CN1065142C

CN1065142C - 组合物用作慢性病毒性肝脏疾病治疗剂的应用

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Publication number: CN1065142C
Application number: CN92100242A
Authority: CN
Inventors: 汗斯·A·托马
Original assignee: Medeva Holdings BV
Current assignee: Medeva Holdings BV
Priority date: 1992-01-14
Filing date: 1992-01-14
Publication date: 2001-05-02
Anticipated expiration: 2007-01-14
Also published as: CN1074377A

Abstract

本发明提供了一种结合物，它包括介导一个或多个抗原决定基的至少一种多肽序列以及能够呈现该多肽序列的载体，该结合物可用于生产治疗慢性病毒性肝炎的药物。

Description

组合物用作慢性病毒性肝脏疾病治疗剂的应用

本发明涉及一种包含以DNA重组技术制备的多肽序列和载体的组合物，以提供治疗慢性病毒性肝脏疾病的治疗剂。本发明还涉及编码所说多肽序列的DNA序列以及用于表达该DNA序列的转染的细胞。

至少有5种不同的病毒即甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎病毒，能够引发急性肝炎的临床症状。通过肠道转移的甲型和戊型肝炎均能痊愈，而乙型、丙型肝炎(以前称为肠道外非甲非乙型肝炎)和丁型肝炎则能发展成为慢性炎症，进而导致肝硬变和原发性肝细胞癌。

有关丙型和丁型肝炎的诊断和治疗方法以及相应的病毒的资料相对很少。丁型肝炎病毒是一种RNA病毒，且已知是不完整的。因此，为了在患者体内发育，它需要有一种辅助病毒，并且它仅发现于被HBV感染的个体中。只是在最近才检测到丙型肝炎病毒，并开发出一种有助于诊断慢性丙型肝炎感染的抗体试验法(抗HCV)。但是，迫切需要有一种治疗该疾病的方法。

对于慢性乙型肝炎同样如此，已从其免疫学鉴定法、其致病病素、病毒生活史以及DNA序列等方面对乙型肝炎进行过深入地研究。病毒DNA能在其中存在10周以上、HBe抗原(HBeAg)能够在其中维持12周以上或乙型肝炎表面抗原(HBsAg)能够在其中维持6个月以上，这样的患者即被看作是慢性乙型肝炎病毒携带者。

全世界约有3亿人患有慢性乙型肝炎，其中的大部分生活在远东。

对于这些人来说，被感染的主要危险期是在出生过程中或出生之后不久，因为受到慢性感染的母亲可将病毒转移给其新生儿。90％以这种方式被感染的儿童将在未来的生存中变成慢性感染者。在西方，通常是在少年乃至成年时期主要通过非肠道或性传递的方式遭受感染。在出生后感染乙型肝炎的情况下，只有5-10％的受感染者变为慢性携带者。但是，转移的病毒并不决定感染者是消除该病毒还是终生在体内保留该病毒。因此，似乎是免疫学状态在决定病人未来的身体条件。

HB病毒粒子(丹氏颗粒)由不同的结构蛋白、核心蛋白和表面蛋白组成，后者是包括3个S型区域之编码序列在内的开放读码的翻译产物。其中每一编码序列均起始于能够起始体内翻译过程的ATG三联密码子。这三个区域依分子中5′至3′端的顺序分别称为前S₁、前S₂和S区。该开放读码(ORF)共产物6种蛋白产物：仅由S区翻译的主要蛋白(gp27和p24)的糖基化和非糖基化形式(226个氨基酸)、由前S₂和S区编码且带有1个或2个多糖侧链的中等蛋白(281个氨基酸)(分别为gp33和gp36)，以及由前S₁、前S₂和S翻译形成的大蛋白(389-400个氨基酸，取决于病毒血清型)的糖基化(gp42)和非糖基化(p39)形式。核心蛋白是HBcAg和HBeAg，可以想象到后者是HBcAg的加工产物。

作为感染性病毒粒子的丹氏颗粒，其包括核心蛋白和表面蛋白，而丝状体包含6种表面抗原的混合物。S肽单独装配成所谓的20nm颗粒，它完全无感染性。

被HB病毒感染的患者在被认为是慢性HBV感染之前要经过肝炎的几个发展阶段。感染后即直接进入是感染期，其特征是血清中存在HBeAg。接下去尽管抑制了HBV复制，但仍然出现的HBs抗原血症，表明存在整合到了患者细胞基因组中的病毒DNA序列。整合的病毒序列并不能保证使宿主细胞合成完整病毒。但是，有整合之HBV序列的肝细胞只能够产生HBsAg，而HBsAg能够在患者的血清中检测到，并且是慢性乙型肝炎的指征。被转化的肝细胞很可能不会被细胞毒性T-细胞所溶解，而是繁殖并诱导慢性持续性肝炎(CPH)或慢性活动性肝炎(CAH)，进而发展为肝硬变或原发性肝细胞癌，导致患者过早死亡。

最近已证实，慢性HBV感染的患者在内源干扰素产生方面存在缺陷(Abb et．al．，1985：J．Med．virol 16。171-176)。这就是用α-干扰素(IFNα)治疗根据血清中存在HBeAg和HBV-DNA而鉴定为慢性乙型肝炎患者的理论基础。对大量患者进行的对照试验表明，与对照组相比较使用α-干扰素可导致乙型肝炎病毒的显著减少。但是，在出生时或出生前后感染的人在对该治疗法反应中似乎未出现血清转化。这一现象不幸地将约75％的携带者排除于INFα疗法之外。

有关α-干扰素对慢性乙型肝炎的确切作用方式目前仍不清楚。其抗病毒活性可能保护了被感染细胞免受感染或减少了病毒在HBV感染之细胞中的转录、翻译和复制。干扰素还具有激活T细胞、巨噬细胞和NK细胞以及减少MHC I类蛋白表达的免疫调节作用。

治疗慢性乙型肝炎的另一个方法是基于以下想法：抑制病毒的复制，从而修复其防御能力，以使宿主免疫系统足以能够消除病毒。这一想法导致了使用腺嘌呤阿拉伯糖苷和腺嘌呤阿拉伯糖苷单磷酸酯等抗病毒药物治疗慢性HBV感染之患者的试验。但是只有半数以下的患者对这种治疗有反应，他们可表现有持久的或短暂的血清转化(HBeAg⁺变为抗HBe⁺)。这些抗病毒药物的另一个不利方面是它们的免疫抑制性质。

已试验过的用于治疗慢性携带者的其它药物包括β和γ干扰素、9-(2-羟乙氧甲基)鸟嘌呤(acyclovir)、白细胞介素2、类固醇(如脱氢可地松)及其联合应用。但其中没有任何一种药物能够产生比α-干扰素疗法更好的效果。只有联合治疗(包括先用类固醇，再用αINF)可能会提高某些患者的应答率。

从现有技术中知道，用HBsAg(与破伤风毒素结合)或用抗HBs抗体进行治疗均不能治愈慢性HBV感染的黑猩猩。而且，也曾试图用S肽免疫慢性HBV感染的患者。这一治疗方法甚至未导致这些患者体内抗HBs抗体的生成。

另外，根据定义，乙型肝炎病毒慢性携带者的特征是可从其血清中检测出HBsAg。因此，人们绝对没有预见到根据本发明的包含病毒S肽之T细胞激活抗原决定基的组合物能够在乙型肝炎病毒慢性携带者体内诱导免疫反应并最终治愈之。

鉴于以上所讨论的现有技术状况，本发明的目的在于提供一种治疗病毒性慢性肝脏疾病的有效治疗剂，它能够导致完全的治疗反应(即持久地抑制HBV复制、丢失HBV DNA和DNA多聚酶以及减少及最终消除患者血清中的HBeAg和HBsAg。

按照本发明，这一目的是通过组合a)至少一种介导一个或多个抗原决定基之抗原性的多肽序列和b)一种能够呈现抗原决定基序列a)的载体而达到的，其中多肽序列a)可通过吸附、任何的化学键合或次合价结合于载体b)上。

本发明还涉及该结合物在生产治疗慢性病毒性肝炎的药物方面的应用。

本发明还涉及治疗慢性病毒性肝炎的方法，该方法包括给患者使用上看所述的a)至少一种介导一个或多个抗原决定基之抗原性的多肽序列和b)一种能够呈现抗原决定基序列a)的载体的结合物，其中多肽序列a)可通过吸附、任何的化学键合或次合价结合于载体b)上。

多肽序列a)(其可以是一种或多种不同多肽)以直接或间接方式介导T细胞激活抗原决定基的抗原性这一点很重要。根据本发明，多肽序列a)可以是一种多肽或者是任何亚型的乙型肝炎病毒(尤其是adw、ayw、adr和ady)的两种或多种多肽的结合物。这些来源于乙型肝炎病毒的肽可能是HBV肽前S₁、前S₂或HBV核心抗原。

另外，作为多肽序列a)，还可以是被修饰过的上述多肽或两个或多个多肽的结合物，所说的修饰可以是从多肽序列a)上删去氨基酸(但必须保留至少一个包括至少6个连续的氨基酸残基的抗原决定基)，或者是向多肽序列a)的N-末端、C-末端加进或插入其它氨基酸。但是，在所有这些情况下均必须保持其生物活性。

最好是使多肽序列a)十四烷基化。

为了发挥适当的药理学活性，必须将本发明的多肽序列a)的结合物呈现在一种载体上。该载体由特定物质组成，例如由疏水聚合物颗粒、无机颗粒或多糖颗粒组成。载体b)最好是分必后形成颗粒的第二个多肽序列，所说的颗粒的直径最好至少为10nm。

形成颗粒的多肽序列b)最好是以下多肽的完整氨基酸序列或其一部分：HBV S肽、HBV核心抗原、HAV核心抗原、HAV表面抗原、HIV表面抗原、HIV核心抗原以及脊髓灰质炎病毒表面抗原。优选的颗粒形成载体b)是HBV S肽和／或核心肽。

当使用上述的多肽作为载体序列b)时，可通过以下方式对其进行修饰：任意删去氨基酸、取代一个或多个氨基酸、在多肽序列b)的C端或N端加上一个或多个氨基酸或向其中插入一个或多个氨基酸，条件是颗粒形成能力得以保留。最好使多肽序列b)十四烷基化。

如果载体b)为多肽序列，则可通过一个或多个以下相互作用来连接序列a)和b)：疏水结合(由十四烷酸介导)或二硫桥键形成，或者通过肽键将两个序列连接成融合肽。在后一种情况下，偶而可将一间隔基序列插入到多肽序列a)和多肽序列b)之间，其中间隔基序列通过肽键与两种多肽相连。

本发明还提供了编码结合物的重组DNA分子，该结合物可用于生产治疗慢性病毒性肝脏疾病的药物。该重组DNA分子包括至少一种第一DNA序列，还可选择性地包括第二、第三和／或第四DNA序列，其中

i)所说的至少一种第一DNA序列编码至少一种上面所定义的多肽序列a)，

ii)所说的第二DNA序列编码根据上述颗粒形成肽之定义的多肽序列b)，

iii)所说的第三DNA序列编码间隔基序列，

iv)所说的第四DNA序列编码选择标记。且其中DNA序列受控于表达所必需的DNA成分，且它们可以具有共同的读码。

由于许多氨基酸是由一个以上的三联密码子编码的，因此可有几个属于本发明的DNA序列用来编码上面所定义的肽序列a)和b)。此外，本发明还包括不同于上面所定义的重组DNA分子的重组DNA分子，其中可以有高达30％的核苷酸被取代。

本发明的另一个目的是提供一种被重组DNA分子转染的宿主细胞，该重组DNA分子编码可用于治疗慢性HBV感染患者的前述结合物。该宿主细胞可以是哺乳动物、酵母或细菌细胞。为了本发明的目的，该细胞最好不产生除了包括在上述结合物中的多肽之外的任何人血清蛋白或任何灵长类动物血清蛋白。

本文所用的术语“HBV S肽”是指由HBV基因组的整个区域编码的肽。术语“HBV前S₂肽”是指由HBV基因组的整个前S₂区和S区编码的肽。术语“HBV S₁肽”是指由HBV基因组的整个前S₁、前S₂和S区编码的多肽。术语“抗原决定基”是指由指定的基因组区域编码的至少有6个连续氨基酸的序列(例如，“HBV前S₂抗原决定基”指由HBV基因组之前S₂区编码的至少6个氨基酸的序列)。术语“T细胞抗原决定基”是指与T细胞表面上的受体发生反应以或影响免疫应答的抗原决定基。术语“抗原性”是指引起免疫应答的能力(如起抗原作用)、引起抗体产生的能力(如起抗原作用)和／或与细胞表面受体反应以增强免疫应答或产生抗体的能力。

术语“HBV”是指任何的病毒亚型，尤其是文献中所述的adw、ayw、adr和ayr(P．Valenzuela，Nature Vol．280，p．815(1979)；Gerlich，EP-A-85 111 361，Neurath，EP-A-85102 250)。构成介导一个或多个抗原决定基抗原性之多肽序列a)的肽序列实例见序列目录(SEQ ID No．17-20，22)。

本发明的优选实施方案为以下结合物：

-具有前S₁、前S₂和／或核心肽之特定抗原决定基的HBS抗原颗粒；

-具有前S₁、前S₂、S肽和／或核心抗原之特定抗原决定基的HB核心抗原颗粒；

-具有乙型肝炎S、前S₁、前S₂和／或核心肽之特定抗原决定基的肝炎A抗原颗粒。

优选用于本发明的重组DNA分子的特征在于，存在编码多肽序列a)(其可介导一个或多个T细胞抗原决定基的抗原性)和编码多肽b)(其可在分必后形成直径为10nm或大于10nm的颗粒)的序列，这两种序列均处于适当启动子的控制之下。编码a)的序列包括序列目录中ID序号1至24的任何序列。编码多肽序列b)的DNA序列包括序列目录中ID序号为25-27的任何序列。

序列目录中24个序列(ID数1-24)中的任何一个均可按a-b或b-a的顺序与ID序号25-27下的任何一个序列结合。

本发明的一个具体的优选实例是抗原决定基序列ID28号(对应于HBV之S₁序列的第9-28个氨基酸)与作为颗粒形成体的序列ID26号和／或27号的结合物。

可按下述任何方法形成或分离用于本发明之重组DNA构建物中的肝炎病毒序列，这些方法包括：分离和连接限制片段、利用合成仪(Cyclon，Biosearch)进行寡核苷酸的化学合成以及利用PCR法进行合成(T．J．White，N．Arnleim，H．E．Erlich，1989；ThePolymerase Chain Reaction，Technical Focus 5(6))。

可通过将人工合成的寡核苷酸连接到来自HBV基因组S区的5′xba I-BglII片段(ID27号)(该片段衍生于BglII-BglIIHBV片段，包括了整个前S₁-前S₂-S-区)上或连接至整个S-区上，形成优选的重组DNA分子。用于制造这类构建物的寡核苷酸总结于下面的表I中。

表I

功能	定义	SEQ ID No
功能	定义	SEQ ID No	core(adw)core(adw)core(adw)core(adw)core(adw)core(adw)core(adw)core(adw)core(adw)S1(ayw)S1(ayw)S1(ayw)S1(ayw)S1(adw)S1(adw)S2(ayw)S2(ayw)	aa* 59-87aa 2-28aa -10-28aa 29-58aa 1-87aa -10-87aa 70-110aa 80-125aa 88-120aa 9-28aa 83-103aa 20-40aa 59-94aa 94-114aa 70-105aa 2-21aa 14-33	678910111213151718192021222324

*aa=氨基酸

其它优选的DNA分子是通过将按PCR法制得并编码T细胞抗原决定基的核心序列与用作多肽序列b)的HBV核心序列(SEQ ID No25)相连接而形成的。

表II-1给出了用于制备这些构建物的寡核苷酸。

表II-1

功能	定义	SEQ ID NO
功能	定义	SEQ ID NO	核心核心核心核心/前核心″核心核心/前核心	完整，bp1901-2500C-末端缺失，bp1901-2405C-末端缺失且插入了终止密码子，bp1901-245010aa前核心C-末端缺失，bp1871-240510aa前核心C-末端缺失并插入了终止密码子，bp1871-2405氨基酸(-10-120)10aa前核心完整核心，bp1871-2500	123451635

表II-2显示了几个例子，其中编码T-细胞抗原决定基的DNA序列已通过对HBV基因组的限制性片段切割分离出来并已被连接至编码上文限定之多肽序列b)的DNA序列上。

表II-2

功能	定义	SEQ ID NO
功能	定义	SEQ ID NO	核心/前核心S2ay/adS2(K)ay/ad	完整，bp1403-31S2-S，缺失7个密码子，起始密码子ATG变为ATA	****14

**序列已由Galibert，F。等人(1979：Nature 281，646-650)和Ono，Y．等人(1983：Nucl．

Acid Res．11(6)，1747-1757)公开。

表II-3列出了特定的重组DNA分子。其构建方法将在实施例中详细叙述。

表II-3

最终构建物	T细胞抗原决定基	颗粒形成体	选择基因
最终构建物	T细胞抗原决定基	颗粒形成体	选择基因	MT-核心(-10-120)+SAg+neoMT-S1(aa9-28 )-S+egptMT-核心-neoMT-核心(1-87)+HBsAg-neo	核心( aa-10-120)S1(aa-9-28)ay核心/前核心bp 1403-31核心(aa1-87)	S adw/ayw或S/Xbal/BglⅡS adw/ayw或S/XbaⅠ/BglⅡ核心adwS adw/ayw或S/XbaI/BglⅡ	neoegpt#neoneo

#egpt=大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶

优选的本发明重组DNA分子除包括多肽a)和b)的编码区外还包括另一个编码选择标记的DNA序列。此外，它们还包括表达所必需的所有通用成分，如启动子序列、起始密码子以及多聚腺苷酸化信号。

当使用哺乳动物作为宿主细胞时，合适启动子的例子有金属硫因(MT)、U2和H₂K启动子。如果使用酵母或细菌细胞作用宿主，则可利用合适的酵母和细菌启动子，如GCN4和GAL1／10启动子或原核trp和tac启动子。

为了产生本发明的多肽a)和多肽b)的结合物，可通过转染(在哺乳细胞的情况下)、转化(在酵母和细菌细胞的情况下)或其它方法将重组DNA分子插入宿主细胞。可使用能够转录和翻译重组DNA分子的任何生物体的细胞，如哺乳动物、细菌和酵母细胞作为宿主细胞。

根据本发明，合适的哺乳动物细胞例如有VERO细胞(猴肾细胞系)、3T3-、C127和L细胞(小鼠成纤维细胞系)和CHO(中国仓鼠卵)细胞，它们在脱氢叶酸还原酶试验中为阳性或阴性。

按照本发明的一具体实施方案，上面所定义的分别编码多肽序列a)和多肽序列b)的第一DNA序列和第二DNA序列可存在于不同的重组DNA分子中，在此情况下，须用这两种重组DNA分子共转染宿主细胞。

表III含有针对慢性肝炎携带者之T细胞抗原决定基的颗粒的可选择组合物

最终构建物¹	启动子²	T细胞抗原决定基			颗粒形成体	选择基因	纯化³
		T细胞抗原决定基						SYN	PCR	GENE
		1234	MT-核心-neo	MT/H2/U2″″″				SYN	PCR	GENE	核心，无前核心如bp1901-2500核心，无前核心，C-末端缺失如bp1901-2405核心，无前核心，C-末端和终止信号缺失核心和前核心10N	带有前核心的核心即bp1403-31	核心(adw)核心(adw)″″	neo/egpt″″″	材料和方法

表III(续)

最终构建物¹	启动子²	T细胞抗原决定基		颗粒形成体	选择基因	纯化³
		T细胞抗原决定基					SYN	PCR
		5678910	MT/H2/U2″″″″″				SYN	PCR	核心(59-87)核心(M2-28)核心(M-10-+28)核心(M29-5％)	核心和前核心10AAC-末端缺失如bp1871-2405核心和前核核心，C-末端和终止信号缺失如bp1871-2405	核心(adw)″整个S Sadw/ayw-S/Xbal/Bglll″″″	neo/egpt″″″″

表III(续)

最终构建物¹	启动子²	T细胞抗原决定基			颗粒形成体	选择基因	纯化³
		T细胞抗原决定基						SYN	PCR	GENE
		11121314151617	MT核心(1-87)+HBsaG-neoMT核心(-10+120)+SAg+neo	MT/H2/U2″″″″″″				SYN	PCR	GENE	核心(M1-87)核心(aA-10-+87)核心(AA70-110)核心(AA80-125)核心(AA88-120)核心(AA-10+SATG+AA2-87)	核心(AA-10-+120)	整个Saddw/aywS/Xbal/BgⅢ″″″″″″	neo/egpt″″″″″″

表III(续)

最终构建物¹	启动子²	T细胞抗原决定基			颗粒形成体	选择基因	纯化³
		T细胞抗原决定基						SYN	PCR	GENE
		18192021222324	Mr-Sl(AA9-28)-s+egpt	MT/H2/U2″″″″″″				SYN	PCR	GENE	S1-(AA9-28)(ay)S1-(AA83-103)(ay)S1-(AA20-40)(ay)S1-(AA59-94)(ay)S1-(AA94-114)(ay)S1-(AA70-105)(ad)S1-(AA9-28)(ay)	整个Sadw/aywS/Xbal/BgⅢ″″″″″core adw	neo/egpt″″″″″″	材料和方法

表III(续)

最终构建物¹	启动子²	T细胞抗原决定基		颗粒形成体	选择基因	纯化³
		T细胞抗原决定基					SYN	PCR	GENE
		25262728	MT/H2/U2″″″				SYN	PCR	GENE	S2-(AA2-21)(ay)S2-(AA14-33)(ay)连接子	S2aywS2-(K)-ayw	整个Sadw/aywS/Xbal/BgⅢ″S ayw／adw″	neo/egpt″″″

注：¹见实例3

²任何所述的启动子均适用

³见实施例

表III概括了如何将合适的DNA序列结合起来以得到本发明的DNA构建物。应当指出的是，该表中所公开的任何组分均可被结合以产生适用的DNA序列，并在转染到宿主细胞中后产生能用作治疗慢性病毒性肝炎之药物的结合物(包括多肽a)和b))。编码T细胞抗原决定基序列的DNA序列已通过Biosearch Cyclon合成仪人工合成法(SYN)、PCR法(PCR)或病毒基因组的限制性酶切法(GENE)制得。

为了治疗慢性病毒性肝炎患者，可将多肽序列a)和b)的结合物配制成任何形式的药用组合物，其中还包括合适的稀释剂或药用载体物质，如缓冲液。

可经胃肠道外途径(如静脉或肌肉内)给药或口服(如利用伤寒细菌细胞包衣活性物质)给药等任何方法给药。

药用制剂中含有足以在用药后诱发应答之浓度的上述结合物。

图1显示编码启动子、颗粒形成体序列及选择基因的DNA构建物(实施例3／4)。

图2显示包含启动子、带有整个HB-S-Ag的抗原决定基和选择基因的DNA-基因构建物(实施例3／18)。

图3显示呈现启动子、具有颗粒形成体残基的T细胞抗原决定基和选择基因的DNA构建物(实施例3／21)。

图4显示在Hepa-Care期间黑猩猩1的AST值(实施例10／1)。

图5显示Hepa-Care治疗期间黑猩猩1的抗原值(实施例10／1)。

图6显示用Hepa-Care加强剂量治疗三次之黑猩猩肝脏ALT和GGT酶的值(实施例10／2)。

图7显示Hepa-Care治疗期间黑猩猩2肝脏ALT、AST和GGT酶的值及抗原值(实施例10／3)。

图8显示所测得的未处理之对照黑猩猩的肝脏酶的值(实施例10／3)。

图9和图10分别显示在Hepa-Care治疗期间患者1的抗原和抗体滴度(实施例11)。

图11和图12分别显示在Hepa-Care治疗期间患者2的抗原和抗体滴度(实施例11)。

图13和图14分别显示在Hepa-Care治疗期间患者3的抗原和抗体滴度(实施例11)。

下面借助实施例更具体地叙述本发明。

实施例1

1．用聚乙二醇(PEG)分级沉淀

收集产生HBV蛋白之培养物的上清液并分装成2400ml的等份。向每份中加入144g PEG6000(serva)，于室温下搅拌20分钟使之溶解，再于4℃下搅拌6小时。于10℃下在GS3转子的500ml瓶中以9000rpm(15000×g)离心分离出沉淀物。收集上清液，加入144g PEG6000，并按上述方法溶解之。在4℃下将溶液搅拌3小时。按上述方法从该溶液中收集沉淀物，所不同的是将离心时间延长至60分钟。

2．凝胶层析

将PEG沉淀后获得的材料重新溶解于20ml PBS中，并在A-5m(BioRad)上进行凝胶层析。柱子尺寸为25×1000mm，柱床体积为480ml。在一典型分级分离操作中，用1000μg PEG沉淀的HBV蛋白质(10-15ml)上样，并按6滴／分(18ml／h)的流速用PBS洗脱。每管收集3ml。洗脱的HBV蛋白有第一个峰。对所收集的各管进行CsCl梯度离心。

3．在CsCl梯度中沉降

收集约100ml复盖了A-5m上柱层析中第一个峰且含有预纯化之HBV蛋白的约30管层析洗脱物。用CsCl将该溶液的密度调至1．30g／cc，然后转移到插入SW27／28转子(Beckman)中的晶形塑料试管内。经在下层铺敷密度为1．35g／cc的4ml CsCl溶液、上层铺敷密度为1．25g／cc的4ml CsCl溶液，然后是密度为1．20g／cc的4ml CsCl溶液而形成梯度。将该梯度于10℃以28000rpm的转速离心50小时。之后分级分离该梯度，收集位于1．20g／cc密度层的纯化之HBV蛋白。通过在透析袋中对水透析三次使溶液脱盐。

实施例2

HBV蛋白的定量测定

1．用放射免疫检测法

在AuSRIA II-125“夹心”(可从Abbot购得)放射免疫检测法中，将用豚鼠抗乙型肝炎表面抗原的抗体(抗-HBs)包被的小珠与血清或血浆或纯化的蛋白和合适的对照物一起保温。所存在的任何HBsAg均与固相抗体结合。吸出来结合的材料并涤小珠后，加入人¹²⁵I-抗HBs与小珠上的抗体-抗原复合物反应。然后洗涤小珠以除去未结合的125 I-抗HBs。

)-抗HBsHBsAg

)-抗HBs·HBsAg¹²⁵ I-抗HBs

)-抗HBs·HBsAg·¹²⁵ I-抗HBs

2．用ELISA法

在Enzygnost HBsAg微量“夹心”检测法(可从Behring购得)中，用抗HBs包被各孔。向各孔内加入血清、血浆或纯化的蛋白和合适的对照物并保温。洗涤后，使过氧化物酶标记的抗HBsAg抗体与剩余的抗原决定基反应。通过洗涤除去未结合的酶联抗体，并测定固相上的酶活性。加入稀硫酸终止过氯化氢与显色原间的酶促反应。颜色深度与样品中HBsAg的浓度成正比，并且是通过将未知样品的颜色深度与阴性和阳性对照血清的色深度进行光度比较而得知。

实施例3

制备含有启动子、所需抗原序列和选择基因的本发明基因构建物

1．分离MT启动子

用核酸内切酶Bgl II和BamHI消化质粒pBPV-342-12(ATCC37224)，产生出三个DNA分子。有用片段含有金属硫因启动子和pBR322序列(4．5kb)，并且它易于从其它片段(2．0kb和7．6kb)中检测出来。

反应是在总体积为200μl的反应缓冲液中进行，其中DNA的终浓度为0．5μg／μl，且包括100单位的每种限制酶。37℃保温3小时后，于0．8％琼脂糖凝胶上经琼脂糖凝胶电泳检查是否消化完全。加入4μl 0．5M EDTA终止反应。

通过1．2％琼脂糖的制备性凝胶电泳从其它片段中分离出4．5kb片段。将该DNA从琼脂糖凝胶中洗脱到DE-81 Whatman滤纸上，并从滤纸上洗入高盐缓冲液中。通过苯酚-氯仿萃取和两次乙醇沉淀纯化该DNA。

2．连接编码HBV核心抗原的1．8kb片段

从含有HBV的DNA中分离出含有HBV核心编码区的1．8kbBamHI-BamHI片段。将该片段与含有MT启动子和pBR残余物的4．5kb片段(如1中所述)连接。

将2μl的1．8kb片段与3μl的4．5kb片段在总体积为10μl的连接缓冲液中混合并于14℃过夜连接在一起，其中连接缓冲液含有2单位T4-DNA连接酶和2mM ATP。

将该连接混合物加至用于DNA摄入的150μl感受态细菌细胞悬浮液中。DNA摄入后，按照50-300μl细菌悬浮液／平板的量将细菌细胞涂布到含有50μl／ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。然后将琼脂平板于37℃保温过夜。从分离出的单个细菌菌落中筛选出含有所需片段的质粒。

3．筛选含有所需质粒的细菌菌落

用牙簦挑起单个菌落并转移至含有LB-氨苄青霉素培养基的试管(5ml)中。将该试管在快速振荡的环境下于37℃培养过夜。从每份生长细菌的悬浮液中制取微小质粒制剂。通过用限制性核酸内切酶Bgl Ⅱ消化证明所产生的DNA是不同的。两个分子(400bp片段和5．9kb片段)是所需要的。经琼脂糖凝胶电泳分析消化产物。从细菌细胞中分离出质粒DNA。

4．插入新霉素选择标记

通过用限制酶EcoRI消化使上面(3)中产生的质粒线性化。反应是在50μl的总体积中进行，且其中质粒DNA的终浓度为1μg／μl。加入50单位的EcoRI，37℃保温3小时后通过琼脂糖凝胶电泳证明消化是否完成。加入1μl 0．5M EDTA终止反应，并用终浓度为0．3M的乙酸钠和3-4信体积的乙醇于-80℃处理30分钟以沉淀DNA。将沉淀出的DNA溶于50μl蒸馏水中。

将2μl线性化的质粒与含MT启动子和新霉素选择基因(通过用核酸内切酶EcoRI消化后从质粒pMT-neo-E(得自ATCC／Exogene)中分离出的3．9kb片段)的3μl DNA片段混合，并连接在一起。筛选带有所需质粒的单个细菌菌落。

5．分离含有U2启动子序列的片段

用限制性核酸内切酶EcoRI和ApaI消化质粒pUC-8-42(得自Exogene)，产生出两个DNA分子。所需的片段含有U2启动子(340bp)且易于从另一片段(3160bp)中检测出来。消化在总体积为200μl的反应缓冲液中进行，DNA的终浓度为0．5μg／μl，其中包括100单位的每种限制酶。消化的完成是于37℃保温3小时后通过在0．7％琼脂糖凝胶中进行琼脂糖凝胶电泳来检测的。加入4μl 0．5M EDTA终止反应。通过使用1．2％琼脂糖的制备性凝胶电泳从质粒DNA中分离出340bp片段。将DNA从琼脂糖凝胶中洗脱到DE-81 Whatman滤纸上，再将DNA从中转移至高盐缓冲液内。经苯酚／氯仿提取和两次乙醇沉淀纯化DNA。

6．将含有启动子序列的片段插入多聚连接子质粒中用限制酶EcoRI将含有多聚连接子序列的质粒pSP165(得自Promega Biotec)(含有下列限制位点：EcoRI，Sacl，SmaI，AvaI，BamHI，Bgl II，SalI，PstI，Hind III)切成线性。

反应在50μl的总体积中进行，且质粒DNA的终浓度为1μg／μl。加入50单位EcoRI，于37℃保温3小时后通过琼脂糖凝胶电泳证明消化是否完成。加入1μl 0．5M EDTA终止反应，并用终浓度为0．3M的乙酸钠和3-4倍体积的乙醇于-80℃处理30分钟以沉淀DNA。将所沉淀的DNA溶解于50μl蒸馏水中。

将2μl质粒DNA与10μl含有U2启动子序列的片段DNA混合，并在含有2单位T₄-DNA连接酶和2mM ATP的25μl总体积连接缓冲液中14℃保温过夜，使之连接在一起。然后，通过苯酚／氯仿提取和两次乙醇沉淀纯化DNA，并溶解于10μl蒸馏水。所产生的EcoRI和ApaI粘性末端必须转变成平端并连接之。粘性末端是按如下方法通过与绿豆核酸酶反应而变为平端的：将20单位的酶加至含25μl DNA的反应缓冲液(浓度为1μg／μl)中，产生1％终浓度的甘油，和35μl的最终反应体积。于30℃保温30分钟后，经用苯酚／氯仿提取接着用乙醇沉淀两次而纯化DNA。将所得的DNA重新溶于5μl蒸馏水中。在含有比上述者多10倍的T₄连接酶和2mM ATP的15μl反应体积中14℃保温过夜，使所得平端DNA连接在一起。

将连接混合物加至用于DNA摄入的150μl感受态细菌细胞悬浮液中。DNA摄入后，将细菌细胞按每平板50-300μl细胞悬液的量涂布在含有50μg／ml的氨苄青霉素的LB琼脂平板上。使琼脂平板于37℃保温过夜。筛选携带含所需U2启动子片段之质粒的单个细菌菌落。从细菌细胞中分离所产生的质粒，并通过限制酶分析鉴定之。

7．合成的寡DNA-核苷酸89(SEQ ID No：30)与MT启动子片段(4．5kb)连接。

将含有MT启动子和pBR残余部分的4．5kb片段(如1中所述)与合成的寡核苷酸89(SEQ ID No：30)连接在一起。将连接混合物加至用于DNA摄入的150μl感受态细菌细胞悬浮液中。筛选其中存在所需质粒的单个细菌菌落。经用限制性核酸内切酶EcoRI和XbaI消化证实该新质粒。有两个分子是预期得到的，一个为2．0kb，一个为2．6kb。

8．将合成的寡核苷酸101(SEQ ID No：32)与质粒(如7中所述)连接。

用Bgl II和BamHI消化如7中所述的质粒并除去13个核苷酸的片段(如1中所述)。将所产生的含有第一寡核苷酸89(SEQID No：30)的片段与寡核苷酸101(SEQ ID No：32)(Bgl II-BamHI片段)连接在一起。DNA摄入后，筛选含所需质粒的单个细胞。所产生的新质粒通过用核酸内切酶EcoRI和XbaI或用EcoRI和Bgl II消化而加以证实。

9．将合成的DNA-寡核苷酸99(SEQ ID No：31)与4．5kb片段(如1中所述)连接

将4．5kb片段(Bgl II-BamHI)与DNA寡核苷酸99(SEQID No：31)连接在一起。对含有不同DNA的单个细菌菌落进行筛选后，通过用EcoRI消化后产生两个片段(1．9kb和2．7kb)并通过用Bgl II或BamHI产生正线性化而鉴定出所需质粒。

然后用PstI和BamHI消化该新质粒。产生两个预期的分子，一个为2kb片段，它含有pBR残余部分、MT启动子和寡核苷酸；另一个为2．0kb的pBR残余部分。分离出2．6kb片段。

10．将9中所述质粒的2．6kb片段与从8中所述质粒分离的片段连接。

用PstI和Bgl II消化含有DNA寡核苷酸89和101(分别为SEQ ID No：30和32)的质粒(见8)。共产生两个片段，即含有pBR残余部分和MT启动子的2．5kb片段以及含有pBR残留部分和两种寡核苷酸的2．2kb片段。

使该2．2kb片段与8中所述的含有pBR残余部分、MT启动子和寡核苷酸99(SEQ ID No：31)的2．6kb片段相连接。

筛选出所需质粒后，通过Bgl II-xbaI的限制性核酸内切酶消化鉴定该质粒。得到两个预期的片段，即寡DNA-核苷酸的270bp片段以及含MT启动子和pBR的4．5kb片段。

11．连接2．3kb HBV Bgl II-Bgl II片段

从含有HBV的DNA中分离出含HBV前S₁、前S₂和S编码区的2．3kb Bgl II-Bgl II片段。然后将该2．3kb片段与含有MT启动子的4．5kb片段(按1中所述方法制得)连接在一起。

将2μl 2．3kb片段与3μl 4．5kb片段相混合，并在含有2单位T₄-DNA连接酶和2mM ATP的总体积10μl的连接缓冲液中于14℃连接过夜。

将所得的连接混合物加到用于DNA摄入的150μl感受态细菌细胞悬浮液中。DNA摄入后，将细菌细胞按每平板50-300μl细胞悬液的量涂布到含有50μl／ml氨苄青霉素的LB琼脂平板上。平板于37℃培养过夜。筛选其中存在含所需片段之质粒的分离的单个细菌菌落。

12．用HBV核心抗原决定基转化部分HBV-基因序列

用核酸内切酶Bgl II和XbaI消化上面11中产生的质粒，得到两预期的分子，即550bp片段和6．25kb片段。然后，通过琼脂糖凝胶电泳分离出6．25kb片段。

使6．25kb片段与编码HBV核心基因之抗原决定基部分的270bp片段(该270bp片段是用Bgl II和XbaI消化10中所述的质粒并按上述方法分离后得到)相连接。

将连接混合物加至用于DNA摄入的150μl感受态细菌细胞悬浮液中。从分离的单个细菌菌落中筛选所需质粒。通过用BamHI消化证明该新质粒。得到三个预期的分子，即950bp、450bp和5，150bp片段。

13．制备“载体”质粒

用EcoRI和XbaI消化11中所述的质粒。预期产生一个2，450bp片段和一个经凝胶电泳后分离出的4，350bp片段。

将该4，350bp片段与编码从ATG至XbaI位点之HBV-S基因整个DNA序列(其中ATG变为ATA)的寡DNA-核苷酸39(SEQ ID No：29)连接在一起。

14．完整HBV-S基因上游核心-抗原决定基

用PstI和XbaI消化该“载体”质粒，得到600bp质粒残余部分和3，850bp片段这两个预期的分子。分离出3，850bp片段，并与消化10中算术的质粒后分离出的2，800bp Pst-XbaI片段(2，700bp)相连接。

筛选出所需质粒后，通过EcoRI和XbaI、EcoRI和Bgl II以及BamHI的限制性核酸内切酶消化鉴定该质粒。

15．插入选择标记

用EcoRI将14中所述的质粒切成线性。反应在50μl总体积中进行，且质粒DNA的终浓度为1μg／μl。加入50单位EcoRI，并于37℃保温3小时后通过琼脂糖凝胶电泳证实消化已完成。

加入1μl 0．5M EDTA终止反应。用终浓度0．3M的乙酸钠和3-4倍体积的乙醇于-80℃处理30分钟以沉淀出DNA。将沉淀出的DNA溶解于50μl蒸馏水中。

将2μl切成线性质粒与3μl含有MT启动子和新霉素选择基因(如4中所述)的DNA片段混合并连接之。筛选带有所需质粒的分离的单个细菌菌落，并从中分离、纯化和鉴定该质粒。

也可用U2启动子构建上面所述的各基因构建物。从而以用EcoRI和BglII消化后分离出的含有U2启动子的DNA片段取代了同样消化后得到的含MT启动子的DNA片段。

16．分离大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(cgpt)选择基因。

用BamHI和Bgl II消化质粒pMSG后分离出含有egpt选择基因的片段(1．8kb)，并与含有MT启动子的4．5kb片段(Bgl II-BamHI，1中所述)连接。

筛选所需质粒后，分离、纯化并最后将BamHI位点转化为EcoRI位点。

17．借助PCR法分离所需DNA序列

经凝胶电泳分离出一个DNA片段(400bp)。它是利用特定的寡核苷酸131和132(SEQ ID No：33和34)作引物以PCR方法(如实施例5所述)产生的。

用核酸内切酶BamHI和XbaI消化该DNA片段，然后经凝胶电泳纯化之。将分离出的PCR片段与用Bgl II和XbaI消化后从13中所述质粒中分离到的6．25kb片段相连接。DNA摄入和细菌转化后，筛选含所需质粒的单个细菌菌落。

18．插入选择标记

通过向15中所述的质粒中加入选择基因而完成质粒(17中所述)的构建。

19．分离H₂K启动子

用EcoRI和Bgl II消化质粒pSP65H₂(得自Exogenc)，从而分离出H₂K启动子(2kb)。

在所述的所有构建物中，所有启动子均可换成EcoRI／Bgl II片段。

20．转化部分HBV基因序列

用核酸内切酶Bgl II和XbaI消化得自11)的质粒，得到两个所需分子，其中一个是经琼脂糖凝胶电泳后分离出的0．250kb片段。

将此6．250kb片段与寡DNA-核苷酸23(SEQ ID No：28)连接。将连接混合物加到用于DNA摄入的150μl感受态细菌细胞悬液中。从分离出的单个细菌菌落中筛选出所需质粒。经用EcoRI和Bgl II核酸内切酶消化证明该新质粒。预期得到两个分子，一个为1．9kb，另一个为4．450kb。

21．插入egpt选择标记

用EcoRI将20中所述的质粒切成线性。反应在100μl总体积内进行，且其中质粒DNA的终浓度为0．6μg／μl。加入60单位EcoRI，并于37℃保温3小时后通过琼脂糖凝胶电泳证实消化已完成。加入2μl 0．5M EDTA终止反应，并于-80℃用终浓度为0．3M的乙酸钠和4倍体积的乙醇沉淀DNA1小时。将沉淀的DNA溶解于50μl蒸馏水中。

将2μl线性化的质粒与3μl用EcoRI消化后获得的含MT启动子和egpt选择基因(如16中所述)的DNA片段(3．7kb)混合并连接。从单个细菌菌落中筛选出所需质粒。表III中所述的各基因构建物均可按上述方法制备。

实施例4

用本发明的构建物转染哺乳动物细胞

为了实现本发明构建物编码的HBV肽的大量分泌，须用本发明的DNA构建物转染哺乳动物细胞。共转染可分两步完成(即每一构建物单独转染)或以一步完成(即用两种构建物的制品一次转染)。可利用两种构建物上的不同选择标记或用免疫检测法检测两种构建物之表达产物的分泌来进一步证实共转染。

或者，可将编码本发明HBV肽序列的序列和编码完整S或核心或HAV蛋白的各个序列结合在单个构建物中。

实施例5

聚合酶链反应(PCR)

聚合酶链反应可在体外将已知基因组序列选择区域的特定DNA核苷酸序列扩增一百万倍以上(Thomas J．White，Nor-man．Arnleim，Henry A．Erlich 1989：The polymerase chainreaction，Technical Focus，Vol．5．No．6；S．Kwok and R．Higuchi 1989：Avoiding false positives with PCR．Nature，Vol．399，pp237-238)。

对从细胞分离的DNA或质粒DNA进行处理以分离其互补链。然后将这些链与过量的两种DNA寡核苷酸(每个长20-25个碱基对)一起退火，所说的寡核苷酸是通过化学方法合成的，以与由X核苷酸(其中X一般为50-2，000bp)分隔开的序列相匹配。

在DNA聚合酶催化的体外DNA合成中，将这两种寡核苷酸用作特异性引物，该聚合酶是在对应于这两种寡核苷酸的序列间拷贝DNA。如果这两种引物寡核苷酸含有正确序列，就可能在5′和3′端产生新的消化位点。

经过多轮反应后，得到大量的具有所需长度的DNA片段。通过凝胶电泳进行纯化，并通过限制酶消化和琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。然后将扩增并纯化过的DNA片段与其它片段(即质粒)连接。

扩增带平端的PCR-DNA片段。为了得到粘性末端(用于连接步骤)，必须用所需的核酸内切酶消化该片段并再次纯化之。

PCR反应共进行20-30个循环周期。每一周期分为三个步骤，其反应时间和反应温度均不相同(由PCR-热循环控制器控制)。第一步骤为基质DNA变性(1分钟／95℃)，第二步骤为基质DNA和引物杂交(1分钟／55℃)，接着是“聚合”步骤(2分钟／72℃)。

每次检测的终体积为30μl，例如，含有以下终浓度：PCR缓冲液(IX)、有各200μM之四种核苷酸的核苷酸混合物、各200μg(30μl)的两种引物、每30μl aquabidest含0．5单位Taq聚合酶。

实施例6

培养转染细胞以分泌蛋白质

于第1天向平皿(φ10cm)中的普通生长培养基(DMEM+10％牛胎血清、葡萄糖和谷氨酰胺)中接种受体细胞(C127或CHO细胞，得自ATCC)(每平皿接种1-2×10⁶个细胞)。第二天，除去培养基(在向细胞中加入DNA沉淀物前4小时)，用1×PBS洗涤细胞两次。然后加入8ml无FCS的DMEM。4小时后向细胞中加入DNA沉淀物(按下述方法制备)。再过4小时后除去培养基，加入3ml Glycerol-Mix(50ml 2×TBS缓冲液，30ml甘油，120ml蒸馏水)。于37℃保温3分钟后立即除去Glycerol-Mix，并用1×PBS洗涤细胞。将细胞加于8ml含10％FCS的DMEM中培养过夜。

48小时后，用胰蛋白酶-EDTA溶液(0．025％胰蛋白酶+1mM EDTA)处理，以从平皿中回收细胞。然后用1×PBS洗涤细胞以除去胰蛋白酶-EDTA，悬浮于加有10％ FCS的DMEM中，并分加到24孔平板各孔内(将每一平皿的细胞分加到四个24孔平板中)。

当细胞生长良好时，加入选择培养基〔(例如，当选择eco-gpt时其浓度为：O．5-1mg／ml的新霉素或黄嘌呤(250μg／ml)、次黄嘌呤(15μg／ml)或腺嘌呤(25μg／ml)、胸腺嘧啶(10μg／ml)、氨基喋呤(2μg／ml)、霉酚酸(25μg／ml)〕。每周更换一次培养基。两周后可看到第一个生长的细胞集落。

向10μg质粒DNA和20μg载体-DNA(鲑精子DNA，牛胸腺DNA)中加入TE缓冲液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH7．05)至终体积为440μl，并与60μl 2M CaCl₂混合。然后加入相同量的2×TBS(Hepes 50mM，NaCl 280mM，Na₂HPO₄ 1．5mM，PH7．05)并充分混合。沉淀溶液于37℃保温30分钟，并直接加到用于转染的细胞中。

实施例7

制备纯化之颗粒的佐剂

将所需浓度的抗原悬浮于无菌盐水中，然后向其中加入1∶10000体积的乙基汞硫代水杨酸钠(Thimerosol)、1／10体积过滤除菌的O．2M KAl(SO₄)₂·12H₂O。用无菌1NNaOH调节PH至5．O，并将悬浮液于室温下搅拌3小时。2000rpm离心10分钟以回收铝沉淀的抗原。然后重新悬浮于含有1∶10000的乙基汞硫代水杨酸钠的无菌生理盐水中，并在无菌条件下分装成若干等份。

实施例8

纯化乙型肝炎核心抗原

收集分泌HB-核心抗原之细胞的上清液，并超滤浓缩。于Beckman SW28转子中以20，000rpm的转速4℃离心15分钟，以澄清该浓缩物。

在Beckman SW28转子中，于4℃以28，000rpm的转速进行蔗糖密度梯度离心(0-45％蔗糖)，以检验颗粒形成分离梯度，并用ELISA法分析各部分。

实施例9

下列各表给出了对下述的本发明免疫原性颗粒进行ELISA分析的部分结果：

表IV显示了利用抗前S₁单克隆抗体MA18／7和抗HBs单克隆抗体G022对产生于包括前S₁抗原决定基和S区的本发明任何HBV序列构建物的纯化之HBs-抗原颗粒进行ELISA分析的数据。

表IV显示经CsCl密度梯度离心后收集的各部分(21)。

表IV-1

CsCl梯度分级分离序号	ELISA测定(E=492)单克隆抗体18／7
13141516171819	0．0920．2100．3881．6622．6040．6480．031

表IV-2

分级分离序号	ELISA测定(E=492)多克隆抗体GO22
13141516171819	0．1360．4260．8221．9702．9540．9670．076

表V显示用抗HB核心多克隆抗体和抗HB-S-Ag单克隆抗体G022对产生于本发明的任何HB-核心序列构建物的纯化之HB-核心抗原颗粒进行ELISA分析的数据。

表V-1

蔗糖梯度分级分离序号	ELISA测定(E=492)多克隆抗体
6789101112	0．250．9221．4231．51．51．280．466

表V-2

蔗糖梯度分级分离序号	ELISA测定(E=492)单克隆抗体GO22
6789101112	0．0200．0240．0180．0110．0150．0200．022

实施例10

给黑猩猩使用Hepa-Care的研究

Hepa-Care是以特定配方(比值为50∶50)呈现乙型肝炎表面抗原(S₁和S)的颗粒，它用于治疗肝炎病毒慢性携带者。

实验1

于0、4和8周按每次注射18μg的剂量用Hepa-Care对携带乙型肝炎的黑猩猩1进行治疗(肌肉内注射)。

监测肝脏酶活性(图IV)及乙型肝炎抗原水平(图V)。

实验2

经过以上处理后，于30，34和38周对黑猩猩1进行加强剂量注射。其结果示于图VI中。

实验3

用Hepa-Care处理黑猩猩2，与黑猩猩1不同的是对黑猩猩2进行静脉内注射。剂量为2mg。其结果示于图VII中。

同时监测对照黑猩猩3的肝脏酶，结果示于图VII中。

实施例11

用Hepa-Care治疗(其定义见实施例10)：

患者1(男性，年龄65岁，患病两年)：

乙型肝炎参数：

HBsAg 阳性

抗-HBs 阴性

HBeAg 阴性

抗-HBe 阳性

抗-HBc 阴性于第0、1、6和7个月用Hepa-Care治疗(i．m．)。图IX和X中给出了抗原和抗体测定的结果。

患者2(女性，年龄48岁，患病12年)：

乙型肝炎参数：

HBsAg 阳性

HBeAg 阴性

抗-HBs 阴性

抗-HBe 阳性

抗-HBc 阳性于第0、1和6个月用Hepa-Care治疗(i．m．)。抗原和抗体测定的结果示于图XIXII中。

患者3(女性，年龄41岁，患病5年)：

乙型肝炎参数：

HBsAg 阳性

HBeAg 阴性

抗-HBs 阴性

抗-HBe 阳性于第0、1、2和5个月用Hepa-Care进行治疗(i．m．)。HBs抗原和抗HBs抗体的测定值示于图XIII和XIV中。

序列目录

SEQ ID NO： 1

序列类型：核苷酸

序列长度： 558bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源： PCR扩增ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAAGAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TATGTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAACTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTTGGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCTTTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TATAGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTTCCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGAGGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCTCGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGAAGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG

SEQ ID NO： 2

序列类型：核苷酸

序列长度： 504bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源： PCR扩增ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAAGAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TATGTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAACTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTTGGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCTTTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TATAGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTTCCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGAGGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCTCGC AGA CGT

SEQ ID NO： 3

序列类型：核苷酸

序列长度： 504bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源： PCR扩增ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAAGAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TATGTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA TTG ATC AGG CAACTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTTGGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCTTTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TATAGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTTCCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGAGGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCTCGC AGA CGT

SEQ ID NO： 4

序列类型：核苷酸

序列长度： 534bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源： PCR扩增TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGCATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAAGAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TATGTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAACTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTTGGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCTTTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TATAGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTTCCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGAGGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCTCGC AGA CGT

SEQ ID NO： 5

序列类型：核苷酸

序列长度： 534bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

SEQ ID NO： 6

序列类型：核苷酸

序列长度： 87bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATG ACT CTA GCTACC TGG GTG GGC AAT AAT TTG GAA GAT CCA GCATCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT

SEQ ID NO： 7

序列类型：核苷酸

序列长度： 81bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACTGTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTCTTT CCT TCC GTC AGG

SEQ ID NO： 8

序列类型：核苷酸

序列长度： 114bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGC ATGGAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCT ACTGTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GAC TTCTTT CCT TCC GTC AGG

SEQ ID NO： 9

序列类型：核苷酸

序列长度： 90bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成GAT CTC CTA GAC ACC GCC TCA GCT CTG TAT CGAGAA GCC TTA GAG TCT CCT GAG CTA TGC TCA CCTCAC CAT ACT GCA CTC AGG CAA GGT

SEQ ID NO： 10

序列类型：核苷酸

序列长度： 261bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTC AGG GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CTA TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GGT ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGC AAT AAT TTG GAAGAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT

SEQ ID NO： 11

序列类型：核苷酸

序列长度： 291bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGCATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTC AGG GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CTA TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GGT ATC CTC TGC TGG GGG GAA TGG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGC AAT AAT TTG GAAGAT CCA GCA TCT AGG GAC CTT GTA GTA AAT

SEQ ID NO： 12

序列类型：核苷酸

序列长度： 123bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAA GAT CCA GCATCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT GTT AAT ACTAAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA CTA TTG TGGTTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT

SEQ ID NO： 13

序列类型：核苷酸

序列长度： 138bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TAT GTT AATACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAA CTA TTGTGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTT GGA AGAGAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCT TTC GGAGTG TGG

SEQ ID NO： 14

序列类型：核苷酸

序列长度： 822bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV S2 ayw／adw

即时实验来源： HBV DNAATG CAG TGG AAT TCC AGA ACC TTC CAC CAA ACT CTGCAA GAT CCC AGA GTG AGA GGC CTG TAT TTC CCT GCTGGT GGC TCC AGT TCA GGA ACA GTA AAC CCT GTT CTGACT ACT GCC TCT CCC TTA TCG TCA ATC TTC TCG AGGATA GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTTCTC GTG TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGAACT CTC ACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGGACT TCT CTC AAT TTT CTA GGG GGA ACT ACC GTG TGTCTT GGC CAA AAT TCG CAG TCC TCA ACC TCC AAT CACTCA CCA ACC TCT TGT CCT CCA ACT TGT CCT GGT TATCGC TGG ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC ATC TTC CTCTTC ATC CTG CTG CTA TGC CTC ATC TTC TTG TTG GTTCTT CTG GAC TAT CAA GGT ATG TTG CCC GTT TGT CCTCTA ATT CCA GGA TCC TCA ACA ACC AGC ACG GGA CCATGC CGG ACC TGC ATG ACT ACT GCT CAA GGA ACC TCTATG TAT CCC TCC TGT TGC TGT ACC AAA CCT TCG GACGGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCA TCC TGGGCT TTC GGA AAA TTC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GCCCGT TTC TCC TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTTCAG TGG TTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTTTCA GTT ATA TGG ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGTCTG TAC AGC ATC TTG AGT CCC TTT TTA CCG CTG TTACCA ATT TTC TTT TGT CTT TGG GTA TAC ATT

SEQ ID NO： 15

序列类型：核苷酸

序列长度： 99bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成TAT GTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGGCAA CTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACTTTT GGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC

SEQ ID NO： 16

序列类型：核苷酸

序列长度： 390bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源： PCR扩增TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGCATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAAGAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TATGTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAACTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTTGGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC

SEQ ID No 17

序列类型：核苷酸及对应的蛋白质

序列长度： 60bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV Sl ay

即时实验来源：化学合成AAT CCT CTG GGA TTC TTT CCC GAT CAC CAG TTG GATCCA GCC TTC AGA GCA AAC ACC GCAAsn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu AspPro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala

SEQ ID No 18

序列类型：核苷酸及对应的蛋白质

序列长度： 63bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV Sl ay

即时实验来源：化学合成CCT GCC TCC ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCTACC CCG CTG TCT CCA CCT TTG AGA AACPro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln ProThr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asn

SEQ ID No 19

序列类型：核苷酸及对应的蛋白质

序列长度： 63bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV Sl ay

即时实验来源：化学合成GAT CCA GCC TTC AGA GCA AAC ACC GCA AAT CCA GATTGG GAC TTC AAT CCC AAC AAG GAC ACCAsp Pro Ala Phe Arg Ala Asn Thr Ala Asn Pro AspTrp Asp Phe Asn Pro Asn Lys Asp Thr

SEQ ID No 20

序列类型：核苷酸及对应的蛋白质

序列长度： 108bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV Sl ay

即时实验来源：化学合成CCG CAC GGA GGC CTT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCTCAG GGC ATA CTA CAA ACT TTG CCA GCA AAT CCG CCTCCT GCC TCC ACC AAT CGC CAG TCA GGA AGG CAG CCTPro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro GlnAla Gln Gly Ile Leu Glu Thr Leu Pro Ala AsnPro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyArg Gln Pro

SEQ ID NO： 21

序列类型：核苷酸

序列长度： 63bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV Sl ad

即时实验来源：化学合成CCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCTACT CCC ATC TCT CCA CCT CTA AGA GAC - X

SEQ ID No 22

序列类型：核苷酸及对应的蛋白质

序列长度： 108bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV Sl ay

即时实验来源：化学合成CCA CAC GGC GGT ATT TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCTCAG GGC ATA TTG ACC ACA GTG TCA ACA ATT CCT CCTCCT GCC TCC ACC AAT CGG CAG TCA GGA AGG CAG CCTPro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro GlnAla Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr IlePro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser GlyArg Gln Pro

SEQ ID NO： 23

序列类型：核苷酸

序列长度： 60bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV S2 ay

即时实验来源：化学合成CAG TGG AAT TCC AGA ACC TTC CAC CAA ACT CTGCAA GAT CCC AGA GTG AGA GGC CTG TAT - X

SEQ ID NO： 24

序列类型：核苷酸

序列长度： 60bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV

即时实验来源：化学合成GAT CCC AGA GTG AGA GGC CTG TAT TTC CCT GCTGGT GGC TCC AGT TCA GGA ACA GTA AAC - X

SEQ ID NO： 25

序列类型：核苷酸

序列长度： 558bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心adw

即时实验来源： PCR-扩增ATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAAGAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TATGTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAACTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTTGGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCTTTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TATAGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTTCCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGAGGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCTCGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGAAGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG

SEQ ID NO： 26

序列类型：核苷酸

序列长度： 678bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV S adw/ayw

即时实验来源： HBV DNAATA GAG AAC ATC ACA TCA GGA TTC CTA GGA CCC CTT CTCGTG TTA CAG GCG GGG TTT TTC TTG TTG ACA AGA ATC CTCACA ATA CCG CAG AGT CTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTCAAT TTT CTA GGG GGA ACT ACC GTG TGT CTT GGC CAA AATTCG CAG TCC TCA ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCT TGTCCT CCA ACT TGT CCT GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGGCGT TTT ATC ATC TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTCATC TTC TTG TTG GTT CTT CTG GAC TAT CAA GGT ATG TTGCCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA TCC TCA ACA ACC AGCACG GGA CCA TGC CGG ACC TGC ATG ACT ACT GCT CAA GGAACC TCT ATG TAT CCC TCC TGT TGC TGT ACC ACC CCT TCGGAC GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCC ATC CCA TCA TCC TGGGCT TTC GGA AAA TTC CTA TGG GAG TGG GCC TCA GCC CGTTTC TCC TGG CTC AGT TTA CTA GTG CCA TTT GTT CAG TGGTTC GTA GGG CTT TCC CCC ACT GTT TGG CTT TCA GTT ATATGG ATG ATG TGG TAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATCTTG AGT CCC TTT TTA CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGTCTT TGG GTA TAC ATT

SEQ ID NO： 27

序列类型：苷酸

序列长度： 585bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV S adw／ayw

即时实验来源： HBV DNACTA GAC TCG TGG TGG ACT TCT CTC AAT TTT CTA GGGGGA TCT CCC GTG TGT CTT GGC CAA AAT TCG CAG TCCCCA ACC TCC AAT CAC TCA CCA ACC TCC TGT CCT CCAATT TGT CCT GGT TAT CGC TGG ATG TGT CTG CGG CGTTTT ATC ATA TTC CTC TTC ATC CTG CTG CTA TGC CTCATC TTC TTA TTG GTT CTT CTG GAT TAT CAA GGT ATGTTG CCC GTT TGT CCT CTA ATT CCA GGA TCA ACA ACAACC AGT ACG GGA CCA TGC AAA ACC TGC ACG ACT CCTGCT CAA GGC AAC TCT ATG TTT CCC TCA TGT TGC TGTACA AAA CCT ACG GAT GGA AAT TGC ACC TGT ATT CCCATC CCA TCG TCC TGG GCT TTC GCA AAA TAC CTA TGGGAG TGG GCC TCA GTC CGT TTC TCT TGG CTC AGT TTACTA GTG CCA TTT GTT CAG TGG TTC GTA GGG CTT TCCCCC ACT GTT TGG CTT TCA GCT ATA TGG ATG ATG TGGTAT TGG GGG CCA AGT CTG TAC AGC ATC GTG AGT CCCTTT ATA CCG CTG TTA CCA ATT TTC TTT TGT CTC TGGGTA TAC ATT

SEQ ID NO： 28

序列类型：核苷酸

序列长度： 106bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV Sl

即时实验来源：化学合成5′-GAT-CTT-TAA-CAT-GGA-GAA-CAA-TCC-TCT-GGG-ATT-CTT-TCC-CGA-TCA-CCA-GTT-GGA-TCC-AGC-CTT-CAG-AGC-AAA-CAC-CGC-AAA-TCC-AGA-TTG-GGA-CTT-CAA-TCC-CAG-(T)-3′

SEQ ID NO： 29

序列类型：核苷酸

序列长度： 115bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBVS

即时实验来源：化学合成5′-AAT-TCT-AGA-CTC-GAG-TCT-GAA-CAT-AGA-GAA-CAT-CAC-ATC-AGG-ATT-CCT-AGG-ACC-CCT-TCT-CGT-GTT-ACA-GGC-GGG-GTT-TTT-CTT-GTT-GAC-AAG-AAT-CCT-CAC-AAT-ACC-GCA-GAG-(C)-3

SEQ ID NO： 30

序列类型：核苷酸

序列长度： 108bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成5′-GAT-CTT-TTA-AAG-GGA-TCC-TCT-GCT-GGG-GGG-AAT-GGA-TGA-CTC-TAG-CTA-CCT-GGG-TGG-GCA-ATA-ATT-TGG-AAG-ATC-CAG-CAT-CTA-GGG-ACC-TTG-TAG-TAA-ATC-TAG-AC-(A)-3′

SEQ ID NO： 31

序列类型：核苷酸

序列长度： 106bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成5′-GAT-CTC-CGG-GAA-TTC-CTG-GGG-CAT-GGA-CAT-TGA-CCC-TTA-TAA-AGA-ATT-TGG-AGC-TAC-TGT-GGA-GTT-ACT-CTC-GTT-TTT-GCC-TTC-TGA-CTT-CTT-TCC-TTC-CGT-CAG-(G)-3′

SEQ ID NO： 32

序列类型：核苷酸

序列长度： 89bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成5′-GAT-CTC-CTA-GAC-ACC-GCC-TCA-GCT-CTG-TAT-CGA-GAA-GCC-TTA-GAG-TCT-CCT-GAG-CAT-TGC-TCA-CCT-CAC-CAT-ACT-GCA-CTC-AGG-CAA-G-(G)-3′

SEQ ID NO： 33

序列类型：核苷酸

序列长度： 25bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成5′-TTG-GAT-CCT-CCA-ACC-TGT-GCC-TTG-(G)-3

SEQ ID NO： 34

序列类型：核苷酸

序列长度： 25bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源：化学合成5′-CCT-CTA-GAA-CCA-AAT-ATT-CAA-GTA-(C)-3

SEQ ID NO： 35

序列类型：核苷酸

序列长度： 588bp

链型：单链

拓扑结构：线性

分子类型：基因组DNA

原始来源： HBV核心

即时实验来源： PCR扩增TCC AAC CTG TGC CTT GGG TGG CTT TGG GGCATG GAC ATT GAC CCT TAT AAA GAA TTT GGA GCTACT GTG GAG TTA CTC TCG TTT TTG CCT TCT GACTTC TTT CCT TCC GTA CGA GAT CTC CTA GAC ACCGCC TCA GCT CTG TAT CGA GAA GCC TTA GAG TCTCCT GAG CAT TGC TCA CCT CAC CAT ACT GCA CTCAGG CAA GCC ATT CTC TGC TGG GGG GAA TTG ATGACT CTA GCT ACC TGG GTG GGT AAT AAT TTG CAAGAT CCA GCA TCC AGA GAT CTA GTA GTC AAT TATGTT AAT ACT AAC ATG GGT TTA AAG ATC AGG CAACTA TTG TGG TTT CAT ATA TCT TGC CTT ACT TTTGGA AGA GAG ACT GTA CTT GAA TAT TTG GTC TCTTTC GGA GTG TGG ATT CGC ACT CCT CCA GCC TATAGA CCA CCA AAT GCC CCT ATG TTA TCA ACA CTTCCG GAA ACT ACT GTT GTT AGA CGA CGG GAC CGAGGC AGG TCC CCT AGA AGA AGA ACT CCC TCG CCTCGC AGA CGT AGA TCT CAA TCG CCG CGT CGC AGAAGA TCT CAA TCT CGG GAA TCT CAA TGT TAG

Claims

1．一种组合物在生产治疗由肝炎病毒引起的慢性肝炎的药物中的应用，该组合物包括：

a)至少一个多肽序列，它具有该肝炎病毒的一个或多个抗原性T-细胞激活的抗原决定基和

b)能够呈现抗原决定基序列a)的载体，其中多肽序列a)是通过共价键或疏水键与载体b)结合。

2．根据权利要求1所述的应用，其中所说的多肽序列a)为乙型肝炎病毒的多肽。

3．根据权利要求2所述的应用，其中所说的多肽序列a)为一个或多个选自HB病毒前S1、前S2和S肽及HB核心抗原的氨基酸序列。

4．根据权利要求1-3所述的应用，其中所说的多肽序列a)为经过如下修饰的天然多肽序列：

i)任意缺失，但保留了包含至少6个连续氨基酸残基的抗原决定基，

ii)一个或数个氨基酸被取代，或

iii)有其它氨基酸加到多肽序列a)的N-末端、C-末端或插入到多肽序列(a)中间。

5．根据权利要求1-3之一所述的应用，其中所说的多肽序列a)是十四烷基化的。

6．根据权利要求1-3之一所述的应用，其中所说的多肽序列a)是通过重组DNA分子的表达而产生的。

7．根据权利要求1-3之一所述的应用，其中所说的载体b)为具有颗粒形式的多糖、疏水聚合物或无机分子。

8．根据权利要求1所述的应用，其中所说的载体b)为第二种多肽序列。

9．根据权利要求8所述的应用，其中所说的多肽序列b)在分泌后形成直径至少为10nm的颗粒。

10．根据权利要求9所述的应用，其中所说的多肽序列b)为选自HBV S-肽、HBV核心抗原、HAV核心抗原及HIV核心抗原和脊髓灰质炎病毒、HAV或HIV表面抗原之多肽的全部氨基酸序列。

11．根据权利要求10所述的应用，其中所说的多肽序列b)可受如下修饰：

i)任意缺失，但保留了形成颗粒的能力，

ii)一个或多数氨基酸被取代，或

iii)在多肽序列b)的N-末端或C-末端加上了其它的氨基酸序列，或在其中间插入了其它的氨基酸序列。

12．根据权利要求11所述的应用，其中所说的多肽序列b)是十四烷基化的。

13．根据权利要求12所述的应用，其中所说的多肽序列b)是通过重组DNA分子的表达而产生的。

14．根据权利要求1或8所述的应用，其中所说的多肽序列a)和b)是通过二硫桥键连接的。

15．根据权利要求1或8所述的应用，其中所说的多肽序列a)和b)是通过由十四烷酸介导的“疏水结合”连接。

16．根据权利要求1或8所述的应用，其中所说的多肽序列a)和b)是通过肽键连接，其中a)和b)之间插入了一间隔基，该间隔基序列通过肽键与多肽序列a)和b)相连接。

17．根据权利要求16所述的应用，其中所说的多肽序列a)和b)串联编码在同一DNA分子上。

18．根据权利要求17所述的应用，其中所说的多肽序列a)和b)是从所说DNA分子上的单个开放读码表达的，并可被也在同一单个开放读码上编码的间隔基多肽序列隔开。

19．根据权利要求18所述的应用，其中所说的组合物是通过静脉注射或肌内注射服用的。