CN106589067B - 一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用 - Google Patents

一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用，涉及基因工程技术领域。该信号肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示的序列，或者是由SEQ ID NO:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。该信号肽具有引导目的蛋白例如β‑内酰胺酶进行分泌表达的作用，且相应的目的蛋白具有生物活性。

Description

一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用。
背景技术
蛋白质是一类大分子物质，生命活动主要依靠蛋白质来承担。获得大量的某种蛋白质往往是对其展开研究或应用的前提条件。在基因工程技术出现以前，从自然界原材料或组织中提取是获得蛋白质的主要途径，如从猪胰腺中提取胰岛素。但因为天然的蛋白质在细胞中的含量很低，因而纯化难度大，产量有限，导致产品价格高昂。现代基因工程技术的发展使得克隆并大量表达蛋白质成为可能。相对于天然提取，重组表达具有诸多优势，如：可利用质粒的多拷贝性或将目标基因置于强启动子下表达以提高蛋白质的表达水平；可对重组菌进行高密度培养，以提高目标蛋白质的产量；在构建表达载体时加入纯化标签以简化分离纯化步骤等。
蛋白质的表达系统已发展出真核表达系统和原核表达系统两大类。常用的真核表达系统包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等；常用的原核表达系统包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌等。其中，大肠杆菌表达系统是发展最早、应用最广泛的表达系统。作为一种简单的原核生物，大肠杆菌具有遗传背景清晰、生长快速、基因操作简便、易于高密度发酵等显著优点，使其成为重组蛋白表达的首选。
大肠杆菌为革兰氏阴性菌，其细胞具有内外两层细胞膜，因而重组蛋白的表达在大肠杆菌中可定位于三个区域：胞内(细胞内膜包裹的空间)、周质空间(细胞内膜和细胞外膜之间区域)及胞外。通常将定位于胞内的表达称为胞内表达，定位于周质空间和胞外的统称为分泌表达。但除了一些特殊蛋白质如毒素和溶血素之外，大肠杆菌通常不将蛋白质分泌到胞外，因而在大肠杆菌中的分泌表达一般是指将蛋白质分泌至周质空间。
胞内表达具有表达水平高、表达载体构建容易等优点，但也有一些缺点，主要表现在：(1)蛋白质在胞内大量表达时容易形成不可溶的聚集体即包涵体，而从包涵体中回收活性蛋白质非常困难；(2)胞内有较多的蛋白酶，而蛋白酶可能会降解表达的目标蛋白；(3)胞内为强还原性环境且缺乏促进二硫键形成的酶，这对于一些含有二硫键结构的蛋白质的表达是不利的。相比较之下，分泌表达在某些方面具有优势：分泌产物的N端氨基酸残基与经过特定信号肽酶切除掉信号肽之后的自然基因产物的N端序列相同；周质空间的蛋白酶种类及活性比在细胞质中的少且活性低，可以避免或减少目标蛋白的降解；周质空间高的氧化还原环境和催化二硫键形成的酶的存在有利于二硫键的正确形成；除此之外，相对与大肠杆菌胞内4000多种蛋白而言，周质空间中100余种蛋白的存在大大降低了后续的分离纯化的难度。
跨内膜转运是重组蛋白分泌表达的重要前提，而跨内膜转运依赖于信号肽的引导。大肠杆菌胞内蛋白质的分泌主要通过三种途径：依赖于SecB的途径、信号肽识别颗粒(SRP)和双精氨酸转运途径(Tat)，其中依赖SecB的途径为绝大多数的分泌蛋白转运出内膜的途径,依赖于SecB途径转运的分泌蛋白氨基端一般都带信号肽。
信号肽位于分泌蛋白的N端，一般由10～40个氨基酸组成，按其结构划分，可分为三个区域：N末端、中间序列和C末端。N末端带正电荷，富含碱性氨基酸如赖氨酸和精氨酸；中间序列富含疏水氨基酸，能够形成一段α螺旋结构，是信号肽的主要功能区；C末端带负电荷，富含小分子氨基酸如甘氨酸、丝氨酸、丙氨酸，是信号肽序列的切割位点，也称加工区。信号肽利用N端的正电荷和中间区域的疏水性以静电作用和疏水作用与转运关键蛋白相互作用，它们对于蛋白质的跨膜转运是必不可少的。在将蛋白质转运跨越细胞内膜时，信号肽被特定的信号肽酶切割以得到成熟的蛋白产物。
信号肽没有严格的专一性，一段信号肽可以引导不同的蛋白质的分泌，而同一个蛋白也可能由不同的信号肽引导其分泌，但不同的信号肽引导的效率是不一样的，因而选择较优的信号肽对高效分泌表达重组蛋白非常重要。除信号肽之外，蛋白质分泌表达的效率还受宿主的种类、分泌蛋白的大小及类型等多种因素的影响。迄今为止，没有一个通用的规则能够指导选择适宜的信号肽来引导任意给定蛋白质的成功分泌，需要经过不断尝试才能筛选到合适的信号肽。
发明内容
本发明的目的在于提供一种信号肽，该信号肽具有引导目的蛋白分泌表达的功能。
本发明的另一目的在于提供一种编码基因，其能够编码上述信号肽。
本发明的另一目的在于提供一种蛋白分泌表达载体，其含有上述的用于编码信号肽的编码基因。
本发明的另一目的在于提供含有上述蛋白分泌表达载体的细菌或细胞。
本发明的另一目的在于提供上述信号肽在引导目的蛋白分泌表达中的应用。
本发明是这样实现的：
一种信号肽，其氨基酸序列为(1)或(2)；(1)SEQ ID NO:1所示的序列；(2)由SEQID NO:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。
一种编码基因，其编码上述的信号肽。
一种蛋白分泌表达载体，其含有上述的编码基因。
含有上述蛋白分泌表达载体的细菌或细胞。
上述信号肽在引导目的蛋白分泌表达中的应用。
本发明提供的一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用的有益效果是：
本发明提供的一种合适的信号肽，其氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示的序列或者是由SEQ ID NO:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。该信号肽具有引导目的蛋白例如β-内酰胺酶进行分泌表达的作用，且相应的目的蛋白具有生物活性。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用进行具体说明。
一方面，本发明提供了一种信号肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明的发明人经过长期的研究探索，提出了一种全新的信号肽，该信号肽能够引导连接其下游的目的蛋白在相应的宿主菌或宿主细胞或宿主体(例如转基因植物或转基因动物)中分泌表达，且具有较高的引导效率，能够适用各种表达系统(包括原核表达系统和真核表达系统)。且通过该信号肽分泌表达得到的目的蛋白具有生物活性。另外，通过该信号肽的引导作用可以避免目的蛋白形成包涵体，降低纯化工作的难度。需要说明的是本发明提供的信号肽，其氨基酸序列还可以是由SEQ ID NO:1所示的序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列。
应当容易理解，在SEQ ID NO:1的基础上所进行的一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的且与SEQ ID NO:1具有相同的生物活性的衍生序列，也是属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明还提供了一种编码基因，用于编码上述的信号肽。
应当容易理解，根据密码子的简并性，编码上述信号肽的编码基因的碱基序列有多种，只要是能够编码出具有SEQ ID NO:1所示的或由前述的衍生序列的信号肽的编码基因或核酸片段即属于本发明的保护范围。
进一步地，当信号肽的序列为SEQ ID NO:1时，该编码基因的碱基序列如SEQ IDNO:2所示。
本发明的发明人经过长期的探索研究，对上述的编码基因进行了密码子优化，得到了SEQ ID NO:2所示的编码基因，其具有较高的表达水平。且该编码基因能够适用于各种表达系统(例如原核表达系统和真核表达系统)，都能够表达翻译出上述信号肽。
另一方面，本发明还提供了一种蛋白分泌表达载体，其含有上述的编码基因。该蛋白分泌表达载体可以用于构建表达出目的蛋白的重组载体。操作时，只需将编码目的蛋白的目的基因连接至编码基因的下游即可。
另一方面，本发明还提供了含有上述蛋白分泌表达载体的细菌或细胞。该细菌可以是原核表达系统中的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或链霉菌。该细胞可以是真核表达系统中的酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞。当然，也可以是其他类型的细菌或细胞，只要其含有上述的蛋白分泌表达载体即属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明还提供了上述的信号肽在引导目的蛋白分泌表达中的应用。
进一步地，该目的蛋白分泌表达为在原核表达系统中分泌表达。
更进一步地，该目的蛋白分泌表达为在原核表达系统的周质空间中分泌表达。
优选地，原核表达系统为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌中的任意一种。
应当容易理解，目的蛋白分泌表达还可以是在真核表达系统中分泌表达。真核表达系统为酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞中的任意一种。
进一步地，目的蛋白为β-内酰胺酶。β-内酰胺酶分子结构内含有一对二硫键，在胞质内无法形成正确的结构，因而β-内酰胺酶分泌至周质空间是转化菌产生氨苄青霉素抗性的先决条件。在该信号肽的引导作用下，β-内酰胺酶可以被引导分泌至周质空间进行正确折叠，形成具有生物活性的结构，进而可赋予相应的宿主体氨苄青霉素抗性。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
下列实施例中未注明具体条件的实验，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克等著，2003)中所述的条件进行。
实施例1
本实施例提供的信号肽(命名为SPX)，其氨基酸序列为：
Met-Tyr-Ile-Ser-Phe-Ile-Ser-Gly-Gly-Ser-Ala-Gly-Ser-Ala-Ala-Gly(SEQID NO:1)。
该信号肽能够引导目的蛋白分泌进入周质空间，跨膜后，该信号肽被信号肽酶切除，产生成熟的目的蛋白，目的蛋白进而得已产生相应的生物活性。
实施例2
本实施例提供了编码实施例1的信号肽的编码基因即SPX基因，其碱基序列为：
atgtatatct ccttcatttc tggtggatcc gctggctccg ctgctggttc tggc(SEQ IDNO:2)。
本实施例提供的SPX基因可编码实施例1所述的信号肽。将该SPX基因用于引导目的蛋白在宿主细胞中分泌表达的方法可参考如下：将该SPX基因连接至目的基因(编码目的蛋白)上游，形成融合基因，将融合基因连接至表达载体上，转化宿主细胞或宿主菌即可。
实施例3
本实施例提供了含有上述实施例2提供的SPX基因的蛋白分泌表达载体。其中，SPX基因的下游连接有编码目的蛋白(为β-内酰胺酶)的bla基因(SEQ ID NO:3)。
常用的氨苄青霉素抗性质粒上携带有抗氨苄青霉素基因，其编码β-内酰胺酶。β-内酰胺酶在胞质内合成后经自身信号肽引导进入周质空间。跨膜转运后，信号肽被可信号肽酶切除，产生成熟的β-内酰胺酶。β-内酰胺酶水解氨苄青霉素的β-内酰胺环使其失效，转化菌因而得以在氨苄青霉素存在的环境下生长。
β-内酰胺酶分子结构内含有一对二硫键，在胞质内无法形成正确的结构，因而β-内酰胺酶分泌至周质空间是转化菌产生氨苄青霉素抗性的先决条件。
以β-内酰胺酶作为目的蛋白，将实施例2提供的编码实施例1的信号肽的SPX基因与去除了自身信号肽碱基序列的β-内酰胺酶基因融合，构建了融合基因，将融合基因插入到以卡那霉素为筛选标记的pMK表达载体的tac启动子下游，得到蛋白分泌表达载体，其构建方法如下。
(1)根据SPX基因的碱基序列，设计引物如下。
SPX-F：5’-ggaattccatatgtatatctccttcatttctggtggatccgctggctccgc-3’
(SEQ ID NO:6、下划线为Nde I酶切位点)；
IP：5’-gatccgctggctccgctgctggttctggccacccagaaacgctggtgaaag-3’
(SEQ ID NO:7，IP为搭桥引物，PCR反应中其用量为SPX-F用量的十分之一)；
(2)以SPX-F和IP两个引物为上游引物，bla-R(5’-cccaagcttatcaccaatgcttaatcagtgag-3’，下划线为Hind III酶切位点)为下游引物，以商品化质粒pUC57为模板，PCR扩增出编码信号肽的SPX基因(SEQ ID NO:2)与编码成熟β-内酰胺酶的bla基因(SEQ ID NO:3)的融合基因SPX-bla(SEQ ID NO:8)。
(3)利用Nde I和Hind III双酶切之后，将该融合基因连入经过同样双酶切的带有卡那霉素抗性的PMK载体中，得到pMK-SPX-bla载体，该载体即为蛋白分泌表达载体。
实验例
本实验例以实施例3提供的蛋白分泌表达载体转化原核表达系统即大肠杆菌，观察大肠杆菌的抗性来验证实施例1提供的信号肽具有引导目的蛋白分泌表达的功能。
实验步骤如下。
(1)构建含成熟β-内酰胺酶的编码基因(bla)的质粒载体作为对照载体。
根据bla基因的碱基序列(SEQ ID NO:3)，设计引物:
bla-F：5’-ggaattccatatgcacccagaaacgctggtgaaag-3’(SEQ ID NO:4、下划线为Nde I酶切位点)；
bla-R：5’-cccaagcttatcaccaatgcttaatcagtgag-3’(SEQ ID NO:5、下划线为HindIII酶切位点)；
以两个引物为上下游引物，以商品化质粒pUC57(含bla基因)为模板，进行PCR扩增成熟β-内酰胺酶(不含自身信号肽)的编码基因bla，经过Nde I和Hind III双酶切之后，将其连入经过同样双酶切的带有卡那霉素抗性的pMK载体中，得到pMK-bla载体(含bla基因)。
(2)转化
将pMK-bla载体和实施例3得到的pMK-SPX-bla载体分别转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并分别涂布单抗的LB平板(含50mg/L的卡那霉素)和双抗的LB平板(含卡那霉素和氨苄青霉素各100mg/L)，37℃恒温箱过夜培养，观察两种转化菌的生长情况。
结果显示：pMK-bla载体转化菌只能在卡那霉素单抗平板上生长，不能在双抗平板上生长；而pMK-SPX-bla载体转化菌在双抗平板上生长。
本实验例的结果验证了本实施例1提供的信号肽SPX能够引导β-内酰胺酶在大肠杆菌中的分泌表达，使得转化菌产生了氨苄青霉素抗性。也同时表明了本发明提供的信号肽可以用于其它蛋白质的分泌表达。
综上所述，本发明提供的信号肽(SEQ ID NO:1)具有引导目的蛋白分泌表达的功能。其可以用于引导多种目的蛋白分泌表达。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 生工生物工程（上海）股份有限公司
<120> 一种信号肽及其编码基因、蛋白分泌表达载体和应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 18
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPX氨基酸序列
<400> 1
Met Tyr Ile Ser Phe Ile Ser Gly Gly Ser Ala Gly Ser Ala Ala Gly
1 5 10 15
Ser Gly
<210> 2
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPX DNA sequence
<400> 2
atgtatatct ccttcatttc tggtggatcc gctggctccg ctgctggttc tggc 54
<210> 3
<211> 789
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 3
cacccagaaa cgctggtgaa agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt 60
tacatcgaac tggatctcaa cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt 120
tttccaatga tgagcacttt taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtattgac 180
gccgggcaag agcaactcgg tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac 240
tcaccagtca cagaaaagca tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct 300
gccataacca tgagtgataa cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg 360
aaggagctaa ccgctttttt gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg 420
gaaccggagc tgaatgaagc cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgtagca 480
atggcaacaa cgttgcgcaa actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa 540
caattaatag actggatgga ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt 600
ccggctggct ggtttattgc tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc 660
attgcagcac tggggccaga tggtaagccc tcccgtatcg tagttatcta cacgacgggg 720
agtcaggcaa ctatggatga acgaaataga cagatcgctg agataggtgc ctcactgatt 780
aagcattgg 789
<210> 4
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 4
ggaattccat atgcacccag aaacgctggt gaaag 35
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 5
cccaagctta tcaccaatgc ttaatcagtg ag 32
<210> 6
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 6
ggaattccat atgtatatct ccttcatttc tggtggatcc gctggctccg c 51
<210> 7
<211> 51
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物
<400> 7
gatccgctgg ctccgctgct ggttctggcc acccagaaac gctggtgaaa g 51
<210> 8
<211> 843
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> SPX-bla融合基因
<400> 8
atgtatatct ccttcatttc tggtggatcc gctggctccg ctgctggttc tggccaccca 60
gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc 120
gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt gagagttttc gccccgaaga acgttttcca 180
atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg 240
caagagcaac tcggtcgccg catacactat tctcagaatg acttggttga gtactcacca 300
gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg acagtaagag aattatgcag tgctgccata 360
accatgagtg ataacactgc ggccaactta cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag 420
ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg 480
gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca 540
acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta 600
atagactgga tggaggcgga taaagttgca ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct 660
ggctggttta ttgctgataa atctggagcc ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca 720
gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag 780
gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc gctgagatag gtgcctcact gattaagcat 840
tgg 843

Claims (9)

1.一种信号肽，其特征在于，其氨基酸序列为(1)；(1)SEQ ID NO:1所示的序列。
2.一种编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的信号肽。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述信号肽的氨基酸序列为SEQ IDNO:1，所述编码基因的碱基序列如SEQ ID NO:2所示。
4.一种蛋白分泌表达载体，其特征在于，其含有权利要求2或3所述的编码基因。
5.含有权利要求4所述的蛋白分泌表达载体的细菌或细胞。
6.权利要求1所述的信号肽在引导目的蛋白分泌表达中的应用，其特征在于，所述目的蛋白为β-内酰胺酶。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述目的蛋白分泌表达为在原核表达系统中分泌表达。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述目的蛋白分泌表达为在原核表达系统的周质空间中分泌表达。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述原核表达系统为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和链霉菌中的任意一种。
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