CN106560176A - 一种载灯盏花素纳米结晶的长效缓释微粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒及其制备方法。将灯盏花素制备成纳米结晶后，进一步采用凝胶模板法新型微粒制备技术，最终得到灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，此微粒大小均一、释药行为可调控，且能显著提高其载药量与包封率，获得良好的长效缓释效果。

Description

一种载灯盏花素纳米结晶的长效缓释微粒及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，特别是药物递送系统领域。更具体地，本发明涉及一种灯盏花素长效缓释微粒及其制备方法。

背景技术

灯盏花素（Breviscapine）是从彝药灯盏花即菊科植物短葶飞蓬中提取精制的黄酮类有效成分，其中以灯盏乙素为主（又名野黄芩苷，占95%以上），还含有少量灯盏甲素。灯盏花素在临床上用于治疗心血管疾病、风湿性关节炎和中风后遗症，引起国内外众多医药工作者的广泛关注。药理研究发现其有改善心脑血管血流量、抗血小板凝聚、抗氧自由基、增强肝脏解毒，保护糖尿病性肝脏、肾脏等作用。

但是，灯盏花素水溶性和脂溶性均不佳，口服生物利用度低，半衰期短，极大地限制了其临床应用。目前，灯盏花素的上市制剂主要有普通片剂、分散片、滴丸、颗粒剂、注射液、注射用无菌粉末等。但其中口服制剂生物利用度低，而注射剂需要频繁用药（肌内注射每日1至2次、静脉滴注每日1次）。因此，急需开发一种长效注射用制剂克服上述不足、弥补剂型空白。

近年来，随着制剂技术的发展，微粒给药系统以其独特的优势已成为药物递送系统领域研究的热点和前沿。其中，以聚乳酸类为骨架材料（包括PLA、PLGA等）的微粒制剂以其良好的生物相容性和卓越的缓控释特性获得了广泛关注和深入研究。聚乳酸类微粒具有提高药物稳定性和生物利用度、释药速率和周期易于调节等优点，且已有多个上市制剂，其安全性和有效性获得了广泛认可。目前以O/W乳化-溶剂蒸发法制备此类微粒的研究和应用最为广泛，但所得微粒的粒径分布极不均匀，其形态大小、载药和释药特性同时受到诸多处方和工艺因素的影响。由于粒径分布极不均匀，导致所述微粒的释药行为与预想差距较大，释药不能得到精确调控。此外，上述方法一般对于脂溶性良好的药物其载药量、包封率较高，对水溶性药物则较差，而对于水溶性和脂溶性均不佳的药物则更为有限，导致本领域通常不会将水溶性和脂溶性不佳的药物采用聚乳酸类为骨架材料制备为微粒给药系统。特别是针对灯盏花素这种分子量较小，且水溶性和脂溶性不佳的药物，采用聚乳酸类为骨架材料制备为微粒将更为困难。

本领域的现有技术中，通常将灯盏花素制备为聚合物纳米粒，但是，纳米粒的载药量非常低，并且由于其材料、结构等因素的限制，其通常仅能用于静脉注射，体内留存时间短、释药仅为十几到几十个小时，这与本领域技术人员期望的长效释放相距甚远。现有技术CN101088505A就是一种灯盏花素纳米粒，其为了克服灯盏花素采用聚乳酸类为骨架材料制备微粒制剂所面对的技术问题，使用了加入表面活性剂的方法。其通过将灯盏花素和聚合物完全溶于适量的易挥发有机溶剂中形成溶液A，在滴加到适当浓度的表面活性剂水溶液中，挥发有机溶剂来制备纳米混悬液制剂，再冷冻干燥为粉剂。但是，出人意料地，本发明人经过研究发现，在上述现有技术中存在明显的缺点，如表面活性剂没有充分发挥促进灯盏花素包合的作用，其绝大部分均被吸附在聚合物其他非相关位置上。同时，活性药物灯盏花素也未被有效包合在聚合物中，并且受聚合物的影响无法有效控制灯盏花素析出后的结晶状态。而且其最终溶剂为混悬水溶液，溶剂为水，非常不利于干燥。并且如前所述，这种方法制备的颗粒的粒径分布极不均匀，工艺重现性差，不能有效长效释放。

凝胶模板法制备技术的优势在于模板的空间限域和调控作用可实现对制剂表面形貌及结构的精确控制。凝胶是一类具有预组织、自组合的三维网状结构，凝胶聚合物分子内的交联网状结构可以为构造材料提供化学反应环境和成长空间。由于凝胶的水溶性特点，其也易于去除，以凝胶高分子聚合物为模板来制备微粒具有很大潜力。但是，针对分子量较小，水溶性和脂溶性不佳的化合物，尚不能使用凝胶模板法来有效制备微粒制剂。

在医药技术领域中一直希望获得能够长效释放的制剂，其有效的活性成分的释放时间期望达到以10天为单位，甚至几十天。然而，这种制剂的制备过程存在诸多困难，如不能在较长时间段内均释放速度稳定，重现性不好等。为了控制药物的形状和释放特性，使用了较多的辅料和活性成分，导致制剂体积过大，临床上不能使用等。

本发明出人意料地首先将灯盏花素制成纳米结晶、然后利用一种新型微粒制备技术-凝胶模板法将该结晶载入聚乳酸类骨架材料制成缓释微粒，能够同时克服乳化-溶剂蒸发法所带来的粒径不均、载药量低等问题。凝胶模板技术最显著的特点在于所得微粒具有高度的均一性和可控性，不仅粒径均匀一致、重现性好，且能够精确地控制其形状和大小，易于调节载药和释药性能。

发明内容

本发明的目的在于提供一种粒径均一可控、载药量高、缓释性能优良的的灯盏花素长效缓释微粒。

具体地，本发明的灯盏花素长效缓释微粒是由灯盏花素和微球骨架材料构成的，其中，灯盏花素以纳米结晶的形式存在于缓释微粒中，被载入到微球骨架材料中。

所述微球骨架材料为聚乳酸类聚合物，具体地为聚乳酸（聚丙交酯，polylactide，PLA），左旋聚乳酸（PLLA），和/或聚乳酸-乙醇酸共聚物（PLGA），更具体地为不同分子量、不同乳酸与羟基乙酸的比例（lactic acid/glycolic acid，L/G）的PLGA以及PLLA。

本发明人出人意料地发现，在本发明技术方案中当灯盏花素的纳米结晶粒径的平均粒径小于等于600nm，多分散指数（Polydispersity Index，PDI）小于等于0.4时，能限制延长灯盏花素的释放时间，起到长效缓释的作用，且其释放速度较稳定均一，能够保证较平稳的血药浓度和长期的治疗效果。这与本领域现有技术中倾向于将灯盏花素制备为粒径更小产品或更容易被分散产品的趋势相反。优选的，平均粒径小于等于500nm，更优选的小于等于400nm，更优选的小于等于250nm。优选的多分散指数小于等于0.4，更优选的小于等于0.3，更优选的小于0.2，更优选的小于0.1。

本发明人更出人意料地发现，当灯盏花素长效缓释微粒的平均粒径为20-60μm时，能有效控制灯盏花素的释放时间，起到长效稳定缓释的作用，且其释放速度稳定均一。同时，上述灯盏花素长效缓释微粒的平均粒径范围显著的增加了载药量，通过增加载药量能够进一步保证产品应用时的血药浓度和生物利用度。

更进一步地，本发明的灯盏花素长效缓释微粒其粒径分布均一，其span值小于0.4，优选的span值小于0.3，更进一步的span值小于0.2，更进一步的span值小于0.1。

更进一步地，本发明的灯盏花素长效缓释微粒其载药量高，其载药量可达5%以上，优选的载药量可达10%以上，更进一步的载药量可达15%以上。

更进一步地，本发明的灯盏花素长效缓释微粒是由灯盏花素、表面活性剂和微球骨架材料构成的，其中，灯盏花素以纳米结晶的形式存在于缓释微粒中，被载入到微球骨架材料中。

更进一步地，本发明的灯盏花素长效缓释微粒其缓释性能优良，其体外释放时间可达10天以上，优选的体外释放时间可达20天以上，更进一步的体外释放时间可达50天以上。

本发明的目的还在于提供所述长效缓释微粒的制备方法。

具体地，本发明的灯盏花素长效缓释微粒的制备方法是，将灯盏花素制成纳米结晶，进一步采用凝胶模板技术将该纳米结晶载入聚乳酸类微粒中。

同时，本发明人出人意料的发现，所得灯盏花素纳米结晶可在粒径不增长的前提下，均匀分散于二氧六环-PLGA溶液中，这极有利于采用凝胶模板技术进行灯盏花素纳米结晶微粒的制备。

本发明人更出人意料的发现，采用凝胶模板技术制备所得的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒比传统的O/W法微粒载药量要更高，同等条件下本申请凝胶模板技术的载药量高于传统O/W法微粒载药量的2倍以上，更优选4倍以上，进一步优选6倍以上。同时，采用传统的O/W法无法将灯盏花素纳米结晶有效载入聚乳酸类微粒，而本申请凝胶模板技术采用先将灯盏花素制备为纳米结晶，再载入聚乳酸类聚合物的方式，更好的控制了活性成分灯盏花素的粒径，且有效的将灯盏花素载入了聚乳酸类聚合物。

具体的，本发明涉及如下技术方案：

一种灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，由灯盏花素和微球骨架材料构成的，其特征在于，灯盏花素以粒径均匀的纳米结晶的形式存在于缓释微粒中，被载入到微球骨架材料中，所述微球骨架材料为聚乳酸类聚合物，所述纳米结晶的平均粒径小于等于600nm，多分散指数小于等于0.4，并且所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的平均粒径为20-60μm，其span值小于0.4。

在上述技术方案中，通过控制纳米结晶的平均粒径和其多分散指数，可以保证制剂中活性成分的释放速度稳定均一。而通过控制灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的平均粒径和其span值，可以进一步保证制剂的载药量，其缓释效果和释放速度均一稳定，从而实现本发明的技术效果，解决相应的技术问题。

更进一步地，一种灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，所述聚乳酸类聚合物为PLLA或PLGA中的一种或一种以上的组合。

更进一步地，所述纳米结晶的平均粒径小于等于600nm，更优选的小于等于400nm，更优选的小于等于250nm；优选的所述纳米结晶多分散指数PDI小于等于0.4，更优选的小于等于0.3，更优选的小于0.2，更优选的小于0.1。

更进一步地，所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的平均粒径为20-60μm，优选地平均粒径为30-45μm，更优选的平均粒径为35-40μm，其span值小于0.4，优选的span值小于0.3，更进一步的span值小于0.2，更进一步的span值小于0.1。

更进一步地，所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，可以还包括表面活性剂，即由灯盏花素、表面活性剂和微球骨架材料构成的，其中，灯盏花素在表面活性剂的作用下以纳米结晶的形式存在于缓释微粒中，被载入到微球骨架材料中。

更进一步地，所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒中，灯盏花素与微球骨架材料的用量按重量份数计为5-30:70-95。

更进一步地，所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒中，表面活性剂的用量按重量份数计为0-0.5，更优选为0-0.4，更优选为0.1-0.3，更优选为0.1-0.2。

具体地，本申请还涉及如下技术方案：

一种灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的制备方法，其特征在于，先将灯盏花素制备为纳米结晶，再将灯盏花素纳米结晶和聚乳酸类聚合物的骨架材料均匀分散在二氧六环中，将混合液填充到凝胶模板中，挥干二氧六环，去除凝胶模板即得。

更进一步的，所述灯盏花素是采用反溶剂沉淀法制备为纳米结晶。

更进一步的，所述反溶剂沉淀法是，将灯盏花素溶于二甲基亚砜（DMSO）至近饱和溶液作为良溶剂，水作为不良溶剂（非溶剂）；于超声或均质下将良溶剂注入至不良溶剂中，制得灯盏花素纳米结晶混悬液，分离即获得灯盏花素纳米结晶。

更进一步地，所述不良溶剂可以是表面活性剂的水溶液。具体地可以是0.5%泊洛沙姆188的水溶液。

更进一步地，将收集灯盏花素纳米结晶均匀分散于PLGA的二氧六环溶液中，最后将得灯盏花素纳米结晶-PLGA溶液均匀填入模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板加入适量纯水使模板完全溶解，过滤，滤液离心收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得。

更具体地，本发明的实施方案为：

一种灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，组份内包括有效成分灯盏花素的纳米结晶、微粒骨架材料PLGA以及制备微粒过程中的有机溶剂体系；

各组份的含量按质量百分比计为：灯盏花素5～30%，微球骨架材料（PLGA）70～95%；

上述灯盏花素包括来源于天然或合成途径的各种灯盏花素异构体或灯盏花素衍生物中的一种或多种的混合物；

上述微球骨架材料包括不同分子量及不同乳酸与羟基乙酸的比例（lactic acid/glycolic acid，L/G）的PLGA以及PLLA。

上述灯盏花素纳米结晶的制备方法采用反溶剂沉淀法，其长效缓释微粒的制备方法采用凝胶模板法；

优选的，上述灯盏花素纳米结晶的平均粒径等于239.4±20.1nm，多分散指数（Polydispersity Index，PDI）为0.356； 上述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒平均粒径等于36.88±3.85 μm，Span值为0.26；载药量为5%以上，体外释放可长达50 d。

优选的，灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的载药量为10%以上。更优选的，载药量为15%以上。

在本发明中，所使用的模板或凝胶模板是指本领域中常规的用于形成微粒的模板。进一步地，为了获得更好的骨架效果，本发明人结合灯盏花素的物理、化学性质，经过实验研究，优选使用PVA模板。

所述PVA模板的制备方法为：取适量2.67% 的PVA溶液加至具孔的PDMS模板表面并涂布均匀，室内水平面上静置10-15min，移至60～65℃烘箱内干燥2h，即得PVA模板。

更具体的，本发明的目的通过以下技术方案予以实现:

一种灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，处方组份包括灯盏花素纳米结晶、微粒骨架材料PLGA以及制备微粒过程中残存的微量有机溶剂体系；

各组份的含量按质量百分比计为：灯盏花素5～30%，微球骨架材料70～95%；

上述微球骨架材料包括不同分子量及不同乳酸与羟基乙酸的比例（lactic acid/glycolic acid，L/G）的PLGA以及PLLA。

上述灯盏花素纳米结晶的制备方法：将灯盏花素溶于二甲基亚砜（DMSO）至近饱和溶液作为良溶剂，0.5%泊洛沙姆188溶液作为不良溶剂（非溶剂）；于800W的超声作用下将一定量良溶剂缓慢匀速注入至一定体积的不良溶剂中，冰浴超声5min（连续90 s，间歇1 s），制得灯盏花素纳米结晶混悬液。

优选地，所述上述灯盏花素纳米结晶的平均粒径等于239.4±20.1 nm，PDI=0.356。

上述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的制备方法：将上述所得灯盏花素纳米结晶混悬液离心，收集灯盏花素纳米结晶均匀分散于PLGA的二氧六环溶液中，最后将所得灯盏花素纳米结晶-PLGA溶液均匀填入模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板置入烧杯中，加入适量纯水使模板完全溶解，过200目（75 μm）滤布除杂，滤液离心（4000 rpm，2min）收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒。

所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒粒径均一，平均粒径等于36.88±3.85 μm，Span值为0.26；载药量为5%以上；体外释放可长达50 d。

优选的，灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的载药量为10%以上。更优选的，载药量为15%以上。

本发明的有益效果:

本发明综合利用反溶剂沉淀纳米结晶技术和凝胶模板微粒制备技术，先将灯盏花素制成纳米结晶，极大的提高了灯盏花素的溶解度和稳定性，使其可均匀的分散在PLGA的二氧六环溶液中，进而采用凝胶模板微粒制备技术得到灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，能有效提高灯盏花素的载药量，且释药行为可调控。

附图说明

图1是灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒（实施例2）与传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒粒径（对比例1）分布和形状对比实验。其中a为传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒，b为灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒（实施例2）。如图1所示，本发明灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒颗粒均一，形状稳定。

图2是灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒（实施例2）与传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒（对比例2）体外释药性能对比实验。其中左图为灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的释放情况，右图为传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒的释放情况。

图3是不同溶剂对灯盏花素纳米结晶的粒径影响对比实验。灯盏花素纳米结晶分别分散于二氧六环、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、以及二氯甲烷和二氧六环、乙酸乙酯、丙酮的混合溶液中，观察灯盏花素纳米结晶变化。出人意料的发现，所得灯盏花素纳米结晶可在粒径不增长的前提下，均匀分散于二氧六环-PLGA溶液中，但在其他有机溶剂体系中均迅速聚集并沉淀。

具体实施方式

以下结合附图通过实施例对本发明的技术方案做进一步说明，可以理解，本发明的具体实施方式仅是试图用于进一步解释和理解发明的技术方案，但不会影响本发明权利要求请求保护的范围。

实施例1：

取60 mg灯盏花素，溶于0.15 ml二甲基亚砜（DMSO）作为良溶剂，3 ml蒸馏水作为不良溶剂（非溶剂）；于800W的超声作用下将良溶剂缓慢匀速注入至不良溶剂中，冰浴超声5 min（连续90 s，间歇1 s），制得灯盏花素纳米结晶混悬液；

取240 mg PLGA，加入2 mL二氧六环，涡旋使其溶解，将上述所得灯盏花素纳米结晶混悬液离心（12000 rpm，5 min），弃上清，沉淀（灯盏花素纳米结晶）均匀分散PLGA的二氧六环溶液中，最后将得灯盏花素纳米结晶-PLGA溶液均匀填入50 μm的PVA模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板放入烧杯中，加入适量纯水使模板完全溶解，过200目（75 μm）滤布除杂，滤液离心（4000 rpm，2 min）收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒。

测得上述微粒记为样品1，具体参数见表1。

实施例2：

取60 mg灯盏花素，溶于0.15 ml二甲基亚砜（DMSO）作为良溶剂，3 ml 0.5%的泊洛沙姆188溶液作为不良溶剂（非溶剂）；于800 W的超声作用下将良溶剂缓慢匀速注入不良溶剂中，冰浴超声5 min（连续90 s，间歇1 s），制得灯盏花素纳米结晶混悬液；

取240 mg PLGA，加入2 mL二氧六环，涡旋使其溶解，将上述所得灯盏花素纳米结晶混悬液离心（12000 rpm，5 min），弃上清，沉淀（灯盏花素纳米结晶）均匀分散PLGA的二氧六环溶液中，最后将得灯盏花素纳米结晶-PLGA溶液均匀填入50 μm的PVA模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板放入烧杯中，加入适量纯水使模板完全溶解，过200目（75 μm）滤布除杂，滤液离心（4000 rpm，2 min）收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒。

测得上述微粒记为样品2，具体参数见表1。

实施例3：

取60 mg灯盏花素，溶于0.15 ml二甲基亚砜（DMSO）作为良溶剂，3 ml 0.5%的泊洛沙姆188溶液作为不良溶剂（非溶剂）；于高速均质作用（30000 rpm）下将良溶剂缓慢匀速注入至不良溶剂中，均质5 min，制得灯盏花素纳米结晶混悬液；

取240 mg PLGA，加入2 mL二氧六环，涡旋使其溶解，将上述所得灯盏花素纳米结晶混悬液离心（12000 rpm，5 min），弃上清，沉淀（灯盏花素纳米结晶）均匀分散PLGA的二氧六环溶液中，最后将得灯盏花素纳米结晶-PLGA溶液均匀填入50 μm的PVA模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板放入烧杯中，加入适量纯水使模板完全溶解，过200目（75 μm）滤布除杂，滤液离心（4000 rpm，2 min）收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒。

测得上述微粒记为样品3，具体参数见表1。

实施例4：

取60 mg灯盏花素，溶于0.15 ml二甲基亚砜（DMSO）作为良溶剂，3 ml 0.5%的泊洛沙姆188溶液作为不良溶剂（非溶剂）；于800 W的超声作用下将良溶剂缓慢匀速注入至不良溶剂中，冰浴超声5 min（连续90 s，间歇1 s），制得灯盏花素纳米结晶混悬液；

取240 mg PLGA，加入2 mL二氧六环，涡旋使其溶解，将上述所得灯盏花素纳米结晶混悬液离心（12000 rpm，5 min），弃上清，沉淀（灯盏花素纳米结晶）均匀分散PLGA的二氧六环溶液中，最后将得灯盏花素纳米结晶-PLGA溶液均匀填入20 μm的聚丙烯酰胺水凝胶模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板放入烧杯中，加入适量纯水使模板完全溶解，过200目（75 μm）滤布除杂，滤液离心（4000 rpm，2 min）收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒。

测得上述微粒记为样品4，具体参数见表1。

实施例5：

取30 mg灯盏花素，溶于0.075 ml二甲基亚砜（DMSO）作为良溶剂，1.5 ml 0.5%的泊洛沙姆188溶液作为不良溶剂（非溶剂）；于800 W的超声作用下将良溶剂缓慢匀速注入至不良溶剂中，冰浴超声5 min（连续90 s，间歇1 s），制得灯盏花素纳米结晶混悬液；

取270 mg PLGA，加入2 mL二氧六环，涡旋使其溶解，将上述所得灯盏花素纳米结晶混悬液离心（12000 rpm，5 min），弃上清，沉淀（灯盏花素纳米结晶）均匀分散PLGA的二氧六环溶液中，最后将得灯盏花素纳米结晶-PLGA溶液均匀填入20 μm的PVA模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板放入烧杯中，加入适量纯水使模板完全溶解，过200目（75 μm）滤布除杂，滤液离心（4000 rpm，2 min）收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒。

测得上述微粒记为样品5，具体参数见表1。

实施例6：

取90 mg灯盏花素，溶于0.225 ml二甲基亚砜（DMSO）作为良溶剂，4.5 ml 0.5%的泊洛沙姆188溶液作为不良溶剂（非溶剂）；于800 W的超声作用下将良溶剂缓慢匀速注入至不良溶剂中，冰浴超声5 min（连续90 s，间歇1 s），制得灯盏花素纳米结晶混悬液；

取210 mg PLGA，加入2 mL二氧六环，涡旋使其溶解，将上述所得灯盏花素纳米结晶混悬液离心（12000 rpm，5 min），弃上清，沉淀（灯盏花素纳米结晶）均匀分散PLGA的二氧六环溶液中，最后将得灯盏花素纳米结晶-PLGA溶液均匀填入20 μm的PVA模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板放入烧杯中，加入适量纯水使模板完全溶解，过200目（75 μm）滤布除杂，滤液离心（4000 rpm，2 min）收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒。

测得上述微粒记为样品6，具体参数见表1。

对比例1：

取240 mg PLGA与60 mg 灯盏花素，加入2 mL二氯甲烷与DMSO（2:1）的混合溶剂，涡旋使其溶解；在均质机剪切（8000 rpm，1 min）作用下将上述溶液加至40 mL PVA（1%，W/V）溶液制备O/W初乳；将所得O/W初乳注入800 mL PVA（0.5%，W/V）溶液中，搅拌（40 ℃，3 h）固化微球；离心（4000 rpm，3 min）收集微球，冷冻干燥即得灯盏花素微粒。

测得上述微粒记为样品7，具体参数见表1。

对比例2：

取灯盏花素5 g和聚乳酸30 g，完全溶于15 ml的甲醇与丙酮的混合溶液（2:3）中，将其滴加到40 ml 3%的泊洛沙姆溶液中，室温搅拌，完全除去有机溶剂，微孔滤膜（0.45 μm）过滤，即得灯盏花素纳米混悬液制剂，其药物平均包封率为88%，平均粒径为100~250 nm。

测得上述微粒记为样品8。

实验例1：灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒（实施例2）与传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒粒径分布（span值）对比实验。

微粒粒径分布测定：取微球粉末约20 mg均匀分散于10 ml 0.5%（W/V）PVA 溶液（含0.1%吐温-80），超声（10 min）后取适量微球混悬液于粒径测定仪测定。

实验结果：通过上述实验结果可知，传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒粒径分布（span值）为1.33，而灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒粒径分布（Span值）仅为0.26。

具体可参见图1。

实验例2：灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒（实施例2）与传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒（对比例1）载药量对比实验。

微粒载药量测定：取微球粉末约10 mg，精密称定，加入0.3 mL二氧六环使其完全溶解，再加入适量甲醇超声30 min后甲醇定容至5 mL；离心（12000 rpm，10 min）取上清液，适当稀释，采用高效液相色谱仪测定并计算灯盏花素含量（载药量=（微球中GA的含量／微球重量）× 100%）。

实验结果：通过上述实验结果可知，传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒载药量（%）为2.65±0.02，而灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒载药量要高出近6倍。

实验例3：灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒（实施例2）与传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒（对比例2）体外释药性能对比实验。

体外释药性能测定：精密取微球粉末约20 mg，灯盏花素纳米结晶冻干粉5 mg，分别分散于30 mL pH 7.4的磷酸盐缓冲液（PBST，含1% 吐温-20）中，置于恒温气浴摇床（120rpm，37℃），分别于预定时间离心（4000 rpm，3 min），定量取上清液，同时补充等量同温PBST；样品稀释至一定倍数，采用高效液相色谱仪测定并计算灯盏花素累积释放量，绘制体外累积释药曲线

实验结果：通过上述实验结果可知，与CN101088505A中灯盏花素聚合物纳米粒制剂相较，无论是灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，还是传统O/W所得的灯盏花素缓释微粒均显示出良好的长效缓释性能，释药可长达50 d，但灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒载药量高，其释药量更佳。

具体可参见图2。

实验例4：不同溶剂对灯盏花素纳米结晶的粒径影响对比实验

灯盏花素纳米结晶与有机溶剂混溶实验：将上述所得灯盏花素纳米结晶混悬液离心（12000 rpm，5 min），弃上清，沉淀（灯盏花素纳米结晶）分别分散于二氧六环、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、以及二氯甲烷和二氧六环、乙酸乙酯、丙酮的混合溶液中，观察灯盏花素纳米结晶变化。

实验结果：通过上述实验结果，我们出人意料的发现，所得灯盏花素纳米结晶可在粒径不增长的前提下，均匀分散于二氧六环-PLGA溶液中，但在其他有机溶剂体系中均迅速聚集并沉淀。

具体可参见图3。

Claims (10)

1.一种灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，由灯盏花素和微球骨架材料构成的，其特征在于，灯盏花素以粒径均匀的纳米结晶的形式被载入到微球骨架材料中，形成缓释微粒；所述微球骨架材料为聚乳酸类聚合物，所述纳米结晶的平均粒径小于等于600nm，多分散指数小于等于0.4，并且所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的平均粒径为20-60μm，其span值小于0.4。

2.如权利要求1所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，所述聚乳酸类聚合物为PLLA或PLGA中的一种或一种以上的组合。

3.如权利要求1所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，所述灯盏花素纳米结晶的平均粒径小于等于400nm，更优选的小于等于250nm；所述纳米结晶多分散指数小于等于0.4，更优选的小于等于0.3，更优选的小于0.2，更优选的小于0.1。

4.如权利要求1所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的平均粒径为20-60μm，优选地平均粒径为30-45μm，更优选的平均粒径为35-40μm；其span值小于0.4，优选的span值小于0.3，更进一步的span值小于0.2，更进一步的span值小于0.1。

5.如权利要求1所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，可以还包括表面活性剂，即所述灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒由灯盏花素、表面活性剂和微球骨架材料构成，其中，灯盏花素在表面活性剂的作用下以纳米结晶的形式被载入到微球骨架材料中，形成缓释微粒。

6.如权利要求1-5任一所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒，其中灯盏花素与微球骨架材料的用量按重量份数计为5-30:70-95，表面活性剂的用量按重量份数计为0-0.5。

7.一种如权利要求1-6任一所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的制备方法，其特征在于，先将灯盏花素制备为纳米结晶，再用凝胶模板法制备微粒，所述凝胶模板法是将灯盏花素纳米结晶和聚乳酸类聚合物的骨架材料均匀分散在二氧六环中得混合液，将混合液填充到凝胶模板中，挥干二氧六环，去除凝胶模板即得。

8.如权利要求7所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的制备方法，所述灯盏花素是采用反溶剂沉淀法制备为纳米结晶，所述反溶剂沉淀法是，将灯盏花素溶于二甲基亚砜至近饱和溶液作为良溶剂，水作为不良溶剂；于超声或均质下将良溶剂注入至不良溶剂中，制得灯盏花素纳米结晶混悬液，分离即获得灯盏花素纳米结晶。

9.如权利要求8所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的制备方法，所述不良溶剂是0.5%泊洛沙姆188的水溶液。

10.如权利要求7所述的灯盏花素纳米结晶长效缓释微粒的制备方法，其所述凝胶模板法为将收集的灯盏花素纳米结晶均匀分散于PLGA的二氧六环溶液中，将所得灯盏花素纳米结晶-PLGA混合液均匀填入模板微孔中；待二氧六环挥尽、模板干燥后，将模板加入适量纯水使模板完全溶解，过滤，滤液离心收集微粒，纯水适当洗涤后冷冻干燥即得。