CN106591423A

CN106591423A - 一种基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法

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Publication number: CN106591423A
Application number: CN201611070577.5A
Authority: CN
Inventors: 姜玮; 王磊; 徐晓文
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2016-11-29
Filing date: 2016-11-29
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2036-11-29
Also published as: CN106591423B

Abstract

本发明公开了一种基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法，包括银纳米粒子和修饰在银纳米粒子表面的平末端杂交双链，所述杂交双链由单链DNA和与所述单链DNA部分互补的核苷酸序列杂交而成，所述单链DNA由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成，所述核苷酸序列与端粒酶结合底物链完全互补，所述杂交双链通过连续胞嘧啶链修饰在银纳米粒子的表面。本发明制备的银纳米探针由于银纳米表面双链DNA的刚性结构和纳米粒子表面平端之间的堆叠作用，倾向于聚集并显示灰色，在端粒酶作用下，端粒酶结合底物链被延伸，由此在银纳米粒子表面形成了摇摆DNA末端，使银纳米粒子的稳定性增强，其倾向于分散态，并显示黄色。

Description

一种基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法

技术领域

本发明属于分析检测领域，具体涉及一种基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法。

背景技术

人端粒酶是由端粒酶RNA和端粒酶逆转录酶组成的核糖核蛋白，能够催化端粒重复序列(TTAGGG)_n添加在端粒的3’端，补偿在细胞分裂过程中端粒的缩短。研究表明，端粒酶活性在大多数恶性肿瘤细胞中过度表达，是肿瘤细胞持续分裂乃至永生化的原因。作为人类肿瘤的最光谱标志物，端粒酶活性检测在癌症争端和治疗中极具吸引力。不同的技术，包括端粒重复序列扩增法(TRAP)、电化学方法、荧光法、表面等离子体共振、场效应晶体感应器、微阵列和扫描芯片，已被发展用于端粒酶活性的检测。与这些方法相比，比色法使得对复杂仪器的依赖最小化，可实现目视测定，将促进便携式、现场诊断和更易操控的检测方式。基于金纳米粒子的端粒酶活性比色分析方法已被建立。但是，根据粒子尺寸，金纳米粒子的摩尔消光系数仅有其同族元素的几分之一到几百分之一，极大地限制了检测灵敏度的提高。

除金纳米粒子外，银纳米粒子也是重要的光学报告单元。银纳米粒子较之金纳米粒子的优势在于：(1)银纳米粒子比相同尺寸的金纳米粒子的摩尔消光系数更高，原则上灵敏度更高；(2)银的价格比金便宜50倍，有利于实现更加经济和易于推广的分析；(3)作为等离子体结构，银纳米粒子赋予了比色分析除吸收光谱之外的更多定量检测的选择。但是，银纳米粒子与如巯基和氨基等的传统固定基团之间的相互作用较弱，且在修饰条件下很容易被氧化。这些缺陷使得银纳米粒子难以被稳定地修饰生物分子，限制了其在检测中的应用范围。所报道的被分析物主要是掺杂在缓冲液或生物流体中的合成/外源性目标物。相比之下，对自有机体中内源性目标物的检测是风险评估和既定诊断的先决条件。

发明内容

为了解决上述现有技术中存在的不足，本发明的一个目的是提供一种用于检测端粒酶活性的银纳米探针，该银纳米探针在端粒酶的作用下，修饰在银纳米颗粒上的DNA的平末端被延长，产生短链DNA摇摆末端，其能增强银纳米粒子的稳定性，从而抵抗在DNA平末端条件下的聚集。

本发明的第二个目的是提供上述银纳米探针的制备方法，通过银-胞嘧啶配位作用，多聚胞嘧啶被用作锚定序列，以迅速、有效的方式将DNA稳定地修饰在银纳米粒子上。

本发明的第三个目的是提供上述银纳米探针在检测端粒酶活性中的应用。

本发明的第四个目的是提供基于上述银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法，制备得到的银纳米探针与端粒酶作用，产生对应的颜色，端粒酶的活性越大、数量越多，产生的颜色就越深，通过对不同浓度的端粒酶进行比色检测，作出标出曲线，根据标准曲线，即可确定对应的待检测的端粒酶的数量，试验发现，本发明制备的银纳米探针能够获得比金纳米探针类似物更高的灵敏度。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：

一种用于检测端粒酶活性的银纳米探针，包括银纳米粒子和修饰在银纳米粒子表面的若干条平末端杂交双链，所述杂交双链由单链DNA和与所述单链DNA部分互补的核苷酸序列杂交而成，所述单链DNA由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成，所述核苷酸序列与端粒酶结合底物链完全互补，所述杂交双链通过连续胞嘧啶链修饰在银纳米粒子的表面。

平末端是指当限制酶从识别序列的中心轴线处切开时，切开的DNA两条单链的切口是平整的，这样的切口叫平末端。

其中的，端粒酶结合底物链是指与端粒酶结合底物完全互补的链，与另一条核苷酸序列互补，形成的具有DNA平末端的部分杂交双链结构。由于银纳米表面双链DNA的刚性结构和纳米粒子表面平端之间的堆叠作用，银纳米粒子的稳定性降低，倾向于聚集并显示灰色。但是，在端粒酶作用下，端粒酶结合底物链被延伸，产生单链端粒酶重复序列，由此在银纳米粒子表面形成了摇摆DNA末端。由于纳米粒子末端增强的柔性和增加的表面电荷数量，银纳米粒子的稳定性增强，其倾向于保持分散态，并显示黄色。端粒酶的活性越大、数量越多，黄色就越深，测得的吸光度就越大，所以，可以通过测定检测体系的吸光度确定端粒酶的活性。

单链DNA中的连续胞嘧啶链可以与银纳米粒子进行配位结合，将杂交双链修饰在银纳米粒子的表面。端粒酶结合底物链位于末端，可以在端粒酶的作用下，生成单链端粒酶重复序列。间隔链可使得端粒酶底物区域自银纳米粒子表面隔开，增强与溶液相中端粒酶间的接触和作用几率。

优选的，所述端粒酶结合底物链为AATCCGTCGAGCAGAGTT。

优选的，每个银纳米粒子的表面修饰有12-16条平末端杂交双链

优选的，连续胞嘧啶链中的胞嘧啶的数量为10-30个。

优选的，所述间隔链为连续胸腺嘧啶间隔链T_n，其中n为连续胸腺嘧啶的数量，n为4-6，优选为5。

上述银纳米探针的制备方法，包括如下步骤：

一条由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成的短链DNA与另一条互补DNA预杂交，得到杂交双链，互补DNA与所述端粒酶结合底物链完全互补；所述杂交双链与银纳米粒子按设定比例混合，在混合液中加入缓冲液，培育后得到银纳米探针。

优选的，所述预杂交时，将等摩尔的短链DNA与互补DNA混合后，在95-100℃退火8-15min，缓慢冷却后，即得。

退火过程为DNA变性解离成单链的过程，在缓慢冷却过程中，互补的DNA单链会重新形成双螺旋结构，得到杂交双链。

优选的，银纳米探针的培育方法，包括如下步骤：

1)将杂交双链与银纳米粒子的混合液在室温条件下，搅拌1.5-2.5h；

2)向混合液中加入柠檬酸缓冲液，使柠檬酸的最终浓度为3.5-4.5mM，培育25-35min；

3)向混合液中继续加入柠檬酸缓冲液，使柠檬酸的最终浓度为7.5-8.5mM，培育25-35min；

4)向混合液中加入磷酸盐缓冲液，使磷酸盐的最终浓度为20-22mM，培育55-65min，即得。

每一步骤中的培育时间延长，使得DNA能够通过多聚胞嘧啶更稳定地修饰在银纳米粒子上。

进一步优选的，上述培育方法还包括将制备得到的银纳米探针用Tris-HCl缓冲液洗涤的过程。

更进一步优选的，所述Tris-HCl缓冲液的浓度为8-12mM。该浓度的缓冲液可提供略偏碱性的pH值以利于银纳米探针的保存，同时相对较低的离子强度可避免银纳米探针自身发生聚集。

上述银纳米探针在检测端粒酶活性中的应用。

本发明中关于在端粒酶活性检测中的应用、检测端粒酶活性的方法既可以以疾病诊断或治疗为目的，也可以非疾病诊断或治疗为目的。

一种用于端粒酶活性检测的试剂盒，包括上述银纳米探针、5×TRAP缓冲液、dNTPs溶液、BSA溶液和水。

基于上述银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法，包括如下步骤：

将等体积、不同浓度的细胞裂解后，获得含有不同浓度端粒酶的细胞裂解液，将细胞裂解液与5×TRAP缓冲液、dNTPs溶液、BSA溶液、纯水以及上述银纳米探针混匀，培育后，检测650nm、395nm处的吸光度A650和A395，A650除以A395得到吸光度比值，构建吸光度比值与细胞浓度的线性方程；

对待测样品，可通过测定样品的吸光度比值，带入线性方程，计算得到样品的细胞浓度。端粒酶活性与HeLa细胞浓度正相关，细胞浓度越高则端粒酶活性越大。

dNTPs：核苷酸。

BSA：牛血清白蛋白。

优选的，所述细胞为HeLa细胞。

优选的，所述培育的条件为：在30℃培育，培育时间为1h。

在本发明的一个具体实施方式中，5×TRAP缓冲液的组成包括：100mM Tris-HCl、7.5mM MgCl₂、315mM KCl、0.025％Tween-20和5mM EGTA，TRAP缓冲液的pH值为8.3。TRAP缓冲液提供适当的一价、二价离子浓度和溶液pH值，以使端粒酶在该缓冲条件下具有较高的活性。

优选的，在本发明的一个具体实施方式中，10μL 5×TRAP缓冲液、5μL 10mMdNTPs、5μL 10mg/mL BSA、5μL经DEPC处理过纯水、20μL银纳米探针和5μL HeLa细胞裂解液混匀后，培育。

优选的，吸光度比值与细胞浓度的线性方程为：y＝-0.062x+0.79(y为吸光度比值，x为细胞浓度)，相关系数R＝0.95。

上述线性方程的线性范围为1-50cells/μL。

本发明的有益效果为：

1)本发明制备的银纳米探针由于银纳米表面双链DNA的刚性结构和纳米粒子表面平端之间的堆叠作用，稳定性降低，倾向于聚集并显示灰色，在端粒酶作用下，端粒酶结合底物链被延伸，产生单链端粒酶重复序列，由此在银纳米粒子表面形成了摇摆DNA末端，使银纳米粒子的稳定性增强，其倾向于分散态，并显示黄色。颜色变化明显，可以用于可视化检测端粒酶的活性；

2)使用银纳米探针比色法检测端粒酶的活性的检测限低至1cell/μL，具有更高的检测灵敏度。

附图说明

图1是基于银纳米探针比色检测端粒酶活性的原理图(A)和比色检测结果(B)；

图2是银纳米探针在不与端粒酶作用(-)或与自200cells/μL HeLa细胞中提取的端粒酶作用(+)时的透射电子显微镜(A)、琼脂糖凝胶电泳(B)和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(C)表征；

图3为C10-dTS-AgNP(A),C20-dTS-AgNP(B)和C30-dTS-AgNP(C)与自0,2,20and200cells/μL浓度的HeLa细胞中提取端粒酶作用时的吸光度比值(A650/A395)随时间的变化；

图4为C20-dTS-AgNP与自不同浓度HeLa细胞中提取的端粒酶作用时的吸光度比值(A650/A395)随时间的变化(A)，以及时间终点的吸光度比值与细胞浓度的点关系图(B)；

图5为基于银纳米探针的对应于不同细胞浓度端粒酶活性(A)、活性和非活性端粒酶(B)以及从癌细胞和正常体细胞中提取的端粒酶(C)的目视检测对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。

试剂和仪器

硝酸银、柠檬酸钠、硼氢化钠、氯金酸、牛血清蛋白和3’-叠氮-3’-脱氧胸苷(AZT)从Sigma-Aldfich购得。CHAPS裂解缓冲液从Millipore公司获得。Tris碱、硼酸、乙二胺四乙酸二钠盐、乙二醇双四乙酸、四种脱氧核糖核酸(dNTPs)、琼脂糖凝胶和40％(w/v)丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(19:1)溶液购于上海生工生物技术有限公司。焦碳酸二乙酯(DEPC)和二硫苏糖醇(DTT)购于BBI生命科学公司。Tween-20购自Salarbio公司。SYBR gold核酸染色剂购自Invitrogen公司。实验中所用化学品都为分析纯，且使用过程中无需进一步的纯化。所有的溶液均采用超纯水制备(>18.25MΩ·cm)。该工作中的寡核苷酸由上海生工生物技术有限公司合成和纯化，其序列在表格1中列出。

紫外可见吸收光谱在带有控温装置的U-2910分光光度计上测定(Hitachi，日本)。荧光光谱在F-7000荧光光度计上测得(Hitachi，日本)。激发波长设定在498nm，荧光记录波长范围设定在510nm到750nm，激发和发射狭缝均设定在5nm。透射电子显微镜表征在JSM-6700F透射电子显微镜(JEOL，日本)上采集，操作电压200kV。动态光散射在Zetasizer NanoZS(Malvern，英国)上测得。聚丙烯酰胺凝胶成像在GelDocTM XR⁺成像系统(Bio-RAD，美国)上进行。聚合酶链式反应在梯度加热板上进行(Biometra，德国)。

表1.该工作中所使用的寡核苷酸序列

表注：到银纳米粒子表面的锚定胞嘧啶和到金纳米粒子表面的锚定腺嘌呤用加粗标出，胸腺嘧啶间隔链用斜体标出，荧光基团用加粗斜体标出。

银纳米粒子合成

银纳米粒子由柠檬酸钠作保护剂时，硼氢化钠还原硝酸银制得。具体方法为：将500μL 100mM的AgNO₃溶液和500μL 100mM的柠檬酸钠溶液加入到199mL超纯水中(这时AgNO₃和柠檬酸钠的浓度均为0.25mM)，磁子搅拌1min使其混匀。在搅拌状态下加入6mL 10mMNaBH₄溶液，继续搅拌30min，得到亮黄色胶体溶液。此胶体溶液过夜静置后即可使用。

DNA到银纳米粒子表面的修饰

含有连续胞嘧啶的DNA修饰到银纳米粒子表面。对制备C10-dTS-AgNP结合物，相等摩尔数的C10-TS和部分互补的短链DNA在95℃退火10min，然后缓慢冷却至室温。小体积的杂交双链与大体积的合成AgNPs探针以3000:1的摩尔比混合。该混合物在室温条件、搅拌状态下保持2h。随后，加入小体积的柠檬酸缓冲液(500mM，pH 3.0)，使柠檬酸的最终浓度为4mM，接着培育30min。紧接着再加入小体积的柠檬酸缓冲液(500mM，pH3.0)，使柠檬酸的最终浓度为8mM，继续培育30min。随后加入小体积的磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.4)，使磷酸盐的最终浓度为21mM，培育1h。该结合物使用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.0)洗涤三次，最终以合适浓度分散在相同缓冲液中，置于冰箱中4℃、暗处存放。对制备C20-dTS-AgNP和C30-dTS-AgNP结合物，除了使用C20-TS和C30-TS寡聚核酸链外，其余步骤同上所述。

银纳米粒子表面DNA修饰密度定量

银纳米粒子表面DNA修饰密度通过DTT取代法进行定量。FAM标记的含连续胞嘧啶的DNA与其部分互补DNA进行杂交，该双链复合物根据上述步骤修饰在银纳米粒子表面。相等体积的DNA-AgNP结合物与1.0M DTT溶液混匀，混合物在旋转仪上过夜保持，之后在4℃条件下以12000rpm离心25min。含有取代DNA的固定体积的上清液被小心转移至荧光池中以测定荧光。校正曲线通过在相同条件下混合已知浓度的FAM标记双链DNA和DTT后，以相同方式测定荧光得到。取代下的DNA浓度由上清液的荧光和所建立的校正曲线求得。银纳米粒子的浓度由银纳米粒子的表面等离子体共振吸收和其相应摩尔消光系数求得。每个银纳米粒子表面的DNA数量通过DNA浓度除以银纳米粒子浓度计算得到。

金纳米粒子的制备、修饰及表面DNA密度定量

金纳米粒子(粒径13nm)的合成采用柠檬酸钠还原氯金酸的方法。将50mL含1mMHAuCl₄的水溶液加热至沸腾，剧烈搅拌的情况下快速加入5mL 38.8mM的柠檬酸钠溶液。此溶液继续煮沸10min，然后移去加热套，在缓慢搅拌状态下保持30min直至冷却至室温。该溶液经0.22μm滤膜过滤后，存放于冰箱中4℃条件下暗处保存。

A20-dTS DNA修饰在金纳米粒子表面。等摩尔比的A20-TS与部分互补DNA在95℃退火10min后缓慢冷却至室温。小体积的杂交双链与大体积的金纳米粒子以400:1的比例混合，于室温搅拌状态下保持1h。随后，加入小体积的柠檬酸缓冲液(500mM,pH 2.0)，使柠檬酸的最终浓度为10mM，继续保持10min。最后加入小体积的磷酸盐缓冲液(200mM，pH 7.6)，使磷酸盐的最终浓度为11mM，该溶液保持30min。DNA-AuNP结合物使用Tris-HCl缓冲液(10mM，pH 8.0)洗涤三次，以合适浓度分散于相同缓冲液中，于4℃条件下暗处保存，得到A20-dTS-AuNP。

金纳米粒子表面DNA密度通过DTT方法定量。FAM标记的A20-TS与其部分互补DNA链杂交，并依据上述方法修饰在金纳米粒子上。在密度计算前，使用与银纳米粒子相同的取代、离心和荧光测定步骤。金纳米粒子浓度通过其表面等离子体共振吸收和相应摩尔相关系数求得。每个金纳米粒子表面的DNA数量通过DNA浓度除以金纳米粒子浓度计算得到。

端粒酶的提取

HeLa细胞和正常肝细胞在含有10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中、于37℃、含有5％二氧化碳的湿润氛围下培育。细胞数目通过细胞计数器计数得到。端粒酶通过CHAPS裂解法得到。1×10⁶个细胞分散在1.5mL EP管中，使用冰浴下冷的PBS缓冲液洗涤2次。然后细胞沉淀重新分散在200μL CHAPS裂解缓冲液中，于冰上孵育30min。该混合物在4℃条件下以12000rpm离心20min。然后对上清液中澄清的细胞裂解液进行转移、分离，并在-80℃条件下存储以进一步使用。

利用纳米探针检测端粒酶活性

在使用银纳米探针检测端粒酶活性时，10μL 5×TRAP缓冲液(100mM Tris-HCl,7.5mM MgCl₂,315mM KCl,0.025％Tween-20,5mM EGTA,pH 8.3))、5μL 10mM dNTPs、5μL10mg/mL BSA、5μL经DEPC处理过纯水、20μL 3.5nM多聚胞嘧啶-双链DNA修饰银纳米粒子和5μL HeLa细胞裂解液混匀。该混合液在30℃条件下培育，然后在50μL体积的紫外池中以2min的时间间隔记录紫外-可见吸收光谱或是通过目视观察表征。为可视化区分活性和非活性的端粒酶，自200cells/μL中提取的端粒酶通过90℃培育10min作热失活或者与3’-叠氮-3’-脱氧胸苷培育6h作抑制剂抑制。上述处理过的端粒酶和未处理的端粒酶与C20-dTS-AgNP作用以进行目视观察。为可视化区分癌细胞(以HeLa细胞作为模型)和正常细胞(以正常肝细胞作为模型)中的端粒酶活性，50cells/μL浓度下两种模型细胞的细胞提取液与C20-dTS-AgNP作用，以进行目视观察。

在使用金纳米探针检测端粒酶活性时，除使用20μL 3.5nM A20-dTS-AuNP外，其余步骤与银纳米探针检测步骤相同。

凝胶电泳表征

对琼脂糖凝胶电泳，12μL 5×TRAP缓冲液、6μL 10mM dNTPs、6μL 1mg/mL BSA、30μL 7.6nM C10-dTS-AgNP和6μL自200cells/μL HeLa细胞中提取的端粒酶混匀。该混合物在30℃条件下培育1h，以使金纳米粒子表面DNA产生延伸。考虑到C10-dTS-AgNP在该反应条件下无端粒酶存在时可形成聚集体，其不能穿越凝胶，因此阴性对照中使用低离子强度。18μL经DEPC处理的纯水、6μL10mM dNTPs、6μL 1mg/mL BSA和30μL 7.6nM C10-dTS-AgNP混合，该混合液在30℃培育1h。反应结束后，混合液在4℃条件下以12000rpm离心25min，沉淀团粒分散在10μL Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液中。C10-dTS-AgNP的最终浓度约为23nM。8μL上述DNA-AgNP结合物与1.6μL 6×loading buffer混匀，取9μL上样于2％琼脂糖凝胶中。然后在0.5×Tris碱-硼酸-EDTA(TBE)缓冲液中以100V电压跑胶40min，最后使用数码相机拍摄凝胶。

对聚丙烯酰胺凝胶电泳，10μL 5×TRAP缓冲液、5μL 10mM dNTPs、5μL 1mg/mLBSA、25μL 7.6nM C10-dTS-AgNP和5μL CHAPS裂解缓冲液或自200cells/μL HeLa细胞中提取的端粒酶混匀。该混合液在30℃培育1h，然后在90℃保持10min以失活端粒酶。之后向上述50μL液体中加入10μL 0.6M DTT液，在室温下保持3h以释放表面固定的DNA。然后将溶液在4℃条件下以12000rpm离心25min。取5μL上清液与5μL PCR缓冲液、34μL PCR水、1.2μL 15μM C10-TS、1.2μL 15μM CX、1μL 10mM dNTPs、2μL 25mM MgCl₂和0.6μL 5U/μL Taq聚合酶混匀。聚合酶链式反应使用以下程序在梯度加热板上进行：94℃保持4min，接着30个循环(94℃保持30s、58℃保持30s和72℃保持30s)，接着72℃保持5min，最后4℃恒温。20μL上述PCR产物与4μL 6×loading buffer混匀，取10μL样品上样于15％非变性聚丙烯酰胺凝胶中。然后在1×TBE缓冲液中以200V电压跑胶2h，使用1×SYBR gold染色40min，最终通过GelDocTM XR⁺成像系统成像。

原理

所提出的基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测的原理如图1A所示。一条DNA由连续胞嘧啶(C-block)、胸腺嘧啶间隔链(T-spacer)和端粒酶结合底物链(TS)组成，其与另一条短链互补DNA预杂交(DNA序列详见表1)。短链DNA被设计与端粒酶结合底物链区域完全互补，由此形成了具有DNA平末端的部分杂交双链结构。该双链DNA通过其5’端的单链多聚胞嘧啶区域修饰在银纳米粒子上，得到特异性响应端粒酶活性的银纳米探针。由于银纳米表面双链DNA的刚性结构和纳米粒子表面平端之间的堆叠作用，银纳米粒子的稳定性降低，倾向于聚集并显示灰色。但是，在端粒酶作用下，端粒酶结合底物链被延伸，产生单链端粒酶重复序列，由此在银纳米粒子表面形成了摇摆DNA末端。由于纳米粒子末端增强的柔性和增加的表面电荷数量，银纳米粒子的稳定性增强，其倾向于保持分散态并显示黄色。

首先合成了银纳米粒子；经表征，其在395nm处有强吸收，平均粒径为12.8nm，溶液颜色显示为黄色。含有10个连续胞嘧啶锚定序列的双链DNA被修饰在银纳米粒子表面，得到C10-dTS-AgNP结合物。动态光散射表明该结合物的水合直径比银纳米粒子自身增加了14nm，这是在银纳米粒子表面的DNA修饰层所引起的。该结合物与用以裂解HeLa细胞的裂解缓冲液或与200cells/μL的HeLa细胞裂解液作用。在没有HeLa细胞裂解液时，银纳米粒子在395nm的特征吸收降低，同时在650nm出现新的吸收带(图1B)。相应的，溶液颜色变为灰色(见图1B内插图)。但是，当与HeLa细胞裂解液作用时，银纳米粒子在395nm处显示出强的特征吸收，同时溶液颜色保持为黄色(图1B)。该比色结果证实了所设计传感策略的可行性。

为验证上述比色现象背后的原理，我们进一步做了透射电子显微镜和凝胶电泳表征。透射电子显微镜照片表明在没有端粒酶时，银纳米粒子发生了聚集(图2A)，这是由于刚性DNA双链结构及其粘性平末端不能够有效稳定纳米粒子。相比之下，在端粒酶存在时，银纳米粒子的分散性良好，这是由于形成的摇摆末端能有效保护纳米粒子免于聚集(图2A)。凝胶电泳确认了在端粒酶作用下，DNA在银纳米粒子表面的延伸。在琼脂糖凝胶上，C10-dTS-AgNP显示出一条集中的黄色条带。但是，当与端粒酶作用后，C10-dTS-AgNP的迁移速率减缓并产生拖尾现象(图2B)。随纳米粒子表面DNA延长，增加的负电荷是迁移速率降低的原因；表面负载有不同延伸长度DNA的银纳米粒子造成了拖尾条带。并且，银纳米粒子表面的DNA被取代、用聚合酶链式反应扩增并通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征。只有当银纳米探针与HeLa细胞裂解液作用时，才能够观察到重复模式的延伸产物(图2C)，证实了在细胞中提取端粒酶的作用下产生了端粒重复序列。

银纳米表面DNA修饰密度调控

为得到良好的检测性能，我们对银纳米粒子表面的DNA密度进行了调控。除了C10-dTS-AgNP之外，含有20和30个连续胞嘧啶锚定序列的双链DNA也分别被修饰在银纳米粒子上，得到C20-dTS-AgNP和C30-dTS-AgNP结合物。DNA表面密度通过DTT取代方法进行定量。该方法表明对C10-dTS-AgNP、C20-dTS-AgNP和C30-dTS-AgNP，每个纳米粒子上分别修饰了16、14和12条双链DNA。我们将这三种DNA-AgNP结合物与自0至200cells/μL不同浓度HeLa细胞的细胞裂解液作用，记录了随时间变化的紫外-可见吸收光谱。由于395nm和650nm分别对应于分散态和聚集态的银纳米粒子，吸光度比值A650/A395被用来判断银纳米粒子的聚集程度。可以看到，在没有HeLa细胞裂解液存在时，银纳米粒子在缓冲液中迅速聚集，这是由于表面负载DNA平末端的纳米粒子稳定性差造成的。但是，随端粒酶活性增大(等同于细胞浓度增加)，银纳米粒子的聚集逐渐减缓并被最终抑制(图3)。随端粒酶活性增大，端粒重复序列摇摆末端的比例增加，纳米粒子的稳定性增强以抵抗聚集，致使聚集动力学逐渐降低。当使用C20-dTS-AgNP时，在低浓度HeLa细胞范围下的聚集曲线显示出最大的差异；该DNA-AgNP结合物被用于接下来的测定。

该传感系统的分析性能

为了评估该系统的分析性能，我们将C20-dTS-AgNP与从不同浓度HeLa细胞中提取的端粒酶作用，记录了随时间变化的吸收光谱。吸光度比值的变化对不同端粒酶活性显示出良好的区分(图4A)。由于随端粒酶活性提升而逐渐增加的摇摆端比例，聚集动力学逐渐减缓。我们将最终时间点的吸光度比值对HeLa细胞浓度作图，可以看到，吸光度比值随细胞浓度在0至200cells/μL范围内急剧降低，并在500cells/μL时达到平坦(图4B)。吸光度比值与HeLa细胞浓度的线性区间建立在1至50cells/μL。对于检测2、20和50cells/μL浓度的端粒酶，在一天内三次独立测定的相对标准偏差是3.2％、1.6％和3.8％，在三天内三次独立测定的相对标准偏差是3.6％、1.8％和4.6％，表明该方法具有良好的重现性。

该方法的直接检测限低至1cell/μL，与已有报道的比色或是荧光方法的检测限更低或相当。为了比较，我们合成了与该银纳米粒子粒径相近的金纳米粒子(13nm)，并通过20个连续腺嘌呤将部分杂交的双链DNA修饰在金纳米粒子表面，得到A20-dTS-AuNP结合物。DTT取代方法表明14个双链DNA被连接在每个金纳米粒子上，与C20-dTS-AgNP的情况相同，这很可能是由于相同长度的DNA锚定序列和相近的纳米粒子表面积造成的。A20-dTS-AuNP与自HeLa细胞中提取的端粒酶作用，其培育1小时后的吸光度比值对细胞浓度作图。使用金纳米粒子的直接检测限是5cells/μL，较使用银纳米粒子的检测限更高。原因主要是由于银纳米粒子更高的摩尔消光系数使其能产生比金纳米粒子更高和更尖锐的表面等离子体共振吸收，以能更好反映与端粒酶活性相关的纳米粒子分散度的微小变化。

可视化检测

借助于银纳米粒子的光学特性，我们成功实现了人端粒酶活性的可视化检测。随着端粒酶活性的增大，溶液颜色逐渐由灰色渐变为黄色(图5A)。该现象是由于随端粒酶活性增加，银纳米粒子的稳定性逐渐增大，由聚集态渐变为分散态。并且，活性端粒酶能与非活性端粒酶通过目视区分开来。在未经处理的HeLa细胞裂解液存在时，溶液颜色保持为黄色。当有经热失活或抑制剂(3’-叠氮-3’-脱氧胸苷)处理过的HeLa细胞裂解液存在时，溶液颜色变为灰色(图5B)。这是因为非活性端粒酶失去了底物链区域以产生悬挂端的能力，由此银纳米粒子的稳定性不能得到增强以抵抗聚集，产生了溶液颜色变化。最后，癌细胞和正常体细胞可通过目视区分。溶液颜色在与HeLa细胞裂解液作用时保持为黄色，在与正常肝细胞裂解液作用时变化为灰色(图5C)。这是因为端粒酶活性是在癌细胞中、而非在正常细胞内过表达。

上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东大学

<120> 一种基于银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法

<130> 2016

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cccccccccc ttttttaatc cgtcgagcag agtt 34

<210> 2

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cccccccccc cccccccccc ttttttaatc cgtcgagcag agtt 44

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cccccccccc cccccccccc cccccccccc ttttttaatc cgtcgagcag agtt 54

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa ttttttaatc cgtcgagcag agtt 44

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aactctgctc gacggatt 18

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cccccccccc ttttttaatc cgtcgagcag agtt 34

<210> 7

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccccccccc cccccccccc ttttttaatc cgtcgagcag agtt 44

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

cccccccccc cccccccccc cccccccccc ttttttaatc cgtcgagcag agtt 54

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

cccttaccct tacccttacc ctaa 24

Claims

1.一种用于检测端粒酶活性的银纳米探针，其特征在于：包括银纳米粒子和修饰在银纳米粒子表面的平末端杂交双链，所述杂交双链由单链DNA和与所述单链DNA部分互补的核苷酸序列杂交而成，所述单链DNA由连续胞嘧啶链、间隔链和端粒酶结合底物链依次连接而成，所述核苷酸序列与端粒酶结合底物链完全互补，所述杂交双链通过连续胞嘧啶链修饰在银纳米粒子的表面。

2.根据权利要求1所述的银纳米探针，其特征在于：连续胞嘧啶链中的胞嘧啶的数量为10-30个；

或，所述间隔链为连续胸腺嘧啶间隔链T_n，其中n为连续胸腺嘧啶的个数，为4-6。

3.权利要求1或2所述银纳米探针的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：所述预杂交时，将等摩尔的短链DNA与互补DNA混合后，在95-100℃退火8-15min，缓慢冷却后，即得。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：银纳米探针的培育方法，包括如下步骤：

6.权利要求1或2所述银纳米探针在检测端粒酶活性中的应用。

7.一种用于端粒酶活性检测的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述银纳米探针、5×TRAP缓冲液、dNTPs溶液、BSA溶液和水。

8.基于权利要求1或2所述银纳米探针的端粒酶活性比色检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

对待测样品，可通过测定样品的吸光度比值，带入线性方程，计算得到样品的细胞浓度。

9.根据权利要求8所述的端粒酶活性比色检测方法，其特征在于：5×TRAP缓冲液的组成包括：100mM Tris-HCl、7.5mM MgCl₂、315mM KCl、0.025％Tween-20和5mM EGTA，TRAP缓冲液的pH值为8.3。

10.根据权利要求8所述的端粒酶活性比色检测方法，其特征在于：10μL 5×TRAP缓冲液、5μL 10mM dNTPs、5μL 10mg/mL BSA、5μL经DEPC处理过纯水、20μL银纳米探针和5μLHeLa细胞裂解液混匀后，培育。