CN106539815A - 环二核苷酸在防治多发性硬化症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了环二核苷酸在治疗多发性硬化症及其在制备相关药物中的应用。本发明所提供的环二核苷酸，能够有效地刺激β干扰素分泌，抑制IL-17，IFN-ϒ等细胞因子的表达，并能显著治疗小鼠多发性硬化症，优于抗多发性硬化症一线阳性药物β干扰素。因此，环二核苷酸在制备抗多发性硬化症的药物中具有巨大的应用潜力。

Description

环二核苷酸在防治多发性硬化症中的应用

技术领域

本发明涉及环二核苷酸在治疗多发性硬化症中的应用，属于生物医药和分子免疫学技术领域。

背景技术

多发性硬化症，英文叫Multiple Sclerosis，简称MS，是一种慢性、炎症性、脱髓鞘的中枢神经系统疾病。多发性硬化病是一种自身免疫介导的中枢神经系统炎性疾病，可引起各种症状，多发性硬化症影响脑和脊髓的神经细胞神经元，神经元传递信息，形成思维和感觉，以使大脑控制身体。保护这些神经元的脂肪层为髓鞘(Myelin Sheath)，协助神经元进行电信号传递。多发性硬化症逐渐造成大脑和脊髓的斑块性的神经髓鞘的破坏(脱髓鞘)，髓鞘的瘢痕形成会影响神经轴突的信号传递，以失去大脑和脊髓对外周的控制，以至多部位的僵硬或丧失功能。多发性硬化症的平均发病年龄一般在20至40岁，女性发病人数两倍于男性。症状包括视力模糊、四肢无力、疼痛、疲劳、排尿不畅、行走不稳，许多患者最终只能依靠轮椅生活，约有50%的患者出现抑郁症状，自杀率是正常人的5—10倍。

实验性自身免疫性脑脊髓炎( Experimental AutoimmuneEncephalomyelitis，EAE) 小鼠是研究MS 的经典动物模型，由自身抗原特异性T 细胞介导自身免疫疾病，在临床表征和病理特征上与MS 极为相似。实验性自身免疫性脑脊髓炎 (EAE) 是一种以特异性致敏的CD4+ T细胞介导为主, 对实验动物进行髓鞘蛋白免疫构建的疾病模型。诱导发病过程中, 树突状细胞在淋巴结被活化并将髓鞘蛋白抗原提呈给初始T细胞, 特异性T细胞在外周被激活, 穿透血脑屏障迁移至中枢神经系统（CNS）。进入CNS后, T细胞招募炎性细胞,因为CNS中存在同源髓鞘蛋白抗原而被本地抗原递呈细胞 (antigen-presenting cell,APC)再活化, 扩增和释放炎性介质, 并浸润递呈MHC II-抗原肽复合物的APC, 导致炎症发生, 进而脱髓鞘及轴突受损。由于EAE与人类MS在临床、生化、免疫及病理等诸多方面具有相同的特征, 所以它是目前国际公认的MS理想动物模型。

干扰素首先在1957年被发现，是被病毒或特殊细菌感染后、或被免疫刺激时细胞分泌的一种物质。人体可以产生多种干扰素，常用的有α-干扰素、β-干扰素和γ-干扰素，它们对免疫系统的调节机制不同，已明确α和β-干扰素对免疫系统有抑制作用，而γ干扰素则有促进作用。目前，能够治疗多发性硬化(MS)的β-干扰素包括β-干扰素1a和β-干扰素1b。β-干扰素已成为治疗复发-缓解型MS的一线药物，它也可用于治疗继发-缓解型MS。β-干扰素可减少MS总的临床复发次数，可减少约32~33%复发率及50%颅内病灶数目，减轻29~37%的EDSS评分进展。1993年7月，β-干扰素成为美国FDA（食品药品监督管理局）批准的第一个用于治疗MS的药物。从上市至今，已有超过10万余名MS患者用该药物进行治疗。

在天然免疫通路中，感染的哺乳动物细胞中微生物和病毒DNA能通过刺激干扰素分泌诱导內源强有力的免疫应答。内质网（ER）受体蛋白（STING）对胞质DNA的免疫应答是必需的因素。最近的研究表明，环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS）在结合DNA后的活化条件下，内源性地催化cGAMP的合成。cGAMP是一种胞质DNA传感器，它作为第二信使通过STING刺激INF-β的感应，介导TBK1和IRF-3的活化，进而启动INF-β基因的转录。最近报道，重组cGAS在DNA结合条件下催化环化cGMP-AMP二核苷酸GAMP。cGAS结合18bp dsDNA的复合物的晶体结构也已被报道，cGAMP在抗病毒免疫方面的研究已被证实。cGAMP结合STING，使转录因子IRF3激活并产生β干扰素，活化树突状细胞和T细胞，能够激活免疫应答反应，因此，可能cGAMP作为STING的配体，可以激活免疫系统。

发明内容

本发明提供了治疗多发性硬化症的药物环二核苷酸，所采取的技术方案如下：

本发明的目的在于提供治疗多发性硬化症的药物环二核苷酸。所示的环二核苷酸选自cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP、硫取代cGAMP、硫取代c-di-AMP。

所述环二核苷酸的具体应用是激活β-干扰素表达、调节炎症因子表达、抑制多发性硬化症疾病发生。

本发明获得的有益效果如下：

本发明所用的方法是目前治疗多发性硬化症的一种新的化合物及组合，在动物模型中，治疗效果显著优于临床上一线治疗药物β-干扰素，能够显著抑制多发性硬化症相关的细胞因子IL-17，可以替代β-干扰素作为治疗多发性硬化症的候选药物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。

实施例1、环二核苷酸的制备与配制

cGAMP （环化-GMP-AMP）按参照文献方法，先提取环化cGMP-AMP二核苷酸合成酶（cGAS），在结合DNA后的活化条件下，催化合成cGAMP，经HPLC纯化后，其纯度在98％以上（Pingwei Li，et al., Immunity, 2013, 39(6), 1019-1031.）。合成的cGAMP，用去内毒素试剂盒脱去内毒素，并用冷冻冻干机冻干，放置-80度冰箱冻存。

c-di-AMP、c-di-AMP、硫取代cGAMP、硫取代c-di-AMP均购自invivogen公司。

药品配置方法：生理盐水溶解，药品浓度为10 mg/ml。

实施例2、多发性硬化症小鼠模型即EAE小鼠模型建立与治疗

雌性C57BL/6小鼠， 8-10周龄，购自北京维通利华公司，饲养环境温度22℃。髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG35-55多肽(由上海NovoPro生物技术有限公司合成，纯度>98%)，百日咳毒素、含有结核分枝杆菌的完全弗氏完全佐剂均购自Sigma-Aldrich公司。MOG35-55多肽用PBS 稀释后与完全弗氏佐剂等体积混合， 用一次性三通管连接固定玻璃注射器在冰上反复吹打制成乳白色浊液。每只小鼠注射含有300 μg MOG35-55多肽的0.2 ml 乳化剂( 含结核分枝杆菌的终浓度为4 mg /ml)。在免疫后和2天后分别在腹腔注射百日咳稀释液(200ng /只)。大约4周后，大部分小鼠出现单肢完全麻痹等病态，EAE小鼠模型建立成功。

取造模的C57BL /6小鼠， 随机分为6组，分别是治疗组（4组，分别是cGAMP、c-di-AMP、硫取代cGAMP、硫取代c-di-AMP组）和阳性药对照组（β-干扰素组）、阴性对照组（生理盐水组），各10只。按照下述方式实施治疗：

给药方式：尾静脉给药。

给药浓度：治疗组为20 mg/kg； β-干扰素组（阳性药组）为7.8 × 105 IU/kg；阴性药组为等体积生理盐水。

给药次数：每天1次。

小鼠疾病评价方法： 0 分，正常; 1 分，尾部无力或蹒跚步态伴尾巴有力; 2 分，蹒跚步态伴尾巴无力( 共济失调) ; 2. 5 分， 共济失调伴部分单肢麻痹; 3 分，单肢完全麻痹; 3. 5 分，单肢完全麻痹并伴随另一肢体部分麻痹; 4 分，双肢完全麻痹; 4. 5分，四肢麻痹; 5 分，死亡。

结果: 小鼠造模后，出现明显EAE疾病状态，在28天出现明显的四肢麻痹现象。β-干扰素组和cGAMP等给药组均可明显抑制EAE疾病发生，给药28天后的病情均显著低于阴性对照组（P<0.05 ，P<0.01），表明环二核苷酸均具有治疗多发性硬化症的作用。具体结果见表1。

表1 环二核苷酸对多发性硬化症模型小鼠EAE治疗作用

（n=10，mean±SD）

组别 小鼠疾病评价（分）

阴性对照组 4.6±0.4

β-干扰素组 1.8±0.3

cGAMP组 1.2±0.2 *

c-di-AMP组 1.6±0.4

硫代cGAMP组 0.8±0.3 **

硫代c-di-AMP组 1.1±0.2 **

注：*P <0.05 vs β-干扰素组；**P<0.01 vsβ-干扰素组。

实施例3、ELISA方法检测小鼠血液细胞因子

小鼠多发性硬化症疾病模型、药物治疗建立参照实施例2。分别麻醉小鼠，处死，眼眶取血，4000r/min离心15min，取上清，用ELISA试剂盒检测干扰素Beta、IL-17和IFN-ϒ细胞因子的表达量（ELISA试剂盒购自R&D公司）。ELISA结果表明：环二核苷酸均能够显著调节多发性硬化症相关细胞因子的表达，能够诱导分泌干扰素Beta， 降低多发性硬化症相关细胞因子IL-17和IFN-ϒ的表达量，且优于阳性药干扰素Beta，具有治疗多发性硬化症的效果（如表2-4所示）。

表2 环二核苷酸对干扰素Beta的调控作用

（n=10，mean±SD）

组别 干扰素Beta蛋白浓度（pg/ml）

模型对照组 52.24±23.54

cGAMP组 323.35±44.96 **

硫代cGAMP组 526.87±63.31 **

c-di-AMP组 329.43±31.62 **

硫代c-di-AMP组 426.22±51.89 **

注：*P<0.05 vs 模型对照组；**P<0.01 vs 模型对照组。

表3 环二核苷酸对小鼠体内细胞因子IL-17的调控作用

（n=10，mean±SD）

组别 IL-17蛋白浓度（pg/ml）

模型对照组 1736.4±458.2

β-干扰素组 411.8±21.3

cGAMP组 328.6±39.7 *

硫代cGAMP组 277.76±29.1 **

c-di-AMP组 329.34±51.5 **

硫代c-di-AMP组 226.22±81.6 **

注：*P<0.05 vs β-干扰素组；**P<0.01 vs β-干扰素组。

表4 环二核苷酸对小鼠体内细胞因子IFN-ϒ的调控作用

（n=10，mean±SD）

组别 IFN-ϒ蛋白浓度（pg/ml）

模型对照组 3053.2±216.1

β-干扰素组 525.6±61.4

cGAMP组 342. 7±21.8 **

硫代cGAMP组 243.2±43.2 **

c-di-AMP组 415.8±56.6 **

硫代c-di-AMP组 243.8±41.9 **

注：*P<0.05 vs β-干扰素组；**P<0.01 vs β-干扰素组。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明精神和范围内，都可以做各种的改动与修饰，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所界定。

Claims (8)

1.一种应用环二核苷酸预防或治疗多发性硬化症的方法，包括向有需要的病人施用有效剂量的环二核苷酸。

2.环二核苷酸在预防或治疗多发性硬化症中的应用。

3.环二核苷酸在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用。

4.权利要求1的方法， 其中环二核苷酸选自cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP硫取代cGAMP、硫取代c-di-AMP，及其相应的衍生物。

5.权利要求2的方法， 其中环二核苷酸选自cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP硫取代cGAMP、硫取代c-di-AMP，及其相应的衍生物。

6.权利要求3的方法， 其中环二核苷酸选自cGAMP、c-di-AMP、c-di-GMP硫取代cGAMP、硫取代c-di-AMP，及其相应的衍生物。

7.根据权利要求3，环二核苷酸在制备预防或治疗多发性硬化症药物中的应用，其特征在于： 它包含不同规格环二核苷酸的单位制剂及药学上可接受的载体制备成的环二核苷酸制剂。

8.根据权利要求3，所述环二核苷酸药物按常规药剂学制成各种剂型，所述的剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂或注射剂等中的一种或多种，采取口服或注射（包括静脉注射、静脉滴注、肌肉注射或皮下注射等中的一种或多种）等中的一种或多种给药途径进行抗多发性硬化症及其直接相关疾病的预防、保护或治疗。