CN106539797B - 青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用 - Google Patents

青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN106539797B
CN106539797B CN201610898077.4A CN201610898077A CN106539797B CN 106539797 B CN106539797 B CN 106539797B CN 201610898077 A CN201610898077 A CN 201610898077A CN 106539797 B CN106539797 B CN 106539797B
Authority
CN
China
Prior art keywords
stat3
cell
sinomenine derivate
yzjl
application
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201610898077.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN106539797A (zh
Inventor
吴英理
姚祝军
王莹莹
吴霖霖
朱琦
雷虎
徐含章
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing University
Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Original Assignee
Nanjing University
Shanghai Jiaotong University School of Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing University, Shanghai Jiaotong University School of Medicine filed Critical Nanjing University
Priority to CN201610898077.4A priority Critical patent/CN106539797B/zh
Publication of CN106539797A publication Critical patent/CN106539797A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106539797B publication Critical patent/CN106539797B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A61K31/485—Morphinan derivatives, e.g. morphine, codeine

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)

Abstract

本发明公开青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，以及青藤碱衍生物YL064在制备JAK1抑制剂中的应用、YL064在制备STAT3抑制剂中的应用和YL064在制备JAK1和STAT3双重抑制剂中的应用。本发明的青藤碱衍生物YL064安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。

Description

青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用
技术领域
本发明涉及医药领域，更具体地讲，涉及YL064及其系列青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
背景技术
多发性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是浆细胞恶性克隆性增殖性疾病，约占血液系统恶性肿瘤的10％，MM中位发病年龄为60-65岁，随着我国人口老龄化进程加速，我国MM发病率逐年增加，年发病率已接近1/10万，MM正成为影响我国老年人身心健康的恶性肿瘤之一。
MM的临床治疗一直以马法兰等细胞毒化疗药物为主，但化疗的远期效果不理想，五年生存率低于30％。近年来，随着对MM发病机制研究的深入，针对MM细胞及其微环境的靶向治疗成为临床研究热点，一些新型靶向疗法已成功应用于临床，其中包括蛋白酶体抑制剂和免疫调节剂等，这些药物使MM患者临床缓解率和长期无病生存率都有所提高，但仍有相当一部分MM患者缓解后短期内复发并对这些药物发生耐药，另有部分MM患者发生治疗相关性不良反应，MM目前仍是可以治疗但无法治愈的恶性肿瘤之一。因此，探究MM新型靶向治疗途径有其必要性和临床意义。
Janus激酶/信号传导及转录激活因子(Janus-activated kinasesignaltransducers and activators of transcription,JAK-STAT)在肿瘤发生过程中发挥关键作用，它们通过将细胞表面的细胞因子信号传递到细胞核内从而调节细胞增殖，存活，分化。STAT家族成员之一，STAT3，在许多人类肿瘤细胞如多发性骨髓瘤(MM)，白血病和淋巴瘤中都是高表达的。STAT3还可能由特定的白细胞介素[白细胞介素-6(IL-6)]和生长因子(例如，表皮生长因子)激活。STAT3的磷酸化位点主要包括位于转录激活结构域的酪氨酸705和丝氨酸727位点。被激活的STAT3会发生磷酸化，进而诱导发生同型二聚化，随后进入细胞核内发生核易位并结合DNA调控下游的靶基因转录。
目前STAT3抑制剂根据其来源可分为天然来源化合物和合成类化合物两种。天然来源STAT3抑制剂包括从蒲桃树叶、白桦树皮和酸枣仁提取的白桦脂酸，来源于紫铆花素提取物紫铆因和源自辣椒的提取物辣椒素均已被证实可以通过抑制MM细胞内STAT3活性而发挥抗MM效应。进一步研究显示，白桦脂酸和紫铆因分别通过上调受体酪氨酸磷脂酶(SH2-containing phosphatase-1，SHP-1)和诱导活性氧生成抑制MM细胞内STAT3活性。此外，来源于传统中药雷公藤的提取物雷公藤红素可以通过干扰MM细胞内STAT3信号通路进而诱导MM细胞增殖阻滞并逆转其对硼替佐米的抵抗。Bharti研究小组发现源自姜科植物的姜黄素能够抑制MM细胞株U266细胞内STAT3活化进而诱导其凋亡。合成类STAT3抑制剂包括INCB20、SC99、AG490、LS-104和CEP-701等。小鼠移植瘤模型实验证实，INCB20可以延缓MM移植瘤生长。Liby研究小组发现三萜类化合物CDDOIm通过上调MM细胞内STAT3负向调控因子细胞因子信号传导抑制蛋白-1和SHP-1抑制其活化进而诱导MM细胞凋亡。最近，Lee JH研究小组发现合成类STAT3抑制剂金合欢醇也具有抗MM效应。这些研究结果显示，STAT3抑制剂能够改变MM细胞生物学行为，但目前尚未有STAT3抑制剂在临床上应用。
中国药用植物青风藤已被有效地用于在中国对各种风湿性疾病的治疗超过2000年。青藤碱，从防风科植物青藤的根和茎中分离的天然生物碱，在临床上用于治疗风湿性疾病包括类风湿性关节炎(RA)很长一段时间。它也被证明具有多种药理活性，如抗炎，免疫抑制，抗风湿作用，联合脂多糖治疗肝炎，同时有抗心律失常作用。然而，青藤碱由于其疗效弱，副作用大限制了它更广泛的应用。为了提高疗效，减少副作用，青藤碱衍生物的合成十分关键，一些青藤碱衍生物已经在抗炎症研究方面取得了重要进展。目前已有关于青藤碱衍生物能够有效抑制IL-6和IL-1β参与的炎症反应以及抑制NF-κB信号通路的报道，但还未有关于青藤碱衍生物在MM上的研究。本发明中的YL064及其系列衍生物是在青藤碱的基础上进行化学改造合成的新的小分子化合物，其安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景，容易为市场所接受。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用。
本发明的第二个目的在于提供青藤碱衍生物YL064在制备JAK1抑制剂中的应用。
本发明的第三个目的在于提供青藤碱衍生物YL064在制备STAT3抑制剂中的应用。
本发明的第四个目的在于提供青藤碱衍生物YL064在制备JAK1和STAT3双重抑制剂中的应用。
为实现以上第一个目的，本发明公开以下技术方案：青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，其特征在于，所述青藤碱衍生物是指在的基础上，C-10β位置引入芳环或者C-10β位置引入烷基链，或者C-10β的C-H键修饰为C-S键所得到的衍生物。
作为一个优选方案，当衍生物为C-10β位置引入芳环时，芳环上含有非极性基团Me，Br和F中的一种或几种。
作为一个优选方案，所述青藤碱衍生物是指如下化合物：104、YZJL-10-66-A、YZJL-10-95-A、YZJL-10-76-A、YZJL-10-82-A、YZJL-10-62-A、106、YZJL-10-63-A、YZJL-10-80-A、YZJL-9-87-A、YZJL-10-65-A、YZJL-10-86-A、YZJL-10-79-A、YZJL-8-32-A、YZJL-8-79-A、YZJL-10-81-A、YZJL-9-74-A、YZJL-10-77-A、YZJL-10-78-A、YZJL-10-64-A、YZJL-10-69-A、YZJL-9-62-A、YZJL-10-71-A、105、YZJL-10-67-A、YZJL-10-94-A、YZJL-10-96-A、YZJL-10-89-A、YZJL-10-85-A、YZJL-10-74-A、YZJL-10-88-A、YZJL-10-73-A和YL064中的一种或几种。
为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：青藤碱衍生物YL064在制备JAK1抑制剂中的应用。
为实现本发明第三个目的，本发明公开以下技术方案：青藤碱衍生物YL064在制备STAT3抑制剂中的应用。
为实现本发明第四个目的，本发明公开以下技术方案：青藤碱衍生物YL064在制备JAK1和STAT3双重抑制剂中的应用。
青藤碱衍生物YL064是在青藤碱的基础上通过氧化去芳构化反应和随后的硫醇/硫酚共轭加成，导致青藤碱C-10β的C-H键被修饰为C-S键。
本发明所列的化合物均已在中国发明专利CN101798285B：一种青藤碱衍生物、合成方法及其用途中公开。
C-10β位置引入芳环有利于抑制活性，C-10β芳硫基取代衍生物大多数呈现较好的抑制活性。其中，芳环上含有非极性基团的化合物(Me,Br,F)比芳环上含有极性基团(如OH,4-NH2)的化合物活性较好。C-10β烷硫基取代衍生物中，链长太短(88A,96A)或太长(73A)都没有活性，而适当长度的烷链(85A)或体积较大的烷基(74A)则表现出较为明显的抑制活性。
衍生物的具体结构参见下表所列，下表为青藤碱衍生物在骨髓瘤细胞系U266中的IC50值。
本发明的优点在于：本发明所公开的青藤碱衍生物具有抗多发性骨髓瘤效应，其中一个化合物YL064能通过直接结合JAK1和STAT3进而影响STAT3入核，最终抑制STAT3的转录活性，抑制下游一些促进增殖及抗凋亡靶基因的转录，从而表现出在多发性骨髓瘤上的治疗作用。本发明的青藤碱衍生物安全低毒，药理作用强，预示着很好的药用前景。
附图说明
图1A为YL064分子式；图1B(上)为40μM YL064对正常人外周血单个核细胞的影响；图1B(下)为20μM YL064对多发性骨髓瘤病人骨髓中的CD138+细胞的影响，结果显示，YL064对正常人外周血单个核细胞毒性小，但是能够显著诱导骨髓瘤病人的CD138+原代细胞的凋亡；图1C、D、E为YL064能够诱导多发性骨髓瘤细胞系U266、MM1.S的凋亡，并且成浓度依赖以及时间依赖性。
图2A、C显示YL064能抑制STAT3信号通路的705酪氨酸位点的磷酸化，而不影响丝氨酸727位点磷酸化，并且呈浓度和时间依赖性；图2B显示YL064可以抑制上游JAK1信号通路的磷酸化，而对JAK2的磷酸化无明显影响；图2D、E显示YL064能够抑制STAT3信号通路下游靶基因Cylin D1，Mcl-1的转录水平和蛋白水平。
图3A、B显示YL064能够抑制IL-6诱导的STAT3的活化；图3C显示STAT3荧光报告基因实验中，不同浓度YL064与处理pcDNA3.0-STAT3-LUC-1细胞24个小时后加入20ng/ml IL-6刺激20min，检测荧光素酶的活性，结果提示YL064能剂量依赖性的抑制IL-6诱导的STAT3的活化；图3D显示YL064抑制IL-6诱导的STAT3入核，20μM处理U266细胞6个小时后免疫荧光检测STAT3的细胞定位；图3E显示YL064抑制STAT3的入核，不同浓度YL064处理U266细胞6个小时后核浆分离后，WESTERN检测p-STAT3、laminB和β-actin；图3F示YL064抑制STAT3的DNA结合能力，不同浓度YL064处理U266细胞6个小时后提取核蛋白，通过凝胶迁移实验检测STAT3的DNA结合能力，结果提示YL064能剂量依赖性的抑制STAT3的DNA结合能力。
图4A显示U266以及同源的耐硼替佐米U266R对50nM硼替佐米有不同的效应，结果提示U266R能够对硼替佐米耐药；图4B显示不同浓度YL064处理U266R后检测凋亡相关蛋白，结果提示YL064能够诱导U266R的凋亡；图4C显示将U266细胞与多发性骨髓瘤病人标本中分离的骨髓基质细胞共培养24小时后，用不同浓度YL064处理8小时后，发现YL064同样能够剂量依赖性诱导BMSC共培养的U266细胞的凋亡；图4D显示YL064可抑制BMSC介导的STAT3的活化；图4E、F显示YL064可抑制多发性骨髓瘤原代细胞中STAT3的活化。
图5A、B、C显示N-乙酰半胱氨酸(NAC)能够抑制YL064的生物学效应；图5D、E、F显示用CETSA(Cellular Thermal Shift Assay)方法验证YL064可以与STAT3直接作用。
图6A、B、C显示对照组和YL064给药组多发性骨髓瘤进展的情况，YL064可以抑制多发性骨髓瘤的进展；图6D、E显示取生理盐水对照组、YL064给药组小鼠肿瘤切片，组织免疫检测TUNEL、PCNA、p-STAT3(Tyr705)、cyclinD1，YL064明显抑制小鼠肿瘤增殖并诱导肿瘤凋亡，同时可以降低肿瘤中STAT3的活性进而抑制下游靶基因的表达；图6F显示DMSO生理盐水对照组、YL064给药组小鼠肿瘤切片HE染色两组肿瘤形态上无明显差异。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
细胞处理
人多发性骨髓瘤细胞U266及其耐药株U266R及地塞米松敏感株MM1.S细胞均在含有10％热灭活胎牛血清(FBS,Gibco BRL,Gaithersburg,ML)、青霉素(100U/ml)和链霉素(100μg/ml)的RPMI 1640培养基(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)中培养，放置于37℃，含有5％CO2的恒温培养箱中。在实验中，细胞均以4×105/ml接种，并用相应浓度的YL064处理。YL064溶于DMSO其储存浓度为50mM。细胞活率用台盼蓝排斥测试法检测。
CCK8试剂盒测定细胞增殖抑制率及协同指数
取对数生长期的U266细胞，按2×105/ml密度接种于96孔Y培养板，每孔100μl，实验组分别加入终浓度为100、50、25、12.5、6.25、3.125μ.YL064，同时设溶剂对照组(加入含0.1％DMSO的无血清1640培养基)和空白对照组，每组设3个复孔。置于37℃、5％和湿度培养箱中，培养48小时后每孔分别加入10μl CCK-8溶液(避免气泡)，轻微振荡10min混匀，置培养箱继续培养4h，振荡均匀后，在酶标仪上检测450nm处各个孔的吸光度(A)值。按公式计算细胞增殖抑制率。细胞增殖抑制率(％)＝(1-A实验组/A对照组)×100％。用Graphpad软件计算药物IC50。
蛋白印迹分析
YL064不同浓度处理细胞特定的时间后，或者固定浓度处理不同时间后，将U266、U266R、MM1.S细胞通过离心收集起来并裂解提取蛋白。将蛋白等量上样至6-12％SDS-PAGE胶，进行电泳，并转移印迹至NC膜上(Amersham Biosciences,Piscataway,NJ,USA)。用5％脱脂牛奶封闭膜之后，4℃孵育鼠源一抗PARP-1(Cell Signaling,Beverly,MA)、phospho-STAT3(Try-705)(Cell Signaling,Beverly,MA)、phospho-STAT3(Ser727)(CellSignaling,Beverly,MA)、STAT3(Cell Signaling,Beverly,MA)、phospho-JKA2(CellSignaling,Beverly,MA)、JAK2(Cell Signaling,Beverly,MA)、Total-Caspase-3(CellSignaling,Beverly,MA)、Cleaved-Caspase-3(Cell Signaling,Beverly,MA)或者兔源一抗CyclinD1(Cell Signaling,Beverly,MA)、MCL-1(Cell Signaling,Beverly,MA),Bcl-2(Cell Signaling,Beverly,MA)。接着孵育辣根过氧化物酶连接的二抗(Cell Signaling,Beverly,MA)。并采用化学底物发光(Cell Signaling)检测。β-actin抗体(Merck,Darmstadt,Germany)或者β-tubulin用于检测蛋白的上样量。
RNA抽提分析
YL064 20μM处理细胞不同的时间点。将U266细胞通过离心收集起来。按照Invitrogen公司TRIzol试剂盒提供的方法提取细胞的总RNA，使用RT-PCR试剂盒(Promega,Madison,WI,USA)反转录成cDNA。实时定量PCR在ABI PRISM 7900实时定量PCR仪(Perkin-Elmer,Torrance,CA)中进行，10μl反应体系如下：2×SYBR Green PCR Master Mixture(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)5μl,β-actin或者目的基因产物正反向引物各0.05μl，cDNA 1μl，ddH2O 3.8μl。反应程序如下：50℃2分钟(UNG孵育)，95℃10分钟(热启动PCR)，重复如下循环40次：95℃30秒，60℃60秒，最后在60℃建立溶解曲线。以上所有的反应和检测都在覆盖了透明封口膜的MicroAmp optical96孔反应板上进行。所有PCR反应都采用3个样本，并计算反应实验误差的标准偏差。所有的数据都采用ABI PRISM SDS 2.0软件分析。这种仪器配套的软件计算出的阈值threshold cycle(Ct)表示达到一定数值的荧光强度(florescence intensity)所需的循环数。应用“ΔCt法”，β-actin用以矫正不同反应中所有的RNA的量。
单个核细胞分离
采集的标本血液由RPMI1640培养液将其等比稀释，混匀。加Ficoll(Ficoll-PaquePlas,GE Healthy)于15ml无菌离心管中，倾斜离心管，将稀释后的血液缓慢加入，保持血液和Ficoll形成清晰的界面，避免混合，Ficoll与血液的体积比为3:4，使用前需置于室温平衡。400g，室温离心30分钟，由于Ficoll的密度为1.077，人的红细胞密度为1.093，粒细胞密度为1.092，单个核细胞在1.076～1.090之间，经分离后，血浆和血小板位于上层，红细胞因遇Ficoll凝集成串钱状而沉积于管底故与粒细胞均沉积于下层。中层为淋巴细胞分离液，而单个核细胞则因为与分层液密度相当而密集在血浆层和分层液的界面上，呈白色膜状物。吸取分层液液面的细胞，即可从外周血中分离到单个核细胞。小心将单个核细胞吸取，移至另一无菌15ml离心管中，加入5倍以上体积的RPMI1640洗涤两次，1500rpm室温离心10分钟。末次离心后，若所得细胞中混有红细胞，则加1ml红细胞裂解液重悬细胞，充分混匀后室温孵育10分钟，裂解红细胞。再加入适量RPMI1640洗去红细胞裂解液，即得到单个核细胞待用。
免疫组织化学检测石蜡切片制作①固定和脱水：取组织，用PBS冲洗后用4％多聚甲醛固定48h。弃去固定液，用蒸馏水漂洗三次，50％的酒精漂洗两次。再用酒精逐级脱水，70％酒精，12h；80％酒精过夜；95％酒精3h；无水酒精1#、2#各2h。②透明：无水酒精和二甲苯(1:1)混合液，浸泡45min；二甲苯1#、2#各30min。③包埋(在恒温箱内进行)：二甲苯和石蜡(1:1)，浸泡45min。石蜡1#、2#共2.5h，再用石蜡3#包埋组织。④切片、贴片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7m的石蜡带。将组织石蜡块在50C温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上。(洗片：1％HCL浸泡过夜，蒸馏水冲洗，95％酒精浸泡2h后擦干，涂胶：防脱剂多聚赖氨酸)⑤烤片：68C恒温箱内烤片2h。7.2SP(streptavidin-perosidase)法,即链霉素-生物素-过氧化物酶连结法①脱蜡水化：60C，20min；二甲苯，2 10min；无水乙醇，2 5min；95％乙醇，2min；80％乙醇，2min；70％乙醇，2min；ddH2O，5min；PBS漂洗，3 3min。②阻断：灭活内源性过氧化物酶：3％H2O2，37C孵育10min，PBS冲洗3 5min。抗原修复：在0.01M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)中用煮沸(95C，15-20min)，自然冷却20min，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3 5min。③封闭：正常羊血清工作液封闭，37C，10min，倾去血清(勿洗)。滴加一抗50μl，4C冰箱孵育过夜。④PBS冲洗3 5min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照)；滴加生物素标记二抗,37C孵育30min；PBS冲洗3 5min；滴加辣根过氧化物酶标记的二抗40-50μl，37C孵育30min。⑤PBS冲洗3-5min；滴加SP(链霉亲和素-过氧化物酶)，室温孵育1h。PBS冲洗2-3次，每次5min⑥显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度(胞浆为棕色者判定为阳性细胞)。显色剂的配制：在1ml水中加入一滴显色剂A，然后加一滴显色剂B，摇匀，再加一滴显色剂C，摇匀(A：DAB，B：H2O2，C：磷酸缓冲液)。⑦自来水冲洗10min终止反应；复染：苏木素复染2min，盐酸酒精分化；自来水冲洗10-15min。常规脱水：50％乙醇，2min；70％乙醇，2min；95％乙醇，2min；95％乙醇，2min；无水乙醇，2min。透明：二甲苯(1-2min)，二甲苯(2 2min)。⑧封片：用中性树胶滴在组织边上再用盖玻片盖上，镜检。
统计分析
用于统计的数据均来自于每次3个样本共3次试验的结果，Student’s t-test用于评价两组之间的差异，p<0.05被认为具有显著性统计学差异。
实施例1.表1YL064及其系列青藤碱衍生物对骨髓瘤细胞系U266的增殖抑制作用
分别用不同浓度青藤碱衍生物处理多发性骨髓瘤细胞U266，48h后CCK8方法检测各化合物对U266细胞的半数抑制率(IC50)。结果显示，青藤碱衍生物可不同程度抑制U266细胞的增殖(表1.)。
实施例2.YL064诱导人多发性骨髓瘤细胞株以及原代骨髓瘤细胞的凋亡
分别用不同浓度处理多发性骨髓瘤细胞U266、MM1.S细胞24h后用流式检测凋亡率，Westblot检测相关凋亡蛋白PARP1-1,Caspase3、Cleaved caspase3，结果提示，YL064确实能够诱导骨髓瘤细胞系的凋亡，呈剂量以及时间依赖性。(图1C、D、E)。进一步我们用YL064 20μM处理4例骨髓瘤病人的原代细胞，结果提示YL064能明显诱导原代细胞凋亡，而40μM的YL064对正常人外周血单个核细胞并无影响(图1B)。
实施例3.YL064抑制STAT3的活化并抑制下游靶基因
为了研究YL06诱导骨髓瘤细胞凋亡的机制，鉴于IL-6介导的STAT3信号通路的活化是参与多发性骨髓瘤增殖、侵袭比较经典且十分重要的通路，观察YL064对STAT3通路的效应。分别用不同浓度(2.5、5、10、20μM)的YL064处理U266细胞24h，以及用20μM的YL064处理U266细胞(6、12、24、48h)不同时间，分别检测其中p-STAT3(Tyr705)、p-STAT3(Ser727)、STAT3的表达变化，结果提示，YL064能够明显抑制p-STAT3(Tyr705)的活化，呈剂量和时间依赖性，而不影响p-STAT3(Ser727)的活化(图2A、图2C)。由于STAT3的活化受上游JAK1和JAK2的调控，我们接着检测了YL064对JAK1和JAK2通路的影响，结果提示YL064可以抑制JAK1的活化，而不影响JAK2通路(图2B)。进一步我们检测了STAT3下游的靶基因Cyclin D1、Mcl-1的蛋白及RNA水平变化，结果提示YL064能同时下调这些基因的蛋白以及转录水平的表达(图2D、图2E)。
实施例4.YL064能够抑制IL-6介导的STAT3的活化
我们在STAT3不活化的MM1.S中用不同浓度(2.5、5、10、20μM)处理24h以及用20μM处理不同时相(5、10、20、30、60min)后用IL-6 20ng/ml刺激20min,检测STAT3通路的变化，结果提示YL064对IL-6介导的STAT3的活化具有抑制效应(图3A、图3B)。接着，我们建立了一个体外筛选STAT3抑制剂的平台，即在Hela细胞中，瞬转转入pSTAT3-Luc(Panomics)和SV40-Renilla-Luc(Promega)质粒。通过加入IL-6活化STAT3，并用Renilla质粒作为内参证实此系统是可以很好反应STAT3的活性(图1B)。接着，我们用不同浓度YL064处理共转了上述两种质粒的细胞24h后加入20ng/ml IL-6刺激20min，检测荧光素酶的活性。结果提示YL064能剂量依赖性的抑制IL-6诱导的STAT3的活化(图3C)。免疫荧光实验我们发现用20μM的YL064处理U266细胞6h后，再用20ng/ml IL-6刺激20min，IL-6诱导的STAT3的入核被抑制(图3D)。为进一步证实免疫荧光的结果，核浆分离后，WESTERN检测PSTAT3、lamin B和β-actin。我们发现YL064能抑制p-STAT3的入核。(图3E)进一步通过EMSA实验验证上面的结果，用20μM、40μM处理U266细胞6h，提取核蛋白，通过凝胶迁移实验检测STAT3的DNA结合能力，结果提示YL064能直接抑制STAT3的DNA结合能力(图3F)。
实施例5.YL064能够抑制骨髓瘤细胞的耐药效应且能下调原代细胞中活化的STAT3
我们首先证明了U266以及同源的硼替佐米耐药细胞U266R对50nM的硼替佐米反应不同，后者表现出较好的耐受效应(图4A)。接着我们用不同浓度的YL064处理U266R 24h后，检测凋亡相关蛋白PARP-1，结果显示20μM能引起U266R细胞的PARP-1发生剪切。鉴于骨髓基质细胞(BMSC)与骨髓瘤细胞的耐药效应密切相关，我们将U266细胞与BMSC共培养后，用10μM、20μM的YL064处理，结果发现，YL064仍然能够引起共培养条件下U266细胞的凋亡，20μM的凋亡率达到80％，同时能够抑制BMSC介导的STAT3的活化(图4C,图4D)。接下来，我们检测了七个病人原代细胞中的STAT3的活化情况，选取了其中一例STAT3活化的病人原代细胞用不同浓度的YL064处理24小时，结果提示YL064确实能够下调原代细胞中活化的STAT3(图4E)。
实施例6.YL064能够靶向STAT3
从YL064的结构分析其可能的作用机制。我们首先用N-乙酰半胱氨酸(NAC)与其共同作用，发现NAC能够抑制YL064的促凋亡以及抑制STAT3的效应。(图5A，图5B和图5C)。接着我们用细胞热力学稳定性迁移分析实验(Cellular thermal shift assay,CETSA)验证YL064能够与JAK1、STAT3直接结合。我们在U266中检测了相同浓度的YL064与细胞裂解液孵育，发现YL064能使STAT3不稳定，同时我们用不同浓度YL064与细胞裂解液孵育，结果提示不同浓度的YL064使STAT3不稳定的能力不同，而且药物浓度越高，不稳定性能力越强(图5D、图5E)，同样，YL064也能诱导JAK1蛋白的热稳定性发生改变(图5F)。
实施例7.YL064体内抑制STAT3活性和抗骨髓瘤效应
5-6周大小的裸鼠，对数生长期的MM1S细胞，计数后，收取细胞，并用PBS洗3次，最后用PBS重悬。在裸鼠的右侧臀部皮下接种约3×107个细胞。待瘤子体积约有0.2cm3时，分为溶剂组和治疗组(30mg/kg)，开始经腹腔给药治疗，并计做第0天。开始给药治疗后，每天称量小鼠的体重和测量瘤子的大小。瘤子体积的计算公式：0.5*a*b2(a：长度，b：宽度)②待两组瘤子大小有很显著差异时，停止给药。断颈的方式处死小鼠，解剖取下瘤子，拍照。将瘤子剪成小块，一部分迅速装进冻存管，转移至液氮。另外取一块瘤体，用PBS冲洗后转移至EP管中，并加入1.5ml的4％的多聚甲醛，4℃固定大于48小时，用于免疫组化。给药期间，我们监测体重和瘤体大小的变化，可以看出，与溶剂组相比YL064对小鼠的体重基本没有明显的影响(图6A)，反映YL064在体内引起的毒副反应较小。图6B是瘤子大小的变化，YL064显著地抑制了瘤子的增殖。图6C更直观的显示出两组之间瘤子体积的差异。将瘤子取一部分固定后，做免疫组化。分别用抗体PCNA、TUNEL和p-STAT3(Tyr705)、cyclin D1进行检测(图6D、图6E),并用HE染色作为对照。YL064治疗组与对照组相比，结构上没有明显差异，但是PCNA阳性细胞显著减少，而TUNEL阳性的细胞明显增多，提示YL064在体内抑制了多发性骨髓瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。另外，我们用p-STAT3、cyclinD1抗体检测发现，YL064抑制p-STAT3在酪氨酸705位点的磷酸化，并且能抑制体内肿瘤细胞中cyclinD1的表达。
综上，我们发现上述在青藤碱基础上合成的系列青藤碱衍生物具有良好的抗骨髓瘤效应，其中小分子化合物YL064能够直接作用JAK1和STAT3蛋白从而抑制细胞内JAK1-STAT3信号通路的活化，进而引起骨髓瘤细胞的凋亡，为多发性骨髓瘤的治疗提供了新的靶向治疗的化合物，我们也发现YL064对硼替佐米耐药的细胞也有促凋亡效应，为治疗临床硼替佐米耐药的病人提供了新的治疗思路。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用，其特征在于，所述青藤碱衍生物是指在的基础上，C-10β位置引入芳环或者C-10β位置引入烷基链，或者C-10β的C-H键修饰为C-S键所得到的如下衍生物：
CN201610898077.4A 2016-10-14 2016-10-14 青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用 Active CN106539797B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610898077.4A CN106539797B (zh) 2016-10-14 2016-10-14 青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610898077.4A CN106539797B (zh) 2016-10-14 2016-10-14 青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106539797A CN106539797A (zh) 2017-03-29
CN106539797B true CN106539797B (zh) 2019-05-21

Family

ID=58369017

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610898077.4A Active CN106539797B (zh) 2016-10-14 2016-10-14 青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN106539797B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101148437A (zh) * 2007-11-05 2008-03-26 南京大学 碳碳方式连接的双青藤碱衍生物、制备方法及其应用
CN101798285A (zh) * 2010-02-10 2010-08-11 中国科学院上海有机化学研究所 一种青藤碱衍生物、合成方法及其用途

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101148437A (zh) * 2007-11-05 2008-03-26 南京大学 碳碳方式连接的双青藤碱衍生物、制备方法及其应用
CN101798285A (zh) * 2010-02-10 2010-08-11 中国科学院上海有机化学研究所 一种青藤碱衍生物、合成方法及其用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Regio- and stereoselective C10beH functionalization of sinomenine: an access to more potent immunomodulating derivatives;Yang-Tong Lou;《Tetrahedron》;20120113;第68卷;2172-2178

Also Published As

Publication number Publication date
CN106539797A (zh) 2017-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Jeong et al. Anti-inflammatory effects of genistein via suppression of the toll-like receptor 4-mediated signaling pathway in lipopolysaccharide-stimulated BV2 microglia
Hong et al. Angiogenic effect of saponin extract from Panax notoginseng on HUVECs in vitro and zebrafish in vivo
CN105194550B (zh) 一种中药复方组合物及其在抗前列腺癌中的应用
Shen et al. Lycium barbarum polysaccharide stimulates proliferation of MCF-7 cells by the ERK pathway
Wu et al. Sulforaphane inhibits TGF-β-induced epithelial-mesenchymal transition of hepatocellular carcinoma cells via the reactive oxygen species-dependent pathway
CN103269706A (zh) 抗癌萃取物及化合物
Widowati Phytochemical, free radical scavenging and cytotoxic assay of Cucumis Melo L. extract and β-carotene
Lan et al. Parthenolide induces autophagy via the depletion of 4E-BP1
Bargagna-Mohan et al. Small molecule anti-angiogenic probes of the ubiquitin proteasome pathway: potential application to choroidal neovascularization
CN106539797B (zh) 青藤碱衍生物在制备治疗多发性骨髓瘤药物中的应用
CN102526153B (zh) 驱虫斑鸠菊黄酮组分及其制备方法和用途
Hsu et al. Phenethyl isothiocyanate suppresses the proinflammatory cytokines in human glioblastoma cells through the PI3K/AKT/NF-κB signaling pathway in vitro
Chung et al. Water extract isolated from Chelidonium majus enhances nitric oxide and tumour necrosis factor-α production via nuclear factor-κB activation in mouse peritoneal macrophages
Wang et al. Therapeutic mechanism and effect of camptothecin on dextran sodium sulfate-induced ulcerative colitis in mice
Nurhidayati et al. Antiangiogenesis Activity of Awar-Awar Leaf Extract (Ficus Septica Burm. F.) In Chorioallantoic Membrane Assay.
Lee et al. Xanthorrhizol Suppresses Vascular Endothelial Growth Factor-Induced Angiogenesis by Modulating Akt/eNOS Signaling and the NF-κ B-Dependent Expression of Cell Adhesion Molecules
CN105853417B (zh) 乌头碱在治疗红斑狼疮中的应用
Li et al. Protective role of Taraxasterol against cardiovascular aging and aging-induced desensitization of insulin signaling
Odunola Cytotoxic and antiproliferative properties of methanol extract of stem bark of Adansonia digitata linn. in breast cancer cells
Baróniková et al. An ex-vivo angiogenesis assay as a screening method for natural compounds and herbal drug preparations
CN111514209A (zh) 一种中药组合物在制备预防和/或治疗心肌缺血再灌注损伤的药物中的应用
Azwari et al. The immunomodulatory activities of alkaloid (Vf-1) isolated from stem bark of tampa badak (Voacanga foetida (Bl) Rolfe) on Raw 264.7 Cells
Senrung et al. Phytochemicals showing antiangiogenic effect in pre-clinical models and their potential as an alternative to existing therapeutics
CN104223056B (zh) 龟甲胶在制备治疗肿瘤的药物中的用途
Xue et al. BERBERINE INDUCES AUTOPHAGY, APOPTOSIS AND MODULATES MIR-155 IN HEAD AND NECK SQUAMOUS CARCINOMA CELLS.

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant