CN106550871B

CN106550871B - 一种结球甘蓝花粉分化培养基配方

Info

Publication number: CN106550871B
Application number: CN201610876006.4A
Authority: CN
Inventors: 谭兴江; 张瑞明; 宋兆霞
Original assignee: Xinyi Hongzhi Business Service Center
Current assignee: Xinyi Hongzhi Business Service Center
Priority date: 2016-10-08
Filing date: 2016-10-08
Publication date: 2018-10-09
Anticipated expiration: 2036-10-08
Also published as: CN106550871A

Abstract

本发明提供了一种结球甘蓝花粉分化培养基，其配方含有KNO₃、苯乙酸钾、MgSO₄∙7H₂O、CaCl₂∙2H₂O、(NH₄)₂SO₄、NaH₂PO₄∙H₂O、Na₂‑EDTA、FeSO₄∙7H₂O、MnSO₄∙4H₂O、AgNO₃、H₃BO₃、ZnSO₄∙7H₂O、KI、Na₂MoO₄∙2H₂O、CuSO₄∙5H₂O、CoCl₂∙6H₂O、谷氨酰胺、褪黑素、维生素B1、维生素B6、2‑吗啉乙磺酸、烟酸、叶酸、生物素、肌醇、山梨醇、甘氨酸、脯氨酸、阿拉伯半乳聚糖、蔗糖、植物凝胶、KT、调环酸钙、秋水仙素、水解蛋白和活性炭。该培养基可以显著提高结球甘蓝花粉愈伤绿苗再生效率，具有重要的应用价值。

Description

一种结球甘蓝花粉分化培养基配方

技术领域

本发明涉及一种结球甘蓝花粉分化培养基配方，具体涉及一种可以显著提高结球甘蓝花粉愈伤绿苗再生效率的结球甘蓝花粉分化培养基配方，属于农业生物技术领域。

背景技术

结球甘蓝（Brassica oleraca L. var capitata L.）简称甘蓝，又名洋白菜、包心菜、疙瘩白、圆白菜、卷心菜等，属于十字花科芸薹属二年生植物。甘蓝是世界上公认的保健蔬菜之一，营养丰富，含有20多种营养元素，如异硫氰酸盐、类胡萝卜素、维生素C等，特别是含有对胃及十二指肠溃疡有明显止痛和促进愈合作用的稀有维生素-维生素U，而且甘蓝还具有适应性强、耐寒性强、耐储运、四季均可种植的优点，因此深受人们喜爱。甘蓝在我国蔬菜结构中占有举足轻重的地位，种植面积仅次于大白菜，是我国第二大叶用蔬菜。近年来随着国内周年供应需求及出口贸易的增加，甘蓝种植面积呈逐年扩大的趋势，现已达到了每年约90万hm²。

出于甘蓝产业发展的需要，加强高产、优质、抗病甘蓝育种显得尤为重要。甘蓝为异花授粉作物，具有显著的杂种优势，生产上甘蓝种子绝大多数为F1代杂种，因而杂交育种成为甘蓝育种的主要方式。杂种F1的选配是由优良的自交系亲本杂交获得的，而甘蓝优良自交系选育主要采用杂交后代连续自交定向选择获得，这种方法纯和速度慢、育种时间长，一般需要6-8年，且连续自交多代后容易出现植株衰退现象。

花粉培养，又叫游离小孢子培养，是一种快速纯合自交系和创制新育种材料的有效育种途径，选育周期短，仅需1-2年，育种效率显著。近年来，十字花科单倍体育种逐步得到发展，花粉培养作为人工诱导单倍体的有效途径具有实用性、单细胞单倍体性和较高胚胎发生率及较高同步性等特点，不仅可作为重要的细胞筛选系统和基因转移的受体，而且也是获得纯合双单倍体的快捷方法，目前已成为当前生物技术育种中的方法之一。

在十字花科芸薹属作物中，先后对油菜、芥菜、甘蓝、大白菜、小白菜和花椰菜等进行了花粉培养并获得了再生植株。国内外学者对影响芸薹属作物花粉培养的一些因素进行了研究，取得了显著的进展，但甘蓝花粉培养研究进展缓慢，多数具有价值的甘蓝材料花粉诱导胚性愈伤产量低而不稳定，限制了该方法在甘蓝育种中的应用。因此，只有掌握了甘蓝花粉培养技术的关键影响因素，完善甘蓝花粉培养体系，才能在最短的时间内获得纯合自交系，配制优良的杂交组合，选育更多新的优良品种，提高结球甘蓝育种效率和育种水平。

培养基是花粉培养的物质基础，结球甘蓝花粉培养的花粉胚性愈伤诱导和愈伤分化两个阶段是结球甘蓝花粉培养的两个关键步骤。我们通过多年的试验摸索，对结球甘蓝花粉诱导培养基进行了创造性的改良，大大提高了结球甘蓝花粉胚性愈伤组织的诱导率，为结球甘蓝高效花粉培养体系的建立奠定了坚实的基础。然而目前结球甘蓝花粉分化培养基对花粉愈伤的绿苗再生效率并不高，成为我们建立结球甘蓝高效花粉培养体系必需解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种可以显著提高结球甘蓝花粉愈伤绿苗再生效率、具有重要的应用价值的结球甘蓝花粉分化培养基配方。

本发明的目的是通过以下技术方案解决的：

一种结球甘蓝花粉分化培养基配方，其特征在于：该培养基的配方如下：

KNO₃ 2000-2400mg/L，苯乙酸钾 430-470mg/L，MgSO₄∙7H₂O 280-340mg/L，CaCl₂∙2H₂O 270-320mg/L，(NH₄)₂SO₄ 90-110mg/L，NaH₂PO₄∙H₂O 120-140mg/L，Na₂-EDTA 35.6-39mg/L，FeSO₄∙7H₂O 26-29.6mg/L，MnSO₄∙4H₂O 15-17mg/L，AgNO₃ 4.2-4.8mg/L，H₃BO₃ 4.2-4.8mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 9.5-10.5mg/L，KI 0.7-0.8mg/L，Na₂MoO₄∙2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.02-0.03mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.02-0.03mg/L，谷氨酰胺 750-850mg/L，褪黑素 90-110mg/L，维生素B1 0.5-0.6mg/L，维生素B6 0.7-0.8mg/L，2-吗啉乙磺酸 140-180mg/L，烟酸 0.7-0.8mg/L，叶酸 0.15-0.25mg/L，生物素 0.06-0.08mg/L，肌醇 90-110mg/L，山梨醇18～22g/L，甘氨酸 1.8-2.2mg/L，脯氨酸 85-95mg/L，阿拉伯半乳聚糖 5-6mg/L，蔗糖27-33g/L，植物凝胶 5.3-5.7g/L，KT 0.25-0.35mg/L，调环酸钙0.1-0.15mg/L，秋水仙素 0.4-0.5mg/L，水解蛋白 0.8-1.0g/L，活性炭 0.025-0.035g/L，pH 5.7-5.9。

本发明所提供的甘蓝花粉分化培养基，是在现有研究发现基础之上进一步创造性改良的成果，是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，我们进行了大量的实验研究亦得出本发明的组分配比是最优的。采用本发明所提供的培养基可以显著提高结球甘蓝花粉愈伤绿苗再生效率，具有重要的应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。

结球甘蓝种子在前一年秋季播于大田，自然越冬后于第2年春季3-4月结球甘蓝始花期取材，选择单核晚期花粉粒占多数的主花序中的花蕾带回实验室，热激预处理2d后接种，分离结球甘蓝花粉，将花粉接种于我们研发的结球甘蓝花粉诱导培养基中，25℃暗培养，半个月左右胚性愈伤组织开始出现，当诱导培养后的结球甘蓝花粉愈伤组织长到0.3-0.6cm大小时，转到本发明所提供的结球甘蓝花粉分化培养基中诱导绿苗，培养条件控制为：温度24-26℃、湿度70%-85%、光照2500-3500lx 、光周期光l4h/暗10h。甘蓝绿苗产生后，计算绿苗再生率。

绿苗再生率（%）=绿苗数/转移的愈伤块数×100%。。

实施例

配制本发明所提供的结球甘蓝花粉分化培养基，培养基配方具体如下：

KNO₃ 2200mg/L，苯乙酸钾 450mg/L，MgSO₄∙7H₂O 310mg/L，CaCl₂∙2H₂O 295mg/L，(NH₄)₂SO₄ 100mg/L，NaH₂PO₄∙H₂O 130mg/L，Na₂-EDTA 37.3mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.8mg/L，MnSO₄∙4H₂O 16mg/L，AgNO₃ 4.5mg/L，H₃BO₃ 4.5mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 10mg/L，KI 0.75mg/L，Na₂MoO₄∙2H₂O 0.25mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.025mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.025mg/L，谷氨酰胺 800mg/L，褪黑素 100mg/L，维生素B1 0.55mg/L，维生素B6 0.75mg/L，2-吗啉乙磺酸 160mg/L，烟酸 0.75mg/L，叶酸 0.2mg/L，生物素 0.07mg/L，肌醇 100mg/L，山梨醇 20g/L，甘氨酸2mg/L，脯氨酸 90mg/L，阿拉伯半乳聚糖 5.5mg/L，蔗糖30g/L，植物凝胶 5.5g/L，KT0.3mg/L，调环酸钙0.125mg/L，秋水仙素 0.45mg/L，水解蛋白 0.9g/L，活性炭 0.03g/L，pH5.8。

试验品种选择中甘15号和京丰1号，将中甘15号和京丰1号的种子在2014年9月下旬播种，自然越冬后于2015年3月上旬结球甘蓝始花期时取材，选择单核晚期花粉粒占多数的主花序中的花蕾带回实验室，热激预处理2d后接种，分离结球甘蓝花粉，将花粉接种于我们试验研发的结球甘蓝花粉诱导培养基中，25℃暗培养，半个月左右胚性愈伤组织开始出现，当诱导培养后的结球甘蓝花粉愈伤组织长到0.3-0.6cm大小时，转到本发明所提供的结球甘蓝花粉分化培养基中诱导绿苗，培养条件控制为：温度24-26℃、湿度70%-85%、光照2500-3500lx 、光周期光l4h/暗10h。甘蓝绿苗产生后，计算绿苗再生率。

为比较本发明所提供的结球甘蓝花粉分化培养基与前人采用的培养基对结球甘蓝花粉胚性愈伤组织绿苗分化效率（绿苗再生率）的差异，我们另外选择了2种前人采用过的结球甘蓝花粉分化培养基，试验品种亦采用中甘15号和京丰1号，组培操作方法、培养方法、培养条件均相同，花粉绿苗再生后分别统计中甘15号和京丰1号的花粉愈伤在该2种培养基内的绿苗再生率。

其它2种结球甘蓝花粉分化培养基配方为：

B₅培养基+3%蔗糖+l%琼脂+6-BA 0.2mg/L，pH为5.8（对比文件来自于蒋武生等《结球甘蓝游离小孢子培养胚的形成和再生植株》）；

B₅培养基+AgNO₃ 5mg/L+2%蔗糖+l.2%琼脂+6-BA 0.15mg/L+NAA 0.05mg/L，pH为5.8（对比文件来自于曾爱松等《结球甘蓝小孢子胚植株再生技术体系的优化》）。

培养基对比实验

将统计获得的本发明所提供的结球甘蓝花粉分化培养基对中甘15号和京丰1号花粉绿苗再生率与对比实施例中的另外两种前人所用的培养基对中甘15号和京丰1号花粉绿苗再生率进行比较，比较结果如下表1所示。

由表1可以发现，本发明所提供的结球甘蓝花粉分化培养基对结球甘蓝品种中甘15号和京丰1号的花粉愈伤绿苗再生率平均值达到了91.2%，而前人所采用的另外两种培养基对结球甘蓝中甘15号和京丰1号的花粉愈伤绿苗再生率平均值分别仅为45.7%和58%，可以发现本发明所提供的结球甘蓝花粉分化培养基对结球甘蓝花粉愈伤绿苗再生率做出了显著的提高。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

Claims

1.一种结球甘蓝花粉分化培养基，其特征在于：该培养基的配方如下：KNO₃ 2000-2400mg/L，苯乙酸钾 430-470mg/L，MgSO₄∙7H₂O 280-340mg/L，CaCl₂∙2H₂O 270-320mg/L，(NH₄)₂SO₄ 90-110mg/L，NaH₂PO₄∙H₂O 120-140mg/L，Na₂-EDTA 35.6-39mg/L，FeSO₄∙7H₂O 26-29.6mg/L，MnSO₄∙4H₂O 15-17mg/L，AgNO₃ 4.2-4.8mg/L，H₃BO₃ 4.2-4.8mg/L，ZnSO₄∙7H₂O9.5-10.5mg/L，KI 0.7-0.8mg/L，Na₂MoO₄∙2H₂O 0.2-0.3mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.02-0.03mg/L，CoCl₂∙6H2O 0.02-0.03mg/L，谷氨酰胺 750-850mg/L，褪黑素 90-110mg/L，维生素B1 0.5-0.6mg/L，维生素B6 0.7-0.8mg/L，2-吗啉乙磺酸 140-180mg/L，烟酸 0.7-0.8mg/L，叶酸0.15-0.25mg/L，生物素 0.06-0.08mg/L，肌醇 90-110mg/L，山梨醇 18-22g/L，甘氨酸1.8-2.2mg/L，脯氨酸 85-95mg/L，阿拉伯半乳聚糖 5-6mg/L，蔗糖27-33g/ L，植物凝胶5.3-5.7g/L，KT 0.25-0.35mg/L，调环酸钙0.1-0.15mg/L，秋水仙素 0.4- 0.5mg/L，水解蛋白 0.8-1.0g/L，活性炭 0.025-0.035g/L，pH 5.7-5.9；所述结球甘蓝品种为中甘15号和京丰1号。