CN106591141A - 多变根毛霉及其培养方法和菌剂以及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，具体公开了一株多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)，所述多变根毛霉的保藏编号为CGMCC No.11114。本发明还公开了一种多变根毛霉的培养方法以及含有该多变根毛霉的菌剂。另外，本发明还公开了该多变根毛霉以及菌剂在秸秆降解中的应用。采用本发明提供的多变根毛霉对对土壤和水体中的秸秆进行降解，可以快速腐化、降解秸秆，释放出大量作物生长所需的氮、钾等营养元素，解决了现有的秸秆还田技术中存在的秸秆分解速度慢，影响后继作物生根，降解时使用的微生物与作物争夺养分，造成作物氮饥饿现象等一系列问题，具有较高的经济效益和社会效益。

Description

多变根毛霉及其培养方法和菌剂以及应用

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及一株多变根毛霉，具体地，涉及一株具有降解秸秆功能的多变根毛霉，所述多变根毛霉的培养方法，含有所述多变根毛霉作为活性成分的菌剂，以及它们在降解秸秆中的应用。

背景技术

我国是农业大国，拥有丰富的农作物秸秆资源。据统计，我国年产秸秆6-8亿吨，其中42％直接或过腹还田，30％作为农用燃料，8％作工业或其他用途，还有20％未被利用。近年来，随着农村经济的发展，农民生活水平的提高，不再使用秸秆作为主要燃料，剩余秸秆量大幅增加。夏秋时节，为抢收抢种，农民在田间大量焚烧剩余秸秆，造成严重的空气污染和极大的火灾隐患。同时，大面积焚烧秸秆还会使土壤动物类群和数量均不同程度的减少，从而损害土壤微生态环境。

秸秆还田是指将农作物收获后的秸秆废弃物经过沤制成为有机肥料，可以增加土壤肥力和有机质含量，并改善土壤的结构。秸秆中含有丰富的N、P、K以及各种微量元素。目前的还田方式主要有以下几种方式：直接还田、过腹还田和堆沤还田。除过腹还田外，其他还田方式均需要秸秆降解菌的参与。

秸秆降解菌是能够产生纤维素酶、半纤维素酶、木质素酶等粗纤维酶类的微生物，利用秸秆降解菌处理秸秆，使秸秆在适当温度和湿度条件下进行有机物质矿质化、腐殖化等无害变化，将其变成腐熟的生物有机质肥料，使得秸秆中的各种微量元素、有机物以及速效N、P、K回归到土壤，增加土壤肥力、改善土壤结构。

然而，我国复种指数较高，每季作物之间间隔时间短，没有充分的时间让土壤微生物分解还田秸秆，从而导致还田后秸秆在土壤中分解不完全，作物残茬影响播种质量、出苗率、作物生长及农时操作。因此筛选出一株高效降解秸秆的菌株是解决问题的关键。

发明内容

本发明的目的在于开发一种对水体和土壤中的秸秆具有高效降解性能的微生物菌株，从而能够简单快捷的对环境中的秸秆进行有效的降解。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一株多变根毛霉(Rhizomucorvariabilis)，所述多变根毛霉的保藏编号为CGMCC No.11114。

第二方面，本发明提供了一种多变根毛霉的培养方法，该方法包括将如上所述的多变根毛霉接种至以下培养基中进行培养：

含有1.8-2.2重量％的葡萄糖和0.3-0.7重量％的马铃薯粉，pH为6.8-7.0的真菌液体培养基，或者PDA固体培养基。

第三方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的多变根毛霉的菌体作为活性成分。

第四方面，本发明提供了如上所述的多变根毛霉和如上所述的菌剂在降解秸秆中的应用。

第五方面，本发明提供了一种降解秸秆的方法，该方法包括：将如上所述的多变根毛霉和/或如上所述的菌剂与含有秸秆的环境接触，以对环境中的秸秆进行降解。

采用本发明提供的多变根毛霉对对土壤和水体中的秸秆进行降解，可以快速腐化、降解秸秆，释放出大量作物生长所需的氮、钾等营养元素，解决了现有的秸秆还田技术中存在的秸秆分解速度慢，影响后继作物生根，降解时使用的微生物与作物争夺养分，造成作物氮饥饿现象等一系列问题，具有较高的经济效益和社会效益。

本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明的菌株为多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)，于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.11114。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

第一方面，本发明提供了一株多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)，其中，所述多变根毛霉的保藏编号为CGMCC No.11114。

本发明的多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)分离自安徽宣城土壤。

所述分离的方法可以为本领域常规的用于新菌株筛选的方法，例如，土壤环流分离结合稀释平板纯化法。

所述土壤环流分离结合稀释平板纯化法例如可以为：

将100g采自安徽宣城的土壤与适量粒径为3mm的砂粒混合均匀后置于环流富集装置的上层，加入200mL的真菌液体培养基作为环流液，启动蠕动泵进行富集。富集过程中根据环流液的蒸发情况定期补加环流液。富集结束后，取下层液体进行平板划线纯化分离。将下层液体分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7和10^-8倍，吸取适量稀释液涂布于含有2％(w/v)的秸秆无机盐固体培养基上，25-30℃培养3天后取菌株划线分离。

其中，所述真菌液体培养基中含有：2重量％的葡萄糖和0.5重量％的马铃薯粉，pH为6.8～7.0。

所述秸秆无机盐固体培养基中含有：

2重量％的秸秆粉末，0.8-1.2重量％的KH₂PO₄，0.8-1.2重量％的K₂HPO₄，1-1.5重量％的NH₄NO₃，0.03-0.08重量％的MgSO₄，0.001-0.003重量％的CaCl₂，0.01-0.03重量％的FeSO₄·7H₂O，2-2.5重量％的琼脂，pH为6.0-7.5。

本发明从纯化出的菌株中获得了一株对秸秆具有高效降解能力的菌株，并对其进行了DNA提取与鉴定。所述DNA提取可以采用索莱宝真菌基因组DNA提取试剂盒(Solarbio fungi DNA kit)，并按照试剂盒中说明书操作以提取该菌株的基因组DNA。

鉴定结果显示，该菌株的26S rDNA D1/D2具有SEQ ID No：1所示的核苷酸序列，ITS(Internal Transcribed Spacer内转录间隔区)具有SEQ ID No：2所示的核苷酸序列，属于多变根毛霉，并于2015年7月14日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.11114。

本发明提供的多变根毛霉经过培养能够产生大量的多变根毛霉的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述多变根毛霉增殖即可，例如可以按照3g干重/m³的接种量将多变根毛霉的活菌体接种于真菌液体培养基中，并且在好氧条件下，在25-35℃的温度下培养5天后，得到培养液。

本发明可以进一步分离上述培养液中的多变根毛霉的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

根据本发明，用于培养多变根毛霉的培养基可以为本领域常规的真菌培养基。但本发明的发明人发现，在含有如下成分的培养基中对多变根毛霉进行培养，能够进一步促进菌体的生长：含有1.8-2.2重量％、优选2重量％的葡萄糖和0.3-0.7重量％、优选0.5重量％的马铃薯粉，pH为6.8-7.0的真菌液体培养基，或者PDA固体培养基。所述PDA固体培养基即马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基，英文全称为Potato Dextrose Agar Medium。所述PDA固体培养基可以通过向所述真菌液体培养基中加入琼脂，使得琼脂的终含量达到2-2.5重量％制得。所述PDA固体培养基还可以商购获得，例如可以为购自北京索莱宝科技有限公司公司牌号为P8930-250马铃薯葡萄糖琼脂的商品。

本发明的发明人在研究的过程中发现，如上所述的多变根毛霉能够对秸秆进行有效的降解。

第二方面，本发明提供了一种多变根毛霉的培养方法：其中，将如上所述的多变根毛霉接种至以下培养基中进行培养：

含有1.8-2.2重量％、优选2重量％的葡萄糖和0.3-0.7重量％、优选0.5重量％的马铃薯粉，pH为6.8-7.0的真菌液体培养基，或者PDA固体培养基。

所述PDA固体培养基如上所述。

根据本发明，对所述多变根毛霉进行培养的条件可以为本领域常规对霉菌进行培养的条件，例如，在有氧条件下，培养的温度可以为25-35℃。

第三方面，本发明提供了一种菌剂，其中，该菌剂含有如上所述的多变根毛霉的菌体作为活性成分。

根据本发明，对所述菌剂中所述多变根毛霉的浓度没有特别的限制，可以根据具体的情况进行具体的选择，在此不再详细赘述。

另外，根据预定的用途不同，本发明提供的菌剂可以制备为不同的剂型，并添加相应的辅料等成分。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种辅料为本领域技术人员所公知，在此不再详细赘述。

另外，本发明提供的多变根毛霉还可以和其他菌体进行复配制备成混合菌剂，以进一步提高其效率。

根据本发明，所述菌剂可以为菌液的形式，也可以为干粉的形式，本领域技术人员可以根据实际的需要自行选择。所述菌液例如可以为使用上述的真菌液体培养基培养所获得的多变根毛霉菌液。所述干粉例如可以为将前述的培养至对数期的多变根毛霉菌液经冷冻干燥后获得的干粉。

第四方面，本发明提供了如上所述的多变根毛霉和如上所述的菌剂在降解秸秆中的应用。

第五方面，本发明提供了一种降解秸秆的方法，该方法包括：将如上所述的多变根毛霉和/或如上所述的菌剂与含有秸秆的环境接触，以对环境中的秸秆进行降解。

所述秸秆例如可以为水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆等作物秸秆中的至少一种。

本发明优选在所述多变根毛霉能够存活的条件下对环境中的秸秆进行降解。其中，术语“多变根毛霉能够存活”是指在含有秸秆的环境中，至少大于5％，优选至少大于10％，更优选至少大于60％的菌体能够存活。术语“多变根毛霉能够存活的条件”是指环境中至少包括多变根毛霉能够存活的最基本条件，例如，温度、营养源等，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。

根据本发明，优选的，为了进一步提高所述多变根毛霉在环境中的生存能力，还可以向需要修复的环境中加入适宜所述多变根毛霉生长的营养源，例如，在本发明的第二方面所提及的培养基。

根据本发明，含有秸秆的环境可以包括任何含有秸秆的环境，例如，所述含有秸秆的环境可以包括含有秸秆的土壤或水体。

根据本发明，对加入至所述含有秸秆的环境中的多变根毛霉的形式并没有特别的限定，只要保证加入后所述多变根毛霉能够在所述含有秸秆的环境中起作用并且对所述秸秆进行有效降解即可。加入的所述多变根毛霉的形式，例如，可以为菌液的形式，也可以为菌体沉淀的形式，还也可以为干粉的形式。

本发明的发明人发现，本发明提供的多变根毛霉对秸秆的降解具有剂量和时间效应，例如，在一定的范围内，对秸秆的降解率会随着所述多变根毛霉浓度的升高或者时间的延长而提高。

因此，本发明对加入的多变根毛霉的数量没有特别的限制，这可以根据所述含有秸秆的环境中的秸秆的含量来决定，例如，当所述环境中的秸秆含量较高或所述环境对于所述多变根毛霉的生存较不利时，可以提高所述多变根毛霉的接种量；当所述环境中的秸秆含量较低或所述环境对所述多变根毛霉的生存的影响较小时，可以减少所述多变根毛霉的接种量。

根据本发明，当所述含有秸秆的环境为土壤时，为了进一步促进本发明提供的多变根毛霉对秸秆的降解效率，优选的，将土壤中的水含量控制在至少10重量％，优选为15-30重量％。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

以下实施例中：

真菌液体培养基中含有：2重量％的葡萄糖和0.5重量％的马铃薯粉，pH为6.8-7.0。

秸秆无机盐固体培养基中含有：2重量％的秸秆粉末，1.0重量％的KH₂PO₄，1.0重量％的K₂HPO₄，1.5重量％的NH₄NO₃，0.05重量％的MgSO₄，0.002重量％的CaCl₂，0.02重量％的FeSO₄·7H₂O，2重量％的琼脂，pH为6.0-7.5。

木质素磺酸钠无机盐液体培养基中含有：木质素磺酸钠(购自百灵威公司牌号为L0098的商品)0.1重量％，1.5重量％的NH₄NO₃，1.0重量％的KH₂PO₄，1.0重量％的K₂HPO₄，0.05重量％的MgSO₄，0.5重量％的酵母粉，pH为6.0-7.5。

制备例

本制备例用以制备下述实施例中使用的真菌种子液。

将上述真菌液体培养基在121℃下灭菌15min，冷却至室温。将3体积％的多变根毛霉菌株的菌液接入200mL上述灭菌后的真菌液体培养基中，在150-240rpm，25-35℃的培养条件下培养5天，以使其孢子量达到10⁷个/mL，获得真菌种子液。

实施例1

本实施例用于说明本发明的多变根毛霉对纤维素的降解能力。

测试组：向三角瓶内的100mL无机盐液体培养基中加入滤纸条(重1g)，121℃条件下高压灭菌15min，冷却至室温后，接入1mL上述制备例制得的真菌种子液，然后在170rpm和30℃条件下培养5天。

空白对照组：除了将1mL真菌种子液换成1mL的真菌液体培养基外，其它操作条件均和测试组相同。

其中，无机盐液体培养基的组成为1.5重量％的NH₄NO₃，1.0重量％的KH₂PO₄，1.0重量％的K₂HPO₄，0.05重量％的MgSO₄，pH为6.0-7.5。

分别将测试组和空白对照组的培养物连同三角瓶一起烘干，然后分别称量重量，得到空白对照组的三角瓶连同培养物的重量减去测试组的三角瓶连同培养物的重量的差值为0.4g，根据滤纸纤维素降解率＝(处理前后滤纸减重/处理前滤纸重量)×100％计算得到多变根毛霉对滤纸纤维素的降解率为40％。

可见，多变根毛霉株可以高效降解纤维素。

实施例2

本实施例用于说明本发明的多变根毛霉在水中对木质素的降解能力。

测试组：取100mL木质素磺酸钠无机盐液体培养基，121℃条件下高压灭菌15min，冷却至室温后，接入1mL上述制备例制得的真菌种子液，然后在170rpm和30℃条件下培养5天。

空白对照组：除了将1mL真菌种子液换成1mL的真菌液体培养基外，其它操作条件均和测试组相同。

分别取出测试组和空白对照组的培养五天后的液体少许，12000rpm离心10min后取上清液。将上清液在紫外分光光度计280nm下测定其吸光度值。其中，测试组的吸光度值为0.140，空白对照组的吸光度值为0.697。

结果表明，在水相条件下，5天后，多变根毛霉株对木质素磺酸钠的降解率达到80％。

可见，多变根毛霉株对木质素具有很高的降解能力。

其中，木质素磺酸钠的降解率＝(空白对照组的吸光度值-测试组的吸光度值)/空白对照组的吸光度值×100％。

表1多变根毛霉对木质素磺酸钠的降解测试结果

时间	第1天	第3天	第5天	第7天
					降解率	20％	50％	80％	80％

取出测试组培养五天后的发酵液，8000rpm离心10min后取上清液作为粗酶液；以空白对照组培养五天后的发酵液，8000rpm离心10min后取的上清液作为对照，测定漆酶、锰过氧化氢酶和木质素过氧化氢酶的活性。

其中，漆酶活性通过在420nm处监测ABTS(2,2'-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐)的氧化来测定；锰过氧化氢酶的活性通过在240nm处监测在过氧化氢存在条件下将Mn²⁺氧化成Mn³⁺来测定；木质素过氧化氢酶活性则通过在310nm波长下监测藜芦醇被氧化成藜芦醛来测定。

检测结果表明，测试组培养五天后的发酵液中，漆酶、锰过氧化氢酶和木质素过氧化氢酶的酶活分别为518.6U/L、422.7U/L和376.8U/L。

可见，多变根毛霉可以产生大量的漆酶、锰过氧化氢酶和木质素过氧化氢酶，从而具有高效降解木质素的能力。

实施例3

本实施例用于说明本发明的多变根毛霉在土壤中对秸秆的降解助腐能力。

将上述制备例制得的真菌种子液按照每kg土壤加入20mL上述制备例制得的真菌种子液的量加入含有还田秸秆的土壤中，搅拌均匀，在环境温度为20-32℃、含水量为20％的条件下进行培养。取部分20天后的土壤和处理前的土壤，分别在40℃烘干；然后分别称取0.5g烘干的土壤，加入0.05mol/L甲酸溶液消解1小时，取上清液过滤，用土壤营养成分测定仪(购自LASAAGRO公司牌号为3900的商品)测定土壤中速效氮、钾的含量。

经检测发现，土壤中速效氮的含量从处理前的30mg/kg升高至650mg/kg，速效钾的含量从处理前的56mg/kg提高至1200mg/kg。这说明多变根毛霉株能够帮助秸秆快速腐化，释放出大量的氮、钾等营养元素。

由实施例1-3可以看出，多变根毛霉对土壤和水体中的秸秆有明显的降解效果，可快速腐化、降解秸秆，释放出大量作物生长所需的氮、钾等营养元素，解决了现有的秸秆还田技术中存在的秸秆分解速度慢，影响后继作物生根，降解时使用的微生物与作物争夺养分，造成作物氮饥饿现象等一系列问题。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (8)

1.一株多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)，其特征在于，所述多变根毛霉的保藏编号为CGMCC No.11114。

2.一种多变根毛霉的培养方法：其特征在于，将权利要求1所述的多变根毛霉接种至以下培养基中进行培养：

含有1.8-2.2重量％的葡萄糖和0.3-0.7重量％的马铃薯粉，pH为6.8-7.0的真菌液体培养基，或者PDA固体培养基。

3.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的多变根毛霉的菌体作为活性成分。

4.权利要求1所述的多变根毛霉或权利要求3所述的菌剂在降解秸秆中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其中，所述秸秆为水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆中的至少一种。

6.一种降解秸秆的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的多变根毛霉和/或权利要求3所述的菌剂与含有秸秆的环境接触，以对环境中的秸秆进行降解。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述含有秸秆的环境包括土壤或水体。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其中，所述秸秆为水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆和大豆秸秆中的至少一种。