CN106520736A - 一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法，包括：向收集好的白眉蛇毒血凝酶浓缩液中加入CaCl2溶液，以每1分钟0.5℃以下的速率降温到10℃，在10℃下保存15‑25分钟后，再将温度升到室温；加入甘氨酸溶液，在3.5—4.5℃环境中长久保存。本发明提供的保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法能够减少酶的失活，降低成本，同时提高药品的安全性。

Description

一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法
技术领域
本发明涉及一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法。
背景技术
白眉蛇毒血凝酶是从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取纯化得到的一种具有凝血活性的酶，由类凝血酶和类凝血激酶组成。本品能够通过水解纤维蛋白原而促进血液凝固，临床上主要用于治疗各种出血和出血性疾病。本品主要是通过凝胶层析从蛇毒中提取分离得到的，分离得到的活性酶是以浓缩液的形式保存的，经过后期的稀释、配液、冻干制成制剂。在实际的生产过程中发现，浓缩液中的酶很容易变性失活，为了保持活性，就将浓缩液经过冷冻保存。冷冻虽然能在很大程度上减轻酶失活，但仍然会有10％—15％的活性丢失。经过大量深入的研究发现，酶失活的原因主要包括两点：1、白眉蛇毒血凝酶主要是靠三级结构维持其活性的，但是在温度循环变化过程中其三级结构变化，其中有疏水集团暴露，疏水力作用会使疏水集团聚合，进而改变酶的结构而失活。2、层析分离过程中用到Tris-HCl缓冲液，分段收集的浓缩液中溶液就是Tris-HCl缓冲液，该缓冲系pH值随着温度变化而变化，pH值变化会引起酶失活。酶的活性降低会带来很多问题，一方面比活降低，成本上升，另一方面变性失活的蛋白质会引入新的免疫原性，诱发过敏反应。
发明内容
本发明的目的是提供一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法。
本发明所提供的保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法包括下述步骤：
1)向收集好的白眉蛇毒血凝酶浓缩液中加入CaCl2溶液，得到含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液；
2)将所述含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液降温到10℃，在10℃下保存15—25分钟后，再将温度升到室温；
3)向步骤2)得到的体系中加入甘氨酸溶液，得到含甘氨酸的体系，将所述体系在3.5—4.5℃环境中长久保存。
上述方法步骤1)中，所述白眉蛇毒血凝酶是按照专利201410821963.8公开的方法从长白山白眉蝮蛇蛇毒中提取的，能够达到药用标准并可以用于治疗临床出血的蛋白类药物，包括类凝血酶和类凝血激酶。
所述加入的CaCl2溶液的浓度为2.8-3.2mol/L，具体可为3.0mol/L。
所述含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液中，CaCl2的终浓度是0.06—0.08mol/L，具体可为0.06mol/L、0.07mol/L或0.08mol/L。
步骤2)中，所述降温的速度保持在每1分钟0.5℃以下，具体可为0.3-0.5℃/min、0.3℃/min、0.4℃/min或0.5℃/min。
步骤3)中，所述加入的甘氨酸溶液的质量百分比浓度为18-22％，具体可为20％。
所述含甘氨酸的体系中，甘氨酸的终浓度(质量百分比浓度)为3-4.5％，具体可为3.5％-4％、3％、3.5％、4％或4.5％。
上述方法在保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液中的应用也属于本发明的保护范围。
白眉蛇毒血凝酶浓缩液在降温的过程中，酶的三级结构会发生改变，暴露出疏水基团，这些基团能够跟Ca2+结合而使疏水基团带有同质电荷来对抗疏水力，防止聚合；同时Ca2+也是生理止血的必须物质，引入Ca2+不会影响药品的疗效，甚至会产生协同效应。实验数据表明降温过程必须缓慢降温，如果降温剧烈，则酶构象变化剧烈，酶可能失活，也可能使疏水基团暴露不够充分而达不到技术效果。钙离子的量控制也要极其严格，量少则跟疏水基团配位不充分，量多则会形成超分子结构而聚合。甘氨酸是两性物质，在不同的pH值溶液中带有不同的电荷，可以起到缓冲作用，能够对抗Tris-HCl缓冲体系因为温度变化而产生的pH值变化。
本发明提供了一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法，能够减少酶的失活，降低成本，同时提高药品的安全性。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试剂、生物材料等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1、Ca2+浓度对白眉蛇毒血凝酶浓缩液活性的影响
按照专利201410821963.8公开的方法得到白眉蛇毒血凝酶浓缩液，活性为40KU/ml。分别取样10ml置于多个试管中，照本发明的方法处理(加入的CaCl2溶液的浓度为2.8mol/L，CaCl2的终浓度如表1所示，降温的速度为0.5℃/min，在10℃下保存15分钟，所述加入的甘氨酸溶液的质量百分比浓度为20％，甘氨酸的终浓度为4％)，按下表添加CaCl2溶液，保存180天后检测活性，观察不同Ca2+终浓度对活性的影响。
表1不同Ca2+终浓度对活性的影响
序号 浓缩液量 Ca2+终浓度(mol/L) 总活性(KU)
1 10ml(400KU) 0.02 370
2 10ml(400KU) 0.04 380
3 10ml(400KU) 0.06 390
4 10ml(400KU) 0.07 400
5 10ml(400KU) 0.08 395
6 10ml(400KU) 0.10 310
7 10ml(400KU) 0.12 190
8 10ml(400KU) 0.14 —
从上述表格数据看，Ca2+浓度在0.06—0.08mol/L时，酶活性损失最小，0.07mol/L时活性没有损失。
实施例2、降温速度对白眉蛇毒血凝酶浓缩液活性的影响
上述的白眉蛇毒血凝酶浓缩液，分别取样10ml置于多个试管中，照本发明的方法处理(加入的CaCl2溶液的浓度为3.0mol/L，CaCl2的终浓度为0.07mol/L，降温的速度如表2中所示，在10℃下保存20分钟，所述加入的甘氨酸溶液的质量百分比浓度为20％，甘氨酸的终浓度为4％)，按下表控制降温的速度，保存1小时后检测活性，观察不同降温速度对活性的影响。
表2不同降温速度对活性的影响
序号 浓缩液量 降温速度(℃/min) 总活性(KU)
1 10ml(400KU) 0.3 400
2 10ml(400KU) 0.4 400
3 10ml(400KU) 0.5 400
4 10ml(400KU) 0.6 395
5 10ml(400KU) 0.8 385
6 10ml(400KU) 1.0 375
7 10ml(400KU) 2.0 370
8 10ml(400KU) 3.0 370
上述实验数据显示，降温速度控制在0.5℃/min以下时，活性无损失，高于这个速度，则对活性产生显著的影响。为了节省时间，将降温速度控制在0.5℃/min为最佳。
实施例3、甘氨酸浓度对白眉蛇毒血凝酶浓缩液活性的影响
上述的白眉蛇毒血凝酶浓缩液，分别取样10ml置于多个试管中，照本发明的方法处理(加入的CaCl2溶液的浓度为3.0mol/L，CaCl2的终浓度为0.07mol/L，降温的速度0.5℃/min，在10℃下保存20分钟，所述加入的甘氨酸溶液的质量百分比浓度为20％，甘氨酸的终浓度如表3所示)，按下表添加甘氨酸溶液，保存180天后检测活性，观察不同甘氨酸终浓度对活性的影响。
表3不同甘氨酸终浓度对活性的影响
序号 浓缩液量 甘氨酸浓度(wt％) 总活性(KU)
1 10ml(400KU) 2 370
2 10ml(400KU) 2.5 380
3 10ml(400KU) 3 390
4 10ml(400KU) 3.5 395
5 10ml(400KU) 4 400
6 10ml(400KU) 4.5 390
7 10ml(400KU) 5 380
8 10ml(400KU) 5.5 360
从上述表格数据看，甘氨酸的终浓度为3-4.5％时，酶活性损失较小，当甘氨酸的终浓度为4％时，酶活性无损失。

Claims (5)

1.一种保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液的方法，包括下述步骤：
1)向白眉蛇毒血凝酶浓缩液中加入CaCl2溶液，得到含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液；
2)将所述含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液降温到10℃，在10℃下保存15-25分钟后，再将温度升到室温；
3)向步骤2)得到的体系中加入甘氨酸溶液，得到含甘氨酸的体系，将所述体系在3.5—4.5℃环境中长久保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法步骤1)中，所述加入的CaCl2溶液的浓度为2.8-3.2mol/L，
所述含CaCl2的白眉蛇毒血凝酶浓缩液中，CaCl2的终浓度是0.06—0.08mol/L。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述方法步骤2)中，所述降温的速度保持在每1分钟0.5℃以下。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法步骤3)中，所述加入的甘氨酸溶液的浓度质量百分比浓度为18-22％；
所述含甘氨酸的体系中，甘氨酸的终浓度，以质量百分比浓度计，为3-4.5％。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法在保存白眉蛇毒血凝酶浓缩液中的应用。
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