CN106525945A - 基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法 - Google Patents

基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，属于分子识别和核酸适配筛选领域。本发明主要借助局域表面等离子体共振个人型分子相互作用分析仪筛选出可特异结合靶标物的核酸适配体，其筛选方法为：以纳米金芯片为介质，将靶标物固定在介质上，再以核酸适配体为识别元素，进行核酸适配体的可视化筛选。本发明借助LSPR‑SELEX技术，利用固体芯片在检测过程中无需标记物，最大限度地保持了核酸适配体的空间结构和生物活性。与传统的核酸适配体筛选方法相比，本发明创建的LSPR‑SELEX传感技术操作简单、灵敏度高、耗时短(15min)、响应速度快，最大的优势在于相互作用数据实时在线的呈现，能快速准确地获悉每一轮分子间的亲和力。

Description

基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法
技术领域
本发明属于分子识别和核酸适配筛选领域，主要借助局域表面等离子体共振(Localized Surface Plasmon Resonance technology，LSPR)个人型分子相互作用分析仪筛选出可特异结合靶标物的核酸适配体。
背景技术
局域表面等离子体共振(LSPR)是一种全新的、高灵敏度的蛋白及分子互作分析方法。由于生物分子易在纳米颗粒表面沉积，通常将1～100nm的超细粒子—纳米金颗粒(AuNPs)作为LSPR传感层固定在金属薄膜表面。LSPR的纳米金传感器(1.5mm2)比传统SPR使用的持续金膜小，其在可见光范围内可产生很强的共振吸收峰，使得颗粒周围的局域折射率高度敏感，因此LSPR具有更短的响应时间和更高的检测灵敏度。LSPR不仅能用于无标记实时监测许多种类生物分子之间的反应，还可以准确、灵敏、快速地检测出各种生化指标。鉴于LSPR技术的一系列卓越性能，它可以广泛地应用到食品、环境和分子生物学等领域，将直接成为实时观测生物分子间相互作用的主导技术。
核酸适配体(Aptamer)是一类长度小于100nt的单链DNA或RNA序列，其是应用新型组合化学技术—指数富集配体系统进化技术(Systematic Evolution of Ligands byExponential Enrichment，SELEX)体外从随机寡核苷酸文库中筛选得到能够与靶标物高灵敏和特异性地结合的适配体。当目标分子存在时，适配体通过自身特殊而稳定的三维折叠形成特异性的靶物质结合位点，这使得适配体可以区分出在结构上仅有细微差异的结构相似的物质。核酸适配体又称为“人工抗体”，其亲和力强、稳定性好、无免疫原性，而且易于修饰和标记，已被广泛用于检测、分离纯化和医疗三大领域。
发明内容
本发明借助LSPR传感技术，利用设计构建的寡核苷酸文库进行两轮筛选，最终得到不同序列的克隆子。进一步对核酸适配体进行亲和力和特异性的研究，挑选亲和力最高，特异性最强的序列作为理想适配体进行研究。借助本发明LSPR-SELEX技术，可用于对不同芯片的靶标物进行核酸适配体筛选。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，以纳米金芯片为介质，将靶标物固定在介质上，再以核酸适配体为识别元素，进行核酸适配体的可视化筛选。
所述的靶标物包括但不限于小分子、蛋白或病毒。
具体的，首先，用PBS缓冲液稀释寡核苷酸文库，作为样品，进样；其次，用PBS缓冲液冲洗系统，以清洗除去结合力弱或未结合的寡核苷酸分子，然后，用水冲洗进样系统，并用空气排空，防止样品在样品管内壁吸附；最后通入NaOH再生缓冲液，洗脱回收与靶标物特异性结合的核苷酸分子，进行PCR扩增，制备单链，获得单链次级库，以此进行下一轮筛选，重复筛选和PCR扩增，直至筛选出目的核酸适配体。
进样之前，运行PBS缓冲液，至仪器达到稳定的信号基线。
所述的进样流速为20μL/min，时间为5min。
所述的PBS缓冲液冲洗时的流速为150μL/min，时间为5min。
所述的NaOH再生缓冲液洗脱的流速为20μL/min。
所述的NaOH再生缓冲液的浓度为10mM。
所述的PBS缓冲液浓度为10mM。
筛选出的核酸适配体可用于靶标物的定量和定性检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明借助LSPR-SELEX技术，利用固体芯片在检测过程中无需标记物，最大限度地保持了核酸适配体的空间结构和生物活性。本发明以SA为例，利用LSPR-SELEX技术筛选SA特异性结合的核苷酸序列，得到了总长度为114bp的核酸适配体SBA；结合CE实验进行亲和力表征，结果证明，此序列可与SA靶标物有很好的结合。
(2)与传统的核酸适配体筛选方法相比，本发明创建的LSPR-SELEX传感技术操作简单、灵敏度高、耗时短(15min)、响应速度快，最大的优势在于相互作用数据实时在线的呈现，能快速准确地获悉每一轮分子间的亲和力。
(3)本发明借助LSPR传感器芯片的再生性能好，可重复利用80～100次，能够实现对多个不同浓度样品检测，极大降低筛选成本。
附图说明
图1：LSPR-SELEX筛选的适配体和靶标物的亲和力鉴定结果。其中，纵坐标代表传感器所检测到的信号值；横坐标代表样品在传感器中相互作用的时间。
A图为第一轮筛选的核酸适配体和靶标物的亲和力鉴定结果；图中，从上到下各曲线对应的核酸适配体浓度逐渐降低(6μM、3μM、1.5μM、0.75μM、0.375μM)。
B图为第二轮筛选的核酸适配体和靶标物的亲和力鉴定结果。图中，从上到下各曲线对应的核酸适配体浓度逐渐降低(10μM、5μM、2.5μM、1.25μM、0.625μM)。
图2：CE-SELEX表征SBA适配体。
A：SA(250μg/mL)的电泳迁移；B：SBA(150μg/mL)的电泳迁移；C：SBA(75μg/mL)+SA(125μg/mL)的电泳迁移；D：BSA(250μg/mL)的电泳迁移；E：BSA(125μg/mL)+SBA(75μg/mL)的电泳迁移。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1 LSPR-SELEX的筛选方法
(1)将寡核苷酸文库(两侧各含有20bp的上下游引物的固定序列，中间为80nt的随机序列)高速离心1min。再用ddH2O将其稀释成100μM的原液。寡核苷酸文库进行热变性(95℃10min)以破坏核酸分子间形成的聚合物，冰浴5min，避免核酸发生聚合。试验中所用溶液使用前用0.22μm的微孔滤膜过滤。
(2)实验仪器：Open-SPR(Nicoya，Ca)，采用链霉亲和素(SA)包被的纳米金芯片，开始以150μL/min的流速运行10mM的PBS缓冲液(NaCl 4g、Na2HPO4·12H2O 1.45g、KCl 0.1g、KH2PO4 0.1g、ddH2O定容至0.5L，pH7.4)，至到达稳定的信号基线。
(3)将100μM的寡核苷酸文库原液，用PBS缓冲液稀释至终浓度为10μM，作为样品。首先，注入250μL的寡核苷酸样品，以20μL/min的流速进样，与传感器相互作用5min，一旦相互作用时间结束，立即通入PBS缓冲液，以150μL/min的流速，高速冲洗系统5min，以清洗除去结合力弱或未结合的寡核苷酸分子；然后，用水冲洗进样系统，并用空气排空，防止样品在样品管内壁吸附；最后注入250μL的NaOH再生缓冲液(称取NaOH 0.4g，ddH2O定容至1L)，在20μL/min低流速下与传感器芯片相互作用5min，洗脱回收与靶标物特异性结合的核苷酸分子。
实施例2 PCR扩增及单链的制备
(1)将洗脱回收的核苷酸分子作为次级文库，进行PCR富集。引物序列为：P1：5’-TTGACTTGCCACTGACTACC-3’(SEQ ID NO.1)，P2：5’-GATGACGACCGACTGACTTC-3’(SEQ IDNO.2)。优化PCR的反应体系和程序如下：50μL的反应体系为：20μM P1 2μL、20μM P2 2μL、2×Taq Master Mix 25μL、次级文库21μL；PCR程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，61.7℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；最后72℃延伸2min，4℃保存。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定正确后进行纯化，其产物作为制备单链次级库的模板。
(2)优化制备单链次级库的不对称PCR，50μL的反应体系为：20μM P2 4μL、2×TaqMaster Mix 25μL、ddH2O 19μL、模板2μL；PCR程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，61.7℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；最后72℃延伸2min，4℃保存。扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳，110V 30min，鉴定正确后对PCR产物进行纯化，以此进行下一轮筛选。同时以同样条件将PCR产物进行纯化、复性。每一轮筛选后，采用TraceDrawer数据处理分析软件进行KD的计算。
结果表明，第一轮LSPR-SELEX筛选的核酸适配体与靶标物的KD值为107μM(见图1A)。第二轮LSPR-SELEX筛选的核酸适配体与靶标物的KD值为98nM(见图1B)。这说明，LSPR-SELEX技术仅需两轮筛选就能获得亲和力为98nM的核酸适配体。
实施例3克隆与测序
将第二轮LSPR-SELEX筛选得到的寡核苷酸序列连接到T载体上，进行克隆、测序，从而得到不同序列的适配体克隆株。最终以亲和力最高、特异性最强的序列作为理想的适配体进行研究，命名为SBA(测序结果如SEQ ID NO.3所示)。
实施例4毛细管电泳法表征(CE)
(1)利用毛细管电泳法对LSPR-SELEX过程进行表征。实验仪器：G7100A(AgilentTechnologies，USA)；熔融石英毛细管内径50μM，长度56cm；运行缓冲液及样品稀释液均为PBS缓冲液(NaCl 8.5g、Na2HPO4 2.2g、NaH2PO4 0.1g、ddH2O定容至1L，pH 7.6)
(2)使用前用1M NaOH(称取NaOH 4g，ddH2O定容至0.1L)、ddH2O依次冲洗5min、20min两遍，然后PBS缓冲液运行一次查看基线，待基线平稳后，进行样品分离。
(3)每个样品不少于200μL，分别上样SA、SBA、SA与SBA的结合物(室温孵育30min)、BSA、BSA与SBA的结合物(室温孵育30min)，进样压力为50mbar×10s，分离电压为20KV；样品分离20min。
通过毛细管电泳法表征，结果表明，SA+SBA混合孵育后有复合物峰的出现，证实了SA和SBA存在相互作用(见图2A-C)。对照组BSA+SBA混合孵育后无复合物峰的出现，说明BSA和SBA不反应(见图2B、D-E)。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南省农业科学院
<120> 基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgacttgcc actgactacc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatgacgacc gactgacttc 20
<210> 3
<211> 114
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aactgaacgg tgactgatgg gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt 60
ttgcgtattg ggcgctcttc cgcttcctcg ctcagatgac gaccgactga cttc 114

Claims (10)

1.基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，以纳米金芯片为介质，将靶标物固定在介质上，再以核酸适配体为识别元素，进行核酸适配体的可视化筛选。
2.根据权利要求1所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述的靶标物包括但不限于小分子、蛋白或病毒。
3.根据权利要求1所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，首先，用PBS缓冲液稀释寡核苷酸文库，作为样品，进样；其次，用PBS缓冲液冲洗系统，以清洗除去结合力弱或未结合的寡核苷酸分子，然后，用水冲洗进样系统，并用空气排空，防止样品在样品管内壁吸附；最后通入NaOH再生缓冲液，洗脱回收与靶标物特异性结合的核苷酸分子，进行PCR扩增，制备单链，获得单链次级库，以此进行下一轮筛选，重复筛选和PCR扩增，直至筛选出目的核酸适配体。
4.根据权利要求3所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，进样之前，运行PBS缓冲液，至仪器达到稳定的信号基线。
5.根据权利要求3所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述的进样流速为20μL/min，时间为5min。
6.根据权利要求3所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液冲洗时的流速为150μL/min，时间为5min。
7.根据权利要求3所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述的NaOH再生缓冲液洗脱的流速为20μL/min。
8.根据权利要求3-7任一项所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述的NaOH再生缓冲液的浓度为10mM。
9.根据权利要求3-7任一项所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，所述的PBS缓冲液浓度为10mM。
10.根据权利要求1所述的基于局域表面等离子体共振技术的核酸适配体筛选方法，其特征在于，筛选出的核酸适配体可用于靶标物的定量和定性检测。
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