CN106632819A - 一种具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法。采用自制的三嵌段两亲性聚合物作为表面活性剂和微乳液聚合的大分子可逆加成‑断裂链转移试剂，通过微乳液活性聚合得到具有核壳结构的纳米载体，进一步水解后得到pH响应型纳米药物载体。该纳米载体可以作为冻干粉储存，并且核层和壳层都具有独特的功能。核层在pH值呈酸性的肿瘤或发炎部位会由溶胀状态迅速收缩，从而将包埋的药物迅速“挤压”出来；壳层的聚乙二醇片段会使纳米粒子在体内循环过程中“隐形”，延长了药物载体在体内的循环半衰期；壳层的阳离子聚合物片段在中性pH值时会通过静电作用吸附于核层上，阻止药物释放出来，在酸性pH值时静电作用消失而呈伸展状态，有助于药物的释放，起到了“开关”作用。该纳米药物载体在药物可控释放领域特别是恶性肿瘤的化疗方面具有很大应用潜力。

Description

一种具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，利用该法可以制备得到一种具有核壳结构的高分子纳米球，进一步通过静电作用载药后可以实现在酸性环境下的快速释放，是一种优良的药物定向释放载体。属于生物医用高分子材料领域。
背景技术
与传统药物制剂相比，纳米药物载体具有延长药物在体内的半衰期、提高药物生物利用率和有效血药浓度、包埋疏水性药物、降低用药次数、实现靶向给药(靶向基团修饰后)等特点，在疾病治疗特别是癌症化疗方面具有无可比拟的优势(Advanced DrugDelivery Reviews,2002,54:631-651；Nature Materials，2013,12：991-1003)。截至目前科研人员已经开发制备了多种多样的纳米药物载体，包括胶束、微囊、脂质体、树状大分子、聚合物-药物偶联物以及无机纳米球等(Langmuir,2014,30:9819-9827)。刺激响应型纳米药物载体能够通过感应外部环境的变化(温度、pH、光、磁场、离子强度等)或在酶的作用下实现药物的释放，在实现药物在体内的定向释放方面具有很大的潜力。
我们知道人体消化道内存在天然的pH梯度(pH1-7.5)，此外感染/炎症部位(pH5.4-5.7)、肿瘤部位(pH5.8-7.2)、细胞内涵体和溶酶体(pH4.5-5.5)等特定部位的pH都低于正常体液(pH7.4)。这些差别使得pH响应型纳米药物载体的研究开发成为热点。人们可以在器官、组织以及细胞器水平上设计多种pH响应型纳米载体(MolecularPharmaceuticals,2010,7:1913-1920)。pH响应型纳米药物载体的释药机理通常有以下四种：1)药物通过酸敏感共价键偶联到载体上，在酸性条件下实现药物释放；2)离子聚合物构成的壳层/壳层通过在酸性条件下溶胀增加药物释放速率；3)通过离子聚合物在酸性条件下破坏胶束/脂质体的结构实现药物释放；4)两性离子聚合物在酸性条件下实现载体表面电荷由负电到正电的转变，从而增加细胞内吞量。要想实现pH响应型药物载体在pH7时具有高载药量和低泄漏率，在pH5-6时能够快速可控释放药物是比较困难的。并目前文献报道的大多数pH响应型药物载体往往合成步骤复杂(多步反应偶联药物或载药后多步纯化)。大多数给药系统的药物释放都是以浓度差为驱动力的扩散(菲克第一定律)，尽管能做到快速响应，很难做到药物的快速释放。
具有挤压功能的pH响应型给药系统可以突破浓度扩散限制，实现药物快速释放。Kim等人将装有药物的水凝胶置于有两个释放小孔的刚性胶囊(0.6ml)中，把胶囊置于释放介质溶液中，水凝胶马上溶胀堵塞小孔。当介质溶液的pH值或pH值/温度改变时，水凝胶开始收缩，打开小孔并从凝胶基质中机械挤压出药物溶液，排出的药液通过小孔迅速扩散到装置外(Journal of Controlled Release,1997,48：141-148)。这种给药系统被用来运送在胃部易分解的药物以及对胃有刺激、会在胃肠道上部产生有害作用的药物，只适合于口服。最近，Bronich等人(Journal of Controlled Release,2009,138:197-204)制备了负载阿霉素的pH敏感型胶束。他们首先利用Ca2+驱动商品化的聚乙二醇-聚甲基丙烯酸自组装，然后利用乙二胺交联聚甲基丙烯酸内核。这种纳米载体在pH7时可以通过静电作用达到75％(质量比)的载药率，在pH5.5时通过交联内核的收缩快速释放阿霉素。然而这种交联胶束在pH7.4时高度溶胀，阿霉素的泄漏比较严重，48h内有超过60％的阿霉素被释放出来，降低了它的临床应用价值。
发明内容
针对现有pH响应型纳米药物载体存在的问题，本发明采用自制的三嵌段两亲性聚合物作为表面活性剂和微乳液聚合的大分子可逆加成-断裂链转移(RAFT)试剂，通过微乳液活性聚合制备具有核壳结构的纳米载体，进一步水解后得到pH响应型纳米载体(请见附图1)。这种纳米载体可以作为冻干粉储存，对带正电的药物具有很高的负载率。在pH7.4时通过壳层的开关作用有效降低了药物的释放，在pH5.0时通过机械挤压作用迅速释放药物，后者的药物释放速率是前者的3倍以上，是一种在肿瘤化疗领域具有很大应用潜力的pH响应型纳米给药系统。
本发明所采用的技术方案是：
一种具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)以聚乙二醇单甲醚(甲基)丙烯酸酯为单体，采用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)方法制备线性聚合物，反应温度为55-85℃；反应时间为3-24h；单体浓度0.1-5M，单体和RAFT试剂的摩尔比范围为10:1-100:1，RAFT试剂与引发剂的摩尔比范围为1:0.05-1:0.2，反应溶剂可选甲苯、乙苯、氯苯、二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、苯甲醚、乙醇、异丙醇等有机溶剂的一种；内标物可选均三甲苯、三恶烷等。反应后的产品在正己烷、环己烷或乙醚中沉淀两次，离心后，所得高分子真空干燥后进入步骤(2)；
(2)以步骤(1)所得的第一嵌段线性聚合物作为大分子RAFT试剂，选用阳离子单体作为第二嵌段单体，采用RAFT聚合得到两嵌段聚合物。反应后的产品在正己烷或环己烷中沉淀两次，其他反应条件同步骤(1)；
(3)以步骤(2)所得的嵌段共聚物作为大分子RAFT试剂，选用(甲基)丙烯酸叔丁酯作为第三嵌段单体，采用RAFT聚合得到三嵌段聚合物。反应溶剂可选甲苯、乙苯、氯苯、苯甲醚、二氧六环等有机溶剂的一种，反应后的产品在正己烷或环己烷中沉淀两次，其他条件同步骤(1)；
(4)将步骤(3)所得的三嵌段两亲性聚合物溶于去离子水中配成水相；(甲基)丙烯酸叔丁酯、交联剂、引发剂和内标物均三甲苯混合配成油相，交联度(交联剂占单体和交联剂质量和的百分数)范围为5-50％；油相加入水相后利用超声波破碎仪在冰水浴中制备微乳液。所得微乳液转入带有橡皮塞的单口瓶，充氮气除氧30min后升温开始RAFT聚合，反应温度为55-85℃，反应一段时间后得到具有核壳结构的聚(甲基)丙烯酸叔丁酯纳米球。将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇和去离子水，目的是除去未参加反应的物质，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到聚(甲基)丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
(5)将步骤(4)所得的产品加入到90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜脱除叔丁基保护，然后将反应混合物在去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有挤压和开关效应的pH响应型聚(甲基)丙烯酸纳米球干粉。
(6)将步骤(5)所得的纳米球干粉分散在药物的pH缓冲溶液中，药物的浓度范围10-2000μg/ml,pH缓冲液pH值范围6-8。药物分子通过静电作用吸附到载体上，室温下混合24h后通过离心分离得到载药纳米球。
优选的，步骤(1)-(4)中的引发剂为常规油溶性自由基聚合引发剂，选自偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二环己基甲腈、过氧化苯甲酰、过氧化苯甲酰叔丁酯、过氧化甲乙酮等中的一种。反应温度为60-70℃；反应时间为5-21h。步骤(1)-(3)中单体浓度为1-3M。
步骤(1)-(4)中单体的转化率通过核磁分析反应前后的反应液可以确定。
步骤(1)中所述的RAFT试剂为4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(CPADB)、4-氰基-4-(丙基三硫代碳酸酯基)戊酸(CPPT)、4-氰基-4-(十二烷基三硫代碳酸酯基)戊酸(CDPT)二硫代苯甲酸枯酯(CDB)、2-氰基-2-丙基苯并二硫(CPDB)等常见RAFT试剂的一种。
阳离子单体是指在酸性条件下可以质子化的单体，优选的，步骤(2)中所述的阳离子单体为(甲基)丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯和(甲基)丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯这四种单体中的至少一种，但是并不局限于以上四种。
步骤(2)中所述大分子RAFT试剂的分子量范围1000-30000Da，优选5000-15000Da。
步骤(2)中阳离子聚合物分子量的控制很关键，它主要起到纳米药物载体的开关作用，过低起不到开关作用，过高会增加药物在酸性条件下的扩散阻力。分子量的控制通过反应时间、单体浓度以及单体与RAFT试剂的摩尔比来控制。
步骤(3)中所述大分子RAFT试剂的分子量范围1500-40000Da，优选5000-20000Da。
步骤(3)中第三嵌段聚合物的分子量大小也很关键，它直接影响着步骤(4)中水包油型微乳液的稳定性。分子量的控制方法与步骤(2)相同。
步骤(3)中所得的双亲性三嵌段大分子RAFT试剂的亲油亲水平衡值(HLB)，采用Griffin’s方法计算，属于比值法，公式如下：
其中，M1，M2，M3分别是第一嵌段、第二嵌段和第三嵌段的摩尔质量，MH是亲水的第一嵌段和第二嵌段摩尔分子量之和，M为三嵌段聚合物分子的总摩尔质量。
步骤(4)中所述的交联剂为二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸1,4-丁二醇酯、新戊二醇二(甲基)丙烯酸酯、双(2-甲基丙烯酰氧乙基)二硫醚中的至少一种；三嵌段聚合物的分子量范围1800-80000Da；HLB范围10-18；三嵌段聚合物RAFT稳定剂的用量为去离子水质量的0.1-2.0％；油相质量占水相质量的1-20％。
优选的，步骤(4)中所述的三嵌段两亲性聚合物分子量范围5000-20000Da,HLB范围12-16，加入量为去离子水质量的0.3-1.0％；油相质量占水相质量的5-15％，交联度为10-30％。
步骤(4)中超声波破碎仪的工作振幅和时间会影响纳米药物载体粒径的大小，可根据所需粒径调节。超声破碎破碎仪的振幅范围30-70％，超声时间范围5-30min。
步骤(6)中所述的药物为在pH6-8的范围内带正电的药物，如阿霉素、吉西他滨、表柔比星等。载药时纳米球与药物的质量比范围1:1-20:1，优选1.5:1-10:1。
本发明所制备的具有挤压和开关效应的pH相应型纳米药物载体的粒径为80-300nm，具有核壳结构。
本发明产生的技术效果是：
本发明利用RAFT微乳液聚合技术制备了一种具有核壳结构的纳米粒子，进一步水解后得到具有挤压和开关功能的pH响应型纳米药物载体。该纳米载体核层和壳层都具有独特的功能。核层由交联的聚丙烯酸或聚甲基丙烯酸组成，壳层由两嵌段的聚乙二醇和阳离子聚合物组成。核层在pH值呈酸性的肿瘤或发炎部位会由溶胀状态迅速收缩，从而将包埋的药物迅速“挤压”出来；壳层的聚乙二醇片段会使纳米粒子在体内循环过程中“隐形”，延长了药物载体在体内的循环半衰期；壳层的阳离子聚合物片段在中性pH值时会通过静电作用吸附于核层上，阻止药物释放出来，在酸性pH值时静电作用消失而呈伸展状态，有助于药物的释放，起到了“开关”作用(请见附图6)。该纳米药物载体在药物可控释放领域特别是恶性肿瘤的化疗方面具有很大应用潜力。
附图说明：
图1具有挤压和开关效应的pH响应型纳米药物载体制备过程示意图；
图中标号1为以三嵌段大分子RAFT为稳定剂的微乳液；
标号2为具有核壳结构的聚(甲基)丙烯酸叔丁酯纳米球结构示意图；
标号3为具有核壳结构的聚(甲基)丙烯酸纳米球结构示意图；
标号4为三嵌段聚合物的聚(甲基)丙烯酸叔丁酯片段；
标号5为三嵌段聚合物的阳离子聚合物片段；
标号6为三嵌段聚合物的聚乙二醇片段。
图2为本发明实例1中pH响应型纳米球水解前后的透射电镜图；
图中a图为水解前的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球；
b图为水解后的聚甲基丙烯酸纳米球。
图3为本发明实例1中pH响应型纳米药球水解前后的红外光谱图；
图中a线为水解前的红外光谱图；
b线为水解后的红外光谱。
图4为本发明实例1中pH响应型纳米球水解后粒径及zeta电势随pH的变化图；
图中a线为粒径随pH值的变化图；
b线为zeta电势随pH值的变化图。
图5为本发明实验例中pH响应型纳米球在pH7.4和pH5.0下的药物释放曲线图。
图中a线为实施例1中载药纳米球在pH5.0下的药物释放曲线；
b线为实施例1中载药纳米球在pH7.4下的药物释放曲线。
图6为本发明中pH响应型纳米药物载体“挤压”和“开关”功能示意图。
图中标号1为具有“隐形”功能的聚乙二醇片段；
标号2为具有“开关”功能的阳离子聚合物片段。
具体实施方式
本发明具体实施方式如下：
实施例1
1)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯(PPEGMEMA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(49.26mg，0.3mmol)、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMEMA)(9000mg，30mmol)、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(CPADB)(558.8mg，2mmol)、均三甲苯(100μl)及20ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应16h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到第一嵌段PPEGMEMA。通过核磁氢谱分析单体转化率91.56％，理论分子量4400。
2)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯-聚甲基丙烯酸N,N-二甲胺基乙酯(PPEGMEMA-b-PDMAEMA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(8.21mg，0.05mmol)、PPEGMEMA(2200mg，0.5mmol)、甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)(3144mg，20mmol)、均三甲苯(100μl)及15ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应15h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEMA-PDMAEMA。通过核磁氢谱分析单体转化率77.93％，理论分子量9300。
3)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯-聚甲基丙烯酸N,N-二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸叔丁酯(PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(4.93mg，0.03mmol)、PPEGMEMA-b-PDMAEMA(2790mg，0.3mmol)、甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)(1279.8mg，9mmol)、均三甲苯(100μl)及12ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应10h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA。通过核磁氢谱分析单体转化率79.08％，理论分子量12673，所得三嵌段聚合物HLB值为14.7。
4)利用RAFT反应合成具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球
将三嵌段聚合物PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA(50mg)溶于10ml去离子水中作为水相，甲基丙烯酸叔丁酯(368mg)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(92mg)、AIBN(0.32mg)和均三甲苯(10μl)作为油相。将油相和水相在25ml的玻璃瓶中混合均匀后，用超声波破碎仪在60％振幅下超声10min制成微乳液，所得微乳液转入带有橡皮塞的单口瓶，充氮气除氧30min后升温开始聚合，反应温度为75℃，反应18h后得到具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球，单体转化率100％，平均粒径185nm。用无水乙醇和去离子水依次透析纳米球溶液，真空冻干后得到聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
5)将聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有挤压和开关效应的pH响应型聚甲基丙烯酸纳米球冻干粉。聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球水解前后的透射电镜图见图2，可以看出纳米球具有明显的核壳结构；水解前后的红外光谱图见图3，可以看出水解后叔丁基在1392cm-1和1367cm-1处的特征峰消失，同时在3350cm-1处出现了一个很宽的羧基共轭峰；水解后纳米粒子粒径及zeta电势随pH变化图见图4，可以看出纳米粒子具有明显的pH响应性。
6)载药
将阿霉素(3mg)溶于5ml pH7.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载阿霉素的pH响应型聚甲基丙烯酸纳米球。载药量为565.8μg/mg纳米球，载药率94.3％。
实施例2
1)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯(PPEGMEMA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(49.26mg，0.3mmol)、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMEMA)(9000mg，30mmol)、4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(CPADB)(558.8mg，2mmol)、均三甲苯(100μl)及20ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应16h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到第一嵌段PPEGMEMA。通过核磁氢谱分析单体转化率91.56％，理论分子量4400。
2)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯-聚甲基丙烯酸N,N-二甲胺基乙酯(PPEGMEMA-b-PDMAEMA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(4.11mg，0.025mmol)、PPEGMEMA(1100mg，0.25mmol)、甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)(3144mg，20mmol)、均三甲苯(100μl)及15ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应17h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEMA-PDMAEMA。通过核磁氢谱分析单体转化率66.12％，理论分子量12715。
3)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯-聚甲基丙烯酸N,N-二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸叔丁酯(PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(3.28mg，0.02mmol)、PPEGMEMA-b-PDMAEMA(2543mg，0.2mmol)、甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)(1137.6mg，8mmol)、均三甲苯(100μl)及12ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应12h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA。通过核磁氢谱分析单体转化率75.36％，理论分子量17001，所得三嵌段聚合物HLB值为14.95。
4)利用RAFT反应合成具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球
将三嵌段聚合物PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA(67mg)溶于10ml去离子水中作为水相，甲基丙烯酸叔丁酯(414mg)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(46mg)、AIBN(0.32mg)和均三甲苯(10μl)作为油相。将油相和水相在25ml的玻璃瓶中混合均匀后，用超声波破碎仪在65％振幅下超声10min制成微乳液，所得微乳液转入带有橡皮塞的单口瓶，充氮气除氧30min后升温开始聚合，反应温度为75℃，反应18h后得到具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球，单体转化率100％，平均粒径205nm。用无水乙醇和去离子水依次透析纳米球溶液，真空冻干后得到聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
5)将聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有挤压和开关效应的pH响应型聚甲基丙烯酸纳米球冻干粉。
6)载药
将阿霉素(5.0mg)溶于5ml pH7.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载阿霉素的pH响应型聚甲基丙烯酸纳米球。载药量为754.6μg/mg纳米球，载药率75.5％。
实施例3
1)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚丙烯酸酯(PPEGMEA)
室温下在25ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(2.46mg，0.015mmol)、聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯(PEGMEA)(2880mg，6mmol)、4-氰基-4-(丙基三硫代碳酸酯基)戊酸(CPPT)(41.6mg，0.15mmol)、均三甲苯(100μl)及5ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应16h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到第一嵌段PPEGMEA。通过核磁氢谱分析单体转化率93.61％，理论分子量18250。
2)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚丙烯酸酯-聚丙烯酸N,N-二乙胺基乙酯(PPEGMEA-b-PDEAEA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(4.11mg，0.025mmol)、PPEGMEMA(4563mg，0.25mmol)、丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEA)(3424mg，20mmol)、均三甲苯(100μl)及15ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应10h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEA-PDEAEA。通过核磁氢谱分析单体转化率57.31％，理论分子量26100。
3)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯-聚丙烯酸N,N-二乙胺基乙酯-聚丙烯酸叔丁酯(PPEGMEA-b-PDEAEA-b-PtBA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(3.28mg，0.02mmol)、PPEGMEA-b-PDEAEA(5220mg，0.2mmol)、丙烯酸叔丁酯(tBA)(2563.4mg，20mmol)、均三甲苯(100μl)及15ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在65℃油浴锅中反应19h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEA-b-PDMAEA-b-PtBA。通过核磁氢谱分析单体转化率87.27％，理论分子量37199，所得三嵌段聚合物HLB值为14.03。
4)利用RAFT反应合成具有核壳结构的聚丙烯酸叔丁酯纳米球
将三嵌段聚合物PPEGMEA-b-PDEAEA-b-PtBA(106mg)溶于10ml去离子水中作为水相，丙烯酸叔丁酯(322mg)、乙二醇二丙烯酸酯(138mg)、AIBN(0.47mg)和均三甲苯(10μl)作为油相。将油相和水相在25ml的玻璃瓶中混合均匀后，用超声波破碎仪在70％振幅下超声10min制成微乳液，所得微乳液转入带有橡皮塞的单口瓶，充氮气除氧30min后升温开始聚合，反应温度为75℃，反应18h后得到具有核壳结构的聚丙烯酸叔丁酯纳米球，单体转化率100％，平均粒径223nm。用无水乙醇和去离子水依次透析纳米球溶液，真空冻干后得到聚丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
5)将聚丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有挤压和开关效应的pH响应型聚丙烯酸纳米球冻干粉。
6)载药
将表柔比星(1.5mg)溶于5ml pH7.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载表柔比星的pH响应型聚丙烯酸纳米球。载药量为236.4μg/mg纳米球，载药率为78.8％。
实施例4
1)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯(PPEGMEMA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(16.42mg，0.1mmol)、聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯(PEGMEMA)(9000mg，30mmol)、4-氰基-4-(丙基三硫代碳酸酯基)戊酸(CPPT)(277mg，1mmol)、均三甲苯(100μl)及30ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在60℃油浴锅中反应15h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到第一嵌段PPEGMEMA。通过核磁氢谱分析单体转化率90.45％，理论分子量8418。
2)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯-聚甲基丙烯酸N,N-二甲胺基乙酯(PPEGMEMA-b-PDMAEMA)
室温下在25ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(4.93mg，0.03mmol)、PPEGMEMA(2525.4mg，0.3mmol)、甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEMA)(2830mg，18mmol)、均三甲苯(100μl)及12ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在70℃油浴锅中反应13h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEMA-PDMAEMA。通过核磁氢谱分析单体转化率61.52％，理论分子量14221。
3)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚甲基丙烯酸酯-聚甲基丙烯酸N,N-二甲胺基乙酯-聚甲基丙烯酸叔丁酯(PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(4.93mg，0.03mmol)、PPEGMEMA-b-PDMAEMA(4266.3mg，0.3mmol)、甲基丙烯酸叔丁酯(tBMA)(3412.8mg，24mmol)、均三甲苯(150μl)及24ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在70℃油浴锅中反应12h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA。通过核磁氢谱分析单体转化率75.01％，理论分子量22754，所得三嵌段聚合物HLB值为12.5。
4)利用RAFT反应合成具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球
将三嵌段聚合物PPEGMEMA-b-PDMAEMA-b-PtBMA(90mg)溶于10ml去离子水中作为水相，甲基丙烯酸叔丁酯(391mg)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(69mg)、AIBN(0.33mg)和均三甲苯(10μl)作为油相。将油相和水相在25ml的玻璃瓶中混合均匀后，用超声波破碎仪在65％振幅下超声15min制成微乳液，所得微乳液转入带有橡皮塞的单口瓶，充氮气除氧30min后升温开始聚合，反应温度为80℃，反应15h后得到具有核壳结构的聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球，单体转化率100％，平均粒径187nm。用无水乙醇和去离子水依次透析纳米球溶液，真空冻干后得到聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
5)将聚甲基丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有挤压和开关效应的pH响应型聚甲基丙烯酸纳米球冻干粉。
6)载药
将吉西他滨(2mg)溶于5ml pH7.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载阿霉素的pH响应型聚甲基丙烯酸纳米球。载药量为352.9μg/mg纳米球，载药率为88.2％。
实施例5
1)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚丙烯酸酯(PPEGMEA)
室温下在25ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(3.28mg，0.02mmol)、聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯(PEGMEA)(1920mg，4mmol)、2-氰基-2-丙基苯并二硫(CPDB)(44.3mg，0.2mmol)、均三甲苯(100μl)及5ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在70℃油浴锅中反应16h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到第一嵌段PPEGMEA。通过核磁氢谱分析单体转化率95.82％，理论分子量9420。
2)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚聚丙烯酸酯-聚丙烯酸N,N-二甲胺基乙酯(PPEGMEA-b-PDMAEA)
室温下在25ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(4.11mg，0.025mmol)、PPEGMEMA(2355mg，0.25mmol)、丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯(DMAEA)(1790mg，12.5mmol)、均三甲苯(100μl)及6.25ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在70℃油浴锅中反应19h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEA-PDMAEA。通过核磁氢谱分析单体转化率75.13％，理论分子量14800。
3)利用RAFT反应合成聚乙二醇单甲醚丙烯酸酯-聚丙烯酸N,N-二甲胺基乙酯-聚丙烯酸叔丁酯(PPEGMEA-b-PDMAEA-b-PtBA)
室温下在50ml单口反应瓶中加入搅拌子，然后然后依次加入偶氮二异丁腈(AIBN)(3.28mg，0.02mmol)、PPEGMEA-b-PDMAEA(2960mg，0.2mmol)、丙烯酸叔丁酯(tBA)(1923mg，15mmol)、均三甲苯(100μl)及15ml甲苯，翻口橡皮塞密封。待反应体系混合均匀后在冰水浴中用针头通入氮气除氧20min，将反应瓶在60℃油浴锅中反应12h。反应结束后将反应液在正己烷中沉淀两次，离心后真空干燥得到嵌段共聚物PPEGMEA-b-PDMAEA-b-PtBA。通过核磁氢谱分析单体转化率57.64％，理论分子量20342，所得三嵌段聚合物HLB值为14.55。
4)利用RAFT反应合成具有核壳结构的聚丙烯酸叔丁酯纳米球
将三嵌段聚合物PPEGMEA-b-PDMAEA-b-PtBA(86mg)溶于10ml去离子水中作为水相，丙烯酸叔丁酯(345mg)、乙二醇二丙烯酸酯(115mg)、AIBN(0.69mg)和均三甲苯(10μl)作为油相。将油相和水相在25ml的玻璃瓶中混合均匀后，用超声波破碎仪在70％振幅下超声15min制成微乳液，所得微乳液转入带有橡皮塞的单口瓶，充氮气除氧30min后升温开始聚合，反应温度为75℃，反应18h后得到具有核壳结构的聚丙烯酸叔丁酯纳米球，单体转化率100％，平均粒径173nm。用无水乙醇和去离子水依次透析纳米球溶液，真空冻干后得到聚丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
5)将聚丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉(100mg)加入90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜以脱除叔丁基，然后将反应混合物去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有挤压和开关效应的pH响应型聚丙烯酸纳米球冻干粉。
6)载药
将阿霉素(3mg)溶于5ml pH7.0的磷酸盐缓冲液中，然后加入纳米球冻干粉(5mg)在25℃水浴摇床中震荡混合24h，离心分离除去上清液即得负载表柔比星的pH响应型聚丙烯酸纳米球。载药量为493.9μg/mg纳米球，载药率为82.3％。
实验例
为了验证本发明中载药纳米球的挤压和开关功能，我们查了实施例1中所制备的载药纳米球的药物释放曲线，结果如图5所示。图中a线为阿霉素在pH5.0时的药物释放曲线，b线为阿霉素在pH7.4时的药物释放曲线。在核层的迅速收缩挤压(pH5.0)和壳层的收缩封闭(pH7.4)协同作用下，阿霉素在pH5.0时的药物释放速率是在pH7.4时的3倍左右。

Claims (10)

1.一种具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，其特征在于步骤包括：
(1)以聚乙二醇单甲醚(甲基)丙烯酸酯为单体，采用可逆加成-断裂链转移聚合(RAFT)方法制备线性聚合物，反应温度为55-85℃；反应时间为3-21h；单体浓度0.1-5M，单体和RAFT试剂的摩尔比范围为10:1-100:1，RAFT试剂与引发剂的摩尔比范围为1:0.05-1:0.2，反应溶剂可选甲苯、乙苯、氯苯、二氧六环、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、苯甲醚、乙醇、异丙醇等有机溶剂的一种；内标物可选均三甲苯、三恶烷等。反应后的产品在正己烷、环己烷或乙醚中沉淀两次，离心后，所的高分子真空干燥后进入步骤(2)；
(2)以步骤(1)所得的第一嵌段线性聚合物作为大分子RAFT试剂，选用阳离子单体作为第二嵌段单体，采用RAFT聚合得到两嵌段聚合物。反应后的产品在正己烷或环己烷中沉淀两次，其他反应条件同步骤(1)；
(3)以步骤(2)所得的嵌段共聚物作为大分子RAFT试剂，选用(甲基)丙烯酸叔丁酯作为第三嵌段单体，采用RAFT聚合得到三嵌段聚合物。反应溶剂可选甲苯、乙苯、氯苯、苯甲醚、二氧六环等有机溶剂的一种，反应后的产品在正己烷或环己烷中沉淀两次，其他条件同步骤(1)；
(4)将步骤(3)所得的三嵌段两亲性共聚物溶于去离子水中配成水相；(甲基)丙烯酸叔丁酯、交联剂、引发剂和内标物均三甲苯混合配成油相，交联度(交联剂占单体和交联剂质量和的百分数)范围为5-50％；油相加入水相后利用超声波破碎仪在冰水浴中制备微乳液。所得微乳液转入带有橡皮塞的单口瓶，充氮气除氧30分钟后升温开始RAFT聚合，反应温度为55-85℃，反应一段时间后得到具有核壳结构的聚(甲基)丙烯酸叔丁酯纳米球。将所得的纳米球溶液用透析袋透析24h，透析介质依次为无水乙醇和去离子水，目的是除去未参加反应的物质，然后将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到聚(甲基)丙烯酸叔丁酯纳米球冻干粉。
(5)将步骤(4)所得的产品加入到90％(体积比)的三氟乙酸水溶液中，室温下反应过夜脱除叔丁基保护，然后将反应混合物在去离子水中透析24h，将透析袋里的纳米球溶液用真空冻干机干燥，得到具有挤压和开关效应的pH响应型聚(甲基)丙烯酸纳米球干粉。
(6)将步骤(5)所得的纳米球干粉分散在药物的pH缓冲溶液中，药物的浓度范围10-2000μg/ml,pH缓冲液pH值范围6-8。药物分子通过静电作用吸附到载体上，室温下混合24h后通过离心分离得到载药纳米球。
2.根据权利要求1所述的具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的RAFT试剂为4-氰基-4-(苯基硫代甲酰硫基)戊酸(CPADB)、4-氰基-4-(丙基三硫代碳酸酯基)戊酸(CPPT)、4-氰基-4-(十二烷基三硫代碳酸酯基)戊酸(CDPT)二硫代苯甲酸枯酯(CDB)、2-氰基-2-丙基苯并二硫(CPDB)等常见RAFT试剂的一种。
3.根据权利要求2所述的具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的RAFT反应体系中，引发剂为偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈、偶氮二异丁酸二甲酯、偶氮二环己基甲腈、过氧化苯甲酰、过氧化苯甲酰叔丁酯、过氧化甲乙酮中的至少一种。反应温度为60-70℃；单体浓度为1-3M。
4.根据权利要求1所述的具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的阳离子单体为丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、甲基丙烯酸N,N-二甲氨基乙酯、丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯和甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯的至少一种。
5.根据权利要求1所述的具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的三嵌段两亲性聚合物的分子量范围5000-20000Da,亲油亲水平衡值(HLB)范围12-16，加入量为去离子水质量的0.3-1.0％，油相质量占水相质量的5-15％。
6.根据权利要求5所述的具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述超声波破碎仪的工作振幅范围30-70％，超声时间范围5-30min。
7.根据权利要求6所述的具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的交联剂为二(甲基)丙烯酸乙二醇酯、二(甲基)丙烯酸丙二醇酯、二(甲基)丙烯酸1,4-丁二醇酯、新戊二醇二(甲基)丙烯酸酯、双(2-甲基丙烯酰氧乙基)二硫醚中的至少一种；所述交联度为10-30％。
8.根据权利要求5-7任一项所述的具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(4)中反应时间12-18h；反应温度60-70℃。
9.根据权利要求1所述的具有挤压和开关效应的纳米药物载体的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的药物为在pH6-8的范围内带正电的药物，如阿霉素、吉西他滨、表柔比星等。载药时纳米球与药物的质量比范围为1.5:1-10:1。
10.一种由权利要求1所述的制备方法制得的具有挤压和开关效应的纳米药物载体，其特征在于所述药物载体的骨架为交联的聚(甲基)丙烯酸，载体外表面是亲水性的聚阳离子聚合物和聚乙烯醇构成的壳层；所述的载体粒径为80-300nm。
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