CN106554947A - 一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法 - Google Patents

一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN106554947A
CN106554947A CN201510623906.3A CN201510623906A CN106554947A CN 106554947 A CN106554947 A CN 106554947A CN 201510623906 A CN201510623906 A CN 201510623906A CN 106554947 A CN106554947 A CN 106554947A
Authority
CN
China
Prior art keywords
acid
fructoamino
oxidase
stabilizer
alcohol
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201510623906.3A
Other languages
English (en)
Inventor
龚为民
邢克克
刘海萍
甘伟琼
李亚峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Original Assignee
Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS filed Critical Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority to CN201510623906.3A priority Critical patent/CN106554947A/zh
Publication of CN106554947A publication Critical patent/CN106554947A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0014—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4)
    • C12N9/0022—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with oxygen as acceptor (1.4.3)

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，公开了一种制备果糖基氨基酸氧化酶的方法，该方法包括将携带有果糖基氨基酸氧化酶编码基因的表达载体转化表达菌株，诱导转化后的表达菌株表达果糖基氨基酸氧化酶，分离纯化果糖基氨基酸氧化酶，将经纯化得到的果糖基氨基酸氧化酶与稳定剂混合，所述稳定剂包括含有1-10个糖苷键的糖和/或C2-10的醇。本发明还公开了一种保存果糖基氨基酸氧化酶的方法，该方法包括将果糖基氨基酸氧化酶与稳定剂混合，所述稳定剂包括含有1-10个糖苷键的糖和/或C2-10的醇。通过上述技术方案，本发明能够实现果糖基氨基酸氧化酶的大规模生产和长期的稳定保存。

Description

一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法。
背景技术
糖尿病在中国属于高发病率慢性疾病，平均10个人就有一人是糖尿病患者。目前中国已成为全球糖尿病患病人数最多，患病率最高的国家。糖尿病严重危害到患者的健康，影响其生活质量，因此对糖尿病的治疗和监测显得十分重要。
在人体红细胞120天生命周期内，血红蛋白可以持续被糖基化，而糖化血红蛋白形成的速率与血糖浓度成正比，因此糖化血红蛋白的含量反映了2-3个月血糖控制的情况。研究发现，与单纯的血糖水平相比，糖化血红蛋白的水平用于诊断糖尿病能更好地反映长期血糖控制和慢性并发症的风险，具有生物变异性较小、无需空腹采血等优点。临床上检测糖化血红蛋白的方法有很多，其中基于果糖基氨基酸氧化酶的酶法检测因具有操作简单、快速、价廉、精密度高等优点引起越来越多的关注。酶法检测糖化血红蛋白的原理是：首先糖化血红蛋白在蛋白酶的作用下分解释放出果糖基缬氨酸(f-αVal)或果糖基二肽(f-αVal-His)，然后果糖基缬氨酸或果糖基二肽在果糖基氨基酸氧化酶的作用下分解，反应过程中会产生双氧水，双氧水在过氧化物酶的作用下与特定的发色底物发生反应，颜色变化的程度与糖化血红蛋白的量呈正相关。
果糖基氨基酸氧化酶作为酶法检测糖化血红蛋白涉及的关键酶，是一类能水解果糖基氨基酸的酶。目前发现的果糖基氨基酸氧化酶有来源于原核生物的，也有来源于真菌的，其中来源于真菌的果糖基氨基酸氧化酶根据其底物特异性可分为三类：第一类偏好于以α-果糖基氨基酸(例如α-果糖基缬氨酸(Fructosyl-aN-valine)，f-αVal)为底物；第二类偏好于以ε-果糖基氨基酸(例如ε-果糖基赖氨酸(Fructosyl-εN-lysine)，f-εLys)为底物；第三类对α-果糖基氨基酸和ε-果糖基氨基酸的特异性差不多。另外，有研究发现有些果糖基氨基酸氧化酶对糖基化二肽或糖基化六肽具有活性，这类果糖基氨基酸氧化酶又被称为果糖基肽氧化酶。
目前文献报道的制备果糖基氨基酸氧化酶的方法大多数为直接从该酶的原始来源菌株中提取(例如CN1143111A)，也有部分进行基因重组在工程菌株中表达的，但是由于产生的量较少，仅限于科学研究，不适用于工业化生产。对于果糖基氨基酸氧化酶的保存，目前也鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法。
为了实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种制备果糖基氨基酸氧化酶的方法，该方法包括将携带有果糖基氨基酸氧化酶编码基因的表达载体转化表达菌株，诱导转化后的表达菌株表达果糖基氨基酸氧化酶，分离纯化果糖基氨基酸氧化酶，将经纯化得到的果糖基氨基酸氧化酶与稳定剂混合，所述稳定剂包括含有1-10个糖苷键的糖和/或C2-10的醇。
第二方面，本发明提供了一种保存果糖基氨基酸氧化酶的方法，该方法包括将果糖基氨基酸氧化酶与稳定剂混合，所述稳定剂包括含有1-10个糖苷键的糖和/或C2-10的醇。
通过上述技术方案，本发明能够实现果糖基氨基酸氧化酶的大规模生产和长期的稳定保存。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本发明中，在未作相反说明的情况下，使用的术语“酶活力”的大小即酶含量的多少，用酶活力单位表示，即酶单位(U)，本发明中酶单位的定义是：在37℃、pH 8的条件下，每分钟产生1μmol氨基酸产物所需要的酶量定义为一个酶单位，即1U＝1μmol/min；“酶的比活力”代表每单位质量蛋白质的催化能力，能够反应酶活性大小，其值越大，表明酶活性越高，比活力的计算公式为：比活力(U/mg)＝总酶活力单位数/mg总蛋白；单位M＝mol/L，相应地，mM＝mmol/L，依此类推。
组成蛋白质的20种氨基酸，按照侧链极性可以分成四类：1、非极性的氨基酸：丙氨酸(Ala，A)、缬氨酸(Val，V)、亮氨酸(Leu，L)、异亮氨酸(Ile，I)、甲硫氨酸(Met，M)、苯丙氨酸(Phe，F)、色氨酸(Trp，W)和脯氨酸(Pro，P)；2、极性不带电荷的氨基酸：甘氨酸(Gly，G)、丝氨酸(Ser，S)、苏氨酸(Thr，T)、半胱氨酸(Cys，C)、天冬酰胺(Asn，N)、谷氨酰胺(Gln，Q)和酪氨酸(Tyr，Y)；3、带正电荷的氨基酸：精氨酸(Arg，R)、赖氨酸(Lys，K)和组氨酸(His，H)；4、带负电荷的氨基酸：天冬氨酸(Asp，D)和谷氨酸(Glu，E)。
第一方面，本发明提供的制备果糖基氨基酸氧化酶的方法包括将携带有果糖基氨基酸氧化酶编码基因的表达载体转化表达菌株，诱导转化后的表达菌株表达果糖基氨基酸氧化酶，分离纯化果糖基氨基酸氧化酶，将经纯化得到的果糖基氨基酸氧化酶与稳定剂混合，所述稳定剂包括含有1-10(如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或上述任意两个数值之间的范围)个糖苷键的糖和/或C2-10(如C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10或上述任意两个数值之间的范围)的醇。
其中，所述糖优选为二糖，更优选为蔗糖、海藻糖、麦芽糖和乳糖中的至少一种，进一步优选为蔗糖和/或海藻糖。所述醇优选为多元醇，更优选为甘油、甘露醇和山梨醇中的至少一种。
本发明中，只要选择上述糖和/或醇作为稳定剂即可实现长期稳定保存的目的，对稳定剂的用量没有特别的要求，但优选情况下，相对于每克的果糖基氨基酸氧化酶，所述稳定剂的用量为3-70g(如3g、5g、10g、15g、20g、30g、33g、40g、50g、60g、65g、67g、70g、或者上述任意两个数值之间的范围)，更优选为30-70g。
为了更好地保证酶活性，优选地，所述混合在缓冲液的存在下进行，且混合体系中稳定剂的浓度为20-410g/L(如20g/L、50g/L、80g/L、100g/L、150g/L、180g/L、190g/L、200g/L、250g/L、300g/L、350g/L、400g/L、410g/L、或者上述任意两个数值之间的范围)，更优选为200-401g/L。所述缓冲液可以为pH 7-8.5的Tris-HCl缓冲液或pH 6.5-8磷酸盐缓冲液。
为了进一步防止果糖基氨基酸氧化酶被杂菌污染，优选地，所述稳定剂还包括防腐剂。所述防腐剂的用量可以为常规的用量，例如，在上述混合体系中，防腐剂的浓度可以为0.2-2g/L(如0.2g/L、0.5g/L、1g/L、1.5g/L、2g/L、或者上述任意两个数值之间的范围)。优选地，糖和/或醇的重量与所述防腐剂的重量之间的比值为10-2000:1，更优选为20-400:1，最优选为200-400:1。对防腐剂的种类没有特别的要求，可以为各种常规的用于防止蛋白被菌污染的防腐剂(包括叠氮钠、液体生物防腐剂等)，如市售的液体生物防腐剂ProClin300。
第一方面中，所述果糖基氨基酸氧化酶编码基因可以来源于各种能够产生果糖基氨基酸氧化酶的微生物，如土正青霉(Eupenicillium terrenum)等。可以通过对果糖基氨基酸氧化酶编码基因进行密码子优化进一步提高所述果糖基氨基酸氧化酶的产量，因此，所述果糖基氨基酸氧化酶编码基因优选为野生型基因序列经密码子优化后的基因，更优选为序列如SEQ ID NO:1所示的基因。
ATGGCACATTCCCGCGCAAGCACGAAGGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGTGGCACGATTGGTTCAAGCACGGCACTGCATCTGATCCGCTCTGGCTATACCCCGAGTAACATTACGGTGCTGGATGTTTACAAAACCCCGTCGCTGCAGAGCGCAGGTCATGACCTGAACAAAATTATGGGCATCCGTCTGCGCAATGGTCCGGATCTGCAGCTGTCTCTGGAAAGTCTGGATATGTGGCAAAACGACGAACTGTTTAAACCGTTTTTCCACCAAGTGGGCATGATTGACTGCAGCTCTAGTAAAGAAGGTATCGAAAATCTGCGTCGCAAGTATCAAACCCTGCTGGATGCGGGCATTGGTCTGGAAAAAACGAACGTCTGGCTGGAAAGCGAAGACGAAATCCTGGCCAAAGCACCGAATTTTACCCGTGAACAGGTTAAAGGCTGGAAGGGTCTGTTCTGTACGGATGGTGGTTGGCTGGCAGCAGCAAAAGCTATTAATGCGATTGGCATCTTTCTGCAAGACAAAGGCGTGAAGTTCGGTTTTGGCGGTGCCGGTACCTTTCAGCAACCGCTGTTCGCTGCGGATGGCAAAACCTGCATCGGTCTGGAAACCACGGATGGCACGAAATACTTTGCTGACAAGGTGGTTCTGGCAGCAGGTGCATGGTCCCCGACCCTGGTGGATCTGGAAGACCAGTGTGTTTCAAAAGCCTGGGTCTTCGCACATATTCAACTGACGCCGAAAGAAGCTGATGCGTATAAGAACGTTCCGGTCGTGTATGACGGCGAATACGGCTTTTTCTTTGAACCGAATGAATACGGCGTCATTAAAGTGTGCGATGAATTCCCGGGTTTTTCGCGTTTCAAGCTGCACCAGCCGTATGGCGCTGCAAGCCCGAAAATGATCTCGGTGCCGCGTAGCCATGCAAAGCACCCGACCGATACGTACCCGGACGCATCTGAAGTTACCATTCGTAAAGCCATCGCACGCTTTCTGCCGGAATTCAAAGATAAGGAACTGTTTAACCGTACGATGTGCTGGTGTACCGATACGGCTGACGCGAACCTGCTGATTTGTGAACATCCGAAATGGAAGAATTTTATCCTGGCGACCGGCGATTCCGGTCATTCATTCAAACTGCTGCCGAATATCGGCAAGCACGTTGTCGAACTGCTGGAAGGCTCCCTGTCACAGGAAATGGCCGGTGCATGGCGTTGGCGCCCGGGCGGTGATGCCCTGCGCAGCCGTCGCGGCGCACCGGCTAAGGACCTGGCTGAAATGCCGGGCTGGAAACACGACGCACATCTGTAA(SEQ ID NO:1)
第一方面中，携带有果糖基氨基酸氧化酶编码基因的表达载体中涉及的载体可以通过常规的表达载体，例如，pET22b载体、pET28a载体、pET32a载体或pGEX6p-1载体。果糖基氨基酸氧化酶编码基因可以插入所述表达载体的多克隆位点之间，例如，pET22b载体的BamHI和XhoI之间、pET28a载体的NdeI和XhoI之间、pET32a载体的BamHI和HindIII之间、pGEX6p-1载体的BamHI和XhoI之间。表达载体或编码基因本身通常携带有便于目的蛋白纯化的标签(如组氨酸标签、GST标签等)。
第一方面中，所述表达菌株可以为常规的基因工程常用菌，如大肠杆菌感受态菌株BL21(DE3)。转化的方法可以为各种常规的方法，如电击法或化学试剂法(CaCl2)。
第一方面中，诱导转化后的表达菌株表达果糖基氨基酸氧化酶的方法和条件可以根据采用的表达菌株的类型进行具体选择，例如，对于大肠杆菌，可以往培养基中添加0.1-2mM的诱导剂(如异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，IPTG)，在16-30℃下诱导培养8-20h。
第一方面中，分离纯化果糖基氨基酸氧化酶的方法可以为常规的从表达菌株的培养物中提取果糖基氨基酸氧化酶的方法，例如，可以包括收集菌体并破碎细胞、亲和层析纯化蛋白、透析等步骤。破碎细胞的方式可以为冻融、超声处理等。亲和层析可以为镍柱亲和层析、谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和层析等，可以根据目的蛋白携带的标签进行选择。透析使用的透析袋的截留分子量可以为8000-14000。
第二方面，本发明提供的保存果糖基氨基酸氧化酶的方法包括将果糖基氨基酸氧化酶与稳定剂混合，所述稳定剂包括含有1-10个糖苷键的糖和/或C2-10的醇。对于稳定剂的用量、混合的方式等如前所述，在此不再赘述。
本发明中，与稳定剂混合的果糖基氨基酸氧化酶置于4℃下保存1年以上或常温(25℃)下保存1个月以上仍保留有较高的酶活性。而且，通过与稳定剂混合，还能够进一步提高果糖基氨基酸氧化酶的热稳定性。
此外，本发明还涉及如上所述的稳定剂在提高果糖基氨基酸氧化酶的热稳定性中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，基因测序委托金唯智生物科技有限公司完成；引物合成委托生工生物工程股份有限公司完成；纯度经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后通过Bandscan分析目的条带的灰度和Marker的灰度比后估算得到；酶的浓度或量通过BCA蛋白定量试剂盒(Sigma)测得；ProClin300购自Sigma；f-αVal委托中国科学院生物物理研究所合成得到，结构式为：
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
本实施例用来说明本发明制备果糖基氨基酸氧化酶的方法。
(一)表达果糖基氨基酸氧化酶(或果糖基肽氧化酶)的编码基因和菌株的构建
根据GenBank中果糖基氨基酸氧化酶的原始基因序列，对密码子进行优化，包括：采用大肠杆菌偏好的密码子，使CAI值大于0.8；降低序列的GC含量，使之小于50％；更改限制性酶切位点，便于后续克隆构建到合适的表达载体上；提高翻译起始和终止效率等。优化后的基因的序列如SEQ IDNO:1所示。
以优化后的基因为模板进行PCR扩增，采用NEB的高保真DNA聚合酶，PCR反应体系如下：
SEQ ID NO:2：5’-CGGGATCCGATGGCACATTCCCGCGCAAGCAC-3’
SEQ ID NO:3：5’-CCGCTCGAGCAGATGTGCGTCGTGTTTCCA-3’
PCR条件如下：
预变性：98℃30sec；变性：98℃10sec，退火：60℃30sec，延伸：72℃1min，25个循环；最后延伸：72℃5min。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段，对目的片段和pET22b载体进行限制性双酶切(BamHI酶和XhoI酶)。
酶切后的载体和目的片段用DNA连接酶进行连接，随后转化大肠杆菌感受态DH5a(购自天根生化科技有限公司)。涂布LB平板，倒置于37℃培养箱培养12个小时。从平板上挑取单克隆，接种于5ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8个小时以上。抽取质粒，经基因测序证实正确的质粒转化到大肠杆菌表达菌株BL21(DE3)(购自天根生化科技有限公司)中。
(二)果糖基氨基酸氧化酶的诱导表达
将步骤(一)中转化有正确质粒的BL21菌株按照1:1000比例接种至100ml的LB培养基(100μg/ml氨苄青霉素)中，37℃培养过夜。然后将过夜培养的菌液按照1:100的比例接种至含800ml LB培养基(100μg/ml氨苄青霉素)的大瓶中，37℃、200rpm培养3小时，至OD值达0.8，向大瓶中加入诱导剂IPTG至终浓度为1mM，16℃诱导表达18h，4℃、4000rpm离心30分钟收集菌体。
(三)果糖基氨基酸氧化酶的分离纯化
参照Ni-NTA产品使用说明书，采用镍离子金属鳌合亲和层析方法纯化酶：将步骤(二)收集的菌体用裂解缓冲液(Lysis buffer，10mM的Tris-HCl，100mM的NaCl，pH 8)重悬，超声破碎，破碎液离心后上清与Ni-NTABeads(购自QIAGEN公司)在4℃下结合1小时，经过不同浓度(10mM、50mM、100mM、300mM和500mM)的咪唑洗脱液洗脱，获得较纯的果糖基氨基酸氧化酶，纯度大于95％。
收集梯度洗脱的目的蛋白，置于透析袋(Viskase，截留分子量为8000-14000)中，4℃磁力搅拌透析20小时，使用的透析液为Tris-HCl缓冲液(pH 8)，得到浓度为6mg/ml的酶液10ml，可见使用800ml的培养基得到菌体3g(经4000rpm离心30min得到的沉淀的湿重)，而最终可得到果糖基氨基酸氧化酶60mg。
(四)果糖基氨基酸氧化酶的酶活性
(1)测活试剂A的配制：
(2)酶液的稀释：用20mM磷酸钾缓冲液(pH 8)将步骤(三)中纯化的酶稀释到合适浓度，如0.05-0.1mg/ml。
(3)取792μl上述测活试剂A于1ml石英比色皿中，37℃孵育5min，加入8μl稀释后的酶液，迅速搅动混匀，于37℃下反应，开始计时3min并连续读取555nm吸光度的值，然后按照如下公式计算酶的比活力：
其中，ΔA/min：每分钟吸光度的变化值
Vt：反应液总体积
D：酶液稀释倍数
ε：生成的苯醌在555nm下的消光系数，取39.2(cm2/μmol)
Vs：加入反应体系的酶液体积
d：比色杯光径(1cm)
最终得到纯化后的酶的比活力为17U/mg。
本实施例说明本发明的方法能够用于果糖基氨基酸氧化酶的大规模生产。
实施例2-11
本实施例用来说明本发明保存果糖基氨基酸氧化酶的方法。
将实施例1获得的酶液(6mg/ml)与稳定剂混合，稳定剂的种类和稳定剂在混合体系中的终浓度(g/L)见表1，与稳定剂混合前后的酶的比活力测定结果表明稳定剂的添加并不会影响酶活性(见表1)。
将与稳定剂混合后的酶在50℃下热处理15min后再测定比活力，计算比活力下降的百分数。
将与稳定剂混合后的酶在4℃下保存1年、在25℃下保存1月，再测定比活力，计算比活力下降的百分数。
以不与稳定剂混合作为空白对照，分别测定热处理和在一定温度下保存一段时间后的比活力，并计算比活力下降的百分数。
比活力的测定方法参见实施例1，比活力下降的百分数的计算结果见下表1。
表1
从表1的结果可以看出，本发明保存果糖基氨基酸氧化酶的方法能够实现果糖基氨基酸氧化酶的长期稳定保存。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (10)

1.一种制备果糖基氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，该方法包括将携带有果糖基氨基酸氧化酶编码基因的表达载体转化表达菌株，诱导转化后的表达菌株表达果糖基氨基酸氧化酶，分离纯化果糖基氨基酸氧化酶，将经纯化得到的果糖基氨基酸氧化酶与稳定剂混合，所述稳定剂包括含有1-10个糖苷键的糖和/或C2-10的醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述糖为二糖，优选为蔗糖、海藻糖、麦芽糖和乳糖中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述醇为多元醇，优选为甘油、甘露醇和山梨醇中的至少一种。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中，相对于每克的果糖基氨基酸氧化酶，所述稳定剂的用量为3-70g。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述混合在缓冲液的存在下进行，且混合体系中稳定剂的浓度为20-410g/L。
6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其中，所述稳定剂还包括防腐剂，糖和/或醇的重量与所述防腐剂的重量之间的比值为10-2000:1。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述果糖基氨基酸氧化酶编码基因为野生型基因序列经密码子优化后的基因，优选为序列如SEQ ID NO:1所示的基因。
8.一种保存果糖基氨基酸氧化酶的方法，其特征在于，该方法包括将果糖基氨基酸氧化酶与稳定剂混合，所述稳定剂包括含有1-10个糖苷键的糖和/或C2-10的醇；所述糖优选为二糖，更优选为蔗糖、海藻糖、麦芽糖和乳糖中的至少一种；所述醇优选为多元醇，更优选为甘油、甘露醇和山梨醇中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，相对于每克的果糖基氨基酸氧化酶，所述稳定剂的用量为3-70g；优选地，所述混合在缓冲液的存在下进行，且混合体系中稳定剂的浓度为20-410g/L。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中，所述稳定剂还包括防腐剂，糖和/或醇的重量与所述防腐剂的重量之间的比值为10-2000:1。
CN201510623906.3A 2015-09-28 2015-09-28 一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法 Pending CN106554947A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510623906.3A CN106554947A (zh) 2015-09-28 2015-09-28 一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201510623906.3A CN106554947A (zh) 2015-09-28 2015-09-28 一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN106554947A true CN106554947A (zh) 2017-04-05

Family

ID=58416333

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201510623906.3A Pending CN106554947A (zh) 2015-09-28 2015-09-28 一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106554947A (zh)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104611319A (zh) * 2015-01-26 2015-05-13 温州医科大学 一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104611319A (zh) * 2015-01-26 2015-05-13 温州医科大学 一种提高液态果糖氨基酸氧化酶热稳定性的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
李礼等: "果糖氨基酸氧化酶的原核表达及在糖化血红蛋白检测中的初步应用", 《临床检验杂志》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2423937T3 (es) Enzima involucrado en la síntesis de ecuol
Panek et al. Effects of the polyhistidine tag on kinetics and other properties of trehalose synthase from Deinococcus geothermalis
CN108138157A (zh) 一种新型内溶素多肽
US10829755B2 (en) Genetically engineered arginine deiminase modified by site-directed mutagenesis
KR101989185B1 (ko) 원생동물 중 참게 인자 c 단백질의 재조합 생산을 위한 방법
WO2015158213A1 (zh) 一种具有高转糖苷活性的β-半乳糖苷酶突变体及其制备方法和应用
Kosakowski et al. The Subunit Structure of Phenylalanyl‐tRNA Synthetase of Escherichia coli
CN109750054A (zh) 一种牛支原体蛋白基因MbovGdpP及其应用
Hennessey et al. The purification and some properties of a β-lactamase (cephalosporinase) synthesized by Enterobacter cloacae
CN108118037A (zh) 一种耐热性提高的葡萄糖氧化酶突变体
Daddona et al. Analysis of normal and mutant forms of human adenosine deaminase—a review
CN109439643A (zh) 一种新型赖氨酸特异性内切酶及其制备方法
CN107988176B (zh) 一种酶活和稳定性提高的酪氨酸酶突变体及其构建方法
Oudega et al. Purification and characterization of cloacin DF13 receptor from Enterobacter cloacae and its interaction with cloacin DF13 in vitro
CN106554947A (zh) 一种制备和保存果糖基氨基酸氧化酶的方法
Charbit et al. Function of the duplicated IIB domain and oligomeric structure of the fructose permease of Escherichia coli
CN106554945B (zh) 一种热稳定性高的果糖基肽氧化酶及其编码基因和用途
KR20020065925A (ko) 고-특이적 활성 재조합 ｓ-아데노실호모시스테이나제(ｓａｈｈ)의 고발현과 생산 및ｓ-아데노실메티오닌(ｓａｍ)에 대한 개선된 분석법
CN106544330B (zh) 一种特异性高的果糖基肽氧化酶及其编码基因和用途
CN104845949B (zh) RGD‑重组葡激酶‑人α微球蛋白融合蛋白及其制备与应用
CN109666618B (zh) 一种在酸胁迫环境下生存能力提高的乳酸菌工程菌
Tsai et al. The subunit structure of Neurospora tryptophan synthase: a reappraisal
Patin et al. Unusual substrate specificity of the peptidoglycan MurE ligase from Erysipelothrix rhusiopathiae
CN104962573A (zh) Pgⅱ与mbp融合蛋白的可溶性分泌表达及其应用
CN106929491B (zh) (s)-羰基还原酶异源聚合体及其在催化多苯环化合物的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170405