CN106546620A - 一种无损定量检测中华绒螯蟹中蟹油含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种无损定量检测中华绒螯蟹(河蟹)中蟹油含量的方法，该方法包括步骤：(1)机械挤压和冷冻干燥制备蟹黄粉；(2)酶法提取蟹黄粉中的蟹油；(3)优化低场核磁共振参数；(4)通过H质子信号量和载体上蟹油含量良好的线性关系建立检测蟹油的标准曲线；(5)无损检测活体河蟹中的蟹油含量。本发明具有操作简单、时间短、安全无污染、成本较低等显著优点。

Description

一种无损定量检测中华绒螯蟹中蟹油含量的方法
技术领域
本发明涉及一种无损定量检测中华绒螯蟹(河蟹)中蟹油含量的方法，更具体地说，涉及通过低场核磁共振技术无损检测河蟹中蟹油含量的方法。
背景技术
由于河蟹浓郁的香味和营养比较丰富，其在中国和东南亚是一种养殖规模比较庞大的水产品。2015年成蟹养殖产量达782万吨以上，年产值400亿元左右。河蟹主要的可食性部位是肝胰腺和性腺，而其香味和营养成份主要来源于蟹油组织，因此，定量检测河蟹蟹黄粉中的蟹油含量具有重要的理论价值和现实意义。
目前，蟹油含量常用的检测方法主要有近红外、中红外、拉曼光谱、电子鼻、电子舌和索氏抽提法等。但这些方法需要对检测样品进行严格的预处理，所需仪器比较昂贵、准确度低、耗时较长和不适宜现场检测等缺点。低场核磁共振(Low field-1H nuclearmagnetic resonance,LF-1H NMR)是一种快速、无损、精确的光谱检测技术，能测定得到样品的氢质子密度与分布图，从而反映样品中的蟹油的分布及含量。LF-1H NMR具有快速、高效、灵敏和对样品无损的特点，在食品、医药和农业等研究中有着广泛的应用。通过检索国内外相关资料，尚未发现基于低场核磁共振无损定量检测河蟹中蟹油含量的报道。基于低场核磁共振技术无损定量检测河蟹中蟹油含量不仅有利于河蟹的品质控制，更有利于河蟹的品质分级和市场流通。
发明内容
本发明针对目前国内外缺乏可靠的准确检测活体河蟹中蟹油含量的方法，提供了一种通过LF-1H NMR无损定量检测活体河蟹中蟹油含量的方法，该方法具有安全快速、操作简单和准确度高等特点。本方法适用于快速检测活体河蟹中蟹油含量，从而判断河蟹的蟹油发育和营养价值。该发明技术可应用于河蟹养殖企业、流通企业和科研单位等。
为了实现上述目的，本发明提供了一种无损定量检测中华绒螯蟹(河蟹)中蟹油含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备蟹黄粉：清洗干净的河蟹通过机械挤压将其肝胰腺和性腺挤出，再低温冷冻干燥制备成蟹黄粉；
(2)提取蟹黄粉中的蟹油：通过中性蛋白酶酶解蟹黄粉提取蟹油；
(3)优化低场核磁共振参数：将一定量的蟹油吸附在载体上，利用吸附在载体上的蟹油优化核磁共振分析仪的低场核磁共振参数；
(4)建立载体上蟹油含量和H质子信号量的标准曲线：将多个不同重量的蟹油吸附在载体上，在核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁共振参数测量所述多个不同重量的蟹油的H质子信号量，建立载体上蟹油含量和H质子信号量的标准曲线；
(5)无损检测活体河蟹中蟹油含量：在核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁共振参数检测自然晾干的活体河蟹的H质子信号量，对比标准曲线上H质子信号量判断该河蟹中蟹油含量。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤(1)中制备蟹黄粉所用河蟹为20-80kg，机械挤压的时间是10-15min，挤压的压力是50-100mPa。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤(1)中低温冷冻干燥的温度为-40℃，时间是3-5h。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)中所用中性蛋白酶的量为蟹黄粉重量的2-5％。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤(2)中加入中性蛋白酶之前先将蟹黄粉与去离子水按照料液比1:2-1:5(g/mL)混合，所述酶解的条件为pH 6.0-8.0、温度50-60℃，酶解时间为4-8h。
在本发明的一个更优选实施方案中，步骤(2)中酶解反应完成后，趁热离心，离心转速为5000-12000rpm，离心时间为10-30min，收集上清液即为蟹油。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)中被优化的低场核磁共振参数是T1、TE、NS、NECH、TW和TR等，其中T1表示横向弛豫时间；NECH表示回波个数；TW表示等待时间；TE表示回波时间；TR表示重复时间。
在本发明的一个更优选实施方案中，采用CPMG序列优化的低场核磁共振参数T1＝250-400ms；TE＝3.51-15.20ms；NS＝10-20；NECH＝1-4；TW＝1000-3000ms；TR＝300-450ms。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)中优化低场核磁共振参数所用蟹油的量为2-5g。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤(3)和(4)中所用载体是木浆卫生纸。
在本发明的一个优选实施方案中，步骤(4)中所述多个不同重量的蟹油指至少5个重量为0.2-10g的蟹油。
在本发明的一个更优选实施方案中，采用CPMG序列优化的低场核磁共振参数T1＝300ms；TE＝11.20ms；NS＝20；NECH＝4；TW＝3000ms；TR＝400ms；利用该优化的低场核磁共振参数建立载体上蟹油含量和H质子信号量的标准曲线是y＝3187.2185X+13.4828，R2＝0.9999。在本发明的一个更优选实施方案中，采用CPMG序列优化的低场核磁共振参数T1＝350ms；TE＝12.8ms；NS＝16；NECH＝5；TW＝4500ms；TR＝360ms，利用该优化的低场核磁共振参数建立载体上蟹油含量和H质子信号量的标准曲线是y＝5026.6806X+7.6764，R2＝0.9999。在本发明的一个更优选实施方案中，采用CPMG序列优化的低场核磁共振参数T1＝360ms；TE＝10.50ms；NS＝14；NECH＝5；TW＝4000ms；TR＝360ms，利用该优化的低场核磁共振参数建立载体上蟹油含量和H质子信号量的标准曲线是y＝6124.2548X+10.2782，R2＝0.9999。
与现有技术相比，本发明的方法具有如下有益效果：
①本发明的方法利用载体上蟹油含量和H质子信号量呈比例关系建立蟹油含量和H质子信号量的标准曲线从而建立的无损定量检测方法，该方法操作方法简单，可以无损定量检测活体河蟹中蟹油的含量，检测时间短，较少样品即可检测，不需要任何化学试剂、操作简单和成本较低。
利用载体上蟹油含量和H质子信号量的标准曲线和活体河蟹的H质子信号量可针对性强，准确度高，无干扰，检测时在10s左右，可以实现活体河蟹中蟹油含量的批量快速检测，有利于养殖企业进行河蟹品质筛选与分级。
附图说明
图1是本发明的无损定量检测河蟹中蟹油含量的方法的流程图。
图2是CPMG序列优化的横向弛豫时间(T1)。
图3是实施例2的载体上蟹油含量和H质子信号量(H质子的信号强度)的标准曲线。
具体实施方式
本发明涉及无损定量检测活体河蟹中蟹油含量的方法，包括冻干蟹黄粉的制备、蟹油的提取、核磁参数优化、建立标准曲线和实际样品检测。具体为(1)首先通过机械挤压和冷冻干燥制备蟹黄粉；(2)接着进行酶解提取蟹油；(3)低场核磁参数的优化：利用载体上的蟹油，调节中心频率、90°和180°脉冲，优化核磁参数如T1、NECH、TW、TR和TE，计算河蟹蟹油的T1弛豫时间；(4)标准曲线的建立：检测载体上不同重量的蟹油的H质子信号量，根据载体上蟹油含量和核磁的H质子信号量成正比，建立蟹油含量和核磁的H质子信号量的标准曲线；(5)利用标准曲线，根据活体检测河蟹的H质子信号量即可判断其中的蟹油含量。该方法结果准确可靠、操作简单安全、成本低廉，具有较高的应用和推广价值。
为了验证检测方法的准确性，将通过低场核磁检测后的河蟹解剖，取出肝胰腺和性腺的混合物(蟹黄)，冷冻干燥成蟹黄粉，再通过索氏抽提方法(索氏抽提方法参照国标：食品中蟹油的测定方法[GB/T 5009.6-1985])测定蟹黄粉中的蟹油含量，结果表明其误差在0.1-0.8％之间，表明该检测方法的准确性和优越性。
下面的具体实施例是在以本发明技术方案为前提下进行实施的，给出了详细的实施方式和操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中所述的蟹黄粉为江苏兴化兵凌水产品有限公司提供；所述的机械挤压机为江苏兴化河蟹养殖场提供；所述的低场核磁共振是MesoMR核磁共振分析仪(上海纽迈电子科技有限公司生产)，磁场强度：0.5±0.08T，仪器主频率：21.3MHz。
实施例1
(1)制备蟹黄粉
称取100kg的河蟹，放入机械挤压机中，挤压15min，挤压的压力为100mPa，收集河蟹肝胰腺和性腺的混合物，放入低温真空冷冻干燥机中，干燥4h，收集冻干的蟹黄粉。
(2)提取蟹黄粉中的蟹油
准确称取蟹黄粉500g置于1000mL小烧杯中，按照1：2g/mL的比例加入去离子水，再加入1.5g中性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液调节溶液pH至7.0，在55℃的水浴锅中反应6h。之后趁热离心10min，转速为5000rpm，发现离心管中出现分层，下层为固体残质，上层即为蟹油，提取率约为48.7％。
(3)优化低场核磁参数
在25mL核磁专用的玻璃瓶中放入与瓶子等高的木浆卫生纸(保证每次称取不同质量蟹油时，信号扫描区间相同)，称取2g蟹油滴于卫生纸条上，旋紧盖子，置于配套线圈中，调整好位置，采用CPMG序列优化LF-1H MRI的参数：T1＝300ms；TE＝11.20ms；NS＝20；NECH＝4；TW＝3000ms；TR＝400ms。
(4)建立载体上蟹油含量和H质子信号量(H质子的信号强度)的标准曲线
采用与25mL核磁专用的玻璃瓶子等高的卫生纸作为称量纸，称取0.2-10g蟹油(分别为0.2g、1.3g、4.6g、5.9g、8.1g、10g)，包裹起来置于25mL核磁共振仪专用玻璃瓶中，放入磁性线圈中，在MesoMR核磁共振分析仪中利用优化低场核磁参数测量这些不同重量的蟹油的各自H质子信号量。根据低场核磁共振的H质子信号量和卫生纸上蟹油含量成正比，建立标准曲线，蟹油含量与H质子信号量的线性关系为y＝3187.2185X+13.4828，R2＝0.9999。
(5)无损检测活体河蟹中蟹油含量
将活体河蟹自然晾干1-2h(水分含量会有一定的信号干扰)，再用聚四氟乙烯膜包裹，在MesoMR核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁参数测量其H质子信号量，根据H质子信号量在建立的标准曲线上找到对应的蟹油含量(即活体河蟹中的蟹油含量)。
验证性实验
为了验证检测方法的准确性，将通过低场核磁共振分析仪检测的河蟹解剖，取出肝胰腺和性腺的混合物(蟹黄)，冷冻干燥成蟹黄粉，再通过上述索氏抽提方法测定蟹黄粉中的蟹油含量，结果表明其误差在0.1-0.8％之间，表明该检测方法的准确性和优越性。
实施例2
(1)制备蟹黄粉
准确称取50kg的河蟹，放入机械挤压机中，挤压10min，挤压的压力为50mPa，收集河蟹肝胰腺和性腺的混合物，放入低温真空冷冻干燥机中，干燥3h，收集冻干的蟹黄粉。
(2)提取蟹黄粉中的蟹油
准确称取500g冻干的蟹黄粉置于1000mL小烧杯中，按照1：3g/mL的比例加入去离子水，再加入1.5g中性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液调节溶液pH至7.0，在55℃的水浴锅中反应6h。之后趁热离心10min，转速为10000rpm，发现离心管中出现分层，下层为固体残质，上层即为蟹油，提取率约为54.8％。
(3)优化低场核磁参数
在25mL核磁专用的玻璃瓶中放入与瓶子等高的卫生纸(保证每次称取不同质量蟹油时，信号扫描区间相同)，称取2.5g蟹油滴于卫生纸条上，旋紧盖子，置于配套线圈中，调整好位置，采用CPMG序列优化LF-1H MRI的参数：T1＝350ms；TE＝12.8ms；NS＝16；NECH＝5；TW＝4500ms；TR＝360ms。
(4)建立载体上蟹油含量和H质子信号量(H质子的信号强度)的标准曲线
采用与25mL核磁专用的玻璃瓶子等高的卫生纸作为称量纸，称取0.5-2.0g蟹油(分别为0.5g、0.7g、1.0g、1.5g、2g)，包裹起来置于25mL核磁共振仪专用玻璃瓶中，放入磁性线圈中，在MesoMR核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁参数测量这些不同重量的蟹油的各自H质子信号量，根据低场核磁共振的H质子信号量和卫生纸上蟹油含量成正比，建立标准曲线，蟹油含量与H质子信号量的线性关系为y＝5026.6806X+7.6764，R2＝0.9999。
(5)无损检测活体河蟹中蟹油含量
将活体河蟹自然晾干1-2h(水分含量会有一定的信号干扰)，再用聚四氟乙烯膜包裹，在MesoMR核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁参数测量其H质子信号量，根据H质子信号量在建立的标准曲线上找到对应的蟹油含量(即活体河蟹中的蟹油含量)。
验证性实验
为了验证检测方法的准确性，将通过低场核磁检测后的河蟹解剖，取出肝胰腺和性腺的混合物(蟹黄)，冷冻干燥成蟹黄粉，再通过上述索氏抽提方法测定蟹黄粉中的蟹油含量，结果表明其误差在0.2-0.8％之间，表明该检测方法的准确性和优越性。
实施例3
(1)制备蟹黄粉
准确称取50kg的河蟹，放入机械挤压机中，挤压10min，挤压的压力为100mPa，收集河蟹肝胰腺和性腺的混合物，放入低温真空冷冻干燥机中，干燥3h，收集冻干的蟹黄粉。
(2)提取蟹黄粉中的蟹油
准确称取400g冻干的蟹黄粉置于1000mL小烧杯中，按照1：3g/mL的比例加入去离子水，再加入1.3g中性蛋白酶，用0.1mol/L NaOH溶液和0.1mol/L HCl溶液调节溶液pH至7.0，在55℃的水浴锅中反应5h。之后趁热离心8min，转速为6000rpm，发现离心管中出现分层，下层为固体残质，上层即为蟹油，提取率约为52.3％。
(3)优化核磁参数
在25mL核磁专用的玻璃瓶中放入与瓶子等高的卫生纸(保证每次称取不同质量蟹油时，信号扫描区间相同)，称取3g蟹油滴于卫生纸条上，旋紧盖子，置于配套线圈中，调整好位置，采用CPMG序列优化LF-1H MRI的参数：T1＝360ms；TE＝10.50ms；NS＝14；NECH＝5；TW＝4000ms；TR＝360ms。
(4)建立载体上蟹油含量和H质子信号量(H质子的信号强度)的标准曲线
采用与25mL核磁专用的玻璃瓶子等高的卫生纸作为称量纸，称取2-8g蟹油(分别为2g、3.3g、4.6g、5.9g、7.1g、8g)，包裹起来置于25mL核磁共振仪专用玻璃瓶中，放入磁性线圈中，在MesoMR核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁参数测量这些蟹油各自的H质子信号量。根据低场核磁共振的H质子信号量和卫生纸上蟹油含量成正比，建立标准曲线，蟹油含量与H质子信号量的线性关系为y＝6124.2548X+10.2782，R2＝0.9999。
(5)无损检测河蟹中蟹油含量
将活体河蟹自然晾干1-2h(水分含量会有一定的信号干扰)，再用聚四氟乙烯膜包裹，在MesoMR核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁参数测量其H质子信号量，根据H质子信号量在建立的标准曲线上找到对应的蟹油含量(即活体河蟹中的蟹油含量)。
验证性实验
为了验证检测方法的准确性，将通过低场核磁检测后的河蟹解剖，取出肝胰腺和性腺的混合物(蟹黄)，冷冻干燥成蟹黄粉，再通过上述索氏抽提方法测定蟹黄粉中的蟹油含量，结果表明其误差在0.1-0.8％之间，表明该检测方法的准确性和优越性。
本发明的工作原理如下：
低场核磁共振技术是一种无损检测技术，能测定样品中氢质子密度与分布图，从而反映样品中的蟹油分布及含量。样品的蟹油中氢质子的排布是无序的，当把样品放入核磁管中，核磁会通过外加磁场使样品中氢质子的排布变得有序，等磁场消失时，会根据样品中氢质子产生相应的信号量而有对应的弛豫时间。根据此工作原理，可以对河蟹中的蟹油含量进行快速和无损定量检测。
本发明采用低场核磁共振无损定量检测活体河蟹中蟹油含量，其是通过核磁H质子信号量和载体上蟹油含量的线性关系，建立它们的标准曲线用于活体河蟹中蟹油含量的检测。本发明针对性强、无干扰、准确率高和检测时间短(10s)，克服了传统色谱分析方法和索氏抽提方法的缺陷，实现无损定量检测活体河蟹中蟹油含量的目的，本发明不仅可以快速判断出活体河蟹的蟹油含量多少，也可以为河蟹的品质分级提供科学依据，具有很好的应用和推广前景。

Claims (10)

1.一种无损定量检测中华绒螯蟹(河蟹)中蟹油含量的方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备蟹黄粉：清洗干净的河蟹通过机械挤压将其肝胰腺和性腺挤出，再低温冷冻干燥制备成蟹黄粉；
(2)提取蟹黄粉中的蟹油：通过中性蛋白酶酶解蟹黄粉提取蟹油；
(3)优化低场核磁共振参数：将一定量的蟹油吸附在载体上，利用吸附在载体上的蟹油优化核磁共振分析仪的低场核磁共振参数；
(4)建立载体上蟹油含量和H质子信号量的标准曲线：将多个不同重量的蟹油吸附在载体上，在核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁共振参数测量所述多个不同重量的蟹油的H质子信号量，建立载体上蟹油含量和H质子信号量的标准曲线；
(5)无损检测活体河蟹中蟹油含量：在核磁共振分析仪中利用优化的低场核磁共振参数检测活体河蟹的H质子信号量，对比标准曲线上H质子信号量判断活体河蟹中蟹油含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中制备冻干蟹黄粉所用河蟹为20-80kg，机械挤压的时间是10-15min，挤压的压力是100-250mPa。
3.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(1)中低温冷冻干燥的温度为-40℃，时间是3-5h。
4.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中所用中性蛋白酶的量为蟹黄粉重量的2-5％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中加入中性蛋白酶之前先将蟹黄粉与去离子水按照料液比1:2-1:5(g/mL)混合，所述酶解的条件为pH 6.0-8.0、温度50-60℃，酶解时间为4-8h。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中步骤(2)中酶解反应完成后，趁热离心，离心转速为5000-12000rpm，离心时间为10-30min，收集上清液即为蟹油。
7.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中优化的低场核磁共振参数是T1、TE、NS、NECH、TW和TR。
8.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)中优化低场核磁共振参数所用蟹油的量为2-5g。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(3)和(4)中所用载体是木浆卫生纸。
10.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(4)中多个不同重量的蟹油指测量至少5个重量为0.2-10g的蟹油。
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