CN106520965A - Msh2基因启动子甲基化检测的引物和检测方法 - Google Patents

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刘赵玲
王淑
王淑一
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Abstract

本发明公开了MSH2基因启动子区多CG位点甲基化检测的引物和方法包括：(1)扩增MSH2基因启动子区的正、反向兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2；(2)上述引物扩增的目标序列包括至少12个CG位点；(3)针对石蜡切片DNA片段化严重，而亚硫酸氢盐修饰饱和状态下仍呈现有效模板浓度低的问题，将Touch‑down PCR扩增和Sanger测序相结合，可显著提高检测灵敏度。本发明具有特异性高，准确度高以及低污染风险等优点，可检测肿瘤患者手术石蜡切片MSH2基因启动子区多个CG位点甲基化，结果可指导医生进行相关疾病的预后评估。

Description

MSH2基因启动子甲基化检测的引物和检测方法
技术领域
本发明属生命科学和生物技术领域，是一种检测MSH2基因启动子甲基化状态的引物和检测方法。
背景技术
错配修复基因是生物进化过程中的保守基因，具有修复DNA碱基错配，增强DNA复制忠实性，维持基因组稳定性，降低自发性突变的功能。hMSH2(human MutS homolog 2)是第一个被分离的人类MMR基因，该基因与细菌的MutS同源，位于人类染色体2p1-p22，其基因组DNA全长约73kb(不包括启动子)，含16个外显子，其中第7个外显子最长，有279bp；11外显子最短，仅98bp，cDNA全长3111bp，含2727bp的开放阅读框架，翻译后编码一种由909个氨基酸组成的蛋白质，与酵母蛋白的相应区域有85％的一致性。
hMSH2是最重要的错配修复基因，它对维持基因组的稳定性发挥着重要作用，该基因异常将导致遗传不稳定，从而引发细胞癌变。研究报道血清样本中检测MSH2基因甲基化有助于多种肿瘤的早期诊断。检测胰腺癌中hMSH2蛋白的表达，发现其表达与肿瘤的恶性分化程度有相关性。hMSH2的检测对了解遗传稳定性，以及恶性黑色素瘤的发生和发展有重要意义，而hMSH2基因的内部和外部发生改变均会导致基因的不稳定性和乳腺癌的发生。应用多态性分析法分析hMsHZ蛋白的表达，对估计脑胶质瘤患者的存活期有一定意义，且其胞核hMSH2的表达检测则是估计其预后的一个独立指标。
另外，人们已认识到lynch(林奇)综合征本质在于MLH1、MSH2、MSH6、PMS2四个基因的遗传缺陷，基因诊断已成为林奇综合征的“金标准”。国际上由多家癌症中心组成的两大癌症诊断治疗权威机构NCCN(National Comprehensive Cancer Network,美国国家癌症综合网络)、ESMO(The European Society for MedicalOncology，欧洲临床肿瘤学会)制定出林奇综合征基因的诊断指南。该指南强调所有70岁以下新诊断的大肠癌患者都要纳入林奇综合征基因筛查，并经过免疫组化、微卫星不稳定(MSI)初筛，再进行甲基化检测，仍不能排除基因缺陷的，就进入MLH1、MSH2、MSH6、PMS2基因筛查。
子宫颈癌确却的发病机制目前尚未明确，一般认为有两种途径，其一为经典的肿瘤抑制基因杂合性缺失途径；其二为错配修复微卫星不稳定途径。大量研究证实了子宫颈癌的发生和MSH2基因密切相关。研究表明了，子宫颈癌组织中，MSH2基因呈过度甲基化。
目前对于MSH2启动子甲基化检测的常规方法有：甲基化特异性PCR(MSP)、亚硫酸氢盐焦磷酸测序、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析(MS-HRM)，甲基化特异性PCR(MS-PCR)等。其中MSP法是使用PCR扩增检测来判断样本是否存在甲基化，该法实用且普遍，但假阳性较高，稳定性较差；亚硫酸氢盐焦磷酸测序因其操作繁琐，因此不适合大批量检测；MS-HRM是通过将单碱基序列的差异转变成熔解曲线的差异，从而判断是否存在甲基化，这种方法对仪器的要求颇高，需要带HRM模块的荧光定量PCR仪，同时该法只能分析检测片段整体甲基化状态，而不能明确每个CG位点的甲基化状态；MS-PCR是基于PCR开发的技术，主要是在检测中加入了TaqMan探针，从而保证了较高的灵敏度和准确度，但其对于多个甲基化位点的检测，也只能做到整体化分析，同时探针成本较高，因此该法较适用于少数位点大量样本检测。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：设计用于检测MSH2基因启动子甲基化的引物，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：
SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。
R碱基代表A或G，Y碱基代表C或T，所述SEQ NO 1和SEQ NO 2同时也为双向测序引物。
本发明提供的另一个技术方案是：用于检测MSH2基因启动子甲基化的方法，包括：
(1)提取样本中的DNA；
(2)将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；
(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2扩增MSH2基因片段，获得PCR扩增产物；
(4)对步骤(3)中获得的产物测序；
(5)根据步骤(4)的测序结果，得到序列CG位点的甲基化结果；
其中，PCR扩增反应条件为：第一阶段，92-97℃预变性5-15min；第二阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度62-66℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环12-18次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度53-57℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24-34次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
所述的测序为Sanger测序，测序引物为：
SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。
该方法检测的样本为石蜡切片样本、全血样本、新鲜组织样本或细胞系样本。
更进一步地，本发明提供一种用于检测MSH2基因启动子甲基化的试剂盒的技术方案，包括亚硫酸盐修饰、PCR扩增试剂以及Sanger测序试剂、阳性对照品、阴性对照品，其中：
(1)亚硫酸盐处理试剂包括：Bisulfite Mix、RNase free water、DNA ProtectBuffer；
(2)PCR扩增试剂：10*PCR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq酶、10uM扩增引物(SEQ NO1、SEQ NO 2)以及灭菌水；
(3)酶纯化试剂：EXOI、CIP；
(4)测序试剂：Bigdye Terminator V3.1、无水乙醇、EDTA、及测序引物(SEQ NO 1、SEQ NO 2)。
其中，阳性对照品为经过所有胞嘧啶甲基化修饰的全甲基化正常人群血液基因组DNA，阴性对照品为正常人群血液基因组DNA。
本发明采用Touch-down PCR扩增和Sanger测序法MSH2启动子甲基化检测，针对石蜡切片DNA片段化严重，在造成亚硫酸氢盐处理饱和的情况下，仍出现的有效模板浓度很低的情况，Touch-down PCR扩增可确保正、反向扩增引物与样本DNA模板的结合发生在最互补的序列之间，当退火温度降低到非特异性扩增发生的水平时，特异性扩增产物在此时已经有一个几何数的起始优势，丰度较高，在剩余的扩增反应中，特异性扩增产物与非特异扩增产物产生竞争，但是因非特异性扩增产物丰度较低，特异性扩增产物始终优先扩增，从而产生单一的占主导地位的特异性扩增产物。而Sanger测序法是检测基因甲基化的金标准，检测结果准确性高，并且很大程度上地节省了检测成本。
由于DNA序列在经亚硫酸盐处理后，其部分C碱基会转变为T，导致序列区域内CG含量和TM值发生较大程度的变异，进而影响常规引物设计软件在其序列上获得理想的引物序列。因此，本发明中PCR采用的扩增引物以及测序引物均为自行设计，其中测序引物使用兼并碱基，从而使得阴性、阳性都可在同一体系扩增。同时，扩增引物的使用比例经过多次优化实验，相对于其它文献和软件设计的引物具备了更加理想的扩增效率。
因此，本发明的检测方法具备了检测出率高，检测稳定性好，准确度高以及低污染风险等优势。检测结果将有助于预见相关肿瘤疾病的早期，同时具有潜在的指导临床医生个体化治疗的作用。
附图说明
图1和图2是本发明的检测基因甲基化的方法检测标准序列，图1为阴性标准序列，图2为阳性标准序列。
图3是本发明的检测基因甲基化的实施例中阴性检测的结果图；图4是本发明的检测基因甲基化的实施例中阳性结果的图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法：譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。
实施例1
MSH2基因启动子区CG岛甲基化检测试剂盒包括一对特异性兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，同时，此引物为测序引物，其碱基序列如下所示：
SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’；
MSH2基因启动子区CG岛甲基化检测试剂盒还包括如下试剂：
(1)亚硫酸盐处理试剂：Bisulfite Mix、RNase free water、DNA ProtectBuffer；
(2)PCR扩增试剂：10*PCR Buffer、2mM dNTP、5*Q Solution Buffer、5U/ul Taq酶、10uM扩增引物(SEQ NO1、SEQ NO 2)以及灭菌水；
(3)酶纯化试剂：EXOI，CIP；
(4)测序试剂：Bigdye Terminator V3.1，无水乙醇，EDTA，及测序引物(SEQ NO 1，SEQ NO 2)。
(5)阳性质控品：已确定的MSH2基因启动子区CG岛甲基化的DNA。阴性质控品：已确定的MSH2基因启动子区CG岛无甲基化的DNA。空白对照品：灭菌水。
实施例2
DNA提取试剂和方式。
取石蜡切片(5-10μm厚，1×1cm2大小)5-8张，将石蜡包埋组织收集到1.5mL离心管内，短暂离心；加入1mL组织透明液，充分振荡，13200rpm离心1min，移除上清液；加入0.5mL组织透明液，充分振荡，13200rpm离心1min，移除上清液；加入1mL乙醇(96-100％)，剧烈振荡，13200rpm室温离心2min，移除上清液；打开盖子，室温(15-25℃)或金属浴37℃孵育直到剩余乙醇完全挥发；取180μL Buffer ATL对管内组织进行吹吸重悬，然后加入20μL蛋白酶K，再次振荡；将含有混合液的离心管置于56℃的金属浴上，孵育1h，期间颠倒混匀3次，直至样品完全溶解；将离心管转移至90℃的金属浴上，再次孵育1h；短暂离心，将管盖上的溶液甩至管底；向管内加入200μL Buffer AL，充分振荡混匀。然后加入200μL乙醇(96-100％)，再次振荡混匀；短暂离心，将管盖上的溶液甩至管底；小心将混合液用移液器转移至含有QIAamp MinElute column吸附柱的2mL收集管内，8000rpm离心1min，弃收集管，将吸附柱置于一个新的收集管上；向吸附柱内加入500μL Buffer AW1，务必不要打湿吸附柱管口边缘。8000rpm离心1min，弃收集管，将吸附柱置于一个新的收集管上；向吸附柱内加入500μLBuffer AW2，务必不要打湿吸附柱管口边缘。8000rpm离心1min，弃收集管，将吸附柱置于一个新的收集管上；13200rpm室温离心3min，以彻底甩掉吸附膜上残留的溶液；将吸附柱将吸附柱置于一个干净的1.5mL离心管上(自备)，小心向膜中央滴加50μL Buffer ATE；13200rpm室温离心1min，取收集到的DNA溶液1.5μL用NanoDrop检测所得DNA的浓度和纯度；将剩余的DNA溶液于-20℃保存。
实施例3
亚硫酸盐处理试剂和方法如下。
操作步骤：将实施例2提取的基因组DNA与1.5mlEP管中使用双蒸水稀释至50ul加5.5ul新鲜配制的3MNaOH溶液，42℃水浴30min；水浴期间配制以下溶液：10mM氢醌溶液(Hydryquinone)：取55mg氢醌于50ml水中溶解；3.6mol/LNaHSO3：取18.8g NaHSO3加入40ml水中，并以3MNaOH溶液调节溶液PH至5.0，最终定容至50ml。加30ul 10mM氢醌溶液和520ul3.6mol/LNaHSO3至上述水浴后溶液中，EP管外包裹以铝箔纸避光，轻柔颠倒混匀溶液，管内加100ul石蜡油，短暂离心使石蜡油盖住液面，防止水浴过程中水分的蒸发并限制氧化50℃避光水浴16h；水浴完后将移液器枪头伸入石蜡油层下，先轻轻加压使其中一小段石蜡油排出，然后小心吸取约580ulDNA溶液至洁净的1.5mlEP管中，使用PCR产物回收试剂盒回收DNA，所得到的DNA溶于50ul去离子水，加5.5ul新鲜配制的3MNaOH，室温放置15min，然后加33ul 10M乙酸铵中和NaOH，使溶液PH＝7，也加入4ul 10mg/ml葡萄糖作为沉淀位置指示剂，加入270ul冰无水乙醇，至于-20℃，过夜沉淀后，4℃，12000rpm离心，30min，倒掉上清液，收集沉淀，加入500ul70％乙醇，洗剂沉淀，4℃12000rpm，5min离心两次；倒掉上清，室温干燥至沉淀由不透明变为半透明或透明时，依DNA沉淀多少加入30-50ul双蒸水溶解沉淀。
利用本发明所述的DNA亚硫酸氢钠处理试剂和方法，可以获得更高的DNA回收率，高转化率，同时可以降低DNA降解率和片段化率，从而提高了PCR扩增和后续分析技术的灵敏度。
实施例4
PCR检测方法如下。
PCR引物为：所有引物纯度达到PAGE级或HPLC级，不含杂带。提供合成结构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用引物达到检测要求。MSH2的引物序列如下：
F：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
R：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’；
PCR检测反应体系为：8-10×PCR缓冲液、0.8-1.2mM dNTPs、0.8-1.2uM扩增引物(SEQ NO 1和SEQ NO 2)、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ul DNA聚合酶。
所述dNTPs包括：10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP。
所述PCR缓冲液包括：TRIS.CL、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。
PCR检测的反应条件为：第一阶段，92-97℃预变性5-15min；第二阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度62-66℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环12-18次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度53-57℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24-34次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
电泳检测后将所得PCR产物进行酶纯化，测序反应，上机测序；
所述酶纯化的反应条件为：37℃50min，95℃5min。所述测序反应的反应条件为：95℃4min，95℃15S；50℃20S；60℃2min，25个循环。
依据相关软件获得样本的MSH2启动子甲基化状态。以亚硫酸盐处理后的MSH2启动子序列为标准序列，通过软件分析获得样本的MSH2启动子甲基化状态。
针对石蜡切片DNA片段化严重，而亚硫酸氢盐修饰饱和状态下仍呈现有效模板浓度低的问题，将Touch-down PCR扩增和Sanger测序相结合，可显著提高检测灵敏度。
实施例5
子宫颈癌样本检测：
选择石蜡切片样本10例，3例为已确诊子宫颈癌样本，3例为正常人样本，其余4例为未知样本。利用本发明的试剂盒按照实施例3中的方法进行样本DNA提取、亚硫酸处理、纯化回收、PCR扩增、测序及结果分析。
(1)材料：待测样本、阳性质控品、阴性质控品、空白对照。
(2)仪器：移液器、高速离心机、NANODROP1000、涡旋震荡以、冰箱、电泳仪、凝胶拍照系统，ABI 3500XL Genetic Analyzer，PCR仪。
(3)试剂：DNA聚合酶(凯杰)，DNA纯化试剂(凯杰)，dNTPs(TaTaRa)、纯化水，亚硫酸盐处理试剂(凯杰)，EXOI(NEB)，CIP(NEB)，Bigdye Terminator(NEB).
(4)引物：所有引物纯度达到PAGE级或HPLC级，不含杂带。提供合成结构出具的合成产物的质检证明，如PAGE电泳结果或HPLC分析图谱，证明使用引物达到检测要求。MSH2的引物序列如下：
F：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
R：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’；
(5)PCR检测，反应体系为：8-10X PCR缓冲液、0.8-1.2mM dNTPs、0.8-1.2uM如权利要求3所述的扩增引物、0.5-2ng模板DNA，0.05-0.1U/ul DNA聚合酶。
(6)所述dNTPs中包括10mM dATP、10mM dCTP、10mM dTTP、10mM dGTP，所述PCR缓冲液包含TRIS.CL、氯化钾、硫酸镁和氯化镁。
(7)所述PCR检测的反应条件为：第一阶段，92-97℃预变性5-15min；第二阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度62-66℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环12-18次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度53-57℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24-34次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
(8)电泳检测后将所得PCR产物进行酶纯化，测序反应，上机测序；
(9)所述酶纯化的反应条件为：37℃50min，95℃5min。所述测序反应的反应条件为：95℃4min，95℃15S；50℃20S；60℃2min，25个循环。
(10)依据相关软件获得样本的MSH2启动子甲基化状态。以亚硫酸盐处理后的MSH2启动子序列为标准序列，通过软件分析获得样本的MSH2启动子甲基化状态。
10例样本的MSH2基因启动子甲基化状态结果如下表所示：
样本编号 检测到甲基化的CG数 检测结果
S1(子宫颈癌) 0个 阴性
S2(子宫颈癌) 12个 阳性
S3(子宫颈癌) 0个 阴性
S4(正常人) 0个 阴性
S5(正常人) 0个 阴性
S6(正常人) 0个 阴性
S7(子宫颈癌未确诊) 12个 阳性
S8(子宫颈癌未确诊) 0个 阴性
S9(子宫颈癌未确诊) 0个 阴性
S10(子宫颈癌未确诊) 0个 阴性
检测样本的MSH2基因启动子甲基化状态结果如图3和图4所示，图3为S1样本检测结果，结果为阴性(箭头指CG位点)。图4为S2样本检测结果，结果为阳性(箭头指CG位点)。
SEQUENCE LISTING
<110> 南昌艾迪康医学检验所有限公司
<120> MSH2基因启动子甲基化检测的引物和检测方法
<130>
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggaagttga ttgggtgtgg ty 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
rctctccaac tacaacrtct ccttc 25
<210> 3
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggaagttga ttgggtgtgg ttgttgtggt tggatgttgt ttgggggatg tgggagggga 60
ggtgggaaat agtttagtgg gtgtggggtt gtgtattttt tttaattagg aggtgaggag 120
gttttgatat ggtggtgtag ttgaaggaga tgttgtagtt ggagagt 167
<210> 4
<211> 167
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tggaagttga ttgggtgtgg tcgtcgtggt cggacgtcgt tcgggggacg tgggagggga 60
ggcgggaaat agtttagtgg gtgtggggtc gcgtattttt tttaattagg aggtgaggag 120
gtttcgatat ggcggtgtag tcgaaggaga cgttgtagtt ggagagc 167

Claims (6)

1.用于检测MSH2基因启动子甲基化的引物，其特征在于，包括一对特异性扩增兼并引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其序列为：
SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，扩增引物同为测序引物，所述测序引物的序列为：
SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。
3.一种用于检测MSH2基因启动子甲基化的方法，包括：
(1)提取样本中的DNA；
(2)将步骤(1)中提取的DNA进行亚硫酸氢盐处理；
(3)以步骤(2)中的DNA作为模板，使用SEQ NO1和SEQ NO 2扩增MSH2基因片段，获得PCR扩增产物；
(4)对步骤(3)中获得的产物测序；
(5)根据步骤(4)的测序结果，得到序列CG位点的甲基化结果；
其所述引物序列为：
SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，PCR扩增反应条件为：第一阶段，92-97℃预变性5-15min；第二阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度62-66℃90sec，延伸温度72℃30sec，循环12-18次，每循环一次，所述退火温度降低0.5℃；第三阶段，变性温度92-97℃30sec，退火温度53-57℃30sec，延伸温度72℃30sec，循环24-34次；第四阶段，72℃10min；第五阶段，扩增反应结束，扩增产物在4℃下保存。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的测序为Sanger测序，测序引物为：
SEQ NO 1：5’-TGGAAGTTGATTGGGTGTGGTY-3’；
SEQ NO 2：5’-RCTCTCCAACTACAACRTCTCCTTC-3’。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述样本为石蜡切片样本、全血样本、新鲜组织样本或细胞系样本。
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