CN106591496A - 一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因pcr检测芯片 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因PCR检测芯片，其特征在于，芯片上固定了人巨细胞病毒的125个基因的正向引物(5’‑3’)和反向引物(5’‑3’)序列，其引物的序列为Seq NO.1‑Seq NO.250。本发明可快速检测巨细胞病毒基因的感染及其表达，不但可以检测DNA样品，也可以检测cDNA样品，本发明是国内首个针对人巨细胞病毒全基因组样品检测的PCR芯片，较传统基于高通量测序的巨细胞病毒全基因组检测方法，本芯片具有快速、经济、涵盖巨细胞病毒全基因组等优点。

Description

一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因PCR检测芯片
技术领域
本发明涉及医学微生物学检测领域，尤其涉及一种可用于人组织和细胞标本及体外培养细胞中人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus，HCMV)感染或人巨细胞病毒基因表达的PCR检测芯片，可用于临床检验及相关学术研究。
背景技术
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)是一种机会性感染的双链线性DNA病毒。基因组长度235kb左右，是目前已知的拥有庞大基因组的病毒之一。人群HCMV感染率达60-100％，绝大多数属于无症状性感染，但在新生儿及免疫功能低下的人群中具有极高的发病率和致死率。其具有潜伏终身、周期性活化的特点，使得HCMV可能与机体发生较多交叉反应的机会，进而影响机体免疫状态。
HCMV基因组由极长片段(UL)和极短片段(US)外加少量终末及内部的重复片段组成，基因表达产物功能丰富。研究表明，HCMV可编码感染不同靶细胞的生长调控蛋白，从而改变其细胞亲嗜性、免疫逃避功能等，因而具有改变病毒毒力的作用。即刻早期蛋白IE1及IE2合并其他蛋白质与病毒的初始复制相关，在体内检测到此类蛋白，意味着HCMV处于复制活跃早期。研究推测，RL1、UL40、UL138等基因与病毒潜伏感染相关，其中UL138具有调控TNF信号通路的作用，通过与HSP-70蛋白的相互作用可引起细胞凋亡。除此之外，文献研究表明UL7、UL82、US9等基因具有免疫调节的作用，部分基因作为膜糖蛋白，通过调节MHC-I的数量、通路等来调节人体免疫功能，与病毒致病性存在较大关联。此外，UL97、UL28-UL29及US28基因表达的蛋白，可通过与细胞转录因子的相互作用来调控病毒的即刻早期启动；Towne株UL24基因与巨细胞病毒对内皮细胞的亲嗜性相关；UL128-UL131区则与病毒对内皮细胞、上皮细胞和树突状细胞的亲嗜性，以及病毒转移至粒细胞的速率呈正相关。Cha等人发现，HCMV Toledo株与其他低传代临床分离株基因组至少存在19个基因(UL133-UL151，称为UL/b′区)的差异，该区可能在病毒潜伏、复制、逃避机体免疫和不同组织细胞嗜性等方面作用相关。这些研究结果提示机体感染HCMV后，其免疫状态与病毒这些基因表达有着密切的关联。因而建立一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因PCR检测芯片十分必要。它不仅能够促进临床医生对HCMV感染患者进行全面的病情评估，更有助于进一步开展HCMV致病机制的基础研究。
目前，国内针对HCMV基因检测的试剂盒数量可观，但能同时进行大量相关巨细胞病毒基因的DNA及cDNA PCR检测芯片尚未出现，无法满足对人组织和细胞标本及体外培养细胞中巨细胞病毒感染或表达的涵盖全基因组的PCR检测所需。
发明内容
本发明专利的目的是提供一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因PCR检测芯片。
为达到上述目的，本发明提供一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因PCR检测芯片，检测芯片上固定了人巨细胞病毒的125个基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)，其引物的序列为Seq NO.1-Seq NO.250。
检测芯片上一个基因设置两个孔，每个孔中都固定该基因的正向引物和反向引物，两个孔的固定物相同。
检测芯片包括3个子芯片，芯片A包括RL1、RL6、RL10、RL11、RL12、RL18A、UL9、UL10、UL14、UL21A、UL23、UL24、UL26、UL30、UL31、UL32、UL33、UL47、UL48、UL50、UL52、UL57、UL71、UL76、UL78、UL79、UL82、UL84、UL94、UL95、UL98、UL120、UL121、UL124、US1、US8、US14、US16、US19、US21、US22、US28、US31
基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)；
芯片B包括RL5A、UL5、UL13、UL15A、UL34、UL41A、UL43、UL44、UL53、UL70、UL73、UL73、UL77、UL91、UL97、UL99、UL102、UL103、UL105、UL111A、UL115、UL116、UL130、UL132、UL133、UL135、UL138、UL140、UL141、UL142、UL144、UL148、UL150、US7、US9、US10、US11、US12、US13、US20、US23、US26、US30基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)；
芯片C包括UL2、UL4、UL6、UL7、UL8、UL16、UL17、UL19、UL25、UL35、UL36、UL38、UL40、UL42、UL45、UL46、UL49、UL51、UL54、UL55、UL56、UL69、UL72、UL74A、UL83、UL85、UL86、UL87、UL88、UL89、UL92、UL100、UL117、UL128、UL136、UL145、UL146、US6、US15、US29基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)。
芯片A的退火温度为64℃。
芯片B的退火温度为60℃。
芯片C的退火温度为57℃。
检测芯片使用2×Taq PCR Mastermix.
芯片上固定的人巨细胞病毒的125个基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)分别为0.6μL(10μM)。
芯片上固定有内参GAPDH引物，包括FP和RP，FP序列为Seq NO.251：5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’序列，RP序列为Seq NO.252：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
检测芯片的反应条件为：95℃反应5min；95℃反应30s，退火30s后72℃反应1min，35个循环；延伸72℃反应10min。
检测芯片的构建方法：
首先针对巨细胞病毒基因组各个基因构建特异性引物，包括正向引物和反向引物；
其次，本检测芯片使用标准株确定每个引物的特异性。以本实验室分离保存的HCMV临床病毒株(其筛选分离保存方法为现有技术)作为模板，探索各引物的最适PCR条件。琼脂糖电泳确定条带单一且符合目标大小后，将PCR产物纯化送测序，并将测序结果与标准株Toledo株进行比对验证。本芯片设计的引物有模板就能扩增出目标条带，无模板就不能扩增出产物(图1，阴性对照未显示)。
最后，在检测芯片上固定上述各基因的正向引物和反向引物。
构建特异性引物的步骤为：从NCBI数据库(National Center for BiotechnologyInformation)获取17株HCMV病毒株的基因组序列，包括HAN31(GenBank：JX512208.1)、U11(GenBank：GU179290.1)、HAN20(GenBank：GQ396663.1)、HAN13(GenBank：GQ221973.1)、HAN38(GenBank：GQ396662.1)、Merlin(GenBank：AY446894.2)、JP(GenBank：GQ221975.1)、JHC(GenBank：HQ380895.1)、AD169(GenBank：FJ527563.1)、3301(GenBank：GQ466044.1)、3157(GenBank：GQ221974.1)、VR1814(GenBank：GU179289.1)、AF1(GenBank：GU179291.1)、TR(GenBank：KF021605.1)、U8(GenBank：GU179288.1)、Toledo(GenBank：GU937742.2)、Towne(GenBank：FJ616285.1)，对巨细胞病毒基因组各个基因分别进行同源性分析，并在每个基因的保守区设计上下游引物。
再将设计好的引物与NCBI Primer-BLAST nr数据库比对，比对对象为全部物种基因组，设计出只扩增出巨细胞病毒特异的基因。设计的引物需排除宿主基因组的扩增，排除其它疱疹病毒基因组的扩增。
检测芯片的使用方法：
步骤一，在检测芯片每孔中加入2×Taq PCR混合缓冲液7.5μL，样品模板1μL，灭菌双蒸水补足至15μL；
步骤二，对检测芯片进行预变性95℃5min，变性95℃30S，退火温度30S后反应72℃1min共35个循环，延伸72℃10min；
步骤三，采用含有溴化乙锭的1.5％的琼脂糖凝胶进行鉴定，在紫外凝胶成像仪下观察扩增的特异性条带，对比内参条带，使用Image J软件进行相应基因的半定量分析。
使用本实验室分离的巨细胞临床株作为模板，分别使用UL133-UL138、UL144和UL146的全长引物扩增获得目的基因，用含EB的1.5％琼脂糖凝胶拍照鉴定并测序验证，将测序正确的PCR产物克隆到T载体上，测定浓度并换算成拷贝数，系列稀释成104，103，102，101，and100copies。将系列稀释的样品作为模板来检测UL133-UL138、UL144和UL146基因引物的敏感性，以出现目的条带作为阳性指标。结果显示本芯片引物的检测敏感性至少达103copies/每个反应，部分高达102copies/每个反应(图2)。
为了能够实现快速、大批量的巨细胞病毒基因组PCR检测，我们对设计的126个基因引物的PCR条件进行了再优化，将在同一条件能够扩增出目的条带的引物组合在了一个芯片上，最终设计出了一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因PCR检测芯片，其由3个子芯片组成，分片为芯片A(退火温度：64℃，44个基因)，芯片B(退火温度：60℃，43个基因)，芯片C(退火温度：57℃，41个基因)，本芯片每个扩增的基因设计了两个复孔(表2)。其中本芯片的反应体系如下：固定于PCR芯片中的上下游引物(正向引物和反向引物)各0.6μL(10μM)，2×Taq PCR Mastermix 7.5μL，模板1μL，灭菌双蒸水补足至15μL。反应条件如下：95℃5min；95℃30s，退火温度(64℃，60℃或57℃)30s，72℃1min，35个循环；延伸72℃10min。
本检测芯片固定在PCR芯片上的内参GAPDH引物序列为：FP：5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’，RP：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。通过与内参基因GAPDH表达量的对比(半定量PCR)，可初步判定各基因的相对表达量。
利用此芯片检测HCMV基因组，不但可以检测DNA样品，也可以检测cDNA样品；不但可用于人细胞标本及体外培养细胞的检测，也可用于人组织标本的检测；此外，本芯片既可用于HCMV表达谱的检测，也可用于HCMV基因表达的定量和半定量PCR检测；本芯片具有快速、经济、涵盖巨细胞病毒全基因组等优点。最终，我们建立了一种涵盖全基因组包含125个基因的HCMV PCR检测芯片。所使用到的仪器有PCR扩增仪，定量PCR仪，移液器，超速低温离心机，电泳仪。所使用的主要试剂有Taq聚合酶，特异性引物对。
附图说明
图1：人巨细胞病毒基因PCR检测芯片扩增后电泳图(M：100bp DNA marker；泳道1：目的基因).使用本实验室分离保存的临床株作为扩增模板。
图2：引物敏感性检测.UL133-UL138，UL144和UL146基因通过PCR扩增，并在1.5％的琼脂糖凝胶中鉴定；M：100bp DNA marker；泳道1-5分别为：104copies/每个反应，103copies/每个反应，102copies/每个反应，101copies/每个反应，100copies/每个反应。
图3：4个混合体系外周血单个核细胞HCMV基因DNA及cDNA检测结果图(S：SLE患者；N：正常人；A：DNA模板；B：cDNA模板)
图4：胃癌及癌旁组织HCMV基因DNA及cDNA检测结果图(T：癌组织；N：癌旁组织；A：3例胃癌及癌旁组织HCMV基因DNA检测结果；B：6例胃癌及癌旁组织HCMV基因cDNA检测结果)
具体实施例方式
本发明是一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因PCR检测芯片，芯片上固定了人巨细胞病毒的125个基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)序列，其引物的序列为SeqNO.1-Seq NO.250，见下表1：125个基因引物序列及PCR反应条件表
表1 Seq NO.1-Seq NO.250
检测芯片3个子芯片组成，分片为芯片A(退火温度：64℃，43个基因和1个GAPDH)，芯片B(退火温度：60℃，42个基因和1个GAPDH)，芯片C(退火温度：57℃，40个基因和1个GAPDH)，本芯片每个扩增的基因设计了两个复孔(表2，表3，表4)。芯片如下三个表：
表2 芯片A(退火温度：64℃，43个基因和1个GAPDH)
表3 芯片B(退火温度：60℃，42个基因和1个GAPDH)
RL5A RL5A UL5 UL5 UL13 UL13 UL15A UL15A UL34 UL34 UL41A UL41A
UL43 UL43 UL44 UL44 UL53 UL53 UL70 UL70 UL73 UL73 UL77 UL77
UL91 UL91 UL97 UL97 UL99 UL99 UL102 UL102 UL103 UL103 UL105 UL105
UL111A UL111A UL115 UL115 UL116 UL116 UL130 UL130 UL132 UL132 UL133 UL133
UL135 UL135 UL138 UL138 UL140 UL140 UL141 UL141 UL142 UL142 UL144 UL144
UL148 UL148 UL150 UL150 US7 US7 US9 US9 US10 US10 US11 US11
US12 US12 US13 US13 US20 US20 US23 US23 US26 US26 US30 US30
GAPDH GAPDH
表4 芯片C(退火温度：57℃，40个基因和1个GAPDH)
本发明首先针对巨细胞病毒基因组各个基因构建特异性引物。选取17株(包括HAN31、U11、HAN20、HAN13、HAN38、Merlin、JP、JHC、AD169、3301、3157、VR1814、AF1、TR、U8、Toledo、Towne)HCMV病毒株，对巨细胞病毒基因组各个基因分别进行同源性分析，并在每个基因的保守区设计上下游引物。
再将设计好的引物与NCBI Primer-BLAST nr数据库比对，比对对象为全部物种基因组，设计的引物排除宿主基因组的扩增，排除其它疱疹病毒基因组的扩增，只能扩增出巨细胞病毒特异的基因。
随后，为验证本芯片的实用性，分别对人单个核细胞、胃癌及癌旁组织的DNA、cDNA进行检测。本研究抽提了8例SLE患者外周血单个核细胞的mRNA逆转录成的cDNA(4例SLE患者形成一个混合模板样品，分别为ScDNA1，ScDNA2)及DNA(4例SLE患者形成一个混合模板样品，分别为SDNA1，SDNA2)，以及8例健康对照外周血单个核细胞的mRNA逆转录成的模板cDNA(4例健康对照外周血单个核细胞样品形成一个混合模板，分别为NcDNA1，NcDNA2)，及对应的DNA(NDNA1，NDNA2)，使用本发明PCR芯片检测结果如下(图3中的A和B)。此外，我们分别抽提3例胃癌患者及癌旁组织DNA及mRNA逆转录成cDNA作为模板(T为胃癌组织标本，N为癌旁正常组织)，使用本发明PCR芯片分别对其进行了检测，结果如图4中的A和B。
实例一使用本发明进行人外周血单个核细胞、胃癌组织及癌旁组织HCMV基因表达检测
步骤1：外周血单个核细胞的分离
1.所需试剂及配制方法
A：10×PBS缓冲液：称取NaCl，8g；Na2HPO4，1.42g；KH2PO4，0.27g；KCl，0.2g。加入去离子水800ml后，滴加浓盐酸至PH＝7.4，用去离子水定容至1L，高压蒸汽灭菌后常温保存。注：进行外周血单个核细胞清洗时须先将10×PBS用去离子水稀释10倍后，方可使用。
B：0.9％生理盐水。
C：外周血淋巴细胞分离液。
2.外周血单个核细胞分离步骤
A.取当天静脉采取的EDTA抗凝血2ml，2管，离心3000rpm 4℃下10min。
B.弃上层血浆，加入等体积的下层血细胞悬液的0.9％生理盐水，轻轻吹打混匀，再将其缓慢沿壁加入到等体积的外周血淋巴细胞分离液中，勿使上下层混合，离心2000rpm20min。
C.使用3ML吸管抽出白膜层的细胞放入新的15ML离心管中，加入10倍体积的1×PBS缓冲液充分混匀，离心1000rpm 20min。
D.弃上清后，重复步骤C两次，以便彻底清除外周血淋巴细胞分离液。
E.一管加入1ml Trizol用于提取RNA，另一管用于提取基因组DNA。
步骤2：外周血单个核细胞RNA提取方法
1.所需试剂及配制方法
A.RNA清洗液：量取无水乙醇80ml，DEPC水20ml，充分混匀后，4℃保存。
2.外周血单个核细胞RNA提取步骤
A.在清洗完毕的单核细胞沉淀中加入1ml Trizol后，室温下静置5-10分钟。
B.加入0.2ml的氯仿，手动剧烈震荡管体15S混匀，室温下静置5分钟，12000rpm4℃下，离心15min。
C.将水相转移至一新管中，加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀，-20℃下静置过夜。
D.12000rpm 4℃，离心20min，小心弃去上清。
E.缓缓沿管壁加入4℃保存的80％乙醇1ml，8000rpm 4℃，离心5分钟。
F.小心弃去上清后，7500rpm离心30S，用移液器吸尽残余液体，保留沉淀。
G.将沉淀于室温下静置干燥5-10分钟，确认干燥后，加入20μL DEPC水溶解沉淀，测定RNA纯度及浓度，即可用于逆转录或于-80℃超低温冰箱保存备用。
步骤3：胃癌组织RNA提取方法
1.所需试剂及配制方法
80％乙醇溶液：量取无RNase的无水乙醇8ml，以无RNase的DEPC水定容至10ml，置于4℃下保存。
2.组织RNA提取步骤
A.取无RNA酶的2ml EP管，加入经无水乙醇浸泡后、无RNA酶的DEPC水清洗两遍的1大2小三粒钢珠，再加入100ml Trizol试剂，置于-80℃下进行预冷。
B.取一适量大小的组织，放入预冷后的2ml EP管中，将EP管放入研磨盒中，设定条件为65HZ，90S在组织研磨机中研磨。
C.研磨结束后，取出EP管，加入1ml Trizol试剂混匀样品，转移至新的无RNA酶的1.5ml EP管中。
D.加入0.2ml氯仿，盖紧管盖，手动剧烈震荡管体15S，以充分乳化溶液，呈乳白色，室温下静置5min后，12000rpm 4℃，离心15min。
E.用移液枪小心转移上层无色水相至新的无RNA酶的1.5mL EP管中，注意勿吸白色中间层。于装有无色水相的EP管中加入等体积的预冷异丙醇，上下颠倒混匀，-20℃下静置过夜。
F.取出过夜后的EP管，12000rpm 4℃，离心20min。
G.小心弃去上清，用移液枪缓慢吸尽剩余液体，沿管壁缓缓加入4℃保存的80％乙醇1ml，8000rpm 4℃，离心5min。
H.小心弃乙醇，7500rpm 4℃，离心30S，用移液枪吸去剩余乙醇，于室温下静置干燥5-10min。
I.干燥完毕后，加入20μl灭菌双蒸水，可用移液枪轻轻吹打溶解沉淀。即可用于逆转录或于-80℃超低温冰箱保存。
步骤4：RNA提纯方法及逆转录成cDNA
1.RNA提纯步骤
A.RNA 10μg，DNase I 10uL，10×reaction buffer with MgCl210μL，以DEPC水补至100μL，37℃孵育30min。
B.加入10μL 50mM EDTA，65℃10min用以灭活DNase。
C.加入等体积的(约110μL)酚-氯仿-异戊醇24∶25∶1混合液(注：配制过程中需先加酚再加氯仿)，震荡混匀至其成为乳浊液，室温下静置2min。12000rpm 4℃，离心15min，吸取上层水相转移至新的无RNA酶EP管中。
D.加入等体积氯仿充分混匀，12000rpm 4℃下，离心15min，吸取上层水相，转移至新的无RNA酶EP管中，重复操作D一次；
E.加入0.1倍水相体积的3M NaAc Buffer均匀混合。再加入4μL DNAmate混匀，加入2.5倍体积-20℃保存的无水乙醇再次混匀，于-20℃静置过夜；
F.12000rpm 4℃下，离心20min，弃上清，置于室温下干燥5-10min，加入20μL DEPC水，溶解沉淀。
2.RNA逆转录步骤
A.取纯化后的RNA 1.0μg，以DEPC水补至14μL，65℃孵育5min。
B.加入ReverTraqPCR RT Kit中引物1μL，逆转录酶1μL，5×buffer 4μL，37℃孵育1h。98℃灭活酶5min，逆转录产物于-20℃冰箱保存。
步骤5：标本HCMV表达情况(半定量)的检测方法
1.反应体系：上下游引物(10μmol)固定于孔内，各0.6μL，2×Taq PCR混合缓冲液7.5μL，模板1μL，灭菌双蒸水补足至15μL。其中每板设置2孔进行GAPDH扩增。
2.反应条件：预变性95℃5min，变性95℃30S，相应退火温度(板1、2、3)30S，72℃1min共35个循环，延伸72℃10min。
3.产物检测：采用含有溴化乙锭的1.5％的琼脂糖凝胶鉴定。于井梳孔中加入5μLPCR产物，120V电压下电泳30-40分钟后，紫外凝胶成像仪下观察扩增的特异性条带，对比内参条带，使用Image J软件进行相应基因的半定量分析。
实例二使用本发明进行人外周血单个核细胞、胃癌组织及癌旁组织HCMV感染检测
步骤1：DNA提取方法
1.试剂以及配制
A.电泳50×TAE缓冲液：称取Tris 242g，Na2EDTA·2H2O 37.2g加去离子水约800mL，加入57.1mL的醋酸，定容至1L。电泳或制备琼脂糖凝胶时，50×TAE稀释50倍成1×TAE缓冲液。
B.琼脂糖凝胶的配制
配制适量的电泳以及制胶用的1×TAE缓冲液，根据制胶量及凝胶浓度准确称量琼脂糖，加入到锥形瓶，于微波炉中加热融化琼脂糖。溶液冷却几分钟后加入溴化乙锭溶液(终浓度0.5mg/ml)，并充分混匀。将琼脂糖溶液倒入制胶模具中，然后在适当位置处插入梳子。凝胶厚度一般在3-5mm之间。室温下使胶凝固(30分钟至1小时)即可使用
2.DNA提取步骤
A.用天根血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取分离DNA
①人外周血单核细胞：在沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。
②胃癌及癌旁组织：首先打碎处理为细胞悬液，10000rpm(11200xg)4℃，离心1min，倒尽上清后，加入200μL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。
B.加入20μL Proteinase K溶液，混匀，56℃金属浴放置5-10min，直至完全溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠，再进行下一步骤。
C.加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
D.加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15S，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。
E.将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm离心30S，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
F.向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30S，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
G.向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW(使用前请先检查是否加入无水乙醇)，12000rpm离心30S，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。
H.重复操作步骤G。
I.将吸附柱CB3放入收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。
J.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。
K.测DNA浓度及琼脂糖凝胶鉴定DNA质量。
步骤2：标本HCMV感染情况的检测方法
1.反应体系：上下游引物(10μmol，各0.6μL)固定于芯片各孔中，2×Taq PCR混合缓冲液7.5μL，模板1μL，灭菌双蒸水补足每孔至15μL。
2.反应条件：预变性95℃5min，变性95℃30S，相应退火温度(板1、2、3)30S，72℃1min共35个循环，延伸72℃10min。
3.产物检测：采用1.5％的琼脂糖凝胶，溴化乙锭染色。于井梳孔中加入5μl PCR产物，120V电压下电泳30-40分钟后，紫外投射仪下观察扩增的特异性条带。

Claims (10)

1.一种涵盖全基因组的人巨细胞病毒基因PCR检测芯片，其特征在于，检测芯片上固定了人巨细胞病毒的125个基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)，其引物的序列为SeqNO.1-Seq NO.250。
2.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，检测芯片上一个基因设置两个孔，每个孔中都固定该基因的正向引物和反向引物，两个孔的固定物相同。
3.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，检测芯片包括3个子芯片，芯片A包括RL1、RL6、RL10、RL11、RL12、RL18A、UL9、UL10、UL14、UL21A、UL23、UL24、UL26、UL30、UL31、UL32、UL33、UL47、UL48、UL50、UL52、UL57、UL71、UL76、UL78、UL79、UL82、UL84、UL94、UL95、UL98、UL120、UL121、UL124、US1、US8、US14、US16、US19、US21、US22、US28、US31基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)；
芯片B包括RL5A、UL5、UL13、UL15A、UL34、UL41A、UL43、UL44、UL53、UL70、UL73、UL73、UL77、UL91、UL97、UL99、UL102、UL103、UL105、UL111A、UL115、UL116、UL130、UL132、UL133、UL135、UL138、UL140、UL141、UL142、UL144、UL148、UL150、US7、US9、US10、US11、US12、US13、US20、US23、US26、US30基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)；
芯片C包括UL2、UL4、UL6、UL7、UL8、UL16、UL17、UL19、UL25、UL35、UL36、UL38、UL40、UL42、UL45、UL46、UL49、UL51、UL54、UL55、UL56、UL69、UL72、UL74A、UL83、UL85、UL86、UL87、UL88、UL89、UL92、UL100、UL117、UL128、UL136、UL145、UL146、US6、US15、US29基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)。
4.根据权利要求3所述的检测芯片，其特征在于，芯片A的退火温度为64℃。
5.根据权利要求3所述的检测芯片，其特征在于，芯片B的退火温度为60℃。
6.根据权利要求3所述的检测芯片，其特征在于，芯片C的退火温度为57℃。
7.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，检测芯片还附有2×Taq PCRMastermix。
8.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，芯片上固定的人巨细胞病毒的125个基因的正向引物(5’-3’)和反向引物(5’-3’)分别为0.6μL。
9.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，检测芯片的反应条件为：95℃反应5min；95℃反应30s，退火30s后72℃反应1min，35个循环；延伸72℃反应10min。
10.根据权利要求1所述的检测芯片，其特征在于，检测芯片上固定有内参GAPDH引物，包括FP和RP，FP序列为Seq NO.251：5’-AACTCTGGTAAAGTGGATATTG-3’序列，RP序列为SeqNO.252：5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108300730A (zh) * 2018-02-02 2018-07-20 暨南大学 含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒、基因工程菌及其应用
CN108300729A (zh) * 2018-02-02 2018-07-20 暨南大学 含有人巨细胞病毒ul124基因的重组质粒、基因工程菌及其应用
CN110132946A (zh) * 2019-06-11 2019-08-16 安徽师范大学 一种适配体传感器及其制备方法和应用
WO2020041414A1 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101760560A (zh) * 2008-10-23 2010-06-30 上海复星医药（集团）股份有限公司 一种人巨细胞病毒(hcmv)荧光pcr检测方法
US8933045B2 (en) * 2009-03-11 2015-01-13 University Of Massachusetts Modulation of human cytomegalovirus replication by micro-RNA 132 (miR132), micro-RNA 145 (mi145) and micro-RNA 212 (miR212)

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101760560A (zh) * 2008-10-23 2010-06-30 上海复星医药（集团）股份有限公司 一种人巨细胞病毒(hcmv)荧光pcr检测方法
US8933045B2 (en) * 2009-03-11 2015-01-13 University Of Massachusetts Modulation of human cytomegalovirus replication by micro-RNA 132 (miR132), micro-RNA 145 (mi145) and micro-RNA 212 (miR212)

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J CHAMBERS等: "DNA microarrays of the complex human cytomegalovirus genome: profiling kinetic class with drug sensitivity of viral gene expression", 《JOURNAL OF VIROLOGY》 *
郭刚强等: "人巨细胞病毒US31基因序列特征分析及B细胞表位预测", 《温州医科大学学报》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108300730A (zh) * 2018-02-02 2018-07-20 暨南大学 含有人巨细胞病毒ul140基因的重组质粒、基因工程菌及其应用
CN108300729A (zh) * 2018-02-02 2018-07-20 暨南大学 含有人巨细胞病毒ul124基因的重组质粒、基因工程菌及其应用
WO2020041414A1 (en) * 2018-08-21 2020-02-27 Gen-Probe Incorporated Compositions and methods for amplifying, detecting or quantifying human cytomegalovirus
CN110132946A (zh) * 2019-06-11 2019-08-16 安徽师范大学 一种适配体传感器及其制备方法和应用
CN110132946B (zh) * 2019-06-11 2021-09-28 安徽师范大学 一种适配体传感器及其制备方法和应用

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