CN106538100A

CN106538100A - 一种利用生物土壤结皮‑植物体系立体防治荒漠化的方法

Info

Publication number: CN106538100A
Application number: CN201610956478.0A
Authority: CN
Inventors: 冯福应; 贾丽娟; 唐凯; 杨杉杉; 张胜男; 李蘅; 孟建宇
Original assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Current assignee: Inner Mongolia Agricultural University
Priority date: 2016-11-02
Filing date: 2016-11-02
Publication date: 2017-03-29

Abstract

一种利用生物土壤结皮‑植物体系立体防治荒漠化的方法，包括以下步骤：(1)集水管的制备；(2)支撑层的制备；(3)功能菌复合系悬液制备；(4)保护层的制备。本发明之生物土壤结皮‑植物体系立体防治荒漠化的方法具有集水和保水作用，能有效降低风蚀和水蚀的影响，在不人为施加水分的情况下，实现生物土壤结皮迅速形成并良好发育，植物发芽生长，提高荒漠植被建成速率和覆盖度，有效地防治荒漠化、促进荒漠地区生态环境的恢复。

Description

一种利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法

技术领域

本发明涉及一种人工生物土壤结皮的构建方法，具体涉及利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法。

背景技术

荒漠化是指人类长期不合理的活动与脆弱的生态环境相互作用，造成的土地生产力下降、水土流失、地表呈现类似荒漠景观的现象。荒漠化是当今社会人类面临的重要的环境问题，而生物土壤结皮(生物土壤结皮，也有别称微生物结皮、生物结皮)的形成和发育为荒漠地区生态环境的恢复提供良好的基础，是荒漠地区生态环境恢复的关键初始过程，是流动沙丘稳定的首要标志，是全球重要的碳、氮的固定者，对全球气候和物质循环的影响举足轻重，在荒漠环境系统稳定、修复和重建中具有重要的意义。生物土壤结皮是由土壤中细菌、真菌、蓝藻与土壤颗粒共同形成的有机复合体，包括藻结皮、地衣结皮、苔藓结皮三大类，生物土壤结皮分布在灌木或草本植物间的空隙区域。植物为生物土壤结皮发育提供了庇护条件，无植被的沙漠地表还未见生物土壤结皮的存在。生物土壤结皮的覆盖下有利于植物种子的萌发、提高成活率。微生物如植物生长促进细菌可提高植物的抗旱等抗逆性、促进植物生长、增加植物生物量。但是，荒漠裸沙或裸土中微生物很少，植物更是缺乏。可见，通过人为添加微生物-植物，利用微生物-微生物和微生物-植物之间相互促进作用，提高土壤营养、加速植被建成，进而可促进荒漠生态系统的恢复。

目前，利用生物土壤结皮防治荒漠化专利技术，例如CN201110262012.8等主要利用了自然生物土壤结皮(即采挖自然形成的生物土壤结皮)为种源、保证充足水分供给和施肥等来培育生物土壤结皮，但目前还缺乏将生物土壤结皮-植物整合到一起来进行立体防治荒漠化的技术。另外，水分缺乏是荒漠防治的根本难题，在自然荒漠中利用生物土壤结皮时还有待结合开发利用集水保水节水的方法。因此，通过人工培养微生物、结合集水保水技术来构建生物土壤结皮-植物体系，有望提供一种荒漠化防治的有效方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法，有效解决了荒漠中生物土壤结皮-植物体系建成中水分缺乏的问题，防止了风蚀和水蚀的影响，促进了荒漠植被的形成及发育，加快荒漠地区生态环境的恢复。

本发明解决其技术问题采用的技术方案是，一种利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法，包括以下步骤：

(1)集水管的制备：将管材切割制成长度不小于50cm的集水管，插入沙土中，土中部分高度不低于30cm、地表部分高度不低于20cm；

(2)支撑层的制备：将管内表面4～5cm的沙土取出，将50～100颗荒漠牧草种子和5～15颗荒漠灌木种子均匀撒入管内沙土表面，以挖出的沙土∶矿粉∶牛粪比为100∶1∶10的重量比混合制成支撑层，然后将混合均匀的支撑物回填到管内、铺平；

(3)功能复合菌系悬液的制备：将具有植物生长促进和加强土壤粘结功能的细菌、真核荒漠微藻，经过一级、二级、三级逐级扩大培养，使每种菌的细胞浓度达到为1×10⁸个/ml；将各种微生物一起以比例为1∶1的重量比制备成复合菌悬液；接着将复合菌悬液均匀喷洒至塑料管内，喷洒量为不低于60ml/管；

(4)保护层的制备：以透光透水透气塑料膜封闭管口，幼苗生长至管口时，在苗正上方将膜剪口放苗。

进一步，步骤(1)中，所述管材选自任何材质的、任何形状、不透水的管，优选建筑用PVC管。

进一步，步骤(2)中，所述支撑层加入秸秆粉末、矿粉、荒漠牧草、灌木种子和牛粪，矿粉是由磷矿粉∶钾矿粉按照配比1∶1制成，牛粪经干燥粉碎后的粒径不大于1cm的粉末或颗粒物。

进一步，步骤(3)中，所述细菌选自固碳、固氮、解磷、光营养、纤维素降解、产多糖、产铁载体、产ACC脱氨酶、产植物激素等功能的具鞘微鞘藻、念珠藻、红杆菌、固氮螺菌、固氮菌、根瘤菌、类芽孢杆菌、芽孢杆菌、马西利亚菌、鞘氨醇单胞菌和甲基杆菌中的一种或两种以上的混合物；所述真核微藻选自荒漠微藻微芒藻。

进一步，步骤(4)中，所述透光透水透气塑料膜为厚度为0.02～0.08mm的透光塑料膜，中心压有滤纸，大小为管直径的1/8～1/6，有滤纸部分的膜打孔，孔径0.2～0.5cm。

本发明将管状物插入沙土中，施加少量磷和钾矿粉，接种具有固碳和固氮等促进生物土壤结皮形成和植物生长的功能微生物、播种多年生荒漠牧草和荒漠灌木种子，并以特制透光透气透水塑料膜为保护，起到集水和保水的作用，防止风蚀和水蚀的影响，培育生物土壤结皮、培养植物，促进植被的形成从而防治荒漠化。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明采用对植物和蓝藻生长起促进作用等功能微生物与蓝藻形成复合菌体系共同接种于裸沙上，与现有技术中只接种蓝藻或自然生物土壤结皮相比，更能缩短生物土壤结皮的形成和发育时间。

2、本发明使用的任何材质、任何形状的集水管(如PVC管)，具有集水和保水作用，并有效降低风蚀和水蚀。

3、由透光透水透气塑料膜作为保护层封闭管口，也可有效降低风蚀和水蚀，并起到集水和保水作用，尤其是能保证沙土表层湿润、为生物土壤结皮的迅速形成和发育提供必需保障。

4、生物土壤结皮-植物体系中的生物土壤结皮和植物组分相互支撑，可提高水分的保持，降低风蚀和水蚀的影响，促进生物土壤结皮的形成和植物的发芽生长，提高荒漠植被建成速率和覆盖度，提供一种荒漠化防治的方法、促进荒漠地区生态环境的恢复。

附图说明

图1为生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化初步试验效果(其中，A，集水管埋入裸沙时初始状况；B，处理100天后状况；C，膜封闭示意；D，膜封闭20天后藻结皮明显形成；E、F，未封闭管植物可生长，但无生物土壤结皮形成)。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明。

一、培养基配方

1、R2A全营养培养基：可溶性淀粉2.5g，葡萄糖2.5g，细菌学蛋白胨2.5g，酸水解酪素2.5g，酵母提取物2.5g，K₂HPO₃·3H₂O 1.5g，丙酮酸钠1.5g，MgSO₄·7H₂O 0.25g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

2、固氮培养基：KH₂PO₄ 0.2g，CaCO₃ 5g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖10g，NaCl 1.2g，CaSO₄·2H₂O 0.1g，琼脂20g，蒸馏水1000mL。

3、无机磷培养基：葡萄糖10g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，NaCl 0.3g，KCl 0.3g，MgSO₄·7H₂O0.3g，Ca₃(PO₄)₂ 25g，FeSO₄·7H₂O 0.03g，MnSO₄·4H₂O 0.03g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH自然。

4、MDM培养基：K₂HPO₃·3H₂O 0.25g，MgSO₄·7H₂ O 0.25g，NaCl 0.1g，KNO₃ 1g，CaCl₂·2H₂O 0.01g，Fe solution 1mL，A5solutin 1mL，琼脂20g，蒸馏水1000mL。其中，Fesolution的配方：FeSO₄·7H₂O 1.68g，浓硫酸2滴，无菌水500mL。

A5 solution的配方：H₃BO₃ 0.286g，MnSO₄·7H₂O 0.25g，ZnSO₄·7H₂O 0.02g，CuSO₄·5H₂O 0.007g，Na₂MoO₄ 0.002g，无菌水100mL。

5、LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，琼脂15g，去离子水1000mL，pH 7.4。

6、DF培养基：KH₂PO₄ 4g，Na₂HPO₄ 6g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，葡萄糖2g，葡萄糖酸1.62mL，柠檬酸2g，(NH₄)₂SO₄ 2g，去离子水1000mL，pH为7.2。

7、ADF培养基：将DF培养基中的(NH₄)₂SO₄去掉即为ADF培养基。

以下实施例均在无菌条件下操作。

实施例1：微生物的分离鉴定

称取5g采集自内蒙古地区的生物土壤结皮于100mL三角瓶中，加入45mL无菌水，此时的稀释浓度为10-1，称取0.5mL浓度为10-1的土壤悬液于10mL的无菌离心管中，混匀，此时浓度为10-2，依次取样，稀释至浓度为10^-5，取100μL稀释好的土壤悬液置于1/2R2A，Ashby，解磷等固体培养基，涂布，置于光照培养箱培养，培养条件为25℃，3000lx，一周后，分离纯化。待得到光合细菌，固氮菌，解磷菌、蓝藻纯培养物后，提取其DNA，并选用引物

27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，见SEQ ID NO：1，

1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，见SEQ ID NO：2，对其16S rDNA进行PCR扩增，PCR产物经上海生物工程有限公司测序，测序结果经Blast进行序列比对分析。

实施例2：微生物功能基因的初步分析

采用pufM和nifH验证是否分别具有利用光能和固氮功能的依据之一。采用引物

puf M_uni F：5′-GGNAAYYTNTWYTAYAAYCCNTTYCA-3′，见SEQ ID NO：3，

pufM_uni R：5′-YCCATNGTCCANCKCCARAA-3′，见SEQ ID NO：4，对分离得到的微生物进行pufM功能基因的扩增；采用引物

FGPH273：5′-CTC CGG GCC RCC NGA YTC-3′

，见SEQ ID NO：5，

pol R 5′-ATS GCC ATC ATY TCR CCG GA-3′

，见SEQID NO：6，

pol F：5′-TGC GAY CCS AAR GCB GAC TC-3′，见SEQ ID NO：7，

AQER：5′-GAC GAT GTA GAT YTC CTG-3′，见SEQ ID NO：8，对分离到的微生物进行nifH功能基因的扩增。

实施例3：产铁载体菌株的筛选

CAS平板配方：CAS蓝色染液含1mmol/L CAS(铬天青)，0.1mmol/L FeCl₃，4mmol/L十六烷基三甲基溴化胺，pH为6.8的0.1％磷酸盐缓冲液，每100mL MM9盐溶液含3g KH₂PO₄，5g NaCl，10g NH₄Cl。

CAS固体培养基：取100mL MM9盐溶液于750mL去离子水中，溶解32.24g 2-2磺酸，pH为6.8，加15g琼脂，高温高压灭菌，冷却至50℃，加30mL灭菌的酪蛋白水解物和10mL 20％的葡萄糖至MM9/2-2磺酸混合物中，缓慢加入10mL CAS蓝色染液，至底物混合，最后制成固体平板。将已活化的菌株采用划线法接种于CAS固体培养基中，期间观察菌株生长情况，有橙色晕圈的为产铁载体的菌株。实验结果表明，在接种的55株菌中48株菌具有产铁载体能力。

实施例4：产ACC脱氨酶菌株的筛选：

将产铁载体的48株菌采用1/2R2A培养基活化，然后接种于8mL LB培养基中，28℃，160rpm/min培养12h，去0.2mL菌液于8mL DF培养液中，相同条件下培养12h，取0.2mL菌液于8mL ADF培养基中，以不含ACC的ADF培养基为对照，培养24-48h，测定波长600nm下的吸光值，各做3个平行。实验结果表明，48株菌中30株产ACC脱氨酶。

实施例5：复合菌的筛选和培养

选择来自具鞘微鞘藻、念珠藻、红杆菌、固氮螺菌、固氮菌、根瘤菌、类芽孢杆菌、芽孢杆菌、马西利亚菌、鞘氨醇单胞菌和甲基杆菌等菌属、具有固碳、固氮、解磷、光营养、纤维素降解、产多糖、产铁载体、产ACC脱氨酶、产植物激素等多种功能或某种功能较强的菌株各1株，以R2A或MDM培养基，分别通过一、二和三级放大培养后混合在一起、形成接种用的复合菌。

实施例6：接种实验

将沙土、P&K矿粉(P∶K＝1∶1)、牛粪以10000∶1∶10的重量比混合，混匀后置于纸杯中，然后将得到的纯培养物制备成复合系菌体，使各菌株的细胞浓度为1×10⁸个/ml，接着将复合系菌体喷洒于盛有裸沙的纸杯中，每个纸杯的喷洒量为70mL，置于室外培养。培养30天后取样，分析土壤理化，以培养计数结合显微镜观察分析细菌、微藻数量。计数培养：微藻使用MDM培养基，细菌和真菌采用常规培养基。

通过计数，得到形态颜色不同的细菌共39株，蓝藻4株，并且复合菌实验比单独培养实验中微生物的丰度有所增加。

实施例7：野外实验

将室内实验确定的功能菌株(光合细菌，解磷菌，固氮菌，其它功能异养细菌)进行野外接种实验，将选用的菌株经过一级、二级、三级逐级扩大培养，使各菌株的细胞浓度为1×10⁸个/ml，制备成复合系菌体；将集水管(如建筑用PVC管)切割制成直径不小于30cm、长度不小于50cm的集水管，将集水管插入沙土中，土中部分高度不低于30cm、地表部分高度不低于20cm，管间距不大于1m；将管内表面4-5cm的沙土取出，将50-100颗多年生牧草种子(如沙打旺、柳枝稷、苜蓿等种子)和5-15颗荒漠灌木种子(如柠条、白刺、沙冬青等种子)均匀撒入管内沙土表面，以挖出的沙土∶矿粉∶牛粪以10000∶1∶10的重量比混合制成支撑层，然后将混合均匀的支撑物回填到管内、铺平；将制备好的复合菌均匀喷洒至裸沙表面，喷洒量不少于60mL/管，最后将厚度为0.06mm左右的特制透明塑料膜(将一定大小的滤纸平铺于塑料膜中央，将膜打孔并固定滤纸)封闭管口，幼苗生长至管口时、在苗正上方将膜剪口放苗。

通过野外实验，初步形成了人工生物土壤结皮，荒漠牧草和灌木发芽生长，形成了所预期生物土壤结皮-植物的立体荒漠防治体系。如图1所示：植物在管内和管外都有生长，在覆膜后15-20天即可形成肉眼可见绿色藻结皮层。

SEQUENCE LISTING

<110> 内蒙古农业大学

<120> 一种利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

agagtttgat cmtggctcag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

ggttaccttg ttacgactt 19

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

ggnaayytnt wytayaaycc nttyca 26

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

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<400> 4

yccatngtcc anckccaraa 20

<210> 5

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

ctccgggccr ccngaytc 18

<210> 6

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<212> DNA

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<400> 6

atsgccatca tytcrccgga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

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<400> 7

tgcgayccsa argcbgactc 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

gacgatgtag atytcctg 18

Claims

1.一种利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)支撑层的制备：将管内表面4～5cm的沙土取出，将50～100颗荒漠牧草种子和5～15颗荒漠灌木种子均匀撒入管内沙土表面，以挖出的沙土∶矿粉∶牛粪比为10000∶1∶10的重量比混合制成支撑层，然后将混合均匀的支撑物回填到管内、铺平；

2.根据权利要求1所述的利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述管材建筑用PVC管。

3.根据权利要求1或2所述的利用生物土壤结皮-植物体系防治荒漠化的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述支撑层加入秸秆粉末、矿粉、荒漠牧草、灌木种子和牛粪，矿粉是由磷矿粉∶钾矿粉按照配比1∶1制成，牛粪经干燥粉碎后的粒径不大于1cm的粉末或颗粒物。

4.根据权利要求1～3之一所述的利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述细菌选自固碳、固氮、解磷、光营养、纤维素降解、产多糖、产铁载体、产ACC脱氨酶、产植物激素等功能的具鞘微鞘藻、念珠藻、红杆菌、固氮螺菌、固氮菌、根瘤菌、类芽孢杆菌、芽孢杆菌、马西利亚菌、鞘氨醇单胞菌和甲基杆菌中的一种或两种以上的混合物；所述真核微藻选自荒漠微藻微芒藻。

5.根据权利要求1～4之一所述的利用生物土壤结皮-植物体系立体防治荒漠化的方法，其特征在于，步骤(4)中，所述透光透水透气塑料膜为厚度为0.02～0.08mm的透光塑料膜，中心压有滤纸，大小为管直径的1/8～1/6，有滤纸部分的膜打孔，孔径0.2～0.5cm。