CN106518967B - 多肽修饰的低聚原花青素及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽修饰的低聚原花青素及其制备方法，并通过实验证实了所述多肽修饰的低聚原花青素对羟基磷灰石具有牢固的吸附作用，并能在羟基磷灰表面吸附聚集成膜，所述多肽修饰的低聚原花青素能在模拟唾液中诱导羟基磷灰石在磨损牙釉质块表面沉积和结晶，具有促进牙釉质再矿化的能力，将所述多肽修饰的低聚原花青素与三价铁离子配合使用能进一步提升所述多肽修饰的低聚原花青素在模拟唾液中对牙釉质再矿化的能力；所述多肽修饰的低聚原花青素能有效防止细菌在牙釉质上粘附，阻止粘附的细菌在其上繁殖。说明本发明所述多肽修饰的低聚原花青素作为牙釉质原位再矿化诱导剂及牙科植入体表面抗菌材料应用。
Description
技术领域
本发明属于牙釉质原位修复材料及牙科植入体表面抗菌材料领域，特别涉及多肽修饰的低聚原花青素及其制备方法与应用。
背景技术
龋齿是一种细菌引起的疾病，主要表现为牙齿的脱矿现象。目前，用于填充龋齿患处的材料包括金属材料、陶瓷材料和树脂材料，然而由于牙齿基质与填充材料之间性质差异巨大，两者界面间相互作用力不强，50％～60％的填充材料在首次治疗后不久脱落(L.L.Kirkevang,M.A.Wenzel,Caries Res.43(2009)286)。近年来，诱导牙釉质定点再矿化的材料得到了广泛的研究和关注，这类材料通过模拟有机基质诱导牙釉质再矿化，目前可用的这类材料包括生物大分子、脂质体、自组装膜等。
葡萄籽提取物(GSE)是从天然葡萄籽中提取的混合物，主要含多酚类化合物、萜类化合物、维生素、氨基酸、生物碱等多种生物活性物质，能抑制致龋菌的生长和粘附。施桔红等以原花青素含量为61.6％的葡萄籽提取物诱导受损牙本质再矿化，将经过脱矿处理的牙本质块进行pH循环处理8天，以考察GSE对牙本质再矿化的促进作用，结果表明10％的GSE能促进脱矿牙本质的再矿化作用(施桔红,黎红,王伊娜.葡萄籽提取物促进早期牙本质龋损再矿化作用的体外研究.[J]上海口腔医.2015,24(1).)。虽然GSE能促进脱矿牙本质的再矿化，但GSE具有该作用主要是因为其中含有的原花青素能减缓牙本质上胶原的生物降解，起到稳定胶原的作用有关，从而为矿物质的沉积提供网状支撑。与牙本质相比，牙釉质中的胶原等有机成分的含量明显更低，且原花青素对作为牙釉质主要无机成分的对羟基磷灰石没有吸附作用，因而原花青素无法牢固地作用于牙釉质上，难以用于牙釉质的修复。
基于以上技术现状，若能对原花青素的结构进行改进，并利用原花青素能抑制致龋菌的生长和粘附的特点，开发出对牙釉质具有良好的吸附效果、能有效促进牙釉质再矿化和具有抑菌作用的诱导牙齿定点再矿化的材料，对于龋齿修复和牙科植入体表面抗菌都将产生重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供多肽修饰的低聚原花青素及其制备方法，并证明所述多肽修饰的低聚原花青素可作为牙釉质原位再矿化诱导剂以及牙科植入体表面抗菌材料应用。
本发明提供的多肽修饰的低聚原花青素，结构式如式(Ⅰ)所示：
式(Ⅰ)中，R代表结构式如式(Ⅱ)所示的低聚原花青素分子中的任意一个R1被去掉后形成的基团，式(Ⅱ)中，n＝0、1、2或3(即低聚原花青素为二聚、三聚、四聚或五聚原花青素)，R1为羟基，
本发明提供的上述多肽修饰的低聚原花青素的制备方法，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的低聚原花青素的合成
①配制第一种溶液
将低聚原花青素溶解于二甲基甲酰胺中形成第一种溶液，所述低聚原花青素的聚合度为2、3、4或5，低聚原花青素在第一种溶液中的浓度为10～40mg/mL；
②配制第二种溶液
将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中低聚原花青素的摩尔比为(1～1.5):1；
③合成
在氩气保护条件下于-5～5℃将丙烯酰氯加入到第二种溶液中，在室温反应至少24h，然后经透析、冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的低聚原花青素；所述丙烯酰氯与第二种溶液中低聚原花青素的摩尔比为(1～1.5):1；
(2)带保护基团的多肽修饰的低聚原花青素的合成
①配制第三种溶液
将步骤(1)制备的丙烯酰基修饰的低聚原花青素溶解于去离子水中形成第三种溶液，所述去离子水的量以所述丙烯酰基修饰的低聚原花青素能在去离子水中完全溶解为限；
②配制第四种溶液
以结构式如式(Ⅲ)所示的多肽为溶质，将所述溶质溶解于去离子水中形成第四种溶液，所述去离子水的量以溶质能在去离子水中完全溶解为限，
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中并混合均匀，然后加入第四种溶液并混合均匀，在密封条件下于室温反应至少24h，经透析、冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的低聚原花青素；
所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(1～1.5):1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为(10-6～10-5):1；
(3)多肽修饰的低聚原花青素的合成
①配制第五种溶液
将氨水、二氧六环、浓度为3～5mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为(1.9～2.1):(0.9～1):(0.08～0.12)；
②合成
以步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的低聚原花青素为溶质，将所述溶质溶解于第五种溶液中并混合均匀，在密封条件下于室温反应至少24h，然后经透析、冷冻干燥，即得多肽修饰的低聚原花青素；所述第五种溶液的量以溶质能在第五种溶液中完全溶解为限。
本发明提供了上述多肽修饰的低聚原花青素作为牙釉质原位再矿化诱导剂以及牙科植入体表面抗菌材料的应用。实验表明：本发明所述多肽修饰的低聚原花青素对羟基磷灰石具有牢固的吸附作用，并能在羟基磷灰表面吸附聚集成膜；本发明所述多肽修饰的低聚原花青素能在模拟唾液中诱导羟基磷灰石在磨损牙釉质块表面沉积和结晶，具有促进牙釉质再矿化的能力，并且，将本发明所述多肽修饰的低聚原花青素与三价铁离子配合使用，能进一步提升所述多肽修饰的低聚原花青素在模拟唾液中对牙釉质再矿化的能力，说明三价铁离子可与本发明所述多肽修饰的低聚原花青素配合作为牙釉质原位再矿化诱导剂应用。本发明所述多肽修饰的低聚原花青素能有效防止细菌(包括死细菌和活细菌)在牙釉质上粘附，阻止粘附的细菌在其上繁殖，从而体现出抑菌作用，基于该特性，本发明所述多肽修饰的低聚原花青素可作为牙科植入体表面抗菌材料应用。
应用时，将所述多肽修饰的低聚原花青素配制成水溶液使用，所述水溶液中，多肽修饰的低聚原花青素的浓度为1000～3000ppm。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明提供了一种新型结构的诱导牙釉质定点再矿化的材料—多肽修饰的低聚原花青素，丰富了牙釉质定点再矿化的材料的种类。
2.实验表明：本发明所述多肽修饰的低聚原花青素对羟基磷灰石具有牢固的吸附作用，并能在羟基磷灰表面吸附聚集成膜，本发明所述多肽修饰的低聚原花青素能在模拟唾液中诱导羟基磷灰石在磨损牙釉质块表面沉积和结晶，具有促进牙釉质再矿化的能力，并且，与三价铁离子配合使用，能进一步提升所述多肽修饰的低聚原花青素在模拟唾液中对牙釉质再矿化的能力，可在作为牙釉质原位再矿化诱导剂中应用(见实施例5～9)；本发明所述多肽修饰的低聚原花青素能有效防止细菌(包括死细菌和活细菌)在牙釉质上粘附，阻止粘附的细菌在其上繁殖，从而体现出抑菌作用，可作为牙科植入体表面抗菌材料应用(见实施例10)。
3.本发明所述多肽修饰的低聚原花青素在应用时配制成多肽修饰的低聚原花青素的浓度为1000～3000ppm的水溶液直接浸泡进行再矿化的部位即可吸附在相应部位，在吸附后可诱导相应部位再矿化，应用方式简单，具有简化治疗操作和降低治疗成本的优势，容易在实际应用中推广。
4.本发明还提供了上述多肽修饰的低聚原花青素的制备方法，该方法采用常规原料及设备即可实现，易于实现工业化生产。
附图说明
图1是本发明所述多肽修饰的低聚原花青素的合成过程示意图；
图2是实施例1制备的丙烯酰基修饰的二聚原花青素的红外谱图；
图3是实施例1制备的丙烯酰基修饰的二聚原花青素的核磁氢谱；
图4是实施例1制备的带保护基团的多肽修饰的二聚原花青素的红外谱图；
图5是实施例1制备的多肽修饰的二聚原花青素的飞行时间质谱；
图6是实施例5中各样品的荧光分布图，其中，图(A)～(C)分别为罗丹明标记的SAP-2-OPC在酸蚀牙釉质块上、罗丹明标记的SAP-2-OPC在未酸蚀牙釉质块上、罗丹明标记的二聚原花青素在未酸蚀牙釉质块上的荧光分布图；
图7是实施例6中不同浓度的SAP-2-OPC在羟基磷灰石粉末上的吸附量图；
图8是实施例7中SAP-2-OPC在羟基磷灰石片表面聚集成膜后的SEM照片；
图9是实施例8的实验组中矿化不同时间的酸蚀牙釉质块表面的SEM图，其中，图(A)、(B)的矿化时间分别为1天和2周。
图10是实施例8的空白组中矿化不同时间的酸蚀牙釉质块表面的SEM图，其中，图(A)、(B)的矿化时间分别为1天和2周。
图11是实施例9的实验组中矿化不同时间的酸蚀牙釉质块表面的SEM图，其中，图(A)、(B)的矿化时间分别为1天和2周。
图12是实施例10实验组和空白组在波长600nm处测吸光度值柱状图；
图13是实施例10中实验组和空白组的羟基磷灰石片表面的SEM照片，其中，图(A)、(B)为实验组的SEM照片，图(C)、(D)为空白组的SEM照片；
图14是实施例10中空白组与实验组样品的共聚焦显微镜图，其中，图(A)、(B)分别为空白组的样品表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦显微镜图，图(C)、(D)分别为实验组的样品表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦显微镜图。
具体实施方式
以下通过实施例并结合附图对本发明所述多肽修饰的低聚原花青素及其制备方法与应用作进一步说明。
下述实施例1～4中，所述二聚、三聚、四聚和五聚原花青素均由儿茶素与儿茶素聚合而成；步骤(2)中使用的多肽购买自上海波泰生物科技有限公司，其结构式如式(Ⅲ)所示：
实施例1
本实施例中，提供多肽修饰的二聚原花青素的制备方法，其合成路线如图1所示，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的二聚原花青素的合成
①配制第一种溶液
在室温、常压条件下将0.59g二聚原花青素溶解于40mL二甲基甲酰胺中形成第一种溶液，二聚原花青素在第一种溶液中的浓度为14.8mg/mL；
②配制第二种溶液
在室温、常压条件下将三乙胺(TEA)溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中二聚原花青素的摩尔比为1.1:1；
③合成
在0～5℃的冰水浴及氩气保护条件下将丙烯酰氯(Acryloyl chloride)滴加到第二种溶液中，在室温室温、常压条件下反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为500道尔顿的透析袋透析1天，再冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的二聚原花青素；所述丙烯酰氯与第二种溶液中二聚原花青素的摩尔比为1.1:1。
该步骤制备的丙烯酰基修饰的二聚原花青素红外谱图和核磁氢谱分别如图2和图3所示，图2中，1735cm-1和1253cm-1处的峰分别表示酯基中C＝0的伸缩振动和O-C-O的伸缩振动，1655cm-1处的峰代表C＝C的伸缩振动，图2中，7.95ppm和5.87ppm处的峰分别代表C＝CH-O和-C＝CH上的质子氢，峰面积比为1:2，图2和图3说明该步骤已经在二聚原花青素的基础上引入了丙烯酰基。
(2)带保护基团的多肽修饰的二聚原花青素的合成
①配制第三种溶液
在常压、室温条件下将步骤(1)制备的18.3mg丙烯酰基修饰的二聚原花青素溶解于10mL去离子水中形成第三种溶液；
②配制第四种溶液
以40mg结构式如式(Ⅲ)所示的多肽为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第四种溶液；
③合成
将二甲基苯基磷(Dimethylphenylphosphine)加入第三种溶液中，在室温、常压搅拌混合均匀，然后加入第四种溶液并搅拌混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为1500道尔顿的透析袋透析1天，冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的二聚原花青素；
所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为1.1:1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为10-6:1。
该步骤制备的带保护基团的多肽修饰的二聚原花青素的红外谱图如图4所示，图4中1550cm-1处的峰代表酰胺II带，1680cm-1处的峰代表酰胺I带，说明该步骤在步骤(1)制备的产物的基础上引入了带保护基团的多肽。
(3)多肽修饰的二聚原花青素的合成
①配制第五种溶液
在室温、常压条件下将氨水、二氧六环、浓度为4mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为2:1:0.1；
②合成
以20mg步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的二聚原花青素为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于1mL第五种溶液中并搅拌混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应24h，然后然后在去离子水中用截留分子量为1000道尔顿的透析袋透析24h，冷冻干燥，即得多肽修饰的二聚原花青素，记作SAP-2-OPC，其飞行时间质谱如图5所示，图5中，
1919.523为SAP-2-OPC的分子离子峰，SAP-2-OPC的结构式为：
实施例2
本实施例中，提供多肽修饰的三聚原花青素的制备方法，其合成路线如图1所示，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的三聚原花青素的合成
①配制第一种溶液
在室温、常压条件下将0.885g三聚原花青素溶解于40mL二甲基甲酰胺中形成第一种溶液，三聚原花青素在第一种溶液中的浓度为22mg/mL；
②配制第二种溶液
在室温、常压条件下将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中三聚原花青素的摩尔比为1.1:1；
③合成
在0～5℃的冰水浴及氩气保护条件下将丙烯酰氯滴加到第二种溶液中，在室温室温、常压条件下反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为750道尔顿的透析袋透析1天，再冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的三聚原花青素；所述丙烯酰氯与第二种溶液中三聚原花青素的摩尔比为1.1:1。
(2)带保护基团的多肽修饰的三聚原花青素的合成
①配制第三种溶液
在常压、室温条件下将步骤(1)制备的27.5mg丙烯酰基修饰的三聚原花青素溶解于10mL去离子水中形成第三种溶液；
②配制第四种溶液
以40mg结构式如式(Ⅲ)所示的多肽为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第四种溶液；
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中，在室温、常压搅拌混合均匀，然后加入第四种溶液并搅拌混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应24h，然后在去离子水中用截留分子量为1500道尔顿的透析袋透析1天，冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的三聚原花青素；
所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为1.1:1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为5×10-6:1。
(3)多肽修饰的三聚原花青素的合成
①配制第五种溶液
在室温、常压条件下将氨水、二氧六环、浓度为5mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为2:0.9:0.1；
②合成
以40mg步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的三聚原花青素为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于2mL第五种溶液中并搅拌混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应24h，然后然后在去离子水中用截留分子量为1000道尔顿的透析袋透析24h，冷冻干燥，即得多肽修饰的三聚原花青素，记作SAP-3-OPC。
实施例3
本实施例中，提供多肽修饰的四聚原花青素的制备方法，其合成路线如图1所示，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的四聚原花青素的合成
①配制第一种溶液
在室温、常压条件下将1.18g四聚原花青素溶解于40mL二甲基甲酰胺中形成第一种溶液，四聚原花青素在第一种溶液中的浓度为29.5mg/mL；
②配制第二种溶液
在室温、常压条件下将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中四聚原花青素的摩尔比为1:1；
③合成
在0～5℃的冰水浴及氩气保护条件下将丙烯酰氯滴加到第二种溶液中，在室温室温、常压条件下反应30h，然后在去离子水中用截留分子量为750道尔顿的透析袋透析1天，再冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的四聚原花青素；所述丙烯酰氯与第二种溶液中四聚原花青素的摩尔比为1:1。
(2)带保护基团的多肽修饰的四聚原花青素的合成
①配制第三种溶液
在常压、室温条件下将步骤(1)制备的36.6mg丙烯酰基修饰的四聚原花青素溶解于10mL去离子水中形成第三种溶液；
②配制第四种溶液
以40mg结构式如式(Ⅲ)所示的多肽为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第四种溶液；
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中，在室温、常压搅拌混合均匀，然后加入第四种溶液并搅拌混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应30h，然后在去离子水中用截留分子量为2000道尔顿的透析袋透析1天，冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的四聚原花青素；
所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为1:1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为8×10-6:1。
(3)多肽修饰的四聚原花青素的合成
①配制第五种溶液
在室温、常压条件下将氨水、二氧六环、浓度为3mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为2:1:0.1；
②合成
以60mg步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的四聚原花青素为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于3mL第五种溶液中并搅拌混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应30h，然后然后在去离子水中用截留分子量为1500道尔顿的透析袋透析30h，冷冻干燥，即得多肽修饰的四聚原花青素，记作SAP-4-OPC。
实施例4
本实施例中，提供多肽修饰的五聚原花青素的制备方法，其合成路线如图1所示，步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的五聚原花青素的合成
①配制第一种溶液
在室温、常压条件下将1.475g五聚原花青素溶解于40mL二甲基甲酰胺中形成第一种溶液，五聚原花青素在第一种溶液中的浓度为36.9mg/mL；
②配制第二种溶液
在室温、常压条件下将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中五聚原花青素的摩尔比为1.5:1；
③合成
在-5～0℃及氩气保护条件下将丙烯酰氯滴加到第二种溶液中，在室温室温、常压条件下反应32h，然后在去离子水中用截留分子量为1000道尔顿的透析袋透析1天，再冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的五聚原花青素；所述丙烯酰氯与第二种溶液中五聚原花青素的摩尔比为1.5:1。
(2)带保护基团的多肽修饰的五聚原花青素的合成
①配制第三种溶液
在常压、室温条件下将步骤(1)制备的45.8mg丙烯酰基修饰的五聚原花青素溶解于10mL去离子水中形成第三种溶液；
②配制第四种溶液
以40mg结构式如式(Ⅲ)所示的多肽为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于10mL去离子水中形成第四种溶液；
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中，在室温、常压搅拌混合均匀，然后加入第四种溶液并搅拌混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应32h，然后在去离子水中用截留分子量为2500道尔顿的透析袋透析1天，冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的五聚原花青素；
所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为1.5:1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为10-5:1。
(3)多肽修饰的五聚原花青素的合成
①配制第五种溶液
在室温、常压条件下将氨水、二氧六环、浓度为4mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为2:0.95:0.1；
②合成
以80mg步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的五聚原花青素为溶质，在室温、常压条件下将所述溶质溶解于4mL第五种溶液中并搅拌混合均匀，在密封条件下于室温、常压反应32h，然后然后在去离子水中用截留分子量为2000道尔顿的透析袋透析30h，冷冻干燥，即得多肽修饰的五聚原花青素，记作SAP-5-OPC。
实施例5
本实施例中，测定实施例1制备的SAP-2-OPC在牙釉质表面的吸附情况，具体使用激光共聚焦显微镜观察荧光标记了的SAP-2-OPC和二聚原花青素在牙釉质表面的吸附情况。
(1)荧光标记
荧光标记物质选择罗丹明，标记方法为：分别向SAP-2-OPC和二聚原花青素的二甲基亚砜溶液中加入与SAP-2-OPC、二聚原花青素等摩尔的罗丹明的二甲基亚砜溶液，再分别加入与SAP-2-OPC、二聚原花青素等摩尔的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)，搅拌1天，得到浓度为2.25mg/mL的罗丹明标记的SAP-2-OPC和浓度为2.25mg/mL罗丹明标记的二聚原花青素。
(2)酸蚀和未酸蚀牙釉质块的制备
①取因正畸拔除的正常前磨牙，用乙醇除去正常牙表面的有机污染物，用蒸馏水冲洗干净后贮存于4℃的浓度为0.05wt％的麝香草酚水溶液中备用。
②使用高速牙块切割机上将需要的牙釉质部分从经过步骤①处理的牙上切下，切割成4×4×2mm大小的牙齿块，切割牙釉质面暴露，其余部分用甲基丙烯酸甲酯树脂包埋，将暴露面用依次用800#、1200#、2400#碳化硅砂纸在流水下磨平、抛光，去除表层约150μm，以消除表面有机污染物和表面的不规则，得到未酸蚀牙釉质块，置于浓度为0.05wt％的麝香草酚水溶液中备用，使用前，将树脂包埋的牙块置于去离子水中，用超声波清洗器中处理30min。
③使用高速牙块切割机上将需要的牙釉质部分从经过步骤①处理的牙上切下，切割成4×4×2mm大小的牙齿块，切割牙釉质面暴露，其余部分用甲基丙烯酸甲酯树脂包埋，将暴露面用依次用800#、1200#、2400#碳化硅砂纸在流水下磨平、抛光，去除表层约150μm，以消除表面有机污染物和表面的不规则，得到未酸蚀牙釉质块，置于浓度为0.05wt％的麝香草酚水溶液中备用，使用前，将树脂包埋的牙块置于去离子水中，用超声波清洗器中处理30min，取出放入37wt％的磷酸中浸泡45s(每颗树脂包埋的牙块用10mL磷酸浸泡)，用PBS冲洗3次，再将其置于去离子水中，用超声波清洗器中处理5min，将得到的酸蚀牙釉质块保存于磷酸盐缓冲液(PBS)中待用。
(3)用移液枪分别量取2mL罗丹明标记的SAP-2-OPC溶液浸泡酸蚀和未酸蚀牙釉质块，用移液枪分别量取2mL罗丹明标记的二聚原花青素溶液浸泡未酸蚀牙釉质块，浸泡1天后用PBS冲洗3次，将样品烘干后用激光共聚焦显微镜观察其表面的荧光分布情况，结果如图6所示。
图6中，图(A)～(C)分别为罗丹明标记的SAP-2-OPC在酸蚀牙釉质块上的荧光分布图、罗丹明标记的SAP-2-OPC在未酸蚀牙釉质块上的荧光分布图、罗丹明标记的二聚原花青素在未酸蚀牙釉质块上的荧光分布图，其中，图(A)中样品具有明显的红色荧光，图(B)中样品的荧光较图(A)更暗，这是由于酸蚀后的牙釉质的比表面积增大，能吸附更多的荧光标记的SAP-2-OPC造成的，而图(C)中样品没有荧光，说明二聚原花青素对牙釉质没有吸附作用。本实施例说明本发明所述多肽修饰的低聚原花青素在牙釉质上具有良好的吸附性能。
实施例6
本实施例中，测定实施例1制备的SAP-2-OPC和二聚原花青素在羟基磷灰石粉末上的吸附情况，所述羟基磷灰石粉末的规格为HA/M30，其含水量低于0.1％。
将SAP-2-OPC溶解在去离子水中，配制成SAP-2-OPC浓度分别为0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL及2.75mg/mL SAP-2-OPC水溶液，用紫外可见分光光度计测量前述6个浓度的SAP-2-OPC水溶液在波长为264nm处的吸光度值，得到SAP-2-OPC浓度与吸光度值之间的线性关系，即标准曲线。
将SAP-2-OPC溶解在去离子水中，配制成SAP-2-OPC浓度分别为0.25mg/mL、0.75mg/mL、1.25mg/mL、1.75mg/mL、2.25mg/mL及2.75mg/mL的SAP-2-OPC水溶液，分别记作1～6#溶液。取量程为10mL的离心PE管6支，分别向其中加入50mg羟基磷灰石粉末，然后取1～6#溶液各1mL加入离心PE管中，在37℃振荡搅拌12h，然后对各离心PE管中的混合液以10000转/分钟的转速离心4分钟，取离心所得上清液用紫外分光光度计测量上清液中SAP-2-OPC的浓度，对照标准曲线，计算出吸附在羟基磷灰石粉末上的SAP-2-OPC的量，结果如图7所示。由图7可知，当SAP-2-OPC的浓度为2.25mg/mL时在羟基磷灰石粉末上达吸附饱和，SAP-2-OPC在50mg羟基磷灰石粉末上的饱和吸附量为1.9mg。
二聚原花青素在羟基磷灰石粉末上的吸附情况的测试方法与上述SAP-2-OPC在羟基磷灰石粉末上的吸附情况的测试方法类似，测试结果表明二聚原花青素在羟基磷灰石上的饱和吸附量为0，即二聚原花青素对羟基磷灰石粉末并没有吸附作用。
实施例7
本实施例中，测定实施例1制备的SAP-2-OPC在羟基磷灰石片上聚集成膜的情况，所述羟基磷灰石片的尺寸为8mm*2mm，其含水量低于0.1％。
采用扫描电镜观察SAP-2-OPC在羟基磷灰石片表面聚集成膜的情况。将SAP-2-OPC溶解在去离子水中，配制成SAP-2-OPC浓度为2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液，用移液枪量取2mL的SAP-2-OPC水溶液浸泡羟基磷灰石片，浸泡1天后用PBS冲洗3次，烘干后用扫描观察SAP-2-OPC在羟基磷灰石片表面聚集成膜的情况，结果如图8所示，其中，图(A)～(C)是SAP-2-OPC在羟基磷灰石片表面聚集成膜后不同放大倍数的SEM照片。由图8可知，本发明所述多肽修饰的低聚原花青素在羟基磷灰石片上具有良好的聚集成膜性能。
实施例8
本实施例中，测定实施例1制备的SAP-2-OPC对牙釉质再矿化的促进能力。
(1)酸蚀牙釉质块的制备
①取因正畸拔除的正常前磨牙，用乙醇除去正常牙表面的有机污染物，用蒸馏水冲洗干净后贮存于4℃的浓度为0.05wt％的麝香草酚水溶液中备用。
②使用高速牙块切割机上将需要的牙釉质部分从经过步骤①处理的牙上切下，切割成4×4×2mm大小的牙齿块，切割牙釉质面暴露，其余部分用甲基丙烯酸甲酯树脂包埋，将暴露面用依次用800#、1200#、2400#碳化硅砂纸在流水下磨平、抛光，去除表层约150μm，以消除表面有机污染物和表面的不规则，得到未酸蚀牙釉质块，置于浓度为0.05wt％的麝香草酚水溶液中备用，使用前，将树脂包埋的牙块置于去离子水中，用超声波清洗器中处理30min，取出放入37wt％的磷酸中浸泡45s(每颗树脂包埋的牙块用10mL磷酸浸泡)，用PBS冲洗3次，再将其置于去离子水中，用超声波清洗器中处理5min，将得到的酸蚀牙釉质块保存于磷PBS中待用。
(2)①用去离子水将实施例1制备的SAP-2-OPC配制成浓度为2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液。
②按如下配方配制模拟唾液：CaCl2 0.1665g、KCl 9.685g、NaH2PO40.1224g、NaN3·0.065g、HEPES 4.766g，在37℃溶于用750mL去离子中，用1mol/L的KOH溶液调节pH至7.02，用去离子水定容至1000mL。
(3)将步骤(1)制备的酸蚀牙釉质块分为实验组和空白组，每组中酸蚀牙釉质块2块。各组的操作如下：
①将实验组的酸蚀牙釉质块在室温下浸泡于2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液中，浸泡时间为30min，取出，用PBS洗涤；将空白组的酸蚀牙釉质块在室温下浸泡于去离子水中，浸泡时间为30min，取出，用PBS洗涤。
②将步骤①得到的牙釉质块浸泡于模拟唾液中，于37℃恒温保存，模拟唾液每1天更换一次，并重复步骤①，每组中的酸蚀牙釉质块分别浸泡1天和2周，取出，用PBS洗涤、烘干，然后用扫描电镜观察各组酸蚀牙釉质块表面羟基磷灰石的沉积和结晶的情况，结果如图9和图10所示。
图9中，图(A)、(B)分别为实验组矿化1天和2周后酸蚀牙釉质块表面的SEM图，图10中，图(A)、(B)分别为空白组矿化1天和2周后酸蚀牙釉质块表面的SEM图。由图9可知，实验组的酸蚀牙釉质块在模拟唾液中浸泡1天后，其表面已有羟基磷灰石的沉积和结晶，实验组的酸蚀牙釉质在模拟唾液中浸泡2周后，其表面明显可见有一定厚度的羟基磷灰石的沉积和结晶，而由图10可知，空白组的酸蚀牙釉质块则矿化程度较弱，说明本发明所述多肽修饰的低聚原花青素在模拟唾液中能诱导羟基磷灰石在酸蚀牙釉质块表面沉积和结晶，可用作牙釉质原位再矿化诱导剂。
实施例9
本实施例中，考察三价铁离子对本发明所述多肽修饰的低聚原花青素对牙釉质再矿化能力的促进作用。
(1)酸蚀牙釉质块的制备
①取因正畸拔除的正常前磨牙，用乙醇除去正常牙表面的有机污染物，用蒸馏水冲洗干净后贮存于4℃的浓度为0.05wt％的麝香草酚水溶液中备用。
②使用高速牙块切割机上将需要的牙釉质部分从经过步骤①处理的牙上切下，放置于规格为1×1×1cm的砂盘中，并向沙盘中浇上DMDHE树脂，待其自然固化，将树脂块取出，在高速涡轮砂纸上将其磨平，特别注意将所需的牙釉质表面从树脂中暴露出来。将包有DMDHE树脂的牙块置于去离子水中，在超声波清洗器中处理30min，取出放入37wt％的磷酸中浸泡45s(每颗树脂包埋的牙块用10mL磷酸浸泡)，用PBS冲洗3次，再将其置于去离子水中，在超声波清洗器中处理5min，将得到的酸蚀牙釉质块保存于PBS中待用。
(2)①用去离子水将实施例1制备的SAP-2-OPC配制成浓度为2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液。
②按如下配方配制模拟唾液：CaCl2 0.1665g、KCl 9.685g、NaH2PO40.1224g、NaN3·0.065g、HEPES 4.766g，在37℃溶于用750mL去离子中，用1mol/L的KOH溶液调节pH至7.02，用去离子水定容至1000mL。
(3)配制Fe3+缓冲液
①配制Tris.HCl缓冲液，配方为：50mL 0.1mol/L Tris水溶液、45.7mL 0.1mol/LHCl水溶液用去离子水定容至100mL，用0.1mol/lNaOH调节pH值至7；
②用Tris.HCl缓冲液将实施例1制备的SAP-2-OPC配制成SAP-2-OPC浓度为2.25mg/mL的SAP-2-OPC溶液，用Tris.HCl缓冲液将FeCl3.6H2O配制成Fe3+与前述SAP-2-OPC溶液中SAP-2-OPC摩尔浓度相等的溶液，然后将两种溶液等摩尔比混合，并用0.1mol/L的NaOH调pH值至9得到Fe3+缓冲液。
(4)将步骤(1)制备的酸蚀牙釉质块分为实验组和空白组，每组中酸蚀牙釉质块2块。各组的操作如下：
①将实验组的酸蚀牙釉质块在室温下浸泡于步骤(3)配制的Fe3+缓冲液中，浸泡时间为30min，取出，用PBS洗涤；将空白组的酸蚀牙釉质块在室温下浸泡于去离子水中，浸泡时间为30min，取出，用PBS洗涤。
②将步骤①中得到的牙釉质块浸泡于模拟唾液中，于37℃恒温保存，模拟唾液每1天更换一次，并重复步骤①，分别浸泡1天、2周，取出，用PBS洗涤、烘干，然后用扫描电镜观察各组酸蚀牙釉质块表面羟基磷灰石的沉积和结晶的情况，结果如图10和图11所示。
图11中，图(A)、(B)分别为实验组的酸蚀牙釉质块在矿化1天和2周后，其表面的SEM图，由图11可知，酸蚀牙釉质块表面明显可见有一定厚度的羟基磷灰石的沉积和结晶，与实例8中实验组的酸蚀牙釉质块(图9)相比对比，矿化程度明显增强并且分布更加均匀，说明三价铁离子能促进本发明所述多肽修饰的低聚原花青素诱导羟基磷灰石在酸蚀牙釉质块表面沉积和结晶的能力，三价铁离子可与本发明所述多肽修饰的低聚原花青素配合作为牙釉质原位再矿化诱导剂应用。
实施例5～9说明本发明所述多肽修饰的低聚原花青素可作为牙釉质原位再矿化诱导剂应用。
实施例10
本实施例中，考察实施例1制备的SAP-2-OPC对口腔变异链球菌的抑制作用。
(1)将SAP-2-OPC溶解在去离子水中，配制成SAP-2-OPC浓度为2.25mg/mL的SAP-2-OPC水溶液，用移液枪量取2mL的SAP-2-OPC水溶液浸泡羟基磷灰石片1天，干燥后，得到带SAP-2-OPC涂层的在羟基磷灰石片。
(2)以步骤(1)制备的带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片作为实验组试样，以羟基磷灰石片作为空白组试样，实验组和空白组的操作如下：
实验组：将带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片置于孔板中，将口腔变异链球菌接种到所述带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片表面，在厌氧培养箱中培养24h，然后将所述带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片移到新孔板，用PBS冲洗3次，将浓度为5mg/mL的MTT加入到放有所述带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片的孔板中，在厌氧培养箱中培养1h，将孔板中的MTT吸尽，加DMSO，放入摇床振摇至所述带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石上的甲瓒完全溶解，吸取所得溶液到96孔板中，用酶标仪在波长600nm下测吸光度值OD600。
空白组：将羟基磷灰石片置于孔板中，将口腔变异链球菌接种到羟基磷灰石片表面，在厌氧培养箱中培养24h，然后将羟基磷灰石片移到新孔板，用PBS冲洗3次，将浓度为5mg/mL的MTT加入到放有羟基磷灰石片的孔板中，在厌氧培养箱中培养1h，将孔板中的MTT吸尽，加DMSO，放入摇床振摇至所述带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石上的甲瓒完全溶解，吸取所得溶液到96孔板中，用酶标仪在波长600nm下测吸光度值OD600。
实验组和空白组的实验结果如图12所示，由图12可知，空白组的吸光度值明显大于实验组，说明SAP-2-OPC具有抑菌作用。
(3)以步骤(1)制备的带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片作为实验组试样，以羟基磷灰石片作为空白组试样，实验组和空白组的操作如下：
分别将口腔变异链球菌接种到带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片和羟基磷灰石片表面，在厌氧培养箱中培养24小时，用戊二醛固定过夜，然后分别依次用体积浓度分别为60％、70％、80％、90％的乙醇脱水10分钟。用扫描电镜观察，结果如图13所示，其中，图(A)、(B)分别为实验组的带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片表面的SEM照片，图(C)、(D)分别为空白组的羟基磷灰石片表面的SEM照片，由图13可知，与空白组相比，带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片表面粘附的变异链球菌数量明显减少。
(4)以步骤(1)制备的带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片作为实验组试样，以羟基磷灰石片作为空白组试样，实验组和空白组的操作如下：
分别将口腔变异链球菌接种到带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片和羟基磷灰石片表面，在厌氧培养箱中培养24小时，然后分别将细胞死活染染料滴到经过上述处理的带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片和羟基磷灰石片上，染色15分钟，用共聚焦显微镜观察，结果如图14所示。
图14中，图(A)、(B)分别为空白组的羟基磷灰石片表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦显微镜图，图(C)、(D)分别为实验组的带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片表面的活菌和死菌被染色后的共聚焦显微镜图，将图(A)与(B)，(C)与(D)比较可知，活菌和死菌的位置基本一致，说明活菌和死菌都会粘附在羟基磷灰石片上，将图(A)与图(C)、图(B)与图(D)比较可知，实验组的带SAP-2-OPC涂层的羟基磷灰石片上比空白组的羟基磷灰石片上粘附的活细菌和死细菌数量都明显减少，说明SAP-2-OPC具有良好的抑菌作用是由于其能有效防止细菌粘附，进而阻止粘附的细菌在其上繁殖。本实施例说明本发明所述多肽修饰的低聚原花青素可作为牙科植入体表面抗菌材料应用。
Claims (5)
1.多肽修饰的低聚原花青素，其特征在于结构式如下：
2.权利要求1所述多肽修饰的低聚原花青素的制备方法，其特征在于步骤如下：
(1)丙烯酰基修饰的低聚原花青素的合成
①配制第一种溶液
将低聚原花青素溶解于二甲基甲酰胺中形成第一种溶液，所述低聚原花青素的聚合度为2，低聚原花青素在第一种溶液中的浓度为10～40mg/mL；
②配制第二种溶液
将三乙胺溶解于第一种溶液中形成第二种溶液，所述三乙胺与第一种溶液中低聚原花青素的摩尔比为(1～1.5):1；
③合成
在氩气保护条件下于-5～5℃将丙烯酰氯加入到第二种溶液中，在室温反应至少24h，然后经透析、冷冻干燥，即得丙烯酰基修饰的低聚原花青素；所述丙烯酰氯与第二种溶液中低聚原花青素的摩尔比为(1～1.5):1；
(2)带保护基团的多肽修饰的低聚原花青素的合成
①配制第三种溶液
将步骤(1)制备的丙烯酰基修饰的低聚原花青素溶解于去离子水中形成第三种溶液，所述去离子水的量以所述丙烯酰基修饰的低聚原花青素能在去离子水中完全溶解为限；
②配制第四种溶液
以结构式如式(Ⅲ)所示的多肽为溶质，将所述溶质溶解于去离子水中形成第四种溶液，所述去离子水的量以溶质能在去离子水中完全溶解为限，
③合成
将二甲基苯基磷加入第三种溶液中并混合均匀，然后加入第四种溶液并混合均匀，在密封条件下于室温反应至少24h，经透析、冷冻干燥，即得带保护基团的多肽修饰的低聚原花青素；
所述第四种溶液的加入量应使第四种溶液中的巯基与第三种溶液中的碳碳双键的摩尔比为(1～1.5):1，所述二甲基苯基磷与第四种溶液中的巯基的摩尔比为(10-6～10-5):1；
(3)多肽修饰的低聚原花青素的合成
①配制第五种溶液
将氨水、二氧六环、浓度为3～5mol/L的氢氧化钠水溶液混合均匀得到第五种溶液，第五种溶液中，氨水、二氧六环、氢氧化钠的摩尔比为(1.9～2.1):(0.9～1):(0.08～0.12)；
②合成
以步骤(2)制备的带保护基团的多肽修饰的低聚原花青素为溶质，将所述溶质溶解于第五种溶液中并混合均匀，在密封条件下于室温反应至少24h，然后经透析、冷冻干燥，即得多肽修饰的低聚原花青素；所述第五种溶液的量以溶质能在第五种溶液中完全溶解为限。
3.权利要求1所述多肽修饰的低聚原花青素在制备牙釉质原位再矿化诱导剂以及牙科植入体表面抗菌材料中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于将所述多肽修饰的低聚原花青素配制成水溶液使用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述水溶液中，多肽修饰的低聚原花青素的浓度为1000～3000ppm。
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