CN106544299B - 一种预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂及其制备方法与应用。所述复合菌剂包括乳酸菌10‑500亿cfu/g，枯草芽孢杆菌100‑800亿cfu/g，凝结芽孢杆菌100‑800亿cfu/g。本发明还包括含有所述复合菌剂的脂类微胶囊剂，以重量份计包括复合菌剂1‑10份，油脂10‑50份。本发明复合菌剂中微生物种类搭配合理，产生的微生物体系互补性强，能增强草酸的降解能力，还有助于饲草中纤维素的降解，增强营养，提高免疫力；各微生物的配合，尤其是按照1:2:2的用量配比进行配合，可以各菌种组起到协同增效作用，效果优异。

Description

一种预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂及其制备方法与应用。
背景技术
草酸及草酸盐是广泛存在于饲草中的抗营养因子，能显著降低动物对矿物质元素的吸收利用效率。牛羊是以植物为主的反刍动物，因此，草酸对反刍动物的危害更大。通常，饲草中草酸由瘤胃中微生物降解为无害的甲酸和二氧化碳，或者与钙结合形成不溶性的草酸钙排出体外。当牛羊中草酸降解菌数量下降时，或者饲料中高草酸和低钙同时出现时，动物草酸中毒的风险增大。急性草酸中毒主要是未被降解的高浓度草酸入血与大量血钙结合，造成血液中钙浓度急剧降低，影响正常的细胞功能，导致动物肌肉震颤、循环虚脱，最终导致死亡。如果是草酸慢性中毒，不溶性的草酸钙会严重损伤肾小管，造成泌尿系统结石甚至死亡。草酸慢性中毒导致的结石在公畜中发生率更高。牛羊草酸盐中毒时，食欲不振、反刍减少、两眼无神、精神沉郁；频繁起立与卧倒，便秘，排尿不畅，偶尔排出棕红色血尿；心率加速，肌肉震颤与抽搐，血液凝固时间延长；严重的可导致死亡。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供一种预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂及其制备方法与应用。
本发明技术方案如下：
一种预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂，包括乳酸菌10-500亿cfu/g，枯草芽孢杆菌100-800亿cfu/g，凝结芽孢杆菌100-800亿cfu/g。
其中，所述乳酸菌包括乳酸杆菌菌、双歧杆菌菌等中的一种或几种；优选为副干酪乳杆菌CGMCC 1.2468，动物双歧杆菌CGMCC 1.2226中的一种或两种。
优选地，所述枯草芽孢杆菌为CGMCC 1.3358；所述凝结芽孢杆菌为CGMCC 1.3220。
进一步优选地，所述预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂，所述复合菌剂包括乳酸菌20-500亿cfu/g，枯草芽孢杆菌200-800亿cfu/g，凝结芽孢杆菌200-800亿cfu/g；
更进一步优选地，所述预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂，包括乳酸菌100-400亿cfu/g，枯草芽孢杆菌400-800亿cfu/g，凝结芽孢杆菌400-800亿cfu/g。
又进一步优选地，括乳酸菌200-300亿cfu/g，枯草芽孢杆菌400-600亿cfu/g，凝结芽孢杆菌400-600亿cfu/g。
更进一步优选地，所述乳酸菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌的有效活菌数比例为1:2:2。
又更进一步优选地，本发明所述的复合菌剂，有效菌总含量为200-700亿cfu/g；优选有效菌总含量为300-500亿cfu/g；例如200亿cfu/g、300亿cfu/g、400亿cfu/g、500亿cfu/g、600亿cfu/g、700亿cfu/g等。
本发明所述复合菌剂，是将上述微生物制备成菌粉或混合菌粉(包括细菌菌粉、细菌芽孢)，再与载体混合均匀制得。
本发明所述菌粉或混合菌粉可按现有常规方法制备。例如包括：将乳酸菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌的原始菌种分别依次进行斜面培养、摇床培养、固态发酵或液态发酵(例如发酵罐培养后)，将得到的各发酵液或发酵产物分别浓缩干燥制成菌粉，再按比例混合制成混合菌粉；或将得到的各发酵液或发酵产物按比例混合再经过浓缩干燥制备成混合粉。
进一步地，所述菌粉或混合菌粉(包括细菌菌粉、细菌芽孢)的制备方法，包括以下步骤：
1)种子培养：将乳酸菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌的原始菌种分别接种于种子培养基上，在39±1℃条件下培养36-48小时，分别制得乳酸菌菌种、枯草芽孢杆菌菌种、凝结芽孢杆菌菌种；
2)种子扩大培养(即二级培养)：将上述步骤1)培养的乳酸菌菌种接种于种子扩大培养基中，在pH 6.2～6.4、温度为39±2℃条件下，静置培养12～24小时；
将上述步骤1)培养的枯草芽孢杆菌菌种、凝结芽孢杆菌菌种分别接种于液体培养基中，在pH 6.5～7.0、温度为39±2℃条件下，140～160r/min摇床培养36～48小时；
3)发酵罐培养(即三级培养)：将上述步骤2)培养的乳酸菌菌种接种于发酵培养基中(发酵罐)，在pH6.2～6.4、温度为43℃、不通风，间歇搅拌培养16～36小时得到乳酸菌发酵液；
将上述步骤2)培养的枯草芽孢杆菌菌种、凝结芽孢杆菌菌种分别接种于培养基中(发酵罐)，在pH7.2～7.4罐压0.5kg、温度为39℃、通风量1:0.8～1.1条件下，培养48～56小时分别得枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌的发酵液；
4)将步骤3)中分别得到的各微生物的发酵液分别离心，获得菌体沉淀，混合赋形剂，干燥制成菌粉，再按比例混合制成混合菌粉；或将得到的各发酵液按比例混合再经过浓缩干燥、混合赋形剂，制备成混合菌粉。
在上述细菌菌粉的制备方法中：
步骤1)中，乳酸菌(副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌)所用种子培养基为MRS液体培养基，具体配方如下：葡萄糖20g,蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，无水乙酸钠5g，KH2PO42g，柠檬酸氢二铵2g，MgSO4·7H2O 0.58g，MnSO4·H2O 0.25g，吐温80 1ml，用蒸馏水定容至1000mL，调pH 6.2～6.4,121℃灭菌15min。
枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌所用种子培养基的配方如下：蛋白胨10g，牛肉膏5g、氯化钠5g，加水至1000mL；调节pH 7.0-7.2。
步骤2)中，乳酸菌种子扩大培养基配方如下：葡萄糖(水解糖)50g，玉米浆干粉50g，磷酸氢二铵2.5g，碳酸钙100g，用蒸馏水定容至1000mL。
枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌所用种子扩大培养基配方如下：麸皮50g硫酸铵1.5g、KH2PO4 1.5g，加水至1000mL。
步骤3)中，各菌种所述发酵罐培养基分别与种子扩大培养配方相同。
步骤4)中，所述赋形剂为玉米淀粉或沸石粉；所述干燥是在≤70℃的条件下进行的，优选50～60℃。
上述制备方法，每个步骤的培养均是在无菌条件下进行的。
本发明还提供一种含有上述复合菌剂的脂类微胶囊剂。
优选地，上述脂类微胶囊剂以重量份计包括上述复合菌剂1-10份，油脂10-50份。
进一步优选地，上述脂类微胶囊剂以重量份计包括上述复合菌剂2-8份，油脂20-50份。
优选地，所述脂类微胶囊剂粒度为10-830微米。
优选地，所述油脂包括牛油、羊油、猪油、鸡油等动物油脂，或大豆油、菜籽油、棉籽油、花生油、棕榈油、氢化植物油等植物油脂中的一种或几种。进一步优选地，动物油脂与植物油脂的重量比例为5:1-1:5。
所述进一步优选地，本发明所述的脂类微胶囊剂，有效菌总含量300-800亿cfu/g。
本发明还提供上述脂类微胶囊剂的制备方法，包括按配比将上述复合菌剂与油脂在15-55℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，干燥，过筛(例如过20-40目筛)，即可。
进一步地，还可将上述脂类微胶囊剂与赋形剂混合制成复合制剂。优选地，所述复合制剂中所述脂类微胶囊剂的重量含量为70％-90％。所述赋形剂可包括稻壳粉、甲壳素、玉米淀粉等。该复合制剂经真空包装后，在室温下保质期可以达到半年以上。经检测，半年后有效活菌数下降不超过102cfu/g。
本发明还包括上述复合菌剂、脂类微胶囊剂、复合制剂在制备预防反刍动物草酸中毒的药物中的应用。
本发明所述反刍动物优选为牛、羊。
本发明所述复合菌剂主要由具有草酸降解能力的乳酸菌(副干酪乳杆菌、动物双歧杆菌)、具有纤维素降解能力的枯草芽孢杆菌、以及凝结芽孢杆菌等组成，乳酸菌(副干酪乳杆菌)主要作用是降解饲草中的草酸，从而预防牛羊草酸盐中毒；枯草芽孢杆菌主要作用是增强饲草中纤维素的消化与吸收；凝结芽孢杆菌和酵母菌，主要作用是增强营养与免疫功能。
本发明复合菌剂中微生物种类搭配合理，乳酸菌(副干酪乳杆菌)、枯草芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌组合产生的微生物体系互补性强，能增强草酸的降解能力，还有助于饲草中纤维素的降解，增强营养，提高免疫力等性能；本发明复合菌剂中，各微生物的配合，尤其是按照的1:2:2用量配比进行配合，可以起到协同增效作用，效果优异。并且，制备方法先进科学，简便可行，有效活菌数含量高，存活时间长达半年以上。
本发明将上述复合菌剂经脂类包裹形成微胶囊，优点在于1)活菌在较低温度包被，尽可能减少了微生态制剂在加工中失活，提高了产品活性；2)草酸降解菌、纤维素降解菌等有益菌的添加可有效预防牛羊等食草动物的草酸中毒，提高饲草消化吸收能力，提高动物免疫力，促进动物发育，在实践生产中增产效果明显；3)脂类微胶囊进行真空包装储藏，备用；或者按一定比例与预混料或赋形剂等其他成分混合制得复合制剂；方法先进科学，简便可行，有效活菌数含量高，存活时间长达半年以上。
本发明上述复合菌剂、脂类微胶囊剂、复合制剂经过三年多的实验应用，结果表明预防草酸中毒及尿结石效果好，牛羊等反刍动物增重快，推广性强。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
本发明菌种均可以通过市售购得，例如购自中国普通微生物菌种保藏中心。
以下所用副干酪乳杆菌保藏编号CGMCC 1.2468；动物双歧杆菌保藏编号CGMCC1.2226；枯草芽孢杆菌保藏编号CGMCC 1.3358；凝结芽孢杆菌保藏编号CGMCC 1.3220。
实施例1
一种含有复合菌剂的脂类微胶囊剂，以重量份计包括复合菌剂5份，油脂30份；其中，所述复合菌剂，包括副干酪乳杆菌250亿cfu/g，枯草芽孢杆菌500亿cfu/g，凝结芽孢杆菌500亿cfu/g；所述油脂为羊油与豆油，重量比例为5:1。
所述复合菌剂的制备方法包括将副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌分别制成菌粉，再与载体稻壳粉按照2:1的重量比例混合均匀制得。
所述脂类微胶囊剂的制备方法，包括按配比将上述复合菌剂与油脂在55℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，自然干燥，过40目筛，即可。该脂类微胶囊在动物预混料中的比例为5％。
实施例2
一种含有复合菌剂的脂类微胶囊剂，以重量份计包括复合菌剂5份，油脂40份；其中，所述复合菌剂，包括动物双歧杆菌200亿cfu/g，枯草芽孢杆菌400亿cfu/g，凝结芽孢杆菌400亿cfu/g；所述油脂为棕榈油。
所述复合菌剂的制备方法包括将动物双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌分别制成菌粉，混合后制成混合菌粉，再与载体草粉按照1:1的重量比例混合均匀制得。
所述脂类微胶囊剂的制备方法，包括按配比将上述复合菌剂与油脂在40℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，自然干燥，过30目筛，即可。
实施例3
一种含有复合菌剂的脂类微胶囊剂，以重量份计包括复合菌剂6份，油脂50份；其中，所述复合菌剂，包括副干酪乳杆菌300亿cfu/g，枯草芽孢杆菌600亿cfu/g，凝结芽孢杆菌600亿cfu/g；所述油脂为牛油与棕榈油，重量比例为1：3。
所述复合菌剂的制备方法包括将副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌分别制成菌粉，混合后制成混合菌粉，再与载体稻壳粉按照1：2的重量比例混合均匀制得。
所述脂类微胶囊剂的制备方法，包括按配比将上述复合菌剂与油脂在50℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，自然干燥，过40目筛，即可。
实施例4
一种含有复合菌剂的脂类微胶囊剂，以重量份计包括复合菌剂6份，油脂60份；其中，所述复合菌剂，包括动物双歧杆菌100亿cfu/g，枯草芽孢杆菌500亿cfu/g，凝结芽孢杆菌500亿cfu/g；所述油脂为豆油与棕榈油，重量比例为1：5。
所述复合菌剂的制备方法包括将动物双歧杆菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌分别制成菌粉，混合后制成混合菌粉，再与载体草粉按照1：3的重量比例混合均匀制得。
所述脂类微胶囊剂的制备方法，包括按配比将上述复合菌剂与油脂在40℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，自然干燥，过30目筛，即可。
对比例1
一种含有菌剂的脂类微胶囊剂，与实施例1的区别仅在于将所述复合菌剂替换为单一菌剂即副干酪乳杆菌；即该含有菌剂的脂类微胶囊剂，以重量份计包括单一菌剂5份，油脂30份；其中，所述单一菌剂中的微生物仅包括副干酪乳杆菌250亿cfu/g；所述油脂为羊油与豆油，重量比例为5:1。所述单一菌剂的制备方法包括将副干酪乳杆菌制成菌粉，再与载体稻壳粉按照2：1的重量比例混合均匀制得。所述脂类微胶囊剂的制备方法，包括按配比将上述菌剂与油脂在55℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，自然干燥，过40目筛，即可。该脂类微胶囊在动物预混料中的比例为5％。
对比例2
一种含有菌剂的脂类微胶囊剂，与实施例1的区别仅在于将所述复合菌剂替换为单一菌剂即枯草芽孢杆菌；即该含有菌剂的脂类微胶囊剂，以重量份计包括单一菌剂5份，油脂40份；其中，所述单一菌剂中的微生物仅包括枯草芽孢杆菌500亿cfu/g；所述油脂为牛油与棕榈油，重量比例为1:1。所述单一菌剂的制备方法包括将枯草芽孢杆菌制成菌粉，再与载体草粉按照1：1的重量比例混合均匀制得。所述脂类微胶囊剂的制备方法，包括按配比将上述菌剂与油脂在55℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，自然干燥，过30目筛，即可。
对比例3
一种含有菌剂的脂类微胶囊剂，与实施例1的区别仅在于将所述复合菌剂替换为单一菌剂即凝结芽孢杆菌；即该含有菌剂的脂类微胶囊剂，以重量份计包括单一菌剂6份，油脂50份；其中，所述单一菌剂中的微生物仅包括凝结芽孢杆菌500亿cfu/g；所述油脂为牛油与棕榈油，重量比例为1:3。所述单一菌剂的制备方法包括将凝结芽孢杆菌制成菌粉，再与载体稻壳粉按照1:2的重量比例混合均匀制得。所述脂类微胶囊剂的制备方法，包括按配比将上述菌剂与油脂在50℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，自然干燥，过40目筛，即可。
实验例1
实验样品：实施例1及对比例1-3制备的脂类微胶囊剂；育成牛；
实验方法：
在2015年10月到2015年12月，山西平遥某肉牛厂600头6月龄肉牛，随机分为5组，空白对照组为草料加精料(1:1)饲喂，精料饲喂量为体重的1％-2％；实验组为草料加精料基础上，添加0.2％实施例1制备的脂类微胶囊剂；对照组1-3为草料加精料基础上，分别添加0.2％对比例1-3制备的脂类微胶囊剂；各组共添加3个月。
与空白对照组相比，实验组肉牛日消耗饲料量不变，日增重提高10％-30％，日增重达到1.1-1.3kg：空白组肉牛出现、厌食、反刍减少、目光呆滞、粪便松软症状3头，实验组肉牛没有出现症状。
与对照组1-3相比，实验组肉牛日消耗饲料量不变，日增重增加5％-18％。对照组1-3肉牛分别出现厌食、反刍减少、目光呆滞、粪便松软症状1、2、1头。实验组经济效益显著优于对照组。
实验例2
实验样品：实施例2及对比例1-3制备的脂类微胶囊剂；育肥养；
实验方法：
在2015年6月到2015年8月，山西朔州某养羊基地，1500头6月龄羊，随机分为5组，空白对照组在放牧的基础上加精料饲喂，精料饲喂量为体重的0.02％-1％；实验组为草料加精料基础上，添加0.2％实施例2制备的脂类微胶囊菌剂；对照组1-3为草料加精料基础上，分别添加0.2％对比例1-3制备的脂类微胶囊剂；各组共添加3个月。
与空白对照组相比，实验组育肥羊日增重提高10％-20％，日增重达到0.25-0.4kg。空白组育肥羊出现两眼无神、卧多立少、不愿走动、行走无力等症状6只，实验组育肥羊没有出现症状。
与对照组1-3相比，实验组育肥羊日增重提高8％-14％，日增重达到0.23-0.35kg。对照组1-3育肥羊分别出现两眼无神、卧多立少、不愿走动、行走无力等症状2、3、2只。可见，实验组经济效益显著高于对照组。
实施例3和4含有复合菌剂的脂类微胶囊剂作用效果与实施例1和2相当。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (11)

1.一种预防反刍动物草酸中毒的复合菌剂，其特征在于，由乳酸菌200-300亿cfu/g，枯草芽孢杆菌400-600亿cfu/g，凝结芽孢杆菌400-600亿cfu/g组成；
所述乳酸菌选自副干酪乳杆菌CGMCC 1.2468、动物双歧杆菌CGMCC 1.2226菌中的一种或两种；所述枯草芽孢杆菌为CGMCC 1.3358；凝结芽孢杆菌为CGMCC 1.3220。
2.根据权利要求1所述的复合菌剂，其特征在于，所述乳酸菌、枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌的有效活菌数比例为1:2:2。
3.一种含有权利要求1或2所述复合菌剂的脂类微胶囊剂，其特征在于，以重量份计包括所述复合菌剂1-10份，油脂10-50份。
4.根据权利要求3所述的脂类微胶囊剂，其特征在于，以重量份计包括所述复合菌剂2-8份，油脂20-50份。
5.根据权利要求3或4所述的脂类微胶囊剂，其特征在于，所述脂类微胶囊剂粒度为10-830微米。
6.根据权利要求3或4所述的脂类微胶囊剂，其特征在于，所述油脂包括动物油脂和植物油脂；所述动物油脂与植物油脂的重量比例为5:1-1:5。
7.权利要求3-6任一项所述脂类微胶囊剂的制备方法，其特征在于，包括按配比将所述复合菌剂与油脂在15-55℃混合，分散，形成脂类包被微胶囊，干燥，过筛，即可。
8.含有权利要求3-6任一项所述脂类微胶囊剂或权利要求7所述方法制备的脂类微胶囊剂的复合制剂。
9.根据权利要求8所述的复合制剂，其特征在于，所述复合制剂中所述脂类微胶囊剂的重量含量为70%-90%。
10.权利要求1或2所述复合菌剂或权利要求3-6任一项所述脂类微胶囊剂或权利要求8-9任一项所述复合制剂在制备预防反刍动物草酸中毒的药物中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述反刍动物为牛或羊。
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