CN106520769A

CN106520769A - Isknv基因内含子及其在区分isknv活病毒与灭活病毒中的应用

Info

Publication number: CN106520769A
Application number: CN201611036973.6A
Authority: CN
Inventors: 付小哲; 李宁求; 张醴溪; 林强; 梁红茹; 刘礼辉; 黄志斌
Original assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Pearl River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2016-11-23
Filing date: 2016-11-23
Publication date: 2017-03-22
Anticipated expiration: 2036-11-23
Also published as: CN106520769B

Abstract

本发明公开了ISKNV基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用，属于病毒检测领域。所述内含子定位于传染性脾肾坏死病毒基因组NC_003494.1的ORF003L上，长度为80bp，记名为IN‑3。本发明首次公开了ISKNV的一个内含子，记名为内含子IN‑3。可以利用内含子IN‑3转录被剪切的特点，作为病毒是否灭活完全的指标，建立ISKNV灭活快速检测巢氏RT‑PCR方法，可以缩短ISKNV细胞灭活疫苗生产过程中灭活检验周期，提高疫苗生产效率。

Description

ISKNV基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用

技术领域

本发明属于病毒检测领域，具体涉及ISKNV ORF003L基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用。

背景技术

鳜(Sinipercachuatsi)是我国优质淡水鱼消费和出口创汇的重要品种，因其味道鲜美，蛋白质含量高而深受广大消费者的喜爱。然而严重的病害问题已成为限制鳜养殖业发展的主要瓶颈，自1997年以来，鳜暴发性传染病对鳜养殖业带来巨大的经济损失。吴淑勤等人首次确认了一种截面呈六角形，直径约150nm的大型球状病毒颗粒为鳜暴发性传染病的主要病原。由于该病毒主要感染鳜的脾脏和肾脏，何建国等人将其命名为传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleenandkidneynecrosis virus,ISKNV)，隶属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属，其全基因组测序已完成。由于传染性脾肾坏死病毒病发病率高、致病率高、造成经济损失大，其防控技术研究现已成为鱼病研究者重要课题之一。

疫苗接种是预防鱼类病毒病最经济有效的手段，针对鳜鱼传染性脾肾坏死病毒，已有细胞灭活疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗的报道。而细胞灭活疫苗因具有制备简便、免疫效果稳定、研发周期短等优势而成为最具产业前景的疫苗之一。DONG等人报道了以MFF细胞系为扩增体系的ISKNV细胞培养灭活疫苗，其免疫保护率达到95％；FU等人建立了对ISKNV高敏感度的CPB细胞系，为ISKNV疫苗的制备提供了新的扩增体系；付小哲等人建立了检测ISKNV滴度的荧光定量PCR方法，为疫苗制备中病毒的定量提供了方便；罗霞等人优化了ISKNV同步接种培养条件，为细胞灭活疫苗规模化制备打下基础。病毒灭活检验是ISKNV细胞灭活疫苗制备中重要的一环，但传统病毒灭活检测方法是通过细胞盲传3代、同时通过接种鱼体验证病毒是否灭活完全，整个过程约需30天的时间，这大大延长了疫苗生产周期，降低了疫苗的生产效率，因此急需建立一种ISKNV灭活快速检验方法。

病毒在细胞增殖过程中其相关基因持续转录，因此可通过对病毒mRNA进行监测而检验病毒是否灭活。刘令九等人采用细胞培养/链特异性RT-PCR方法建立了甲型肝炎(HepatitisA)灭活疫苗灭活验证方法；余芬等人采用链特异性RT-PCR建立了一种脊髓灰质炎病毒(poliovirus)灭活快速验证方法；Kim等人以黄瓜绿斑花叶病毒(Cucumbergreenmottle mosaicvirus,CGMMV)基因组热敏感区为靶标建立了该病的热灭活RT-PCR快速检测方法；但是在RT-PCR反应中存在一个主要的问题就是无法区分产物的扩增是来源于转录本mRNA还是残留基因组DNA，Nelson等人报道了一种去除病毒基因组DNA残留的RNA作为模板进行RT-PCR检测的方法，但要将总RNA中残留基因组DNA完全去除是很难达到的，且会造成RNA本身的损耗，降低检测的灵敏度。另外一种有效的方法是将包含内含子的病毒基因作为靶标设计特异性引物，通过PCR扩增片段大小来区分扩增产物模板来自基因组DNA还是mRNA。Chul Hyun Joo等人以含内含子的巨细胞病毒糖蛋白B为靶标建立了一种区别活的巨细胞病毒与灭活病毒的RT-PCR方法，并应用于巨细胞病毒活性感染的诊断。Yuasa等人设计了一对跨两个外显子的引物通过RT-PCR监测锦鲤疱疹病毒(koiherpesvirus，KHV)mRNA来检测复制中的病毒。

目前ISKNV的基因组已经公布(NC_003494.1)，基因组全长111362bp，含有124个ORF，但是尚未有任何文章报道过发现其含有内含子。因此没有针对内含子的病毒基因为靶标通过RT-PCR方法区分ISKNV活病毒与灭活病毒方法及试剂盒的相关报道。

本发明从ISKNV感染CPB细胞系转录谱结果中筛选，首次发现ISKNV的一个内含子，位于ISKNV的基因组的ORF003L上，记名为内含子IN-3。根据只有活病毒可以转录，且转录后内含子被剪切的特点，利用内含子IN-3作为病毒是否灭活完全的指标，建立ISKNV灭活快速检测巢氏RT-PCR方法，旨在缩短ISKNV细胞灭活疫苗生产过程中灭活检验周期，提高疫苗生产效率。

发明内容

本发明公开了ISKNV ORF003L基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

一种传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因内含子，其定位于传染性脾肾坏死病毒基因组NC_003494.1的ORF003L上，长度为80bp，记名为IN-3。

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的基因组登录号为NC_003494.1，基因组全长111362bp，含有124个ORF。发明人在上述124个ORF进行分析和研究，并根据本实验室已有的ISKNV感染CPB细胞转录谱结果，与基因组序列比对后筛选出的4个Unigene，即ORF001L、ORF002L、ORF003L和ORF006L，实验结果表明，仅在ORF003L存在一个内含子，其余几个ORF序列上均无内含子存在。

优选的，传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因的内含子IN-3的序列如下所示：GAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCT(SEQ ID NO：1)。

优选的，传染性脾肾坏死病毒基因组中ORF003L的序列为：ATGTCCTGGAGTCGCACAAAGGCCTTGTTGAGTAGCTCTACACGAGCCTCGTCGCACGGGGCGTCTGCTCGTATGGGTCCGCTGGATCGGCGTAGGACGTCGTGTGTAGCCACGGTATACAGCACAATGCAATTGTGCTCCGTCACACAGCTCTTGAGGTGGCTTATGCTGGTCGTGTTCAGGCGCTCCTGCGCAAAGTCAAACAGCTGTAGTTGCCCTGGTATGCGCCACTCGTTAACAGCCACCTGCTGGACCAGGCTGCAGTCAAACCCTCTAGCAGACACAAGACTACTGAGGTTCATAGCTGTCTACAACACAGACACTGCACCACAAGTCGAGATATTCAAAACACACACACATACAGACTTAAATCACTCTTTATTGTGTGATCATAGAGGCATATTTGACACTAACAGCACATGTGGGTTGCAGGGACCTACACAATATCATGAACACCTTAGACACTTTGTTGCCTTGCCTGCACGCATTGTCTATAAGTTTGCGTGCCCAATTGCGTATGTTTGTATCACATTTGATCGCCACCATCATGTCAGGCATGAGCATGCGCACATCCACCAGGCCATCCATCAACAGCATCAGGGTATGCCGGTCGGCAAACTCCGTCAAGAACGACATGCGAAGTGCCCGTAGCACACTTTCGTAGTCTGAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCTTCGGTGGGAAACAGGTTCTCCCTCTTGAGTATGTGGTTTCTGGTACGGACAACCACTGTATTCGCCAAGACAACGTTGGTGTCCAGACGAATGTCACACTCCACACCAGGCACACTGTACACCACATTGTCTACATGCAGGGATAATGTATCCTCCTGGCTACATGAGAATGGGGTGCCGCAGTGGATGGTGCTATCAGGCACCGGCATGTCGCATGCAACGATACGTGCCATCACTGCAAGACTCTCGTGTGTAATGATAAGGCGCATTGCCCGCGTGACGGTCAGTGGATCCTCTGTCTTGCACACCCACACCAAGCCGCTCAGGCTGTTAGCCTCAGACGGGGTCACCGTGACATAGCCCGTGTGCTGTGTATCGGGGGTGTACACCCGCGTTACTACACCGTTGTGGTGGCCCAAGCTCGTCATCACATCTGGAAAAACAAACACACACGAGTCTGTGAATACAGGTGAACCCCACACCACATCATGCAT(SEQ IDNO：2)。

上述任一项所述的内含子在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用。

优选的，提取待测样品病毒总RNA，反转录得到cDNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；由于内含子在转录过程中会被剪切掉，所以如果扩增产物不含有内含子，则判定待测样品中含有ISKNV活病毒。

一种灭活传染性脾肾坏死病毒的检测方法，包括下列步骤：提取待测传染性脾肾坏死病毒样品的总RNA，反转录得到cDNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；如果待测样品扩增产物不含内含子，则判定待测样品中含有ISKNV活病毒；所述内含子如上任一项所述。

优选的，PCR为巢氏PCR扩增反应时，所用的引物其核苷酸序列如下所示：

引物F3：5'-ACCTTAGACACTTTGTTGCCTTGCCTGC-3'(SEQ ID NO：5)；

引物R3：5'-GATACACAGCACACGGGCTATGTCACGG-3'(SEQ ID NO：6)；

引物F3’：5'-CCCGTAGCACACTTTCGTAG-3'(SEQ ID NO：7)；

引物R3’：5'-ACTGCGGCACCCCATTC-3'(SEQ ID NO：8)。

由于ISKNV为DNA病毒，提取ISKNV病毒总RNA得到的是转录本mRNA，提取总RNA时为了防止干扰，通常会有去除基因组DNA的步骤，RNA进一步反转录得到cDNA。由于活病毒才含有mRNA，而且内含子已被剪切掉，所以在干扰基因组DNA的浓度足够低的情况下，可以忽略基因组DNA的干扰。利用上述巢氏PCR引物(SEQ ID NO：5-8)进行检测，根据扩增产物条带大小，判断是否含有内含子，如果待测样品扩增产物不含内含子，则判定待测样品中含有ISKNV活病毒。如果存在基因组DNA的干扰，也可以根据巢氏PCR的扩增产物进行判断。

用于PCR扩增上述所述的传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因内含子的引物对。

优选的，引物对的序列如下所示：

引物F：5'-ACACTTTGTTGCCTTGC-3'(SEQ ID NO：3)；

引物R：5'-AGAACCTGTTTCCCACC-3'(SEQ ID NO：4)。

上述引物可以扩增内含子In-3的全长序列，可以进一步作为研究等利用。

优选的，PCR为巢氏PCR时，引物对的序列如下所示：

引物F3：5'-ACCTTAGACACTTTGTTGCCTTGCCTGC-3'(SEQ ID NO：5)；

引物R3：5'-GATACACAGCACACGGGCTATGTCACGG-3'(SEQ ID NO：6)；

引物F3’：5'-CCCGTAGCACACTTTCGTAG-3'(SEQ ID NO：7)；

引物R3’：5'-ACTGCGGCACCCCATTC-3'(SEQ ID NO：8)。

本发明的有益效果是：

本发明首次公开了ISKNV的一个内含子，记名为内含子IN-3。可以利用内含子IN-3转录被剪切的特点，作为病毒是否灭活完全的指标，建立ISKNV灭活快速检测巢氏RT-PCR方法，可以缩短ISKNV细胞灭活疫苗生产过程中灭活检验周期，提高疫苗生产效率。

本发明建立的基于ISKNV mRNA检测的病毒灭活快速检验方法快速、准确、可靠。

本发明建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法和鱼体安全试验具有更高的灵敏度。

本发明巢氏PCR比验证时用的普通PCR灵敏度更高，特异性更好。

附图说明

图1为ISKNV基因内含子IN-3验证的PCR扩增结果；

图2为跨ORF003L基因内含子设计巢氏PCR引物示意图；

图3为巢氏PCR扩增结果；

图4为敏感性实验的PCR扩增结果；

图5为不同引物浓度的F3/R3PCR扩增结果；

图6为F3/R3引物不同退火温度PCR扩增结果；

图7为不同引物浓度的F3’/R3’PCR扩增结果；

图8为F3’/R3’引物不同退火温度PCR扩增结果。

具体实施方式

所用材料和方法

1.1细胞系与病毒株

鳜脑组织细胞系(Chinese perch brain cell line,CPB)由本实验室建立并保藏；鳜传染性脾肾坏死病毒QY株(ISKNV-QY)由本实验室分离保存。

1.2主要试剂

TRIzol Reagent，III First-Strand Synthesis System for RT-PCR反转录试剂盒均购自Invitrogen公司；Direct-zol RNA Miniprep(200preps.)购自ZYMORESEARCH公司；2×Taq PCR StarMix with Loading Dye购自Genstar公司；细胞培养瓶、胰酶、胎牛血清等均购自Gibico公司。

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。

实施例1内含子IN-3的筛选和验证

一、内含子IN-3的筛选和引物设计

根据本实验室已有的ISKNV感染CPB细胞转录谱结果，与ISKNV(NC_003494.1)的基因组序列进行对比，筛选出Unigene0020179(即ORF003L)中位于668bp～748bp的位置，含有大小为80bp的内含子，记名为内含子IN-3，见表1。

表1内含子所在基因组序列信息

应用Primer 5.0软件设计特异性引物，引物信息以及预计DNA片段和cDNA片段大小如表2所示。

表2跨内含子设计的PCR引物列表

二、内含子验证

1、RNA提取和DNA阳性模板的制备

将ISKNV病毒原液稀释10×，100×后接种CPB细胞孵育72h后提取总RNA，每个T25cm²细胞培养瓶可收获大约2～3×10⁶个细胞数，按照每cm²加入100ul TRI 的标准，每个T25cm²细胞培养瓶加入2.5mLTRI 12000×g离心1min(如有必要可延时)去除细胞裂解后的细胞碎片，将上清全部转移至无RNA酶的离心管中，按照1:1的比例向上一步所获上清液中加入95％～100％的酒精，涡旋混合后将混合液转移至Zymo-SpinTM IIC Column2放入收集管中，12000×g离心30s，使用ZYMO RESEARCH公司的Direct-zol RNAMiniprep试剂盒按照试剂盒说明书提取细胞总RNA，提取过程中用DNase I和DNADigestion Buffer配制成DNase I Reaction Mix去除基因组DNA，提取完成后用酶标仪测量RNA质量和浓度。

用蛋白酶K消化法提取ISKNV基因组DNA：添加蛋白酶K在病毒液中的终浓度为160ug/ml，56℃水浴2h，95℃灭活5min，8000rpm离心5min，取上清作为PCR扩增的模板。

2、cDNA模板的制备

使用III First-Strand Synthesis System for RT-PCR反转录试剂盒从总RNA中合成高质量的第一链cDNA，第一步反应先配置10μl体系RNA/primer mixture：5μl模板，1μl 2μM gene-specific primer(GSP)，1μl 10mM dNTP mix，3μl DEPC-treatedwater，反应条件：65℃孵育5min，置于冰上1min；第二步反应配置20μl cDNA SynthesisMix：2μl 10×RT buffer，4μl 25mM MgCl₂，2μl 0.1M DTT，1μl RNaseOUT(40U/ul)，1μlIII RT(200U/ul)，第一步反应液10ul；反应条件：50℃50min，85℃5min终止反应后置于冰上，添加1μl RNase H置于37℃反应20min，将产物置于-30℃～-10℃保存。

3、普通PCR的反应体系和程序

25μl反应体系为：12.5μL 2×Taq PCR StarMix、上、下游引物(10uM)各0.5μL、1μLcDNA模板，10.5μL ddH₂O；反应条件：94℃2min；94℃30s；54℃退火30s；72℃30s，72℃5min，产物经2％琼脂糖电泳检测。

因为细胞中有基因组DNA的残留，如果基因组有内含子的存在，理论上从制备的cDNA中理应扩增出两条不同的条带，一条带应与DNA阳性模板大小相同。结果见图1。

图1为基因内含子IN-3验证的PCR扩增结果。从感染了稀释度为10×和100×的ISKNV病毒悬液的细胞中提取总RNA，反转录得到cDNA模板。M1:2000marker，ISKNV稀释度为10×；1为cDNA的扩增结果，2为阳性DNA的扩增结果；M2：2000marker，ISKNV稀释为100×；3为cDNA的扩增结果，4为阳性DNA的扩增结果。

从电泳结果可知(图1)，针对ORF003L基因设计的引物能从制备的cDNA模板中扩增出两条带来，一条大小为225bp，一条为149bp，经测序条带正确。

实施例2巢氏PCR扩增

根据ISKNV的ORF003L基因含有一个位于668bp～748bp的位置，大小为80bp的内含子IN-3。如图2所示，DNA发生转录生成成熟的mRNA后内含子将被剪切，分别在外显子a和外显子b上设计巢氏引物(表3)，进行PCR扩增。

表3用于巢氏PCR扩增的IN-3基因引物

第一轮扩增使用25μl反应体系为：12.5μL 2×Taq PCR StarMix、浓度为10μM的引物F3、R3各1μL、1μLDNA或cDNA模板，9.5μL ddH₂O；反应条件：94℃5min，94℃45s，68℃45s，72℃90s，30个循环，72℃10min，产物经2％琼脂糖电泳检测。

第二轮扩增使用25μl反应体系为：12.5μL 2×Taq PCR StarMix、浓度为10μM的引物F3’、R3’各0.5μL、1μL DNA或cDNA模板，10.5μL ddH₂O；反应条件：94℃2min，94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环，72℃5min，产物经2％琼脂糖电泳检测。结果如图3所示。

图3中显示：第一步PCR反应扩增以IN-3DNA为模板得到的片段长为670bp，相应的cDNA上的片段长为590bp的片段；第二轮扩增以IN-3DNA为模板得到的片段长为289bp，相应的cDNA为209bp的片段。

实施例3巢氏PCR方法敏感性试验

将ISKNV梯度稀释成10⁰、10¹、10²、10³拷贝/mL，取1mL病毒液接种T25细胞培养瓶，分别于接种后7天、9天和11天收集细胞，按照上述方法制备cDNA模板，采用建立的巢氏RT-PCR方法进行检测，确定该方法检测ISKNV mRNA的灵敏度和最低检测期限，同时设置未接种病毒的细胞作为阴性对照。结果见图4。

图4中，M1.DNAMarker DL2000，所用引物为F3、R3，1.DNA阳性模板，2.cDNA阳性模板，3.阴性对照，4.细胞接种10⁰～10³个病毒拷贝数孵育7天获得的cDNA样品；

M2.DNAMarker DL2000所用引物为F3、R3，1.DNA阳性模板，2.cDNA阳性模板，3.阴性对照，4.细胞接种10⁰～10³个病毒拷贝数孵育9天获得的cDNA样品；

M3.DNAMarker DL2000，所用引物为F3、R3，1.DNA阳性模板，2.cDNA阳性模板，3.阴性对照，4.细胞接种10⁰～10³个病毒拷贝数孵育11天获得的cDNA样品；

M4.DNAMarker DL2000，所用引物为F3’、R3’，1.DNA阳性模板，2.cDNA阳性模板，3.阴性对照，4.细胞接种10⁰～10³个病毒拷贝数孵育7天获得的cDNA样品。

结果如图4所示，所有样品经过RT-PCR反应均可检测到目标基因的表达，并且随着接种拷贝数的增加，从1拷贝～1000拷贝表达量呈递增趋势，随着接种天数的增加表达量递增。细胞接种1拷贝病毒7天可在第二轮PCR扩增中扩增出cDNA片段(M4)，接种9天在第一轮便可检测到cDNA片段(M2)，因此我们可以选择接种7天作为最低检测天数。

实施例4巢氏PCR引物浓度和退火温度的优化

对实施例3巢氏PCR进行条件优化。

其他条件同实施例3，第一轮扩增分别用浓度为0.1umol/L、0.2umol/L、0.4umol/L的引物对F3/R3扩增DNA阳性模板、cDNA阳性模板、阴性模板和感染1个拷贝ISKNV的细胞cDNA模板，结果如图5所示。

图5中，M1.DNA Marker DL2000，引物浓度为0.1umol/L，1.DNA阳性模板，2.cDNA阳性模板，3.阴性对照，4.感染1个拷贝ISKNV的细胞cDNA样品；M2.DNA Marker DL2000，引物浓度为0.2umol/L，1.DNA阳性模板，2.cDNA阳性模板，3.阴性对照，4.感染1个拷贝ISKNV的细胞cDNA样品；M3.DNA Marker DL2000，引物浓度为0.4umol/L，1.DNA阳性模板，2.cDNA阳性模板，3.阴性对照，4.感染1个拷贝ISKNV的细胞cDNA样品。结果显示，在相同的模板浓度下，0.2umol/L引物浓度比0.1umol/L引物浓度要扩增出较亮的条带，且与0.4umol/L引物浓度扩增产物无明显差异。

其他条件同实施例3，设置退火温度分别为62℃，64℃，66℃，68℃；结果见图6。图6中，M1.DNA Marker DL2000，采用DNA模板，1～4依次表示退火温度为：62℃、64℃、66℃、68℃；M2.DNAMarker DL2000，采用cDNA模板，1～4依次表示退火温度为：62℃、64℃、66℃、68℃；M3.DNAMarker DL2000，阴性对照，1～4依次表示退火温度为：62℃、64℃、66℃、68℃。如图6所示，当F3/R3引物退火温度为66℃时扩增条件较亮，且非特异性扩增较少。

其他条件同实施例3，第二轮扩增分别用0.4umol/L、0.2umol/L、0.1umol/LF3’/R3’引物浓度分别扩增DNA和cDNA，如图7所示。图7中，M1/M2：DNA Marker DL2000，1,2,3:cDNA样品，4,5,6：DNA样品，引物浓度分别为:0.4umol/L,0.2umol/L,0.1umol/L；M1图中采用ISKNV稀释10×倍接种细胞72h后的样品为模板，M2图中采用ISKNV稀释100×接种细胞后的样品为模板。图7显示，引物浓度为0.2umol/L时，扩增条带较亮且非特异性扩增较少。

其他条件同实施例3，第二轮扩增时，设置退火温度分别为55℃，58℃，61℃，64℃。结果见图8。图8中，M1.DNA Marker DL2000，采用DNA模板，1～4依次表示退火温度为：55℃、58℃、61℃、64℃；M2.DNAMarker DL2000，采用cDNA模板，1～4依次表示退火温度为：55℃、58℃、61℃、64℃；M3.DNAMarker DL2000，阴性对照，1～4依次表示退火温度为：55℃、58℃、61℃、64℃。如图8所示，当F3’/R3’引物退火温度为55℃时扩增条带较亮且非特异性扩增较少。

综合优化条件，建立巢氏PCR反应条件如下：

第一轮反应体系为：

第一轮反应条件：94℃预变性5min，94℃变性45s，66℃退火45s，30个循环，72℃延伸90s，72℃终延伸10min，产物经2％琼脂糖电泳检测。

第二轮反应体系为：

第二轮反应条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，30个循环，72℃延伸45s，72℃终延伸5min，产物经2％琼脂糖电泳检测。

实施例5应用实验

采用3个浓度梯度(0.05％、0.1％、0.2％)的甲醛在30℃条件下灭活ISKNV 24h，48h，72h后制备模拟样品以及从实验室制备3批次ISKNV细胞灭活疫苗样品，对本发明建立的ISKNV灭活快速检验方法进行验证。

将以上样品分别接种CPB细胞后9天，按照本发明方法制备模板进行巢氏RT-PCR反应检测病毒mRNA，同时进行细胞盲传检测和鱼体安全试验。细胞盲传法参考OIE方法：接种细胞10天盲传一代，第二代开始接种7天后盲传，盲传三代观察是否产生CPE；鱼体安全试验：每批次样品腹腔注射鳜鱼(体重约50g)30尾(3个平行，每个10尾)，每尾0.2mL，同时设置佐剂组和PBS组作为对照；试验期间水温25-28℃，持续观察21天，记录鱼体的活动和摄食情况。结果见表4。

表4巢氏RT-PCR检测病毒mRNA方法与细胞盲传法、鱼体安全试验法对3批次ISKNV细胞灭活疫苗灭活检验结果的比较

表4结果显示：将3个浓度梯度(0.05％、0.1％、0.2％)的甲醛在30℃条件下灭活ISKNV24h、48h、72h后制备的模拟样品分别接种CPB细胞7天，9天，11天，经上述病毒经过灭活快速检验方法检测，0.2％甲醛灭活ISKNV 72h后的模拟样品经过PCR扩增只有一条DNA条带，检测不到cDNA，说明ISKNV在此条件下被完全灭活，而其他的模拟样品接种CPB细胞可检测到两条带，表明此样品未灭活完全。但0.1％终浓度甲醛灭活72h接种细胞盲传三代未出现CPE，鱼体安全试验显示接种鱼体后无临床发病症状和试验鱼死亡，表明本发明建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法和鱼体安全试验具有更高的灵敏度。以上结果表明，本发明建立的基于ISKNV mRNA检测的病毒灭活快速检验方法是可靠的。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国水产科学研究院珠江水产研究所

<120> ISKNV基因内含子及其在区分ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 80

<212> DNA

<213> Infectious spleen and kidney necrosis virus

<400> 1

gaaaaggcag agcacatcac atattgtaaa ggccattatt attgttaata ataataacac 60

acattactgt acacatacct 80

<210> 2

<211> 1241

<212> DNA

<213> Infectious spleen and kidney necrosis virus

<400> 2

atgtcctgga gtcgcacaaa ggccttgttg agtagctcta cacgagcctc gtcgcacggg 60

gcgtctgctc gtatgggtcc gctggatcgg cgtaggacgt cgtgtgtagc cacggtatac 120

agcacaatgc aattgtgctc cgtcacacag ctcttgaggt ggcttatgct ggtcgtgttc 180

aggcgctcct gcgcaaagtc aaacagctgt agttgccctg gtatgcgcca ctcgttaaca 240

gccacctgct ggaccaggct gcagtcaaac cctctagcag acacaagact actgaggttc 300

atagctgtct acaacacaga cactgcacca caagtcgaga tattcaaaac acacacacat 360

acagacttaa atcactcttt attgtgtgat catagaggca tatttgacac taacagcaca 420

tgtgggttgc agggacctac acaatatcat gaacacctta gacactttgt tgccttgcct 480

gcacgcattg tctataagtt tgcgtgccca attgcgtatg tttgtatcac atttgatcgc 540

caccatcatg tcaggcatga gcatgcgcac atccaccagg ccatccatca acagcatcag 600

ggtatgccgg tcggcaaact ccgtcaagaa cgacatgcga agtgcccgta gcacactttc 660

gtagtctgaa aaggcagagc acatcacata ttgtaaaggc cattattatt gttaataata 720

ataacacaca ttactgtaca cataccttcg gtgggaaaca ggttctccct cttgagtatg 780

tggtttctgg tacggacaac cactgtattc gccaagacaa cgttggtgtc cagacgaatg 840

tcacactcca caccaggcac actgtacacc acattgtcta catgcaggga taatgtatcc 900

tcctggctac atgagaatgg ggtgccgcag tggatggtgc tatcaggcac cggcatgtcg 960

catgcaacga tacgtgccat cactgcaaga ctctcgtgtg taatgataag gcgcattgcc 1020

cgcgtgacgg tcagtggatc ctctgtcttg cacacccaca ccaagccgct caggctgtta 1080

gcctcagacg gggtcaccgt gacatagccc gtgtgctgtg tatcgggggt gtacacccgc 1140

gttactacac cgttgtggtg gcccaagctc gtcatcacat ctggaaaaac aaacacacac 1200

gagtctgtga atacaggtga accccacacc acatcatgca t 1241

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

acactttgtt gccttgc 17

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

agaacctgtt tcccacc 17

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

accttagaca ctttgttgcc ttgcctgc 28

<210> 6

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gatacacagc acacgggcta tgtcacgg 28

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cccgtagcac actttcgtag 20

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

actgcggcac cccattc 17

Claims

1.一种传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因内含子，其定位于传染性脾肾坏死病毒基因组NC_003494.1的ORF003L上，长度为80bp，记名为IN-3。

2.根据权利要求1所述的内含子，其特征在于：传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因的内含子IN-3的序列如下所示：GAAAAGGCAGAGCACATCACATATTGTAAAGGCCATTATTATTGTTAATAATAATAACACACATTACTGTACACATACCT。

3.权利要求1-2任一项所述的内含子在区分传染性脾肾坏死病毒ISKNV活病毒与灭活病毒中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：提取待测样品病毒总RNA，反转录得到cDNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；如果扩增产物不含有内含子，则判定待测样品中含有ISKNV活病毒。

5.一种灭活传染性脾肾坏死病毒的检测方法，其特征在于，包括下列步骤：提取待测传染性脾肾坏死病毒样品的总RNA，反转录得到cDNA，进行PCR扩增反应，获得扩增产物；如果扩增产物不含有内含子，则判定待测样品中含有ISKNV活病毒；所述内含子如权利要求1-2任一项所述。

6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：PCR为巢氏PCR扩增反应时，所用的引物其核苷酸序列如下所示：

引物F3：5'-ACCTTAGACACTTTGTTGCCTTGCCTGC-3'；

引物R3：5'-GATACACAGCACACGGGCTATGTCACGG-3'；

引物F3’：5'-CCCGTAGCACACTTTCGTAG-3'；

引物R3’：5'-ACTGCGGCACCCCATTC-3'。

7.用于 PCR 扩增权利要求 1 或 2 所述的传染性脾肾坏死病毒ORF003L基因内含子的引物对。

8.根据权利要求7所述的引物对，其特征在于，引物对的序列如下所示：

引物F：5'-ACACTTTGTTGCCTTGC-3'；

引物R：5'-AGAACCTGTTTCCCACC-3'。

9.根据权利要求7所述的引物对，其特征在于，PCR为巢氏PCR时，引物对的序列如下所示：

引物F3：5'-ACCTTAGACACTTTGTTGCCTTGCCTGC-3'；

引物R3：5'-GATACACAGCACACGGGCTATGTCACGG-3'；

引物F3’：5'-CCCGTAGCACACTTTCGTAG-3'；

引物R3’：5'-ACTGCGGCACCCCATTC-3'。