因内部没有BglII和PstI这两个酶切位点，故而可用BglII和PstI对目的基因的PCR产物和PEXP-DR载体进行双酶切。后将二者纯化后用T4连接酶进行连接之后即完成了该基因的植物过表达载体的构建，结果见图16。

上述实施例1-4中具体涉及到的一些扩增、纯化等的具体操作过程如下：

具体操作：

a、通过PCR得到目的片段

50μl PCR体系：

PCR程序：30个循环

对PCR产物进行纯化的过程：

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时进行切胶回收。

称取0.3g琼脂糖，用30mlTAE电泳缓冲液加热融化，待其冷却至不烫手后加入2μlEB，混匀后倒入模具中，待冷却凝固后放置电泳槽中，倒入缓冲液，点样。

切胶回收：

●称取两个灭过菌的EP管，标记清楚重量(0.88g、0.88g)。

●将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入事先称量好的EP管中,并再次称重(0.96g、0.92g)。

●琼脂糖凝胶浓度为1％，因此向装有胶块的EP管中加入三倍体积的Buffer A，(如凝胶重为100mg，其体积可视为100μl，依次类推)。

●将EP管放在漂上，放在事先预热好的水浴锅中，50℃孵育10min，期间每隔2-3min温和地上下颠倒EP管，以确保胶块充分溶解。

●加入1.5倍体积的BufferB。

●加入凝胶的一倍体积的异丙醇，将液体吹打混匀后，转移至Spin column(每管每次最多750微升液体，可以分步转移)。

●12000g离心1分钟，弃去离心柱内液体。

●加Washing BufferA 500μl，12000g离心30秒，弃去离心柱内液体。

●加Washing BufferB 700μl，12000g离心30秒，弃去离心柱内液体。

●离心12000g，1分钟。迅速将Spin column管转移至离心管内。

●向Spin column管的滤膜中央加入60℃预热的Elution Buffer 10微升。60℃温浴3分钟。

●12000g离心1分钟，将离心管底部DNA溶液吸置滤膜中，重复一次，收集离心管底部的DNA溶液备用。

b、将纯化后的目的片段与载体连接转化并筛选阳性转化子

目的片段与PEASY-T1-SimpLe的连接

在超净工作台中将上述收集的DNA和PEASY-T1-SimpLe置于PCR管中，在25℃的水浴锅中进行30分钟的连接。

DNA 4μl

PEASY-T1simpLe 1μl

转化

●在超净工作台中，将连接产物5ul加入Trans5α感受态细胞中，冰浴30分钟。

●水浴锅中42℃热激90秒。

●立刻取出，放入冰盒中，冰浴2分钟。

●工作台中，向其中加入800μl LB液体培养基。

●转移至37℃恒温摇床，先慢摇30分钟，后快摇30分钟。

●4000rmp离心2分钟。

●在超净工作台内去掉600μl的液体，留下200μl的液体，将沉淀的菌体悬浮，吸打混匀。

●将剩下的液体吸置带有卡那霉素抗性的LB固体培养基的平板上,用涂布棒轻轻涂匀至干。

●将平板封好，放入37℃的恒温培养箱中，过夜培养(12-16小时)。

筛选阳性转化子

将长出转化子的平板做好标记，进行印迹、菌落PCR、质粒PCR和酶切鉴定。

印迹：将长出的转化子用接种环挑取单菌落，在含有卡那霉素抗性的固体LB培养板上进行印迹。放入37℃恒温培养箱培养12-16小时。

菌落PCR 20μl PCR体系

PCR程序：30个循环

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

在培养好的印迹菌板上，用接种环挑取单菌落，放入含有卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃恒温摇床中进行扩大培养，同时进行菌种的保存。

菌种的保存

·首先，将菌液的浓度培养到OD值为0.5-0.6时，在无菌操作的条件下向EP管中先加入事先灭好菌的87％的甘油100μL(纯甘油太稠)，再加入900μL菌液，上下颠倒混匀。

·将EP管放入液氮中进行速冻，然后迅速将其放入冰箱-70℃中能够保存2年或3年。

快速提取质粒法(提取质粒的试剂盒)：

●准备工作：检查Buffer P1中是否已经加入RNaseA。检查Wash Solution中是否已经加入乙醇。检查Buffer P2和P3中是否有沉淀。

●取1.5-5ml培养好的菌液，8000g离心2分钟收集菌体，弃尽培养基。

●在沉淀中加入250μl Buffer P1,使菌体彻底悬浮。

●加入250μl Buffer P2，马上温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4分钟。

●加入350μl Buffer P3,立刻温和颠倒离心管5-10次使其完全混匀。

●12000g离心5-10分钟，将上清液移入吸附柱中，8000g离心30秒，倒掉收集管中的液体。

●空吸附柱于9000g离心1分钟。

●将吸附柱放到一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl ElutionBuffer，室温静置1分钟后，离心2分钟，保存管中DNA溶液备用。

将上述提取好的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。确定提取质粒的量。

进行质粒PCR:20μl质粒PCR体系

PCR程序：30个循环

对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

将质粒进行双酶切，放于37℃恒温培养箱4小时，后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。

20μl双酶切体系：

通过一系列的鉴定，将提取的质粒10μl送去华大基因公司进行测序。

c、目的片段与目的载体的连接与转化及阳性克隆子的筛选

将上述经过测序鉴定正确的质粒和目的载体的质粒根据实验中所设计的酶切位点进行双酶切。

20μl双酶切体系：

对双酶切的产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时进行切胶回收。

称取0.3g琼脂糖，用30mlTAE电泳缓冲液加热融化，待其冷却至不烫手后加入2μlEB，混匀后倒入模具中，待冷却凝固后放置电泳槽中，倒入缓冲液，点样。

切胶回收：

●称取两个灭过菌的EP管，标记清楚重量(0.88g、0.88g)。

●将单一的目的条带从琼脂糖凝胶中切下，放入事先称量好的EP管中,并再次称重(0.96g、0.92g)。

●琼脂糖凝胶浓度为1％，因此向装有胶块的EP管中加入三倍体积的Buffer A，(如凝胶重为100mg，其体积可视为100μl，依次类推)。

●将EP管放在漂上，放在事先预热好的水浴锅中，50℃孵育10min，期间每隔2-3min温和地上下颠倒EP管，以确保胶块充分溶解。

●加入1.5倍体积的BufferB。

●(该步骤为选做步骤)加入凝胶的一倍体积的异丙醇，将液体吹打混匀后，转移至Spin column(每管每次最多750微升液体，可以分步转移)。

●12000g离心1分钟，弃去离心柱内液体。

●加Washing BufferA 500μl，12000g离心30秒，弃去离心柱内液体。

●加Washing BufferB 700μl，12000g离心30秒，弃去离心柱内液体。

●离心12000g，1分钟。迅速将Spin column管转移至离心管内。

●向Spin column管的滤膜中央加入60℃预热的Elution Buffer 10微升。60℃温浴3分钟。

●12000g离心1分钟，将离心管底部DNA溶液吸置滤膜中，重复一次，收集离心管底部的DNA溶液备用。

目的片段与目的载体的连接：

目的片段与目的载体的连接

在超净工作台中将上述收集的目的片段和目的载体置于PCR管中，在25℃的水浴锅中进行15分钟的连接。

目的片段 6μl

目的载体 3μl

T4连接酶 1ul

转化

●在超净工作台中，将连接产物10ul加入Trans5α感受态细胞中，冰浴30分钟。

●水浴锅中42℃热激90秒。

●立刻取出，放入冰盒中，冰浴2分钟。

●工作台中，向其中加入800μl LB液体培养基。

●转移至37℃恒温摇床，先慢摇30分钟，后快摇30分钟。

●4000rmp离心2分钟。

●在超净工作台内去掉600μl的液体，留下200μl的液体，将沉淀的菌体悬浮，吸打混匀。

●将剩下的液体吸置带有卡那霉素抗性的LB固体培养基的平板上,用涂布棒轻轻涂匀至干。

●将平板封好，放入37℃的恒温培养箱中，过夜培养(12-16小时)。

筛选阳性转化子

将长出转化子的平板做好标记，进行印迹、菌落PCR、质粒PCR和酶切鉴定。

印迹：将长出的转化子用接种环挑取单菌落，在含有卡那霉素抗性的固体LB培养板上进行印迹。放入37℃恒温培养箱培养12-16小时。

菌落PCR 20μl PCR体系

PCR程序：30个循环

对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

在培养好的印迹菌板上，用接种环挑取单菌落，放入含有卡那霉素的液体LB培养基中，在37℃恒温摇床中进行扩大培养，同时进行菌种的保存。

菌种的保存

·首先，将菌液的浓度培养到OD值为0.5-0.6时，在无菌操作的条件下向EP管中先加入事先灭好菌的87％的甘油100μL(纯甘油太稠)，再加入900μL菌液，上下颠倒混匀。

·将EP管放入液氮中进行速冻，然后迅速将其放入冰箱-70℃中能够保存2年或3年。

快速提取质粒法(提取质粒的试剂盒)：

●准备工作：检查Buffer P1中是否已经加入RNaseA。检查Wash Solution中是否已经加入乙醇。检查Buffer P2和P3中是否有沉淀。

●取1.5-5ml培养好的菌液，8000g离心2分钟收集菌体，弃尽培养基。

●在沉淀中加入250μl Buffer P1,使菌体彻底悬浮。

●加入250μl Buffer P2，马上温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4分钟。

●加入350μl Buffer P3,立刻温和颠倒离心管5-10次使其完全混匀。

●12000g离心5-10分钟，将上清液移入吸附柱中，8000g离心30秒，倒掉收集管中的液体。

●空吸附柱于9000g离心1分钟。

●将吸附柱放到一个干净的1.5ml离心管中，在吸附膜中央加入50μl ElutionBuffer，室温静置1分钟后，离心2分钟，保存管中DNA溶液备用。

将上述提取好的质粒进行琼脂糖凝胶电泳。确定提取质粒的量。

进行质粒PCR:20μl质粒PCR体系

PCR程序：30个循环

对该PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

将质粒进行双酶切，放于37℃恒温培养箱4小时，后对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。

20μl双酶切体系：

通过一系列的鉴定，将提取的质粒10μl送去华大基因公司进行测序。

上述实验操作中所用的试剂：

Trans5α感受态细胞和T4连接酶购自北京全式金公司，所有涉及到的限制性内切酶和rTaq酶购买自大连宝生物公司，高纯度质粒小提试剂盒购自上海生工公司，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自康为试剂生物科技公司，测序由华大基因测序公司完成。

上述构建过程中涉及到的所有引物序列：

TP5，<400>5所示序列：5’GGAAGATCTATGGCTTCTATGATATCCTC 3’

TP6，<400>6所示序列：5’GGAATTCCATATGGGATCCGCACTTTACTCTTCCACCAT 3’

PA1，<400>7所示序列：5’GGTACCCCGTGCGGGCCCCTGCAGCGTTCAAACATTTGGCAAT 3’

PA2，<400>8所示序列：5’GAGCTCAAGCTTTCTAGACCCGATCTAGTAACATAGAT 3’

35S1，<400>9所示序列：5’GGTACCGAATTCGTCGACGCTAGAGCAGCTTGCCAAC 3’

35S2，<400>10所示序列：5’AGATCT CCGGGATCTGCGAAAGCTCG 3’

DR1，<400>11所示序列:5’GGAAGATCTGGATCCCCCGGGAGTGTACGGCGTGGCACGG3’

DR2，<400>12所示序列:5’GGAATTCCATATGCAGCATTTTCCATACATTCTTCCAC3’

DR序列为<400>13所示序列

SG1，<400>14所示序列:5'GAAGATCTATGAGTTTGGTGAATTCTACTGC 3'

SG2，<400>15所示序列:5'GGAATTCCATATGTTAATTATCCCTGTAAGCAATATAA3'

S1，<400>16所示序列:5'GAAGATCTATGAGCTGGTGGTGGAAAAG3'

S2,<400>17所示序列:5'AACTGCAGCTATGGGATAAATTTGAAGTCTCTC3'

SmGPPS,<400>18所示序列

SmIS1,<400>19所示序列。

上述参照具体实施方式对该植物中间表达载体及其构建方法与应用进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种植物中间表达载体，其特征在于：为pEXP-DR，具有序列表中<400>1所示的序列。

2.权利要求1所述植物中间表达载体的构建方法，其特征在于：通过PCR扩增和酶切技术在质粒PSK中连接了外源片段DR、启动子、终止子序列，所述外源片段DR序列为序列表中<400>13所示的序列，启动子序列为序列表中<400>2所示的序列，所述终止子序列为序列表中<400>3所示的序列。

3.权利要求1所述植物中间表达载体在植物基因工程载体构建方面的应用。