CN106620745B - 一种降低培养基灭菌过程中的美拉德反应的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种降低培养基灭菌过程中的美拉德反应的方法，向配制好的培养基中加入二元酸和一元醇，搅拌，灭菌，冷却至50~100℃后通入无菌气体使其通过培养基，停止搅拌，继续冷却，待体系分层，分出有机相和固相，培养基用于发酵。采用本发明的方法能够有效的降低体系中的美拉德反应通量，并能通过萃取原理将美拉德反应中间产物和最终产物从体系中分离出去，相比于分消灭菌工艺，本发明的一次灭菌工艺使发酵设备建设成本降低了一半、灭菌能耗降低了一半，显著地节省了设备建设和运行成本。

Description

一种降低培养基灭菌过程中的美拉德反应的方法

技术领域

本发明涉及微生物发酵工业过程的优化调控方法，具体涉及一种降低美拉德反应对微生物生长及发酵抑制作用的方法，属于微生物发酵技术领域。

背景技术

1912年法国化学家路易斯﹒卡米拉﹒美拉德在实验中偶然发现：羰基化合物（还原糖）的羰基可以与氨基化合物（氨基酸/多肽/蛋白质）中的氨基发生反应，该反应经过一系列复杂历程最终生成棕黑色的大分子物质类黑素或称拟黑素，该羰氨反应又称美拉德反应。

经过各国学者多年研究，目前公认的美拉德反应机理可分以下三个阶段：

起始阶段

还原糖与氨基酸或蛋白质发生缩合反应，生成具有亚胺或甲亚胺特性基团的有机化合物，即席夫碱；席夫碱环化生成氨基糖；氨基糖经Amadori重排生成1-氨基-1-脱氧-2-酮糖。

中间阶段

在酸性条件下，1-氨基-1-脱氧-2-酮糖经1,2-烯醇化反应，生成5-羟甲基糠醛；碱性条件下，1-氨基-1-脱氧-2-酮糖经2,3-烯醇化反应，生成还原酮类和脱氢还原酮类；1-氨基-1-脱氧-2-酮糖经Strecker降解反应生成Strecker醛类和吡嗪类等化合物。

最终阶段

该阶段反应较为复杂，历程尚未完全明确，大致是中间阶段的产物与氨基化合物聚合反应生成高分子结构不明的类黑素，此外还有一系列中间体还原酮及挥发性杂环化合物生成。

有研究表明，美拉德反应的反应速率随温度的增长呈现急剧升高的趋势，且美拉德反应部分中间产物和最终产物具有抑制微生物生长的作用，因此在微生物发酵工业中为避免还原糖类碳源与氨基化合物类氮源在高温下发生美拉德反应，通常将碳源和氮源分开灭菌，待冷却后再将其混合进行微生物发酵，而该工艺手段通常存在灭菌能耗较高、设备投入成本较大的问题。同时，美拉德反应产物还具有人们不需要的色泽和一定的致癌性，因此目前关于降低或抑制美拉德反应的文献报道主要集中在食品、医药等领域，而在微生物发酵领域的相关报道较少。

CN1256032C公开了一种能减轻色变的大豆蛋白酶解方法，该方法要求在酶解罐中添加微量的氧化剂（H₂O₂）和还原剂（Na₂SO₃、Na₂S₂O₅和NaHSO₃）将大豆酶解生成的少量低聚糖的羰基转化为羟基，以此抑制美拉德反应。首先该方法不回收循环使用添加到体系的可溶性盐，增加了生产成本；其次微生物发酵领域通常涉及高浓度还原糖-氨基化合物混合体系，因此该方法不适用于微生物发酵领域。

CN102888325A公开了一种发酵型枣酒的加工工艺，该方法在整个工艺流程中控制加工温度最高不超过55℃，以达到抑制美拉德反应并减少褐变发生。该方法无法应用于微生物发酵领域常用的121℃高温湿热灭菌操作，并且为避免后期发酵染菌而向体系中通入SO₂的方法不适用于细菌发酵培养，同时因SO₂具有腐蚀性也相应地增加了设备要求及成本。

CN104188006A公开了一种荞麦提取物、抑制果汁褐变的方法、制备苹果汁的方法，该方法先提取荞麦中具有抗氧化作用的黄酮类化合物，再将该荞麦提取物添加到混浊苹果汁中进行压榨、浓缩处理，以此实现抑制果汁褐变的目的。该方法主要针对食品加工过程中的酶促褐变，且操作步骤多，设备成本高，添加的荞麦提取物不与产品分离且不能循环使用，增加了产品成本。

综上，在微生物发酵领域中，亟需寻找一种优化调控方法，能够在不改动现有设备和高温湿热灭菌工艺的基础上，经济、有效的降低美拉德反应对微生物生长及发酵抑制作用。

发明内容

针对现有技术中在微生物发酵领域缺乏切实有效的降低美拉德反应对微生物生长及发酵抑制的问题，本发明为解决以还原糖为碳源、以氨基化合物为氮源的微生物发酵培养基在高温湿热灭菌过程中普遍发生的美拉德反应抑制微生物生长及发酵的问题，提供一种利用二元酸和一元醇作为美拉德反应抑制剂的方法，可以维持现有高温湿热灭菌工艺和设备并省去培养基分消环节，从而满足微生物发酵领域对经济、有效降低抑制微生物生长及发酵的美拉德反应的需求。

本发明的技术目的通过以下技术方案实现：

一种降低培养基灭菌过程中的美拉德反应的方法，向配制好的培养基中加入二元酸和一元醇，二元酸按10~200g/L培养基加入，二元酸和一元醇的混合摩尔比为1:0.5~2，搅拌，灭菌，冷却至50~100℃后通入无菌气体使其通过培养基，停止搅拌，继续冷却，待体系分层，分出有机相和固相，培养基用于发酵；所述二元酸选自壬二酸、癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸和十五碳二元酸中的至少一种，所述一元醇选自甲醇、乙醇和正丙醇中的至少一种。

进一步的，所述二元酸的加入量优选为50~100g/L培养基，可以保证降低美拉德反应的效果，又能节省原料。

进一步的，所述二元酸和一元醇的混合摩尔比优选为1:1~2。

进一步的，所述二元酸和一元醇选自二者发生酯化反应后可生成密度大于水、沸点高于水的酯类的二元酸和一元醇。本发明所选用的二元酸微溶或难溶于水，常温下为固态晶体或粉末，密度大于水，熔点范围为80~135℃。

进一步的，本发明所述的方法更适用于大型发酵罐内的培养基灭菌，可以在很大程度上节省工艺，在灭菌条件下，达到二元酸的熔点，形成有机相，在灭菌过程中保持搅拌，搅拌可以加强发酵罐内混合体系的动量传递、质量传递和热量传递，同时也能使水-有机两相充分混合达到或接近乳化状态，所述搅拌的转速为10～800rpm，优选为80~150rpm。此时，二元酸和一元醇部分反应生成二酸二酯类化合物。另外，在灭菌结束后，待体系冷却后再停止搅拌，防止冷却前高温下发生美拉德反应。

进一步的，待体系冷却至50~100℃时，将无菌气体通过培养基，可以将反应体系中残留的一元醇带出体系，所述无菌气体为无菌空气或无菌氮气，当培养基用于有氧发酵时采用无菌空气，当培养基用于无氧发酵时采用无菌氮气。

进一步的，继续冷却待体系分层后，优于在本发明所选择的二元酸和一元醇范围内，生成的二酸二酯类化合物不溶或微溶于水，且密度大于水，分于下层，未反应完全的二元酸析出晶体沉于底部，通过发酵罐的出料口即可将反应产物和二元酸分离出来，而培养基可直接用于发酵。大大节省了灭菌工艺，降低染菌的风险。

进一步的，所述灭菌为高温湿热灭菌，它更容易造成美拉德反应，高温湿热灭菌是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，在50～135℃高温湿热灭菌1～1000min。例如现有技术中最常用的121℃、30min灭菌条件下更适合采用本发明的方法降低美拉德反应。

进一步的，本发明的培养基尤指糖浓度和氮浓度较高的培养基，且培养基中的碳源为还原糖，具有游离醛基、半缩醛羟基或游离羰基等基团，选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖或核糖中的至少一种；所述氮源为具有氨基的有机化合物，选自牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、豆粕和玉米浆中的至少一种。

在本发明的方法中，当向培养基中添加二元酸和一元醇后，二者部分发生反应生成二酸二酯类化合物，再将培养基混合进行高温湿热灭菌处理，该培养基颜色明显比不添加二元酸和一元醇而直接混合灭菌的培养基颜色浅。将灭菌培养基中的二酸二酯类化合物及未反应完全的二元酸和一元醇分离除去后进行发酵对比实验，实验比较结果表明微生物在二元酸和一元醇处理过的培养基上的生长指标和发酵指标都明显优于未经处理的培养基对照组。有研究表明美拉德反应的中间产物席夫碱、氨基糖、5-羟甲基糠醛以及最终产物类黑素具有抑制微生物生长和发酵的作用，根据实验现象和结果推断本发明的作用机理如下：1、二元酸和一元醇部分反应生成二酸二酯类化合物，其中的羰基与培养基中的氨基化合物反应，通过阻止还原糖与氨基化合物反应来抑制美拉德反应的发生；2、生成的二酸二酯类化合物与美拉德反应的中间产物发生反应，通过减少美拉德反应体系通量降低了美拉德最终产物的生成量；3、生成的二酸二酯类化合物与培养基混合会形成水-有机两相体系，美拉德反应的中间产物和最终产物素因萃取作用而主要集中在二酸二酯类化合物的有机相中，随长二酸二酯类化合物的分离而被分离出培养基。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、二元酸和一元醇的加入能够有效的降低体系中的美拉德反应通量，并能通过萃取原理将美拉德反应中间产物和最终产物从体系中分离出去，处理后的培养基更适于微生物生长与发酵，显著地提高了培养基的每批次利用率，也提高了发酵经济性。

2、在还原糖类碳源与氨基化合物类氮源同时存在于培养基中时，相比于分消灭菌工艺，本发明的一次灭菌工艺使发酵设备建设成本降低了一半、灭菌能耗降低了一半，显著地节省了设备建设和运行成本。

3、静置分层即可分离出体系的特点使生成的二酸二酯类化合物及及未反应完全的二元酸的分离成本可以忽略不计。

综上，本发明能够提高培养基的每批次利用率，节省设备建设、运行及应用成本，满足了微生物发酵领域对经济、有效的降低美拉德反应对微生物生长及发酵抑制作用的需求，具有良好的应用前景。

具体实施方式

下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例与比较例中使用的干酪乳杆菌为抚顺石油化工研究院筛选培养的Lactobacillus casei FY-04菌株，现保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)；保藏编号：CGMCC No.3269。

实施例与比较例中使用的培养基配方为：葡萄糖150g/L、牛肉膏10g/L、蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、乙酸钠5g/L、柠檬酸氢二氨2g/L、磷酸氢二钾2g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L、吐温80 1g/L。

实施例1

在发酵罐中配制好培养基后，按100g/L培养基加入壬二酸，按壬二酸：甲醇摩尔比为1:2加入甲醇，设定发酵罐搅拌转速100rpm，通入蒸汽将发酵罐温度维持在121℃下30min以达到灭菌效果。灭菌结束后，将发酵罐温度冷却至60℃后通入无菌氮气15min，然后停止搅拌，继续冷却，静置20min后从发酵罐下出料口将有机相和固相排出。恢复搅拌转速100prm，按培养基体积10%接入干酪乳杆菌种子液，42℃度下发酵48h后取样，用铂-钴比色法测定发酵液颜色，铂-钴比色法数值越小说明发酵液颜色越浅；用600nm处吸光度测定菌体浓度，OD₆₀₀越大说明菌体浓度越高；用液相色谱法测L-乳酸浓度。

实施例2

与实施例1相比，实施例2按50g/L培养基加入癸二酸，按癸二酸：乙醇摩尔比为1:1.5加入乙醇，其他与实施例1相同。

实施例3

与实施例1相比，实施例3按150g/L培养基十一碳二元酸，按十一碳二元酸：正丙醇摩尔比为1:1加入正丙醇，其他与实施例1相同。

比较例1

与实施例1相比，比较例不加入二元酸和一元醇，其他与实施例1相同。

实施例与比较例的结果如表1所示。

表1. 实施例与比较例的发酵液色度及发酵结果

Claims (7)

1.一种降低培养基灭菌过程中的美拉德反应的方法，其特征在于：向配制好的培养基中加入二元酸和一元醇，二元酸按10~200g/L培养基加入，二元酸和一元醇的混合摩尔比为1:0.5~2，搅拌，所述搅拌的转速为10~800rpm，灭菌，所述灭菌为在121～135℃高温湿热灭菌1～1000min，冷却至50~100℃后将无菌气体通过培养基，停止搅拌，继续冷却，待体系分层，分出有机相和固相，培养基用于发酵；所述二元酸选自壬二酸、癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸和十五碳二元酸中的至少一种，所述一元醇选自甲醇、乙醇和正丙醇中的至少一种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述无菌气体为无菌空气或无菌氮气。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述无菌气体的通入时间为10~30min。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养基中的碳源为还原性糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述培养基中的碳源选自葡萄糖、果糖、半乳糖、乳糖、麦芽糖、木糖或核糖中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述培养基中的氮源为具有氨基的有机化合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述培养基中的氮源选自牛肉膏、蛋白胨、酵母提取物、豆粕和玉米浆中的至少一种。